Αφηρημένο

Το DEAD κουτί RNA ελικάση ρ68 (Ddx5) είναι ένα σημαντικό υποδοχέα ανδρογόνων (AR) μεταγραφικού συν-ενεργοποιητή στον καρκίνο του προστάτη (PCA) και υπερεκφράζεται σε νόσο προχωρημένο στάδιο. β-κατενίνη είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη με σημαντικές δομικές και σηματοδότησης λειτουργίες που είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε PCa και παρόμοια με ρ68, αλληλεπιδρά με το AR να συν-ενεργοποίηση της έκφρασης των γονιδίων στόχων AR. Σημαντικά, ρ68 σχηματίζει σύμπλοκα με πυρηνικά β-κατενίνης και προάγει τη μεταγραφή γονιδίων στον καρκίνο του παχέος εντέρου που δείχνει μία λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο πρωτεϊνών σε εξέλιξη του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνούμε τη σχέση ρ68 και β-κατενίνης της ΣΕΣΣ με την εκτίμηση της πιθανής συνεργασίας τους στην έκφραση γονιδίων AR-εξαρτώμενη, η οποία μπορεί να έχει σημασία για την ανάπτυξη του καρκίνου του ανθεκτικού ευνουχισμού προστάτη (CRPCa). Χρησιμοποιούμε ανοσοκατακρήμνιση να αποδείξουν μια νέα αλληλεπίδραση μεταξύ ρ68 και β-κατενίνη στον πυρήνα των κυττάρων προστάτη, η οποία εξαρτάται σε κύτταρα LNCaP αλλά ανδρογόνο ανεξάρτητος σε ένα πυρίμαχο παράγωγο ορμόνη της ίδιας κυτταρικής γραμμής (αντιπροσωπευτικό του τύπου νόσου CRPCa) ανδρογόνων. Ενισχυμένη δραστικότητα AR παρατηρείται σε ανιχνεύσεις αναφοράς λουσιφεράσης ανδρογόνο εξαρτάται από παροδική συν-επιμόλυνση των ρ68 και β-κατενίνης ως προσθετική δράση, και ρ68-εξαντλημένο χρωματίνης-ανοσοκατακρήμνιση (μάρκας) έδειξε μία μείωση στην πρόσληψη του AR και β- κατενίνης σε ανδρογόνα περιοχές ανταποκρίνεται υποκινητή. Επιπλέον, βρήκαμε ρ68 ανοσοκαταβυθίστηκαν με το επεξεργαστικό και μη-επεξεργαστικό μορφή RNA πολυμεράσης II (RNAP II) και δείχνουν ρ68 προσλαμβάνονται σε επιμήκυνση περιοχές του AR μεσολάβηση

PSA

γονίδιο, υποδηλώνοντας ένα ρόλο για ρ68 στη διευκόλυνση RNAP ΙΙ μεταγραφή AR μεσολάβηση γονιδίων. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ρ68 είναι σημαντική για τη διευκόλυνση της β-κατενίνης και AR μεταγραφική δραστηριότητα στα κύτταρα του προστάτη

Παράθεση:. Clark EL, Χατζημιχαήλ C, Temperley R, Barnard Α, Fuller-Pace FV, Robson ΣΟ (2013) P68 /DdX5 υποστηρίζει β-κατενίνης Δ ή β-κατενίνης Ε Φ Γ & amp? H. αντισώματα (συμπεριλαμβανομένης μιας IgG αντίσωμα ελέγχου). Ανακτημένο υλικό υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τη δοκιμασία chip και προσλήψεων στο

PSA

ΕΙΝΑΙ Ι (Α & amp? Ε), ΕΙΝΑΙ ΙΙΙ (Β & amp? F),

KLK2

(C & amp? G) & amp?

TMPRSS2

(D & amp? Η) περιοχές υποκινητών αξιολογούνται σε σχέση με το μηδέν λεπτό χρονικό σημείο. εξάντληση ρ68 στα κύτταρα LNCaP έδειξε μειωμένη AR & amp? β-κατενίνης πρόσληψης μετά την αγωγή με 10 ηΜ R1881 για 90 λεπτά σε όλες τις περιοχές αξιολογείται σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (NS) siRNA. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν η = 3 ανεξάρτητα πειράματα (+/- SD). Η ανεξάρτητη δείγμα

t

test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις διαφορές στα επίπεδα έκφρασης και δείχνουν σημασία.

Η

ρ68 και β-κατενίνης προσθετικά Βελτιώστε την μεταγραφική δραστηριότητα των ανδρογόνων υποδοχέων γονιδίων που ρυθμίζονται

Δεδομένου ότι ρ68 και β-κατενίνης αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα του προστάτη και ρ68 διευκολύνει την πρόσληψη της β-κατενίνης σε ανδρογόνων ανταποκρίνεται υποκινητές γονιδίων. Εμείς επιλέξαμε δίπλα για να διερευνήσει τη συνδυασμένη επίδραση της ταυτόχρονης έκφρασης των ρ68 και β-κατενίνη στην μεταγραφική δραστικότητα του AR χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς αναφοράς λουσιφεράσης εξαρτώμενων από ανδρογόνα σε κύτταρα COS-7. Η AR-μεσολάβηση p (ARE)

3 Luc δημοσιογράφος είχε σθεναρά διεγείρεται 2 φορές από την AR κατά R1881 (10 nM) θεραπεία ανδρογόνων (Σχήμα 5, συγκρίνετε ανοιχτό γκρι μπάρα + R1881 και σκούρο γκρι γραμμή -R1881). Υπερ-έκφραση του β-κατενίνης έδειξαν αμελητέα p (ARE)

3 Luc δραστηριότητα ρεπόρτερ υπό την παρουσία ή απουσία R1881 αποδεικνύοντας ότι η β-κατενίνη δεν επηρεάζει άμεσα p (ARE)

3 δραστηριότητα ανταποκριτή Luc απουσία του AR. Ωστόσο, η συν-έκφραση της AR και β-κατενίνης έδειξαν αύξηση 8 φορές σε ρ (ARE)

3 Luc δραστηριότητα ανταποκριτή κατά την αγωγή R1881, επιβεβαιώνοντας β-κατενίνης ως συν-ενεργοποιητής του AR συνεπές με προηγούμενα ευρήματα [28 ]. Ομοίως, η συν-έκφραση της ρ68 AR και έδειξε μία αύξηση κατά 5 φορές σε ρ (ARE)

3 Luc δραστηριότητα ανταποκριτή μετά τη θεραπεία R1881, επιβεβαιώνοντας επίσης ρ68 ως συν-ενεργοποιητής του AR συνεπές με προηγούμενα ευρήματα. (Ν.Β. ρ68 έχει αποδειχθεί ότι δεν επηρεάζουν p (ARE)

3 δραστηριότητα ρεπόρτερ Luc άμεσα με την απουσία του AR [21]). Ωστόσο, συν-έκφραση του AR, β-κατενίνης και κατασκευάσματα ρ68 έδειξαν σημαντική 18 φορές (

p & lt?

0,0011 **

)

αύξηση p (ARE)

3 Luc δημοσιογράφος δραστικότητα κατά την αγωγή R1881, 10 φορές υψηλότερη από ό, τι AR και β-κατενίνης συν-έκφραση, αποδεικνύοντας ρ68 έχει σημαντική επίδραση στην προσθετικό AR και β-κατενίνης μεταγραφική δραστηριότητα. Αυτό παρατηρήθηκε επίσης με ένα άλλο ανδρογόνο ρυθμίζονται

PSA

αναφοράς λουσιφεράσης υποκινητή (ρ (PSA) Luc), σύμφωνα με την οποία συν-έκφραση του AR, β-κατενίνης και κατασκευάσματα ρ68 έδειξαν σημαντική 8 φορές (

ρ

& lt? 0,0057 **) αύξηση της δραστηριότητας ρεπόρτερ, 5 φορές υψηλότερη από ό, τι AR και β-κατενίνης συν-έκφραση, επιβεβαιώνοντας την αθροιστική επίδραση των ρ68 επί β-κατενίνης και Ar μεταγραφική δραστηριότητα (βλέπε πληροφορίες υποστήριξης, Σχήμα S2). ρ68 έχει αναφερθεί ότι σχηματίζει ετεροδιμερή με τον πολύ ομόλογες ελικάση ρ72 (DdX17), και συν-ενεργοποίηση β-κατενίνης μεσολαβεί γονιδιακή έκφραση προηγουμένως [23]. Βρήκαμε ότι η συν-επιμόλυνση AR, β-κατενίνης και κατασκευάσματα ρ72 δεν είχαν σημαντική πρόσθετη επίδραση επί p (ARE)

3 δραστηριότητα ανταποκριτή Luc σε σύγκριση με συν-επιμόλυνση των AR, β-κατενίνης και κατασκευάσματα ρ68 (βλέπε πληροφορίες υποστήριξης, Σχήμα S3

σ

= 0,3646). Αυτό είναι παρόμοιο με μια προηγούμενη αναφορά που βρήκε ρ72 δεν ήταν σε θέση να ενισχύουν τη δραστηριότητα μεταγραφικής AR της ρ (ARE)

3 Luc ανταποκριτή [21], και προτείνει μια ειδικότητα για ρ68 στην μεταγραφική ενεργοποίηση του AR σε PCa. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν β-κατενίνης και ρ68 μπορούν να εργαστούν από κοινού ως συν-ενεργοποιητές για την ενίσχυση της AR ρυθμιζόμενη μεταγραφή.

COS-7 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα εις τριπλούν με p (ARE)

3Luc δημοσιογράφος και ρΟΜν β-γαλακτοσιδάση πλασμίδια μαζί με φορείς έκφρασης θηλαστικών για AR, β-κατενίνης και ρ68 (+/- 10 ηΜ R1881). Η δραστικότητα λουσιφεράσης διορθώθηκε για την αντίστοιχη δραστηριότητα β-γαλακτοσιδάσης για να δώσει σχετική δραστηριότητα. Το φάσμα των επιπέδων πλασμίδιο (+ και ++) αντιστοιχεί σε 50 και 100 ng αντιστοίχως. Δεδομένα που παρουσιάζονται σε σχέση με τη δραστηριότητα AR μόνο (-R1881) (ορίζεται ως 1), και αντιπροσωπευτικές τουλάχιστον πειραμάτων n = 3 δοκιμασία λουσιφεράσης (+/- SE). Η ανεξάρτητη δείγμα

t

test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις διαφορές στα επίπεδα έκφρασης και δείχνουν σημασία.

Η

Συζήτηση

Στη μελέτη αυτή, περιγράφουμε μια λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ P68 , β-κατενίνης και το AR στον πυρήνα των κυττάρων του προστάτη. Η AR έχει δειχθεί να σηματοδοτήσει μέσω του μονοπατιού Wnt /β-κατενίνης σε PCa ως προσαρμογή σε επίπεδα ευνουχισμού των ανδρογόνων [12], και β-κατενίνη είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρά με άλλα συν-ενεργοποιητές του AR [32]. Εδώ παρουσιάζουμε ανοσοκατακρήμνιση, ρ68-εξαντλημένο chip και

PSA

λουσιφεράσης δεδομένων ρεπόρτερ για να επιβεβαιώσει την αλληλεπίδραση μεταξύ P68, β-κατενίνης και το AR σε κύτταρα του προστάτη. Επιβεβαιώσαμε αρχικά μια άμεση

in-vitro

αλληλεπίδραση ρ68-β-κατενίνης με παροδική διαμόλυνση των κατασκευασμάτων στην κυτταρική σειρά AR αρνητική COS-7 (το οποίο δεν ήταν εξαρτώμενη από ανδρογόνα). Ωστόσο, μετά από περαιτέρω έρευνα διαπιστώσαμε υπό ενδογενείς συνθήκες η αλληλεπίδραση ρ68-β-κατενίνης διευκολύνθηκε με την παρουσία των ανδρογόνων στην κυτταρική σειρά LNCaP PCa, αλλά αντιθέτως στο πυρίμαχο ορμόνη (LNCaP-AI) παράγωγο αυτής της κυτταρικής γραμμής (εκπρόσωπος του τον τύπο της νόσου CRPCa), η αλληλεπίδραση διευκολύνθηκε με την απουσία των ανδρογόνων. Αυτό είναι παρόμοιο με τη διαπίστωση αυξημένου σχηματισμού συμπλόκου ενδογενή AR /β-κατενίνης σε ένα ευνουχισμού ανθεκτική προστάτη ξενομοσχεύματα ποντίκι μοντέλο, όπου δεν υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ AR και β-κατενίνη ανιχνεύθηκε με την παρουσία ανδρογόνων [10]. Αυτό μπορεί να υποδεικνύει ένα προσαρμοσμένο μηχανισμό με τον οποίο ρ68 και β-κατενίνης συν-ενεργοποιητές διατηρούν συνεργατικά μεταγραφική δραστικότητα του AR (και ανδρογόνων ρυθμιζόμενα γονίδια), διευκολύνοντας κύτταρο επιβίωσης του τύπου νόσου ευνουχισμού ανθεκτικά (CRPCa). Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω εργασία για να τεκμηριώσει την πλήρη μοριακό μηχανισμό αυτού του ισχυρισμού. δεδομένα ανοσο-στυπώματος επιβεβαίωσε την κυτταρική εντόπιση του ρ68 και β-κατενίνης δεν επηρεάστηκε από ορμόνη (βρήκαμε ρ68 και β-κατενίνη στον πυρήνα των κυττάρων προστάτη τόσο παρουσία όσο και απουσία των ανδρογόνων), και

PSA

δεδομένα αναφοράς λουσιφεράσης έδειξαν συν-επιμόλυνση των ρ68 και κατασκευασμάτων β-κατενίνης είχε ένα προσθετικό αποτέλεσμα στην μεταγραφική δραστικότητα του AR σε παρουσία ανδρογόνων. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ρ68 και β-κατενίνης συνεργαστούν ως συν-ενεργοποιητές για να ενισχύσει προσθετικά την μεταγραφική δραστικότητα του AR τα οποία έχει ενδιαφέρον, μπορεί να έχει επιπτώσεις στην εξέλιξη της νόσου του τύπου CRPCa.

Δείξαμε επίσης χρησιμοποιώντας knockdown της έκφρασης ρ68 με siRNA ολιγονουκλεοτιδίων σε συνδυασμό με ChIP, ότι η ρ68 ήταν απαραίτητη για τη βέλτιστη πρόσληψη του AR και β-κατενίνης με την υποστηρικτής περιοχές των ανδρογόνων γονιδίων που ρυθμίζονται. Ανδρογόνων διέγερση διευκόλυνε την πρόσληψη του AR τόσο ΕΙΝΑΙ Ι και είναι περιοχές ΙΙΙ του

PSA

υποστηρικτής, και siRNA

KLK2

και

TMPRSS2

περιοχές υποκινητών στον έλεγχο (NS) επιμολυσμένα κύτταρα LNCaP, η οποία στη συνέχεια εξασθενημένος σε ρ68 εξαντλημένα κύτταρα. Η παρατηρούμενη β-κατενίνης πρόσληψη στις ίδιες περιοχές υποκινητή των ανδρογόνων ρυθμίζεται μειώθηκε σε ρ68 εξαντλημένο LNCaP κυττάρων κατά των ανδρογόνων θεραπεία, αλλά σε επίπεδα χαμηλότερα από τα μη κατεργασμένα κύτταρα (παρόμοια με τον έλεγχο IgG). Αυτό είναι ένα ενδιαφέρον εύρημα καθώς υποδηλώνει ότι η μείωση στην πρόσληψη β-κατενίνης στις περιοχές υποκινητή των ανδρογόνων ρυθμισμένων γονιδίων σε ρ68 εξαντλημένα κύτταρα δεν είναι απλά μια συνέπεια της λιγότερο AR διαθέσιμο για πρόσληψη, και υποδηλώνει ότι η λειτουργία ρ68 απαιτείται για να φορτίο β-κατενίνης σε μεταγραφικά ρυθμίζονται περιοχές ανδρογόνων αποκριτικών γονιδίων.

Ο ρόλος της ρ68 σε εναλλακτικό μάτισμα του mRNA είναι καλά τεκμηριωμένη (που επισκοπείται στο [19], [21], [33]). Έχουμε προηγουμένως σκεφτεί ότι ρ68 μπορεί να λειτουργήσει ως «προσαρμογέας» ή πρωτεΐνη «σύζευξης» που συντονίζει τα σφικτά ολοκληρωμένες διαδικασίες της μεταγραφής και της επεξεργασίας του RNA, διευκολύνοντας cross-talk μεταξύ μεταγραφή και επεξεργασία RNA σε AR-ρυθμιζόμενα γονίδια, ενδεχομένως με έλεγχο του ρυθμού της μεταγραφικής έναρξης /επιμήκυνση RNAP II [30]. RNAP II έχει δύο φυσιολογικώς σημαντικές θέσεις φωσφορυλίωσης στο Ο-τελικό άκρο που είναι σημαντικά για τη μετάβαση της πολυμεράσης από ένα μεταγραφικό μορφή έναρξης (φωσφορυλίωση στο ser-5), για τη δημιουργία της επιμήκυνσης της μεταγραφής σύνθετη μορφή (φωσφορυλίωση στο ser-2) . Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε χρησιμοποιώντας ενδογενή πυρηνικά εκχυλίσματα των κυττάρων LNCaP προστάτη, ότι ρ68 αλληλεπιδρά τόσο με το επεξεργαστικό (φωσφορυλίωση στο ser-2) και μη-επεξεργαστικό (φωσφορυλίωση στο ser-5) μορφή του RNAP II, υπό την παρουσία και απουσία των ανδρογόνων.