έχουν

Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) έχει αποδειχθεί ότι συμμετέχουν σε πολλές σημαντικές κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων ραδιοευαισθητοποίηση. οικογένειας VEGF, ένας σημαντικός ρυθμιστής της αγγειογένεσης, παίζει επίσης έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση του καρκινικού κυττάρου ραδιοευαισθησία. VEGFR2 μεσολαβεί τις κύριες δράσεις ανάπτυξης και της διαπερατότητας του VEGF σε ένα παρακρινή /αυτοκρινή τρόπο. MiR-200C, στο πλέγμα των επιθηλιακών-μεσεγχυματικών μετάβασης (EMT), προβλέπεται να στοχεύσετε VEGFR2. Ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι να ελεγχθεί η υπόθεση ότι η ρύθμιση του VEGFR2 μονοπατιού από miR-200c θα μπορούσε να διαμορφώσει την ακτινοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων. Βιοπληροφορική ανάλυση, λουσιφεράση δοκιμασίες ρεπόρτερ και βιοχημικές δοκιμασίες διεξήχθησαν για την επικύρωση VEGFR2 ως άμεσο στόχο miR-200c. Οι επιδράσεις της ραδιοευαισθητοποίησης miR-200c επί κυττάρων Α549 προσδιορίστηκαν με κλωνογόνο δοκιμασίες. Ο μεταγενέστερος μηχανισμός ρύθμισης του miR-200c εξερευνήθηκε με αναλύσεις western αποτύπωση, FCM, δοκιμασίες σχηματισμού σωλήνα και δοκιμασίες μετανάστευσης. Εντοπίσαμε VEGFR2 ως νέο στόχο του miR-200c. Η έκτοπη miR-200c αύξησε την ραδιοευαισθησία των Α549, ενώ miR-200c κάτω ρύθμιση μειώθηκε. Εκτός αυτού, έχουμε αποδείξει ότι miR-200c radiosensitized Α549 κύτταρα με τη στόχευση VEGF-VEGFR2 μονοπάτι ειδικά, οδηγώντας έτσι σε αναστολή της κατάντη προ-επιβίωσης μεταγωγής και αγγειογένεση σηματοδότηση της, και χρησιμεύει ως ένας πιθανός στόχος για την έρευνα radiosensitizition.

Παράθεση: Shi L, Zhang S, Wu Η Zhang L, Dai Χ, Χου J, et al. (2013) MiR-200c Αυξάνει την ραδιοευαισθησία του καρκίνου του πνεύμονα μη-μικροκυτταρικό κυτταρική γραμμή Α549 με τη στόχευση VEGF-VEGFR2 Pathway. PLoS ONE 8 (10): e78344. doi: 10.1371 /journal.pone.0078344

Επιμέλεια: Junming Yue, Το Πανεπιστήμιο του Τενεσί Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 του Ιούλη του 2013? Αποδεκτές: 11 του Σεπτέμβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 30 του Οκτώβρη 2013

Copyright: © 2013 Shi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από έργο Hubei Provincial Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (No: 2009CDA061). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι ασθενείς που έπασχαν από καρκίνο του πνεύμονα μη μικρών κυττάρων (NSCLC) αντιπροσωπεύουν περίπου το 85% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα [1], [2]. Ακτινοθεραπεία (RT) είναι ένα ισχυρό τροπικότητα χρησιμοποιούνται ευρέως στην κλινική κατά των καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, πολλοί από αυτούς εμφανίζουν εγγενή ή επίκτητη ραδιοαντοχή σε RT που οδηγεί σε αποτυχία της θεραπείας [3]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι είναι ραδιοαντοχή όχι μόνο από τα εγγενή χαρακτηριστικά αλλά αποτέλεσμα των αλληλεπιδράσεων μεταξύ καρκινικών κυττάρων και μικροπεριβάλλοντος παράγοντες. Η παρακρινής /αυτοκρινής ρόλο του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) με σύνδεση προς τους υποδοχείς της είναι μία σημαντική συνιστώσα της μικροπεριβάλλον του όγκου και αυτορύθμιση της. Η καταστολή της έκφρασης του γονιδίου του VEGF θα μπορούσε να ενισχύσει τη ραδιοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων [4], [5]. Και VEGFR2 θεωρείται συνήθως ότι μεσολαβεί την κύρια λειτουργία που αποδίδεται σε VEGF. Η θεραπεία ακτινοβολίας σε συνδυασμό με VEGFR2 και αποκλεισμό EGFR προκάλεσε σημαντική αύξηση της αντικαρκινικά αποτελέσματα σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα [6]. Μοριακή αναστολή VEGFR2 θα μπορούσε να ενισχύσει απόκριση ακτινοβολία του όγκου μέσω μοριακών στόχευση αγγείωσης του όγκου [7]. Έτσι παρακρινής σηματοδότηση από τον VEGF υποδοχής των καρκινικών κυττάρων VEGFR2 μπορεί να είναι μια σημαντική συνιστώσα της RT αποτυχίες [8].

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια ομάδα μικρών μη-κωδικοποίησης RNAs που καταστέλλουν την έκφραση του στόχου τους μέσω σύνδεσης με το 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (3’UTR). Μια μελέτη που προσδιορίζονται πνεύμονα ειδικά miRNAs αρουραίος από miRNA μικροσυστοιχιών αποκάλυψε ότι το miR-200c εκφράζονται ειδικά σε φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων αρουραίων [9]. Και η απώλεια της έκφρασης miR-200c θα μπορούσε να προκαλέσει μια επιθετική, επεμβατική και χημειοθεραπεία φαινότυπο στον καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρών κυττάρων [10]. Εκτός αυτού, ανεξάρτητες μελέτες έδειξαν ότι η αποκατάσταση του miR-200c θα μπορούσε να αυξήσει την ευαισθησία σε παράγοντες χημειοθεραπείας σε διάφορους όγκους [11], [12]. Έτσι κάνει miR-200c παίζουν παρόμοιο ρόλο στην ακτινοθεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου;

βιοπληροφορική ανάλυση έδειξε ότι VEGFR2 ήταν μια καλή προβλεπόμενο στόχο του miR-200c με δύο θέσεις πρόσδεσης. Σε αυτό το πείραμα, ερευνήσαμε αν VEGFR2 θα μπορούσε να ρυθμιστεί με miR-200c, που οδηγεί στην διαμόρφωση της radiosentivitiy των κυττάρων Α549.

Αποτελέσματα

VEGFR2 είναι ένας άμεσος στόχος του miR-200c

ανάλυση έδειξε ότι Bioinformatic VEGFR2 (παράγοντας υποδοχέα αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού 2) είναι ένα προβλεπόμενο στόχο του miR-200c η οποία μπορεί να αναστέλλουν άμεσα έκφραση γονιδίου του (Εικ. 1Α). κύτταρα Α549 επιμολύνονται με μιμείται miR-200c (50 nM) ή αναστολείς miR-200c (100 ναυτικών μιλίων) για να αυξήσετε ή να μειώσετε την έκφραση του miR-200c. Μιμείται ελέγχους (50 ηΜ) ή αναστολείς μάρτυρες (100 ηΜ) διαμολύνθηκαν σε κύτταρα Α549 ως αρνητικοί έλεγχοι αντίστοιχα. Realtime PCR έδειξε ότι μιμείται miR-200c και αναστολείς miR-200c θα μπορούσε να αυξήσει σημαντικά ή να μειώσουν την έκφραση του miR-200c του Α549 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αν miR-200c θα μπορούσε να συνδεθεί άμεσα με 3’UTR του VEGFR2, θα πραγματοποιηθεί διπλή δοκιμασία λουσιφεράσης γονιδίου αναφοράς χρησιμοποιώντας pLuc-VEGFR2-3’UTR πλασμιδίου σε κύτταρα Α549. Παροδική διαμόλυνση των Α549 κυττάρων με pLuc-VEGFR2-3’UTR πλασμιδίου και μιμείται miR-200c οδήγησε σε σημαντική μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 1Β). Για να εξεταστεί εάν miR-200c θα μπορούσαν να επηρεάσουν την έκφραση της πρωτεΐνης VEGFR2 σε κύτταρα Α549, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς δυτική μπουλόνι και διαπίστωσε ότι μιμείται miR-200c μείωσε την πρωτεΐνη έκφραση του Α549 σημαντικά σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 1 C).

κατάλοιπα στο σημείο-στόχο (Α) miR-200c σε 3′-UTR του γονιδίου VEGFR2 επιθεωρούνται από βιοπληροφορικής. (Β) Το κατασκεύασμα pLuc-VEGFR2-3’UTR περιέχει μία αλληλουχία άγριου τύπου του 3’UTR του VEGFR2. Το κατασκεύασμα pLuc-VEGFR2-3’UTR συν-επιμολύνθηκε με μιμείται miR-200c σε κύτταρα Α549. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ανιχνεύθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Και ο λόγος της κανονικοποιημένη τιμή λουσιφεράσης εμφανίζεται. έκφραση της πρωτεΐνης (C) VEGFR2 σε κύτταρα Α549 μετρήθηκαν με κηλίδα western 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Τα τυπικά σφάλματα του μέσου δείχνεται με μπάρες σφάλματος. * Υποδηλώνει p Su1498 είναι ένας αναστολέας τυροσινικής κινάσης ειδικό για VEGFR2. Βρήκαμε ότι το miR-200c δεν θα μπορούσε να ραδιοευαισθητοποιεί Α549, ενώ VEGFR2 ανεστάλη από su1498. Δεδομένου ότι ο VEGF είναι ο κύριος συνδετήρας του VEGFR2 λειτούργησε σε ένα παρακρινή /αυτοκρινή τρόπο, εξετάσαμε πρώτη παραλλαγή της έκκρισης VEGF μετά από επιμόλυνση miR-200c και διαπίστωσε ότι μιμείται miR-200c δεν θα μπορούσε να επηρεάσει VEGF έκκριση της Α549. Τότε θα εξουδετερωθεί εκκρινόμενη VEGF έξω από τα κύτταρα Α549 με bevacizumab πριν από την επιμόλυνση του miR-200c, και πήρε ένα αρνητικό αποτέλεσμα ακριβώς όπως η αναστολή VEGFR2. Έτσι, αυτό δείχνει ότι το miR-200c θα μπορούσε ραδιοευαισθητοποιεί κύτταρα Α549 με τη στόχευση VEGF-VEGFR2 οδού.

Στη συνέχεια διερευνήθηκε περαιτέρω κατάντη μηχανισμούς miR-200c ραδιοευαισθητοποίηση. ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ σηματοδότηση /ΑΚΤ οδούς μεταγωγής είναι δύο σημαντικά καθοδικά μονοπάτια σηματοδότησης του VEGFR2 [19]. Άμεση στόχευση και την αναστολή αυτών των δύο οδών μπορεί να αυξήσει ραδιοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων. Η φωσφορυλίωση του ρ44 /42 ΜΑΡΚ-(Thr202 /Tyr204) και Akt (Ser473), που είναι βασικά μόρια ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ /ΑΚΤ μονοπατιών σηματοδότησης, συνήθως αυξάνει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων μετά την ακτινοβολία. Στη μελέτη μας, έγιναν αναλύσεις κηλίδος western για να εξετάσει τις αλλαγές επιπέδου φωσφορυλίωσης της Akt και ERK1 /2 (ρ44 /42 ΜΑΡΚ) μετά tansfection της μιμείται miR-200c ή αναστολείς σε κύτταρα Α549. Βρήκαμε ότι, ενώ αυξημένη έκφραση του miR-200c οδήγησε σε αναστολή της Akt και /2 φωσφορυλίωση ERK1, μειωμένη έκφραση του miR-200c ενισχυμένη Akt και ERK1 /2 φωσφορυλίωση σε Α549.

Υποξικές μικροπεριβάλλον εξωγενή προς τα καρκινικά κύτταρα συμβάλλει σημαντικά στην ραδιοαντοχή της ακτινοθεραπείας [7]. Η καταστολή της αγγειογένεσης ενίσχυσε σημαντικά ραδιοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων. Και VEGFR2, κύριος μεσολαβητής της αγγειογένεσης, μπορεί να επηρεάσει την μικροπεριβάλλον του όγκου (ΤΜΕ) που ρυθμίζουν καρκινικών κυττάρων ραδιοευαισθησία. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η έκτοπη έκφραση του miR-200c καταστέλλεται αγγειογένεση των κυττάρων HUVEC.

Εκτός αυτού, ερευνήσαμε και άλλοι μηχανισμοί αλληλεπίδρασης miR-200c-VEGFR2. Με FCM ή ΜΤΤ δοκιμασίες βρήκαμε σημαντικές επιδράσεις της miR-200c επί του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση ή πολλαπλασιασμό κυττάρων Α549 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miR-200c μεσολάβηση της αναστολής του καταρράκτη VEGF-VEGFR2 σηματοδότησης θα μπορούσε ραδιοευαισθητοποιεί ανθρώπινο NSCLC κύτταρα κυτταρικής σειράς Α549 σε ακτινοβολία, η οποία είναι ένας θεραπευτικός στόχος της ραδιοευαισθητοποίησης.

Συμπεράσματα

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι το miR-200c θα μπορούσε σημαντικά ραδιοευαισθητοποιεί Α549 κύτταρα με τη στόχευση VEGF-VEGFR2 οδού.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Α549 κύτταρα, που λαμβάνονται από την Τράπεζα κυττάρων της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα), καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. HUVEC κύτταρα από την American Type Culture Collection (ATCC) καλλιεργήθηκαν σε μέσο ενδοθηλιακών κυττάρων (ECM? Sciencell, USA). Το μέσο καλλιέργειας ανανεώθηκε κάθε 2-3 ημέρες. Και τα κύτταρα διαβιβάστηκαν σε 1:06 κάθε 4 ημέρες μετά θρυψινοποίηση με 0,05% θρυψίνη-ΕϋΤΑ.

παροδική επιμόλυνση κυττάρων και θεραπείες

μιμείται MiR-200c, αναστολείς miR-200c, Si- VEGFR2, μιμείται τους ελέγχους, οι αναστολείς των ελέγχων, και siRNA έλεγχοι συντέθηκαν από Ribobio (Guangzhou, PR China). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 4 Χ 10

5 ανά κύτταρο σε πλάκες 6-φρεατίων μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση. Lipofectamine αντιδραστήριο 2000 (Invitrogen) διαμόλυνση χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση κυττάρων με μιμείται miR-200c (50 ηΜ), αναστολείς miR-200c (100 ηΜ) ή VEGFR2 μικρό παρεμβαλλόμενο (SI) RNA (100 ηΜ). Δεν στόχευση μιμείται ελέγχους (50 ηΜ), αναστολείς μάρτυρες (100 ηΜ) ή τους ελέγχους siRNA (100 ηΜ) διαμολύνθηκαν σε κύτταρα ως αρνητικός έλεγχος, αντίστοιχα. 6 ώρες μετά την επιμόλυνση, το μέσο ανάπτυξης των κυττάρων απομακρύνθηκε και επωάστηκαν σε μέσα που περιέχουν 5% FBS για άλλες 24-72 ώρες. Περαιτέρω πειράματα διεξήχθησαν με επιμολυσμένα κύτταρα ή κυτταρική λύση. Su1498 (Santa Cruz Biotechnology) ή Bevacizumab (Roche) χορηγήθηκε 60 λεπτά πριν την επιμόλυνση.

Αναγνώριση Στόχων miR-200c

Χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen), κύτταρα Α549 επιμολύνονται με ανταποκριτή λουσιφεράσης κατασκευάσματα που περιέχουν την 3’UTR του VEGFR2 ή των αρνητικών φορείς ελέγχου (Promega). Τα μίγματα επιμόλυνσης περιείχαν 100 ng fireflyluciferase πλασμιδίου αναφοράς και 50 nM συνθετικών miR-200c διπλής όψης. Α549 κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, και η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα διπλής Luciferase Reporter Assay (Promega).

κλωνογονική δοκιμασία

ευαισθησία των κυττάρων Α549 σε ακτινοβόληση προσδιορίσθηκε με κλωνογόνο προσδιορισμό μετά τις μεταβλητές δόσεις ακτινοβολίας (0Gy, 2Gy, 4Gy, 6Gy, 8 Gy) χρησιμοποιώντας ένα γραμμικό επιταχυντή (Primus Κ, η Siemens, το Μόναχο, Μπάγερν, Γερμανία). Μετά από επώαση για 10-14 ημέρες, οι αποικίες που σχηματίστηκαν σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με 1% κρυσταλλικό ιώδες. Μόνο οι αποικίες που αποτελούνται από περισσότερα από 50 κύτταρα μετρήθηκαν. Τα δεδομένα προσαρμόστηκαν σε γραμμική-τετραγωνική μοντέλο χρησιμοποιώντας Sigmaplot λογισμικού, όπου οι καμπύλες επιβίωσης δημιουργήθηκαν και οι παράμετροι ραδιοευαισθησία υπολογίστηκαν. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές

Μέτρηση του VEGF Level

Το επίπεδο της VEGF secreation από κύτταρα Α549 αξιολογήθηκε από ανθρώπινα κιτ VEGF-ELISA (R &? Α, USA). Σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή .

Western Blotting

Cells λύσης παρασκευάστηκαν και διαχωρίστηκαν με 8-12% SDS-PAGE, ακολουθούμενη από μεταφορά σε μεμβράνες PVDF (Millipore). Για την ανίχνευση, οι μεμβράνες επωάστηκαν με ειδικά πρωτογενή αντισώματα και δευτερογενή αντισώματα διαδοχικά. Πρωτογενή αντισώματα εναντίον VEGFR2 ή β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. Πρωτογενή αντισώματα εναντίον ρ-ERK1 /2 και p-Akt αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling. αντίσωμα ERK1 /2 και της Akt αντίσωμα αγοράστηκαν από Proteintech. ζώνες πρωτεϊνών αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια σε ταινίες ή με απεικόνιση φθορισμού.

Tube Δοκιμασία Σχηματισμού και κυττάρων Μετανάστευση Δοκιμασία

Για την δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα, 1 × 10

4 κύτταρα HUVEC σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων που είχαν προ-επικαλυφθεί με 50 μL /φρεάτιο Matrigel (BD Biosciences) και επωάστηκαν στους 37 ° C. Περίπου 16 ώρες αργότερα, τριχοειδείς σωλήνες σχηματίζονται αξιολογήθηκαν σε τυχαία πεδία. Για δοκιμασία μετανάστευσης, παρενέβη κύτταρα HUVEC προστέθηκαν στον ανώτερο θάλαμο των πλακών μέγεθος πόρων 24 φρεατίων transwell 8,0-mm (Millipore). Η κάτω θάλαμος γέμισε με πλήρες μέσο ανάπτυξης ως χημειοελκτικό. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 24 ώρες, τα κύτταρα επί της άνω επιφάνειας της μεμβράνης αφαιρέθηκαν. Τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0.5% crystal violet ρυθμιστικό για περίπου 20 λεπτά. Οι μετρήθηκαν τιμές των τυχαίων πεδίων κάτω από ένα μικροσκόπιο αναλύθηκαν στατιστικά.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD και στατιστικά αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

test του Student. P τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

.