Αφηρημένο

Εισαγωγή

Anti-EGFR στοχευμένη θεραπεία είναι ολοένα και μεγαλύτερη σημασία σε προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου και πριν από

KRAS

δοκιμή μετάλλαξης είναι υποχρεωτική για θεραπεία. Ωστόσο, κατά την οποία περιπτώσεις αυτό θα πρέπει να γίνεται είναι ακόμα υπό συζήτηση. Έχουμε ως στόχο να αξιολογηθεί σε ασθενείς με τοπικά προχωρημένο καρκίνο του ορθού αν υπάρχει ενδο-δείγμα KRAS ετερογένεια πριν και κατά την προεγχειρητική χημειοακτινοθεραπεία (CRT), και αν υπάρχουν τυχόν αλλαγές στο

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης του λόγω αυτής της παρέμβασης.

Υλικά και Μέθοδοι

KRAS

αναλύσεις κατάσταση μετάλλαξης διεξήχθησαν σε 199 δείγματα όγκων από 47 ασθενείς με καρκίνο του ορθού. Για να αξιολογηθεί η ετερογένεια μεταξύ των διαφόρων περιοχών του όγκου εντός του ίδιου όγκου πριν από την προεγχειρητική CRT, 114 βιοψίες από 34 ασθενείς (μέσος όρος 3 βιοψίες ανά ασθενή) αναλύθηκαν (προ-θεραπευτική εντός του όγκου ετερογένεια). Για την αξιολόγηση της ετερογένειας μετά CRT υπολειμματικό ιστό του όγκου (85 δείγματα) από 12 ασθενείς (μέση 4,2 δείγματα ιστού ανά ασθενή) αναλύθηκαν (μετα-θεραπευτική ενδονεοπλασματική ετερογένεια) και την αξιολόγηση της ετερογένειας πριν και μετά την CRT αξιολογήθηκε σε αντίστοιχα δείγματα των ασθενών (παρεμβατικές ανομοιογένεια). μέθοδο επέκτασης εκκινητή (snapshot ™) χρησιμοποιήθηκε για την αρχική

KRAS

δοκιμή κατάσταση μετάλλαξης για κωδικονίου 12, 13, 61, και 146. αντικρουόμενα αποτελέσματα με αυτή τη μέθοδο είχαν υποβληθεί εκ νέου χρησιμοποιώντας το FDA-εγκριθεί

KRAS

Pyro Kit 24, V1 και το

RAS

Παράταση Pyro Kit 24, V1 Kit (TheraScreen®

KRAS

δοκιμή).

Αποτελέσματα

Για 20 (43%) από τους 47 ασθενείς, ένας

KRAS

μετάλλαξη ανιχνεύτηκε. Με 12 από τα 20, η πλειοψηφία αυτών των μεταλλάξεων επηρεάζεται κωδικόνιο 35. Εμείς δεν λαμβάνονται στοιχεία που αποδεικνύουν ότι CRT οδηγεί σε αλλαγές του

KRAS

μοτίβο μετάλλαξη. Επιπλέον, δεν υπάρχει εντός του όγκου ετερογένεια στο

KRAS

μεταλλάξεων κατάσταση θα μπορούσε να αποδειχθεί. Αυτό ήταν αληθές για αμφότερα τα βιοψίες πριν από την CRT και τα υποδείγματα εκτομή στη συνέχεια. Η διαφορά που παρατηρείται σε ορισμένα δείγματα κατά τη χρήση της δοκιμασίας στιγμιότυπο ™ οφειλόταν σε ανεπαρκή ευαισθησία της τεχνικής αυτής κατά την τεράστια υποχώρηση του όγκου από CRT ως εφαρμογή των TheraScreen®

KRAS

δοκιμή αποκάλυψε σύμφωνη αποτελέσματα.

συμπέρασμα

τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης στην αρχική τοποθεσία του όγκου του καρκίνου του ορθού είναι ομοιογενής. Η εκτίμησή της για θεραπευτικές αποφάσεις είναι εφικτή σε προ-θεραπευτική βιοψίες, καθώς και σε μετα-θεραπευτική εκτομή δείγματα. Το ποσό των βιώσιμων καρκινικών κυττάρων φαίνεται να είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας για την ευαισθησία της ανάλυσης και, συνεπώς, θα πρέπει να ληφθεί υπόψη για την επιλογή της αναλυτικής μεθόδου

Παράθεση:. Jo P, König Α, Schirmer Μ, Kitz J, Conradi LC, Azizian A, et al. (2016) Η ετερογένεια των

KRAS

Μετάλλαξη Κατάσταση στην καρκίνου του ορθού. PLoS ONE 11 (4): e0153278. doi: 10.1371 /journal.pone.0153278

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, ΙΑΠΩΝΙΑ

Ελήφθη: 24 του Αυγούστου του 2015? Αποδεκτές: 25 Μάρτη 2016? Δημοσιεύθηκε: 11 Απριλίου 2016

Copyright: © 2016 Jo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένων /το ελάχιστο σύνολο δεδομένων είναι εντός του χειρογράφου

Χρηματοδότηση:.. το έργο αποτελεί μέρος της μονάδας Κλινικής Έρευνας (KFO 179) και υποστηρίχθηκε από την Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)

οι ανταγωνιστικές ενδιαφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η στοχευμένη θεραπεία έναντι του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) αποτελεί μια καλά αποδεκτή και αποτελεσματική στρατηγική θεραπείας στο μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου συνδέονται. με αυξημένο ποσοστό ανταπόκρισης και παρατεταμένη επιβίωση των ασθενών [1, 2]. Στην ογκογόνο λειτουργία του

EGFR

ελέγχει κρίσιμο κυτταρικές λειτουργίες, όπως η διαφοροποίηση, ο πολλαπλασιασμός και η επιβίωση καθιστώντας έναν αξιόλογο στόχο για αντικαρκινική θεραπεία [3]. Ωστόσο, η αναστολή αυτού του κεντρικού μορίου σηματοδότησης σε καρκίνο του παχέος εντέρου είναι μόνο ελπιδοφόρα όταν ενδοκυτταρική τελεστές καθοδικά του

EGFR

δεν μεταβάλλονται με την ενεργοποίηση μεταλλάξεων. Ένα από τα σημαντικότερα ενδοκυτταρική δράστες μετάφραση

EGFR

σήματα αντιπροσωπεύουν τα μικρά GTPases

KRAS

έλεγχο ζωτικών ενδοκυτταρική καταρράκτες σηματοδότησης, όπως το μονοπάτι Μιτογόνο-Activated-Πρωτεΐνη (MAP-) κινάσης σηματοδότησης. Genomic μετάλλαξη στο

KRAS

γονιδιακό τόπο αποτελέσματα σε μια συνεχή ενεργοποίηση του μονοπατιού MAPKinase ανεξάρτητη από εξωκυττάρια παράγοντες και από το

EGFR

. Δεν αποτελεί έκπληξη και λόγω της συνεχούς διεγέρσεως των ογκογόνο μονοπάτια σηματοδότησης με mutatively ενεργοποιημένο

KRAS

, η αναστολή της

EGFR

δεν είχε ευεργετικές ή ακόμη και δυσμενείς επιπτώσεις σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος φιλοξενούν ένα

KRAS

μετάλλαξη. Κατά συνέπεια, οι ασθενείς με μεταλλαγμένο

KRAS

εξαιρούνται από αντι-

EGFR

θεραπεία και την αποφασιστικότητα του

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης απαιτείται πριν από την προορίζονται θεραπεία.

Σε γενικές γραμμές,

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης αξιολογείται από την ανάλυση των πρωτογενών ιστό του όγκου. Ωστόσο, λόγω της ετερογένειας ενδοογκική [4-6]

KRAS

ετερογένεια μετάλλαξη εντός διαφορετικές περιοχές του όγκου θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός ανησυχία όπως αναφέρθηκε πρόσφατα τουλάχιστον για επιλεγμένους ασθενείς [7, 8]. Ένα phenomenom που δεν περιορίζεται μόνο στα ορθοκολικού καρκίνου όπως φαίνεται από Queirós et al. [9]. Οι διαφορές στην

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης μεταξύ του πρωτογενούς όγκου και απομακρυσμένες μεταστάσεις [7, 10]. καθώς και η εξάρτηση στάδιο του όγκου [11], έχει επίσης αναφερθεί. Υπάρχει σίγουρα μια υψηλή αντιστοιχία μεταξύ πρωτοπαθούς όγκου και των μεταστάσεων όπως αποκάλυψε πρόσφατα από μια μετα-ανάλυση από το Han και οι συνεργάτες του [12]. Ωστόσο, θα πρέπει επίσης να ληφθεί υπόψη ότι η μεθοδολογία των εξετάσεων μετάλλαξη που χρησιμοποιείται μπορεί να είναι πηγή ανέφερε αποκλίσεις όπως πρόσφατα επισήμανε ο Sherwood et al. στον καρκίνο του πνεύμονα [13].

Σε αντίθεση με καρκίνο του παχέος εντέρου προεγχειρητική χημειοακτινοθεραπεία (CRT) είναι η στρατηγική θεραπεία εκλογής σε ασθενείς με τοπικά προχωρημένο καρκίνο του ορθού. Ωστόσο, δεν υπάρχει συμφωνία σχετικά με το χρονοδιάγραμμα του καθορισμού των

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης. Επιπλέον, οι μελλοντικοί αποτελέσματα όσον αφορά τη συμφωνία του

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης στην προ- και μετα-θεραπευτική δείγματα όγκων (αναφέρονται ως intertumoral ετερογένεια) είναι σπάνιες και των αντικρουόμενων φύσης [14-16]. Επιπλέον, δεν υπάρχουν αποτελέσματα αποδεικνύουν δυνατότητα αναπαραγωγής των

KRAS

δοκιμών στην πρωτογενή βιοψία καθώς και στις εκτομή δείγμα μέσα στην ίδια ιστό του όγκου (που αναφέρεται ως ενδοογκική ετερογένεια). Ως εκ τούτου, με στόχο να αξιολογηθεί η

KRAS

κατάσταση σε πολλές προ-θεραπευτική βιοψίες, καθώς και σε χειρουργικά δείγματα όγκου. Στόχος ήταν να συγκριθεί η κατάσταση μετάλλαξης πριν και μετά την χημειοραδιοθεραπεία στον καρκίνο του ορθού και να διευκρινίσει εάν οι διαφορές μετάλλαξη σε θεραπεία αφελής όγκων συμβαίνουν σε όλους.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και θεραπεία

οι ασθενείς που περιλαμβάνονται σε αυτή την ανάλυση υποβλήθηκαν σε θεραπεία στα Τμήματα της Γενικής, σπλαγχνική και Παιδοχειρουργικής και ακτινοθεραπεία και Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας, University Medical Center Γκέτινγκεν, και εγγράφηκαν ή να αντιμετωπίζονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές δίκη του CAO /ARO /AIO-94 [ ,,,0],17] ή CAO /ARO /AIO-04 [18] (EudraCT Αριθμός 2006-002385-20-NCT00349076) του Καρκίνου Ομάδας μελέτης γερμανική ορθού. Όλοι οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα δοκιμής και έδωσαν γραπτή συγκατάθεση είτε από τους ασθενείς ή τους νόμιμους αντιπροσώπους τους. Αυτή η μελέτη ήταν σύμφωνα με τις ηθικές αρχές της Διακήρυξης του Ελσίνκι (Σεούλ, 2008) και εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο της Επιτροπής Δεοντολογίας Γκέτινγκεν στο Γκέτινγκεν, Γερμανία (αριθμός αίτησης 20/9/95, 9/8/08).

Διαπίστωση της προ και μετά-θεραπευτική όγκων βιοψίες

όγκου βιοψίες συλλέχθηκαν πριν από την προεγχειρητική CRT κατά τη διάρκεια των διαγνωστικών διαδικασιών. Χρησιμοποιώντας τυπική λαβίδα βιοψίας βιοψίες απέδωσε το μέγεθος ενός κεφαλιού καρφίτσας. Μετά τη χειρουργική επέμβαση υπολειμματικό όγκου λαμβάνονται από τα εκτομή δείγματα. Λόγω υποχώρηση του όγκου ολόκληρη η περιοχή του όγκου ήταν ενσωματωμένο και αργότερα αξιολογήθηκε από τον παθολογοανατόμο. Η κατάσταση μετάλλαξης εκτιμήθηκε σε δείγματα με φορμαλίνη ορισμένου εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστός (4% ρυθμισμένη φορμαλίνη) από την προ-θεραπευτική βιοψίες όγκων και μετα-θεραπευτική εκτομή δείγματα.

Tumor DNA Παρασκευή και απομόνωση

διαφάνειες FFPE από την προ-θεραπευτική και εκτομή δείγματα ήταν ανεξάρτητα και τυφλώθηκε επαναξιολογηθεί από δύο έμπειρους γαστρεντερικό παθολόγο (JK, PS). ταξινόμησης Η υποχώρηση του όγκου (TRG) αξιολογήθηκε σε ποσοστό παλινδρόμησης σύμφωνα με την Dworak βαθμολόγησης [19]. Σε ασύμφωνα περιπτώσεις, διαφάνειες επανεκτιμήθηκαν από τους δύο παθολόγους και η τελική απόφαση ελήφθη. Προσθέσαμε τις αντίστοιχες ποιότητες υποχώρηση του όγκου και των σχετικών κλινικών δεδομένων των pretherapeutic βιοψίες για όλα τα δείγματα των ασθενών στον πίνακα 1. μικροανατομίας για εμπλουτισμό των κυττάρων του όγκου για να επιτευχθεί μια περιεκτικότητα 70-80% πραγματοποιήθηκε με το χέρι. Η τεχνική πραγματοποιήθηκε όπως αναφέρθηκε πρόσφατα από Hunt και συνεργάτες [20]. Εν συντομία, FFPE φέτες ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Αντιπροσωπευτικές περιοχές των όγκων ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο σε μεγέθυνση x 40. Dissection διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα αιχμηρό χειρουργική λεπίδα. Ιστός όγκου μεταφέρθηκε σε ένα σωλήνα εκχύλισης και DNA πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια με τη χρήση του Qiagen AllPrep DNA /RNA FFPE Kit (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Η

Μετάλλαξη Ανάλυση

Δοκιμασία επέκτασης Εκκινητή μέθοδος στιγμιοτύπων ™.

μέθοδος επέκτασης εκκινητή χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση γνωστών hot-spot

KRAS

μεταλλάξεις σε καρκίνο του ορθού [21] όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22] . Εν συντομία, οι περιοχές των μεταλλάξεων hotspot στα κωδικόνια 12, 13, 61 και 146 ενισχύθηκαν με πολλαπλή PCR χρησιμοποιώντας Qiagen Multiplex Kit (Qiagen, Hilden, Germany) με DNA εισόδου συνεχώς 20 ng. Αυτή η συνολική ποσότητα του αρχικού DNA διατηρήθηκε επίσης για δοκιμή ευαισθησίας, με την οποία το DNA με μονή γνωστή

KRAS

μεταλλάξεις αραιώθηκε με DNA που φέρει διαμόρφωση άγριου τύπου στο υποδεικνυόμενο

KRAS

τόπους. Ως εκ τούτου, οκτώ αναμίξεις με 100, 50, 40, 30, 20, 10, 1 και 0% του DNA μεταλλάκτη που περιέχει ανά κάθε ένα από τα τέσσερα ανακρίνεται μεταλλάξεις παρασκευάστηκαν πριν από την υποβολή σε πολλαπλή PCR. Μετά αλκαλική φωσφατάση γαρίδας και Escherichia coli εξωνουκλεάση Ι (USB, Staufen, Γερμανία) εφαρμόστηκαν θεραπεία ειδικοί εκκινητές πρόσδεσης που γειτνιάζουν με τις πιθανές θέσεις μετάλλαξης και επιμηκύνονται με φθορισμό σημασμένο διδεοξυνουκλεοτιδίου χρησιμοποιώντας το στιγμιότυπο ™ Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, ΗΠΑ). GeneScan ™ 120 LIZ

® Μέγεθος Πρότυπο χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερική σκάλα μεγέθους DNA για τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (3100 Genetic Analyzer, Εφαρμοσμένων Biosystems, Foster City, CA, USA). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με GeneScan ™ Έκδοση 3.5.1 Ανάλυση (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Primer τεχνική Επέκταση έχει ήδη αποδειχθεί ότι είναι μια έγκυρη τεχνική για τον εντοπισμό μεταλλάξεων ή πολυμορφισμών [23, 24].

Σε περίπτωση αντιφατικά αποτελέσματα για τη δοκιμή μετάλλαξη KRAS που επαναξιολογηθεί την ευαισθησία με το σύστημα ελέγχου KRAS TheraScreen®.

TheraScreen® Test RAS.

Το KRAS

Pyro Kit 24, V1 (Qiagen, Hilden, Γερμανία) (κάλυμμα μεταλλάξεις στο

KRAS

κωδικόνια 12 , 13, και 61 του ανθρώπινου

KRAS

γονίδιο) και το

RAS

Παράταση Pyro Kit 24, V1 (Qiagen, Hilden, Γερμανία) (κάλυμμα μεταλλάξεις στο

KRAS

κωδικόνια 59, 61, 117 και 146 του ανθρώπινου

KRAS

γονιδίων) έχουν διεξαχθεί για την ανίχνευση επικύρωση των μεταλλάξεων του

KRAS

γονίδιο στο γονιδιακό DNA του ορθού δείγματος καρκίνου. Η πλατφόρμα πλατφόρμα PyroMark Ε24 MDx έχει χρησιμοποιηθεί για την εκτέλεση του προσδιορισμού TheraScreen® με την Ε24 Λογισμικού, έκδοση 2.0.7 με τα ακόλουθα plugins,

KRAS

PlugIn v1.2.0 και

RAS

Εσωτ PlugIn v .1.2.1.2.

ενισχυμένες περιοχές ενδιαφέροντος για την εκχύλιση του DNA με τη χρήση εκκινητών στο

KRAS

δοκιμασία Pyro (QIAGEN, Hilden, Γερμανία). Εμείς στη συνέχεια ακινητοποιείται, πλύθηκαν και μετουσιώθηκαν τα ενισχυμένα προϊόντα με τη χρήση του σταθμού εργασίας κενού και υποβλήθηκαν τα προϊόντα αυτά προς Pyrosequencing χρησιμοποιώντας το PyroMark Ε24 Pyrosequencer (QIAGEN, Hilden, Γερμανία) για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση των

KRAS

μεταλλάξεις. Αρχική είσοδος του DNA για κάθε δείγμα ήταν 100 ng.

Οι κυτταρικές σειρές.

Οι ακόλουθες ανθρώπινου ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν ενδείκνυται, ξεχωριστή

KRAS

μετάλλαξη έχουν χρησιμοποιηθεί για τα πειράματα που περιγράφονται σε αυτό το χειρόγραφο: DLD1 (ATCC CCL-221) για G13D, SW1116 (ATCC CCL-233) για G12A, LS 174Τ (ATCC CCL-188) για G12D, και SKCO1 (ATCC ΗΤΒ-39) για G12V. Ως αρνητικός έλεγχος, άγριου τύπου KRAS γονιδιωματικό DNA λήφθηκε από την ανθρώπινη κυτταρική σειρά ινοβλαστών BJ (ATCC: CRL-2522). Όλες οι κυτταρικές σειρές έχουν αγοραστεί από ATCC (Manassas, Βιρτζίνια, ΗΠΑ).

Αποτελέσματα

Η θεραπεία των ασθενών που πάσχουν από τοπικά προχωρημένο καρκίνο του ορθού (στάδιο UICC II και III) περιλαμβάνει εισαγωγική χημειοραδιοθεραπεία, εκτομή και επικουρική χημειοθεραπεία. Στη μελέτη μας 32 (68,1%) αρσενικά και 15 (31,9%) γυναίκες ασθενείς έλαβαν εισαγωγική CRT που ακολουθείται από χειρουργική εκτομή και επικουρική χημειοθεραπεία (Σχήμα 1). Νεοεπικουρική CRT περιλαμβάνονται ακτινοβόληση του presacral χώρο με μια συνολική δόση των 50,4 Gy (εφάπαξ δόση των 1,8 Gy) συνοδεύονται είτε από 5-φθοριοουρακίλη (n = 24? 51,1%) ή ένας συνδυασμός ενδοφλέβια έγχυση του οξαλιπλατίνη και μια συνεχή έγχυση 5-φθοριοουρακίλη (n = 23? 48.9%). Μέσα σε 4 έως 6 εβδομάδες μετά την ολοκλήρωση της εισαγωγικής CRT εκτομή πρωτογενούς όγκου διεξήχθη, συμπεριλαμβανομένης της πλήρους mesorectal εκτομή ακολουθούμενη από επικουρική χημειοθεραπεία.

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης καθορίστηκε τεχνική PCR βασίζεται σε στιγμιότυπο ™ από βιοψίες ελήφθησαν από πρωκτοσκόπηση δείκτη και από την εκτομή δείγματα όπως εμφανίζεται στο σχήμα 1.

Η

Primer Παράταση Μέθοδος Προσδιορισμού Ακρίβεια

Ένα από τα σημαντικότερα παγίδες σε PCR-based ανίχνευση γονιδιωματικών μετάλλαξης αντιπροσωπεύει το όριο ανίχνευσης της ευαισθησίας και της ποιότητας των εκκινητών που χρησιμοποιούνται στο στάδιο ενίσχυσης. Προκειμένου να αξιολογηθεί το σύστημα εκκινητή μας χρησιμοποιήσαμε ανθρώπινη ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν διακριτή γονιδιωματική

KRAS

μεταλλάξεις. Για να εκτιμηθεί το όριο ανίχνευσης της ανάλυσης επέκτασης του εκκινητή θα προσομοιωθεί η πιθανή μόλυνση των κυττάρων όγκου με ινοβλάστες. Ακριβώς, χρησιμοποιήσαμε τέσσερις καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές ως πρότυπο για έναν από τους θεωρούνται μεταλλάξεις KRAS: DLD1 για G13D, SW1116 για G12A, LS174T για G12D, και SKCO1 για G12V. Για άγριου τύπου

KRAS

κατάσταση γονιδιωματικής η ανθρώπινη κυτταρική σειρά ινοβλαστών BJ εργαζόταν. Γονιδιωματικό DNA από κάθε μία από τις τέσσερις κυτταρικές γραμμές όγκου αραιώθηκε σειριακά με εκείνη της γραμμής BJ και υποβλήθηκε σε ενίσχυση με PCR ακολουθούμενη από δοκιμασία στιγμιότυπο ™ να. αξιολόγηση της ευαισθησίας αυτής της διαδικασίας. Ως εκ τούτου, προσδιορίσαμε την ισχύ του σήματος, δηλαδή περιοχή κάτω από τις καμπύλες (AUC), των κορυφών που αντιπροσωπεύουν είτε άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο

KRAS

αλληλόμορφο στα έτοιμα διαδοχικές αραιώσεις των θετικών και αρνητικών ελέγχου και υπολογίζεται ένα ζεύγη αναλογία των αντίστοιχων κορυφών (Σχήμα 2).

η

Για όλους

KRAS

παραλλαγές μετάλλαξη, θα μπορούσε να αποδείξει ότι η εφαρμοζόμενη τεχνική στιγμιότυπο ™ αποτελεί μια αξιόπιστη αποτίμηση δοκιμής. Ειδικά

KRAS

μεταλλάξεις G13D και G12A μπορούσε να ανιχνευθεί αξιόπιστα μέχρι ένα μολυσματικό αραίωση με 90% του DNA των ινοβλαστών, ότι από G12D ακόμη και μέχρι 99% και εκείνη της G12V έως και 80% αποδεικνύοντας την υψηλή ευαισθησία και σαφώς υποδηλώνει αυτό μέθοδος είναι σε θέση να ανιχνεύσει όλα θεωρούνται

KRAS

μεταλλάξεις στα μικροτομή βιοψίες και εκτομή του δείγματος. Επιπλέον, σε όλα τα δείγματα δοκιμής εμείς σωστά λαμβάνεται η αναμενόμενη

KRAS

παραλλαγή μετάλλαξης που ορίζεται από τη χρησιμοποιούμενη κυτταρική σειρά καρκίνου.

Σε κάθε περίπτωση, η ένταση σήματος που αναπαρίσταται ως η AUC (περιοχή κάτω από την καμπύλη ) της κορυφής ανιχνεύθηκε στο ηλεκτροφεροδιάγραμμα για το μεταλλαγμένο (AUCmut) σε σχέση με τον άγριο τύπο (AUCwt) αλληλόμορφο υπολογίσθηκε. Αυτή η αναλογία κάθε αναφέρεται στο δείγμα που περιέχει 100% DNA εισόδου της καρκινικής κυτταρικής γραμμής με την αντίστοιχη μετάλλαξη (ορίζεται σε 1,0). Μια γραμμή παλινδρόμησης υπολογίστηκε με το συντελεστή προσδιορισμού (r

2) ενδείκνυται. Κάθε σειρά αξιολογήθηκε τρεις φορές ανεξάρτητα με την τυπική απόκλιση για κάθε αραίωση συμβολίζεται ως ράβδοι σφάλματος.

KRAS

κατάσταση μεταξύ των προ-θεραπευτικών βιοψίες

έναντι

αντίστοιχο μετα-θεραπευτική εκτομή δείγματος

το

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης των βιοψιών που λαμβάνονται στο πρωκτοσκόπηση δείκτη και η αντίστοιχη εκτομή δείγματα μετά την χημειοραδιοθεραπεία και μετέπειτα εκτομή μελετήθηκε σε 47 ασθενείς (Σχήμα 1). Σε 20 από αυτούς τους 47 ασθενείς (42,6%) ανιχνεύσαμε μια μετάλλαξη στο εξώνιο είτε 2, 3, ή 4 (Σχήμα 3). Η πλειοψηφία αυτών των μεταλλάξεων (12/20) επηρέασε κωδικόνιο 35. Απόκλιση από το

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης σε δείγματα που λαμβάνονται στο πρωκτοσκόπηση δείκτη και σε δείγματα από τους αντίστοιχους ασθενείς μετά CRT βρέθηκαν σε έξι ασθενείς (12,8% ) χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Snapshot ™. Όλοι τους αποκάλυψε ένα

KRAS

μετάλλαξη στο προ-θεραπευτικό βιοψία, αλλά ήταν αποφασισμένος να είναι άγριου τύπου, εφόσον ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε αντιπροσωπευτικό μπλοκ ιστού των εκτομή του δείγματος.

Η

τα αντιφατικά ανιχνευτές επαναξιολογηθεί με ένα πρόσθετο σύστημα δοκιμών με τη χρήση της δοκιμασίας TheraScreen® KRAS. Χρησιμοποιώντας αυτήν την πρόσθετη δοκιμασία δοκιμή, τέσσερις από αυτές τις έξι δείγματα αποκάλυψαν μια σύμφωνη μετάλλαξη KRAS στα δείγματα που λαμβάνονται στο πρωκτοσκόπηση δείκτη και στα συμφωνημένα εκτομή δείγμα. Τα υπόλοιπα δύο περιπτώσεις δεν θα μπορούσαν να επανεκτιμηθούν δεδομένου ότι κανένα DNA ήταν διαθέσιμο για επαναξιολόγηση (Πίνακας 2). Επιπλέον, ο προσδιορισμός TheraScreen® KRAS αποκάλυψε το ίδιο το γονίδιο KRAS μετάλλαξη σε δείγματα από πρωκτοσκόπηση δείκτη και χειρουργική εκτομή η οποία ας δείχνουν αυτά τα αποτελέσματα να είναι αξιόπιστα.

Η

Η ενδονεοπλασματική ετερογένεια μέσα σε βιοψίες από πρωκτοσκόπηση δείκτη και χειρουργικά δείγματα

ένα πιθανό πρόβλημα στον προσδιορισμό της em> KRAS

κατάσταση

KRAS

μεταλλάξεις. Για να αξιολογηθεί ο ρόλος των ενδοογκική ετερογένεια μεταξύ διαφόρων βιοψίες εντός του όγκου,

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης αξιολογήθηκε σε πολλαπλές βιοψίες που λαμβάνεται στο πρωκτοσκόπηση δείκτη καθώς και σε τμήματα του όγκου από τα χειρουργικά δείγμα. Για την ανάλυση αυτή μόνο περιπτώσεις με περισσότερα από ένα δείγμα ιστού (βιοψίες από πρωκτοσκόπηση δείκτης: σειρά 2-5 βιοψίες ανά ασθενή, χειρουργικά δείγματα: 3-5 μπλοκ ιστού ανά ασθενή) συμπεριλήφθηκαν (Σχήμα 4)

Η.

κατά μέσο όρο, πήραμε τρεις βιοψίες στο πρωκτοσκόπηση δείκτη και υποβάλλονται αυτά τα δείγματα για

KRAS

ανάλυση. Μόνο σε έναν ασθενή βρήκαμε ασύμφωνα αποτελέσματα για

KRAS

δοκιμές σε δύο διαφορετικές βιοψίες από τον ίδιο όγκο αναλύονται από την δοκιμασία στιγμιότυπο ™. Ένα δείγμα αποκάλυψε μια μετάλλαξη G12V και το άλλο

KRAS

καθεστώς άγριου tpye. Αυτά τα δύο ασύμφωνα δείγματα DNA παραπέμφθηκαν TheraScreen® δοκιμές KRAS. Δυστυχώς, η ανάλυση απέτυχε επειδή δεν υπάρχουν κορυφές ήταν ανιχνεύσιμα. Για την εκ νέου δοκιμή δεν επαρκή ποσότητα DNA ήταν διαθέσιμο.

Λόγω της υψηλής υποχώρησης του όγκου που προκαλείται από την προεγχειρητική CRT η εντός του όγκου ετερογένεια στα χειρουργικά δείγμα θα μπορούσε να αξιολογηθεί μόνο σε ένα υποσύνολο 12 ασθενών, για τους οποίους περισσότερο από ένα τετράγωνο που φέρει τον όγκο ήταν διαθέσιμη (κατά μέσο όρο 4,2 μονάδες /ασθενή). Σε 6 από τους 12 ασθενείς βρήκαμε ένα ομοιογενές

KRAS

καθεστώς σύγκριση τουλάχιστον δύο μπλοκ χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Snapshot ™. Στις άλλες 6 ασθενείς ανιχνεύσαμε αντιφατικά αποτελέσματα για το

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης (Πίνακας 3). Μετά από επαναξιολόγηση με το TheraScreen®

KRAS

δοκιμή θα μπορούσαμε και πάλι να επιβεβαιώσει ακριβώς που

KRAS

μεταλλάξεις, οι οποίες διαπιστώθηκαν στην προηγούμενη βιοψία από τη δοκιμασία στιγμιότυπο ™. Μετά την διόρθωση των ασύμφωνα στοιχεία όλα τα τμήματα του όγκου έδειξε ένα ομοιογενές

KRAS

κατάσταση.

Η

Συζήτηση

Καθώς το κύριο αποτέλεσμα αυτής της μελέτης στον καρκίνο του ορθού φαίνεται να υπάρχει δεν μπορεί να είναι εμφανής ετερογένεια στο

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης. Αυτό ισχύει για τα δείγματα που λαμβάνονται από όγκους στην ίδια περίσταση και για τα δείγματα εξακριβωθεί πριν και μετά την CRT. Η ανάλυση αυτή βασίζεται σε ένα υψηλό αριθμό προ- και posttherapeutic δειγμάτων και ως εκ τούτου αντιπροσωπεύει ένα σπάνιο σύνολο δεδομένων. Δεδομένης μιας ευαίσθητη μέθοδο ανίχνευσης σε σχέση με τα ποσά των βιώσιμων κυττάρων του όγκου, προσδιορισμός του

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης μπορεί να διεξαχθεί με αξιοπιστία σε δείγματα όγκων της προ-θεραπευτικής βιοψία λαμβάνεται στην πρωκτοσκόπηση δείκτη καθώς στην εκτομή δείγματα μετά την εισαγωγική χημειοραδιοθεραπεία. Όσον αφορά στα προ-θεραπευτικά δείγματα αφελές για την ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία ο προσδιορισμός στιγμιότυπο ™ φαίνεται να παρέχει ένα αξιόπιστο εργαλείο ανίχνευσης, ιδίως αν οι πολλαπλές βιοψίες αναλύθηκαν για να ελαχιστοποιηθεί ο κίνδυνος ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων. Οι συνολικοί αριθμοί του

KRAS

-mutated όγκοι στα προ-θεραπευτικά βιοψίες του 43% (20/47) αντιστοιχούν λίγο πολύ τα τρέχοντα δεδομένα της βιβλιογραφίας σε αυτό το θέμα. Επιπλέον, η κατανομή των απλές μεταλλάξεις που παρατηρήθηκε ήταν επίσης πολύ σύμφωνη με ότι μέχρι τώρα αναφερθεί [25, 26]. Αυτό μας κάνει την πεποίθηση ότι η δοκιμασία στιγμιότυπο ™ παράγει αξιόπιστα αποτελέσματα στα προ-θεραπευτικά δείγματα, δηλαδή όταν υπάρχει επαρκής αριθμός των βιώσιμων κυττάρων του όγκου είναι παρόντες. Όσον αφορά τα δείγματα που λαμβάνονται κατά χημειοραδιοθεραπεία, η μελέτη μας δείχνει ότι πρέπει να προτιμηθεί μια ιδιαίτερη ευαίσθητη μέθοδος, όπως το FDA-εγκεκριμένο κιτ Pyro TheraScreen®.

Τα αποτελέσματά μας ευρήματα υποστήριξη από Ondrejka et al. [14] ο οποίος δεν βρήκε καμία διαφορά όταν το

KRAS

κατάσταση σε 17 ασθενείς με καρκίνο του ορθού αξιολογήθηκε πριν και μετά την εισαγωγική CRT. Τα πρώτα αποτελέσματα της αλληλούχισης επόμενης γενιάς και ποσοτικές αναλύσεις δείχνουν

KRAS

μεταλλάξεις στη συντριπτική πλειονότητα των νεοπλασματικών κυττάρων [27]. Σε μια μελέτη που δημοσιεύθηκε πρόσφατα από δήμους et al. [15] σε δύο από τους 25 ασθενείς σε αντιφατικά

KRAS

κατάσταση σε δείγματα που λαμβάνονται πριν και μετά τη θεραπεία ανιχνεύθηκε. Δεδομένου ότι οι δύο τεχνικές που εφαρμόζονται (αλληλουχίας και Snapshot ™) είναι πολύ σχετικές, μπορεί να υποτεθεί ότι η ευαισθησία στην εν λόγω μελέτη ήταν συγκρίσιμη με την τεχνική Στιγμιότυπο ™ της μελέτης μας και μπορεί να έχουν αποτύχει να εντοπίσει μεταλλάξεις σε εξαιρετικά υποβαθμισμένη δείγματα. Η υπόθεση αυτή είναι σύμφωνη με Boissière-Michot et al. [16] ο οποίος πρόσφατα επεσήμανε ότι ειδικά στον καρκίνο του ορθού μετά από CRT ψευδώς αρνητικά την ανίχνευση του

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης αντιπροσωπεύει ένα σχετικό πρόβλημα ενδέχεται να οδηγήσει σε σοβαρή αμέλεια. Αυτό αναφέρεται σε τεχνικά θέματα ως δεύτερο σημαντικό αποτέλεσμα αυτής της μελέτης.

Ενώ η δοκιμασία στιγμιότυπο ™ φαίνεται να έχουν μια καλή ευαισθησία για την ανίχνευση

KRAS

μεταλλάξεις σε βιώσιμους ιστούς (δηλαδή προ-θεραπευτική βιοψίες ) αυτή η τεχνική δεν ανιχνεύει επαρκώς μεταλλαγμένο τόπους κατά εισαγωγική CRT. Η πιο πιθανή εξήγηση είναι ένα τεράστιο θεραπεία-προκάλεσε διάσπαση των καρκινικών κυττάρων. Φλεγμονώδεις και στρωματικά αντιδράσεις οδηγήσει σε σημαντική αύξηση των μη μεταλλαγμένων κυττάρων στην περιοχή του όγκου έτσι «αραίωση» των υπόλοιπων κακοήθη κύτταρα. Ωστόσο, η εφαρμογή ενός ιδιαίτερα ευαίσθητη τεχνική για την ανάλυση μετάλλαξης αποκάλυψε τα λανθασμένα παρατηρούμενες αλλαγές. Αυτό είναι σύμφωνα με μια μελέτη από Gonzalez de Castro D et al. που έχουν σχέση με την ευαισθησία της αλληλουχίας Sanger, επί των οποίων είναι στην πραγματικότητα βασίζεται η τεχνική στιγμιότυπο ™, με Cobas, TheraScreen και μαζική παράλληλη Pyrosequencing [28] Σε περίπτωση χαμηλής κλάσματα του μεταλλαγμένου DNA της αλληλουχίας Sanger ήταν λιγότερο ευαίσθητη από τις άλλες μεθόδους έρευνας.

Boissière-Michot et al. [16] πρότεινε ότι υψηλότερη ευαισθησία μπορεί να επιτευχθεί με μικροδιατομής λέιζερ και τη χρήση της δοκιμασίας TheraScreen®. Στην παρούσα μελέτη μπορούμε να δείξουμε ότι εγχειρίδιο μικροδιατομής φαίνεται να είναι επαρκής για να συγκεντρωθούν επαρκείς ποσότητες των καρκινικών κυττάρων για ανάλυση DNA. Αυτό μπορεί να είναι σχετική για την κλινική πρακτική ειδικά σε λιγότερο εξειδικευμένα κέντρα όπου μικροδιατομής λέιζερ του ιστού του όγκου δεν είναι συχνά διαθέσιμα.

Όπως επισημαίνεται δεδομένα για

KRAS

δοκιμή κατάσταση είναι ακόμα σπάνιο να εκτιμηθεί η πραγματική ποσοστό ασύμφωνα περιπτώσεις. Με την προσθήκη του στο παρόν μεγαλύτερη ομάδα ασθενών και αναλύει το

KRAS

κατάσταση σε διάφορες προ-θεραπευτική βιοψίες από τον ίδιο όγκο μπορούμε να προσθέσουμε επιπλέον εμπιστοσύνη στην κλινική πρακτική του

KRAS

δοκιμές στον καρκίνο του ορθού. Επιπλέον, συμφωνούμε με Boissière-Michot et al. [16] ότι ο τύπος της τεχνικής που χρησιμοποιείται για τη δοκιμή πρέπει να εκτελείται σύμφωνα με τις διαθέσιμες ιστό του όγκου και οικονομικούς πόρους που είναι σημαντικές αν η αρχική καρκινικός ιστός είναι από μικρή ποσότητα ή την ποιότητα. Αυτό είναι σημαντικό, καθώς οι ασθενείς που λαμβάνουν αντι-EGFR θεραπείας με ένα

KRAS

μετάλλαξη πάσχουν από περιττές παρενέργειες [29].

Συμπεράσματα

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν το αξιόπιστη εκτίμηση του

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης για θεραπευτικές αποφάσεις σε προ-θεραπευτική βιοψίες, καθώς και σε μετα-θεραπευτική υπολειμματικού ιστού όγκου. Ασυμφωνία μπορεί να είναι ένα πολύ σπάνιο γεγονός και είναι πρακτικά ignorable. Η δοκιμασία Snapshot ™ μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποδοτικά για την ανάλυση μεταλλάξεων των δειγμάτων όγκου με υψηλή περιεκτικότητα σε καρκινικό κύτταρο, ενώ πιο ευαίσθητα και ακριβά τεστ θα πρέπει να προορίζεται για ασαφή περιπτώσεις και για δείγματα με χαμηλή ποσότητα των καρκινικών κυττάρων, όπως αυτές μετά την CRT.