Αφηρημένο

Η μετάσταση στο ήπαρ είναι ένας κύριος παράγοντας στην παχέος θνησιμότητα από καρκίνο. Προηγούμενες μελέτες υποδεικνύουν ότι η χρόνια ψυχολογικό στρες είναι σημαντική στην εξέλιξη του καρκίνου, αλλά η επίδρασή της επί ηπατικής μετάστασης δεν έχει διερευνηθεί. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, έχουμε δημιουργήσει ένα μοντέλο μετάστασης ήπατος σε BALB /c γυμνά ποντίκια για να διερευνήσει τον ρόλο του χρόνιου στρες σε μετάσταση στο ήπαρ. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι το χρόνιο στρες αυξάνει τα επίπεδα των κατεχολαμινών και προωθεί μετάσταση στο ήπαρ. Χρόνιο στρες συσχετίστηκε επίσης με αυξημένη διείσδυση που σχετίζονται με όγκους μακροφάγων εντός του πρωτογενούς όγκου και αύξησαν την έκφραση του μεταστατικού γονιδίων. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία β-αναστολέα ανέστρεψε τα αποτελέσματα του χρόνιου στρες στην ηπατική μετάσταση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το β-αδρενεργικών οδό σηματοδότησης εμπλέκεται στη ρύθμιση του παχέος εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση ήπατος. Επιπλέον, σας υποβάλλουμε ότι η συμπληρωματική θεραπεία με β-αναστολείς, μπορεί να συμπληρώσει τις υπάρχουσες θεραπείες του καρκίνου του παχέος

Παράθεση:. Zhao L, Xu J, Liang F, Li Α, Zhang Υ, Sun J (2015) Επίδραση της χρόνιας ψυχολογικό στρες στο ήπαρ μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου σε ποντίκια. PLoS ONE 10 (10): e0139978. doi: 10.1371 /journal.pone.0139978

Επιμέλεια: Obul Reddy Bandapalli, Πανεπιστήμιο της Χαϊδελβέργης, Γερμανία

Ελήφθη: May 30, 2015? Αποδεκτές: 18 Σεπτεμβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 7 Οκτ 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (81403350) και Ανεξάρτητων Έργων Καινοτομίας Putuo District, Shanghai (2012PTKW004). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η συνολική επίπτωση και η θνησιμότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) έχουν μειωθεί λόγω της έγκαιρης διάγνωσης και νέες θεραπευτικές μεθόδους [1]. Ωστόσο, μετάσταση στο ήπαρ εξακολουθεί να παραμένει μια σημαντική πρόκληση στην παράταση της επιβίωσης. Περίπου το 50 ~ 60% των ασθενών αναπτύσσουν μετάσταση στο ήπαρ, το οποίο έχει κακή αναμενόμενα αποτελέσματα. Επιπλέον, οι τρέχουσες θεραπευτικές στρατηγικές δεν είναι αποτελεσματικές [2]. Η χειρουργική εκτομή είναι η μόνη πιθανή θεραπευτική αγωγή για CRC μετάσταση στο ήπαρ. Ωστόσο, περιορίζεται από την ένδειξη και αντενδείξεις, και μόνο το 10 ~ 20% των ασθενών με ηπατική μετάσταση λαμβάνουν χειρουργική θεραπεία. Η πρόγνωση για τους ασθενείς με μη επεξεργασμένο ηπατικών μεταστάσεων είναι κακή, και το αναμενόμενο ποσοστό επιβίωσης 1-έτος είναι μικρότερο του 30% [3-4]. Για τη μείωση της νοσηρότητας και βελτίωση της πρόγνωσης, είναι απαραίτητο να αναπτυχθούν νέες θεραπευτικές ουσίες. Είναι ενδιαφέρον, επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι η θεραπεία με προπρανολόλη (μη-εκλεκτικοί β-blocker) μειώνει τους κινδύνους ορισμένων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων CRC [5-8].

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι ένα αναξιοπαθούντα συναισθηματική κατάσταση είναι ένας πιθανός παράγοντας κινδύνου για την πρόοδο του καρκίνου. Όπως διάγνωση του καρκίνου μπορεί να προκαλέσει σημαντική δυσφορία, οι ασθενείς συχνά βιώνουν τον φόβο, το άγχος και την κατάθλιψη [9]. Αυτά τα σήματα μπορεί να ενεργοποιήσει μονοπάτια του στρες, συμπεριλαμβανομένης της υποθαλάμου-υπόφυσης-επινεφριδίων (HPA) άξονα και του συμπαθητικού νευρικού συστήματος (SNS), και προκαλούν φυσιολογικές αποκρίσεις. Αυτές οι οδοί μπορούν να παράγουν νευροδιαβιβαστές και ορμόνες που μεταβάλλουν το μικροπεριβάλλον του όγκου.

ορμονών κατεχολαμινών, συμπεριλαμβανομένης της νορεπινεφρίνης (ΝΕ) και επινεφρίνης (Ε), είναι αυξημένα κατά τη διάρκεια του στρες, και να παίξει τον καθοριστικό ρόλο στην αντίδραση στο στρες. Αυτές οι ορμόνες ενεργοποιούν υποδοχείς σε καρκινικά κύτταρα και να ρυθμίσει μια ευρεία ποικιλία βιολογικών λειτουργιών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, η μετανάστευση, εισβολή, και την αγγειογένεση [10-12]. Η ενεργοποίηση του β

2-AR οδό σηματοδότησης που επάγεται από κατεχολαμινών ορμόνες παίζει ένα ρόλο κλειδί στην ανάπτυξη του καρκίνου [13, 14].

Προηγούμενες μελέτες υποδεικνύουν ότι το άγχος που προκαλείται από τις ορμόνες πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC είναι αδρενοϋποδοχέα εξαρτώμενη και ότι το χρόνιο στρες θα μπορούσε να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων του καρκινώματος κόλου υποδορίως εμφυτεύονται σε ένα γυμνό μοντέλο ποντικών μέσω της οδού σηματοδότησης β-AR [15, 16]. Υποθέσαμε ότι το χρόνιο στρες θα προωθήσει CRC μετάσταση στο ήπαρ. Εδώ ερευνούμε πώς χρόνιο στρες επηρεάζει την μετάσταση στο ήπαρ, χρησιμοποιώντας ένα

in vivo

μεταστατικό μοντέλο καρκίνου του παχέος εντέρου, και να καθορίσει κατά πόσον το σηματοδοτικό μονοπάτι της β-AR είναι απαραίτητη για την πρόοδο της CRC.

Υλικά και μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και τα ζώα

Ανθρώπινο κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου, ΗΤ-29, αγοράστηκε από το Type Culture Collection της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών. ΗΤ-29 καλλιεργήθηκε σε μέσο McCoy’5A (Invitrogen), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen), 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2.

Four-εβδομάδων αρσενικούς BALB /C ηυ /ηυ αγοράστηκαν από την Shanghai SLAC Experimental Animal Co., Ltd (άδεια No: SCXK [Hu] 2012-0002) και διατηρήθηκαν υπό συνθήκες SPF. Όλες οι διαδικασίες που εκτελούνται εγκρίθηκαν από την Επιτροπή των πειραμάτων σε ζώα Δεοντολογίας της Πουτούο Νοσοκομείο συνδεδεμένες με το Πανεπιστήμιο της Σαγκάης Παραδοσιακής Κινέζικης Ιατρικής.

ήπατος μοντέλο μετάστασης

Ποντίκια ενέθηκαν με καρκίνο ΗΤ-29 κυττάρων στο παχύ έντερο η σπλήνα να παράγει μετάσταση στο ήπαρ. Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με 2,5% πεντοβαρβιτάλη νάτριο με περιτοναϊκή ένεση. Μετά την αποστείρωση του δέρματος στην περιοχή της χειρουργικής επέμβασης, ένα κοιλιακή τομή παράλληλα προς την αριστερά υποπλεύρια περιθώριο έγινε. Καρκινικά κύτταρα (1 χ 10

7) σε 100 μΙ ρυθμισμένου με φωσφορικό αλατούχου διαλύματος εγχύθηκαν στο σπλήνα χρησιμοποιώντας μια βελόνα 29-G. Μετά το πάτημα του pinhole 1-2 λεπτά με ασηπτική βαμβάκι μπουμπούκια να αποτρέψει τα κύτταρα από το να διαρρέει έξω, σπλήνα επεστράφη στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Η πληγή έκλεισε με 5-0 ράμματα vicryl

Χρόνιο στρες και τη χορήγηση του φαρμάκου πρωτόκολλο

Τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 6 ομάδες:. Blank-Control (BC, n = 10), Blank- στρες (BS, n = 10), προπρανολόλη-Control (PC, n = 10), προπρανολόλη-Stress (PS, n = 10), ICI118,551-Control (IC, n = 10) και ICI118,551-Stress ( IS, n = 10). Ποντικοί στις ομάδες στρες υποστεί σωματική συγκράτησης για 6 ώρες ημερησίως για 35 ημέρες αρχίζοντας 7 ημέρες πριν την ένεση των κυττάρων του όγκου. Όλα τα ποντίκια θυσιάστηκαν 28 ημέρες μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων, καθώς και η σπλήνα και το ήπαρ συλλέχθηκαν και ζυγίστηκαν.

Προς β-αδρενεργικό ανταγωνιστή μελέτες, υδροχλωρική (±) -propranolol (ένα μη εκλεκτικό β-αποκλειστή, 10 mg /kg /ημέρα, Sigma, Ρ0884) και ICI118,551 (ένας εκλεκτικός β

2-αναστολείς, 25μΜ /30 μΙ, Sigma, I127) [17] παραδόθηκαν σε ποντικούς υποδορίως με ωσμωτική μικροαντλία (Alzet, Μοντέλο 1004). Τα φάρμακα που δίνονται για τη διάρκεια του πειράματος που αρχίζει 7 ημέρες πριν από την ένεση των κυττάρων του όγκου (Σχήμα 1).

(Α) Ποντικοί στις ομάδες στρες περιορίσθηκαν σε ειδικό χώρο που τους εμπόδισε από το να κινείται ελεύθερα. (Β) Τα ποντίκια στις ομάδες στρες υποστεί σωματική συγκράτησης για 6 ώρες ημερησίως για 35 ημέρες αρχίζοντας 7 ημέρες πριν την ένεση των κυττάρων του όγκου. Ένας ανταγωνιστής β-αδρενεργικού δόθηκε υποδορίως με ωσμωτική μικροαντλία. έκθεση στο φάρμακο διατηρήθηκε σε όλο το πείραμα. ΗΤ-29 κύτταρα εγχύθηκαν εντός του σπλήνα την ημέρα 0.

Η

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

Είκοσι οκτώ ημέρες μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων, οι ποντικοί θυσιάστηκαν και το αίμα συλλέχθηκε από τα μάτια και αμέσως τοποθετήθηκαν σε καθαρούς σωλήνες Eppendorf ηπαρίνης με λεπτό υμένιο. Οι συγκεντρώσεις Ε και ΝΕ στον ορό μετρήθηκαν με ELISA (R &? D Systems). σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία με ηλεκτροχημική ανίχνευση

Τα επίπεδα κατεχολαμινών στον ιστό του όγκου ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια στήλη υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης εφοδιασμένο με ηλεκτροχημικό ανιχνευτή. Οι ιστοί όγκου πλύθηκαν σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο προς απομάκρυνση υπόλοιπο αίμα. Τα δείγματα στη συνέχεια σε επεξεργασία με υπερήχους σε ψυχρό 1 mol /L υπερχλωρικού οξέος. Οι φυγοκεντρείται υπερκείμενα συλλέχθηκαν και διηθείται με μία πλάκα φίλτρου 0,22 μm (Millipore). Το σύστημα HPLC-ECD περιελάμβανε μια στήλη αντίστροφης φάσης (Agilent 1100, 4,6 χιλιοστών × 12,5 χιλιοστά, USA), και έναν ηλεκτροχημικό ανιχνευτή (Couloshem III, ESA, USA). Η κινητή φάση περιείχε 5% μεθανόλη σε απιονισμένο νερό, 85 mmol /L κιτρικού οξέος, 300 mmol /L κιτρικό νάτριο, 0,2 mmol /L EDTA, 1,2 mmol /L οκτάνιο σουλφονικό νάτριο, και απεσταγμένο νερό. Ο ρυθμός ροής ήταν 1 ml /min, και το ρΗ ρυθμίστηκε στο 4,0 με κάλιο 2 mol /L νάτριο.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Για να αναλυθεί διήθηση μακροφάγων που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ) και προερχόμενα μυελοειδή κατέστειλε κύτταρα (MDSCs) διήθηση με κυτταρομετρία ροής, μονοκύτταρους αιωρήματα παρασκευάστηκαν από όγκους εμφυτεύεται στον σπλήνα συγκομίζονται 28 ημέρες μετά την ένεση και επωάστηκαν με αντισώματα συζευγμένα άμεσα με φθοριόχρωμα ετικέτες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Για να αποκτήσετε απλά εναιωρήματα κυττάρου, η σπλήνα αποκόπηκε και ομογενοποιείται σε τροποποιημένο Eagle Medium του Dulbecco (Invitrogen), συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα ερυθροκύτταρα αποβλήθηκαν με επώαση με ένα αιμολυτικό διάλυμα (155 mmol /L NH4Cl, 10 mmol /L KHCO3, ρΗ 7.2) για 5 λεπτά. Για την ανάλυση ΤΑΜ, σπληνοκύτταρα (1 χ 10

6) βάφτηκαν με ΡΕ αντι-ποντικού F4 /80 (BioLegand, 123110) και FITC αντι-ποντικού /ανθρώπου CD11b (BioLegand, 101206). Για να αναλυθεί μονοκυτταρική μυελοειδή προερχόμενα κατασταλτικών κυττάρων (Μ-MDSC) και κοκκιοκυτταρικής μυελοειδή προερχόμενα κατασταλτικών κυττάρων (G-MDSC), σπληνοκύτταρα χρωματίζονται με το ποντίκι MDSC Cocktail2 Flow με ισοτύπου Ctrl (BioLegand, 147003). Αντισώματα αραιώθηκαν 1: 100 σε ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρομέτρησης ροής (αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα με 5% ορό εμβρύου μόσχου). Όλες οι αναλύσεις διεξήχθη σε ροή BD LSRII κυτταρόμετρο (Beckman Coulter).

ποσοτική πραγματικού χρόνου αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (RT-PCR)

RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης της μετάστασης -σχετικών γονιδίων που περιλαμβάνουν IL-6, VEGF, ΜΜΡ-9, ΤΟΡ-β και PTGS2. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από ιστό όγκου στο σπλήνα με αντιδραστήριο TRIZOL (Invitrogen), και η συγκέντρωση και η καθαρότητα προσδιορίζεται με φασματοφωτόμετρο UV. Στη συνέχεια, 1 μg RNA υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA με κιτ αντιδραστηρίων PrimeScript RT ™ (Takara, Dalian, Κίνα). Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR χρησιμοποιώντας SYBR

® Προμίγματα Ex Taq ™ II (Takara, Dalian, Κίνα). Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν: προ-μετουσίωση στους 95 ° C για 30 s και ένα σύνολο 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 5 s, ανόπτηση στους 60 ° C για 34 s και επέκταση στους 72 ° C για 30s. Τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν και έκφραση κανονικοποιήθηκε προς GAPDH έκφραση. Η ενίσχυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: GAPDH νόημα (5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3 ‘) και αντινόημα (5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′), IL-6 νόημα (5’-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3 ‘) και αντινόημα (5’ -TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3 ‘), VEGF νόημα (5′-GCCAGACAGGGTTGCCATAC-3′) και αντινόημα (5’-GGAGTGGGATGGATGATGTCAG-3 ‘), ΜΜΡ9 νόημα (5′-CTGGACAGCCAGACACTAAAG-3′) και αντινόημα (5’-CTCGCGGCAAGTCTTCAGAG-3 ‘), ΤΟΡ-β νόημα (5′-AGACCACATCAGCATTGAGTG-3′) και αντινόημα (5’-GGTGGCAACGAATGTAGCTGT-3 ‘), PTGS2 νόημα (5′-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC-3′) και αντινόημα (5’-GCACGTAGTCTTCGATCACTATC-3 ‘) . Οι εκκινητές συντέθηκαν από Σαγκάη Sangon Biotech.

κηλίδωση Western

Η ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από ιστό όγκου στον σπλήνα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15], και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA ( Beyotime, P0012). Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα: αντι-IL-6 (1: 500, Abcam, ab154367), αντι-VEGF (1: 1000, Abcam, ab46154), αντι-ΜΜΡ-9 (1: 500, Abcam, ab38898), αντι-ΤΟΡ-β (1: 1000, Abcam, ab31013), andanti-PTGS2 (1: 500, Abcam, ab62331), ακολουθούμενο από επώαση με αντι-κουνελιού υπεροξειδάσης συζευγμένο με δευτερογενές αντίσωμα (1: 1000) . Οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με ένα σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας ECL. Ανίχνευση GAPDH (1: 2000, Abcam, ab181602) χρησίμευσε ως εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης

Η ανοσοϊστοχημεία

Τα δείγματα από μετάσταση στο ήπαρ σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ιστολογική εξέταση.. Οι τομές επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-VEGF (1: 200, Abcam, ab1316), αντι-CD31 (1: 200, Abcam, ab28364), ή αντι-ΜΜΡ-9 (1: 200, Abcam, ab38898). Οι πλάκες ξεπλύθηκαν και επωάστηκαν σε βιοτινυλιωμένο δευτερογενές αντίσωμα (1: 200). Ένταση της χρώσης για τον VEGF, CD31, και της έκφρασης ΜΜΡ-9 μετρήθηκε με Image-Pro 6.0. Ο μέσος όρος των 3 ολοκληρωμένων τιμών οπτικής πυκνότητας θεωρήθηκε ως η ένταση έκφραση της πρωτεΐνης σε αυτό το πεδίο.

Στατιστικά

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 18.0 (SPSS Inc.). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM για όλες ζεύγη στατιστικές συγκρίσεις. Η στατιστική ανάλυση έγινε από έναν μαθητή του

t-test

. Η τιμή του

P

& lt? 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Χρόνιο στρες που προκαλείται από β-αδρενεργικών την ενεργοποίηση του υποδοχέα με τη μεσολάβηση μετάσταση στο ήπαρ

ΗΤ-29 κύτταρα (1 × 10

7) ήταν εγχέεται στο σπλήνα των ποντικών 60 για τη δημιουργία μετάσταση στο ήπαρ και θυσιάστηκαν 28 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου για ανάλυση. Όλα τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε ένεση όγκου στο σπλήνα αναπτύχθηκε μετάσταση στο ήπαρ. Αντιπροσωπευτικά εικόνες σπλήνα και του ήπατος μεταστατικού φαίνεται στο Σχ 2Α και 2Β. Για να ερευνηθεί ο ρόλος του χρόνιου στρες στην πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου και η μετάσταση ήπατος, αξιολογήσαμε τα βάρη του σπληνός και του ήπατος. Χρόνιο στρες αύξησε το βάρος του σπλήνα κατά 20,61% (π.χ.

vs

BS:.. 0.13 ± 0.01 g

vs

0,15 ± 0,01 g,

P

= 0,1784), και μια σημαντική αύξηση των ηπατικών μεταστάσεων παρατηρήθηκε σε ποντίκια που εκτέθηκαν σε χρόνιο στρες (1,6 φορές αλλαγή:. 2,73 ± 0,16 g στην ομάδα π.Χ.

vs

4,30 ± 0,27 g στην ομάδα BS,

P

& lt? 0,0001, Σχήμα 2C). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν χρόνιο στρες συγκράτησης προωθεί μετάσταση στο ήπαρ.

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες της σπλήνας που λαμβάνονται για την 28η ημέρα μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων. (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του μεταστατικού ήπατος που ελήφθησαν την ημέρα 28 μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων. (C) Τα στοιχεία αντιπροσωπεύουν το μέσο βάρος σπλήνας από τις έξι ομάδες. (Δ) Τα στοιχεία αντιπροσωπεύουν το μέσο βάρος του ήπατος από τις έξι ομάδες. **

P

& lt? 0,01 έναντι ομάδας π.Χ.,

#

P

& lt? 0,05 έναντι ομάδας BS.

Η

Όπως και προηγούμενες μελέτες πρότειναν ότι το χρόνιο στρες επιταχυνόμενη εξέλιξη του καρκίνου μέσω της β-αδρενεργικών σηματοδότησης, είμαστε ποντίκια που έλαβαν αγωγή με προπρανολόλη ή ICI118,551 να αναστέλλει β-αδρενεργικών σηματοδότησης. Όπως φαίνεται στο Σχ 2D, β-αποκλειστή θεραπεία μειωμένη ηπατική μετάσταση που προκαλείται από το χρόνιο στρες. Σε σύγκριση με τα ποντίκια στην ομάδα BS, ποντίκια στην PS και IS ομάδες είχαν λιγότερα ηπατικές μεταστάσεις. Οι μεταστατική ηπατική βάρη των ποντικών στο PS και IS ομάδες ήταν σημαντικά χαμηλότερες από αυτές των ποντικών στην ομάδα BS (PS

vs

BS:. 3,46 ± 0,28 g

vs

4,30 ± 0,27. g,

P

= 0,0482? ΕΙΝΑΙ

vs

BS: 3,35 ± 0,28 g

vs

4,30 ± 0,27 g,

P

= 0,0265).. . Δεν παρατηρήσαμε καμία σημαντική διαφορά στην μετάσταση στο ήπαρ μεταξύ προπρανολόλη και θεραπεία ICI118,551 (

P

& gt? 0,05).

Χρόνιο στρες up-ρυθμίζει τα επίπεδα των κατεχολαμινών

Ένα κεντρικό χαρακτηριστικό της χρόνιας αντίδραση στο στρες είναι αυξητική ρύθμιση του αδρενεργικού οδού απόκρισης στρες, η οποία οδηγεί σε απώλεια βάρους και αυξημένα επίπεδα κατεχολαμινών [19]. Ψυχολογικό στρες επιβεβαιώθηκε κατά βάρος χάνουν (Σχήμα 3Α) και την έκθεση σε χρόνιο στρες σημαντικά αυξημένα επίπεδα της ΝΕ ορού κατά 30,25% (π.χ.

vs

BS:. 101,5 ± 1,78 ng /L

vs

. 132,2 ± 2,51 ng /L,

P

& lt? 0,0001, Σχήμα 3Β), και μετρίως αυξημένα επίπεδα της Ε στον ορό κατά 14,24% (π.χ.

vs

BS:. 37.43 ± 1.76 μg /L

vs

. 42.76 ± 1.82 μg /L,

P

= 0,047, σχήμα 3Β). HPLC-ECD ανάλυση του ιστού του όγκου του σπλήνα παρουσίασαν σημαντική αύξηση της τάξης του Ε κατά 18,3 φορές (π.χ.

vs

BS:.. /Μί

vs

103,4 ± 25,08 pg /μL 5.657 ± 1.613 pg,

P

= 0,0177, Σχήμα 3C και 3D).

(Α) σωματικά βάρη παρακολουθούνταν τη διάρκεια του πειράματος. ΗΤ-29 κύτταρα εγχύθηκαν εντός του σπλήνα την ημέρα 0. (Β) Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο επίπεδα ορού της ΝΕ και Ε σε π.Χ. και BS ομάδα, *

P

& lt? 0,05 έναντι ομάδας π.Χ., **

P

& lt? 0.01 έναντι της ομάδας BC. (C) Εκπρόσωπος εικόνες της HPLD-ECD δακτυλικών αποτυπωμάτων των επιπέδων κατεχολαμινών σε ιστούς σπλήνας όγκου σε π.Χ. και ομάδα BS. (Δ) Τα στοιχεία αντιπροσωπεύουν το μέσο επίπεδο της ΝΕ και Ε στον ιστό σπλήνα όγκου σε π.Χ. και ομάδα BS, *

P

& lt? 0,05 έναντι της ομάδας. Π.Χ.

Η

Επίδραση των β-αδρενεργικών σηματοδοτικό μονοπάτι στο μικροπεριβάλλον του όγκου

Προηγούμενη έρευνα έδειξε ότι η β-αδρενεργικών σηματοδότηση ρυθμίζει το μικροπεριβάλλον του όγκου με την πρόσληψη ή την τροποποίηση της δραστηριότητας του όγκου -associated μακροφάγα [20]. Για να καθοριστεί εάν το χρόνιο στρες επηρεάζει το μικροπεριβάλλον του όγκου, χρησιμοποιήσαμε κυτταρομετρία ροής για την ποσοτικοποίηση της σύνθεσης σε κύτταρο ΗΤ-29 πρωτογενών όγκων συλλέγεται από το σπλήνα.

Όπως φαίνεται στο Σχ 4Α, χρόνιο στρες αυξημένη CD11b

+ F4 /80

+ μακροφάγα διήθηση (4,2-φορές αλλαγή:. 2,79 ± 0,43% των ζωντανών κυττάρων στην ομάδα π.Χ.

vs

10,33 ± 1,01% στην ομάδα BS,

P

= 0,0023 , Σχήμα 4Β). Χρόνιο στρες αύξησε επίσης τη διείσδυση M-MDSCs κατά 2,4 φορές (π.χ.

vs

BS:.. 17.15 ± 0.38% των ζωντανών κυττάρων

vs

35.51 ± 4.27%,

P

= 0,0128, Σχήμα 4C και 4D). Χρόνιο στρες κυρίως επαγόμενη πρόσληψη των μακροφάγων που σχετίζονται με όγκους και M-MDSCs για τον πρωτογενή όγκο, ως G-MDSCs δεν ήταν παρούσες (

P

& gt? 0,05). Για να επιβεβαιωθεί ότι σχετίζεται με όγκο μακροφάγων και M-MDSCs διήθηση ήταν διαμεσολαβείται από την οδό σηματοδότησης β-αδρενεργικών, αναλύσαμε την σύνθεση των κυττάρων του ιστού σπληνός όγκου που συλλέγονται από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή τόνισε με προπρανολόλη ή ICI118,551. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4, η αγωγή β-αποκλειστή κατήργησε σημαντικά το CD11b

+ F4 /80

+ μακροφάγα πληθυσμός στον ιστό του πρωτογενούς όγκου (PS

vs

BS:. 6.71 ± 0.57% των ζωντανών κύτταρα

vs

10,33 ± 1,01%,

P

= 0,0353? ΕΙΝΑΙ

vs

.BS:. 6,60 ± 0,68% των ζωντανών κυττάρων

vs

. 10,33 ± 1,01%,

P

= 0,0374). Ωστόσο, καμία σημασία δεν παρατηρήθηκε στην CD11b

+ Gr

loLy6C

hi MDSC πληθυσμών (PS

vs

BS:. 28.08 ± 0.80% των ζωντανών κυττάρων

vs

. 35.51 ± 4.27%,

P

= 0,2722? ΕΙΝΑΙ

vs

.BS:. 26.77 ± 0.57% των ζωντανών κυττάρων

vs

35.51 ± 4.27%,

P

= 0,2116).

(Α) CD11b

+ F4 /80

+ κύτταρα ποσοτικά με κυτταρομετρία ροής σε ΗΤ-29 όγκων πρωτογενούς σπλήνα συγκομίζονται 28 ημέρες μετά την ένεση. (Β) Τα στοιχεία αντιπροσωπεύουν μέση CD11b

+ F4 /80

+ σύνθεση σε όγκους που συλλέγονται από το σπλήνα. **

P

& lt? 0,01 έναντι ομάδας π.Χ.,

#

P

& lt? 0,05 έναντι ομάδας BS. (Γ) MDSCs ποσοτικοποιήθηκαν με κυτταρομετρία ροής σε ΗΤ-29 όγκων πρωτογενούς σπλήνα συγκομίζονται 28 d μετά την ένεση. (Δ) Τα στοιχεία αντιπροσωπεύουν μέση CD11b

+ Gr

loLy6C

hi σύνθεση σε όγκους που συλλέγονται από το σπλήνα. *

P

& lt? 0,05 έναντι της ομάδας. Π.Χ.

Η

Επίδραση των β-αδρενεργικών σηματοδοτικό μονοπάτι για μετάσταση στο ήπαρ

Προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι το χρόνιο στρες μεταβάλλει το μικροπεριβάλλον του όγκου και μπορεί να συμβάλει στη μετάσταση του καρκίνου

στο vivo

[21]. Για να καθοριστεί εάν το χρόνιο στρες προωθείται ηπατικών μεταστάσεων, εξετάσαμε την έκφραση του ΤΟΡ-β, IL-6, PTGS2, ΜΜΡ-9, και VEGF σε όγκους σπλήνα με RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western. Βρήκαμε ότι ο ΤΟΡ-β (9,4-φορές αύξηση,

P

= 0,0040), IL-6 (7,6-φορές αύξηση,

P

= 0,0005), PTGS2 (8,1-φορές αύξηση,

P

= 0,0002), ΜΜΡ-9 (9,4-φορές αύξηση,

P

= 0,0081), και VEGF (7,6-φορές αύξηση,

P

= 0,0005) mRNA έκφραση αυξήθηκε σημαντικά σε ποντικούς στην ομάδα π.Χ., σε σύγκριση με τα ποντίκια στην ομάδα BS. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με β-αναστολείς είχαν μειωθεί ΤΟΡ-β σημαντικά, IL-6, εκφράσεις PTGS2, ΜΜΡ-9, και VEGF mRNA σε όγκους σπλήνα σε σύγκριση με ποντίκια στην ομάδα BS (Σχήμα 5Α). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των προπρανολόλη και ICI118,551 θεραπείες (

P

& gt? 0,05).

(Α) έκφραση mRNA του TGF-β, IL-6, PTGS2, ΜΜΡ-9 και VEGF σε σχέση με τα ποντίκια στην ομάδα π.Χ. σε όγκους σπλήνα **

P

& lt.? 0,01 έναντι ομάδας π.Χ.,

#

P

& lt? 0,05 έναντι ομάδας BS,

##

P

& lt? 0.01 έναντι της ομάδας BS. (Β) Η έκφραση της πρωτεΐνης του TGF-β, IL-6, PTGS2, ΜΜΡ-9, και VEGF σε όγκους σπλήνα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Επίσης παρατηρήσαμε αυξημένη έκφραση πρωτεΐνης του TGF-β, IL-6, PTGS2, ΜΜΡ-9, και VEGF πρωτεΐνης σε ποντίκια που εκτέθηκαν σε χρόνιο στρες, η οποία ήταν καταργείται με αγωγή με β-αποκλειστές (Σχήμα 5Β).

Προηγούμενες μελέτες υποδεικνύουν ότι η χρόνια ψυχολογικό στρες προάγει τη μετάσταση με αυξητική ρύθμιση της νεοαγγείωσης του όγκου και εισβολή ιστού. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι οι αυξήσεις της έκφρασης πρωτεΐνης VEGF, CD31, και ΜΜΡ9 σε ιστό ήπατος ενδεικτικό της αγγειογένεσης και της εισβολής. Η έκφραση ήταν σημαντικά αυξημένη σε ποντίκια στην ομάδα BS σε σύγκριση με τα ποντίκια στην ομάδα BC (VEGF: 2,5-πλάσια αύξηση,

P

= 0,0014? CD31: 2,1-πλάσια αύξηση,

P

= 0,0004? ΜΜΡ9: 2,2-πλάσια αύξηση,

P

= 0,0028). Η αναστολή των β-αδρενεργικών σηματοδότησης μειώθηκε VEGF (PS

vs

BS:.. 0.3091 ± 0,04158

vs

0,5340 ± 0,04043,

P

= 0,0179? ΕΙΝΑΙ

vs .

BS:. 0.2854 ± 0,02639

vs

0,5340 ± 0,04043,

P

= 0.0067), CD31 (PS

vs

BS:. 0.3053 ± 0,03593

vs

0,4333 ± 0,01677,

P

= 0,0320? ΕΙΝΑΙ

vs

BS: 0,3040 ± 0,02751

vs

0,4333 ± 0,01677,

P..

= 0,0160) και ΜΜΡ9 (PS

vs

BS:.. 0.3338 ± 0,01203

vs

0,5277 ± 0,04289,

P

= 0,0121? ΕΙΝΑΙ

vs

BS:. 0.3187 ± 0,01987

vs

0,5277 ± 0,04289,

P

= 0,0115) έκφραση της πρωτεΐνης (Σχήμα 6).. Μαζί, τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση των β-αδρενεργικών σηματοδότηση είναι αναγκαίο και επαρκές για την ενίσχυση της αγγειογένεσης όγκου, εισβολή, και μετάσταση παρουσία του χρόνιου στρες.

δειγμάτων μεταστατικού όγκου (Α) Ήπαρ βάφτηκαν για VEGF από ανοσοϊστοχημεία. Δείγματα μεταστατικού όγκου (Β) Ήπαρ χρωματίστηκαν για CD31 με ανοσοϊστοχημεία. Δείγματα μεταστατικού όγκου (Γ) Ήπαρ βάφτηκαν για ΜΜΡ9 με ανοσοϊστοχημεία. Όλες οι φωτογραφίες ελήφθησαν σε 200 ×. (D) Μέση οπτική πυκνότητα (OD) του VEGF, CD31, και ΜΜΡ9 σε μεταστατικούς όγκους του ήπατος από ποντικούς στην π.Χ., PC, IC, BS, PS, και IS ομάδες. **

P

& lt? 0,01 έναντι ομάδας π.Χ.,

#

P

& lt? 0,05 έναντι ομάδας BS,

##

P

& lt? 0.01 έναντι της ομάδας BS.

Η

Συνολικά, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι το χρόνιο στρες προάγει CRC μετάσταση στο ήπαρ μέσω της β-αδρενεργικών σηματοδότησης, και τονίζει τη σημασία της μικροπεριβάλλον του όγκου στη ρύθμιση των καρκινικών κυττάρων εισβολής.

Συζήτηση

Παρά τις βελτιώσεις στην ολοκληρωμένη θεραπεία για CRC, οι κλινικοί γιατροί αντιμετωπίζουν προκλήσεις στην θεραπεία ασθενών με μετάσταση στο ήπαρ, λόγω της περιορισμένης αποτελεσματικότητας. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι το χρόνιο στρες αύξησε την ανάπτυξη και μετάσταση του CRC μέσω β-αδρενεργικών σηματοδότηση (Εικόνα 7).

β-αδρενεργικών σηματοδότηση σημαντικά ενισχυμένη κυττάρων του όγκου διάδοσης στο συκώτι, και φαρμακολογική αναστολή της β- αδρενεργικών σηματοδότησης μειωμένη ηπατική μετάσταση. Οι μελέτες μας δείχνουν επίσης ότι η προπρανολόλη μπορεί να συμπληρώνει τις υπάρχουσες θεραπευτικές στρατηγικές για να επιβραδύνει ή να αποτρέψει μετάσταση στο ήπαρ από την CRC, βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών που πάσχουν ψυχολογικό στρες.

Η

Η αρνητική επίδραση του χρόνιου στρες σχετικά με την έκβαση του καρκίνου είναι καλά εδραιωμένη. Χρόνιο στρες ενεργοποιεί το ΕΣΥ και τον άξονα HPA για να ενθαρρύνει την απελευθέρωση των κατεχολαμινών, και την περαιτέρω ρύθμιση το μικροπεριβάλλον του όγκου και να επηρεάσει την εξέλιξη του όγκου [19]. Οι κατεχολαμίνες είναι ισχυροί διεγέρτες της αγγείωσης. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το στρες χρόνιου περιορισμού οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα κατεχολαμινών ιστού και αυξημένη αγγειογένεση των όγκων μέσω της ρύθμισης του VEGF και της έκφρασης ΜΜΡ [22]. Επιπροσθέτως, β-αποκλειστές είχε αποδειχθεί για να αντιστρέψει την πίεση με ενισχυμένη αγγειογένεση [23]. Άλλες μελέτες δείχνουν ότι το χρόνιο στρες ανεβάζει τις ορμόνες του στρες που αυξάνουν την ανάπτυξη CRC

in vivo

[16]. Εδώ, θα επεκταθεί σε αυτές τις μελέτες με τη διερεύνηση του ρόλου των κατεχολαμινών στο CRC μετάσταση στο ήπαρ. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το χρόνιο στρες ανεβάζει σημαντικά τα επίπεδα E και NE στον ορό και στους ιστούς όγκων.

Για να προσδιορίσετε αν το χρόνιο στρες ήταν αρκετή για να ρυθμίσει την αγγειογένεση

in vivo

, έχουμε χαρτογραφήσει την πυκνότητα των αιμοφόρων αγγείων του ήπατος μεταστατικού όγκου μέσω VEGF και CD31 ανοσοχρώσης και διαπιστώθηκε σημαντική αύξηση αγγειογένεσης σε τόνισε ποντίκια, αντίστοιχα. Συνεπής με προηγούμενες μελέτες που αποδεικνύουν ότι η SNS ρυθμίζει την αγγειογένεση, τα στοιχεία μας δείχνουν θεραπεία β-αναστολείς καταργηθεί το στρες που προκαλείται από την αγγείωση. Μπορούμε επίσης δείχνουν ότι η χρόνια έκθεση στο στρες ρυθμίζει την έκφραση ΜΜΡ9 στο ήπαρ μεταστατικό όγκο. Συλλογικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η β-αδρενεργικών σηματοδότηση ρυθμίζει τόσο την αγγείωση του όγκου και την εισβολή.

Χρόνιο στρες μπορεί επίσης να μεταβάλλει το μικροπεριβάλλον του όγκου και την προώθηση της εξέλιξης του όγκου με την καταστολή της ανοσίας του ξενιστή [2, 24]. ΤΑΜ και MDSCs είναι δύο μεγάλες ανοσοκατασταλτικά κύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου. ΤΑΜ καταστολή αντι-ογκογόνο κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, προωθώντας έτσι τη μετάσταση [25]. Ωστόσο, ο μηχανισμός εμπλοκής ΤΑΜ σε μετάσταση στο ήπαρ κατά τη διάρκεια της έκθεσης σε χρόνιο ψυχολογικό στρες δεν έχει οριστεί. MDSCs συσσωρεύονται επίσης σε ασθενείς που αναφέρουν υψηλά επίπεδα ψυχολογικού στρες [26-27]. Τα στοιχεία μας επιβεβαιώνουν προηγούμενα ευρήματα ότι το χρόνιο στρες διαμορφώνει το μικροπεριβάλλον του όγκου με την πρόσληψη περισσότερων μακροφάγων και MDSCs σε πρωτοπαθή όγκο, το οποίο μπορεί να διευκολύνει την μετάσταση.

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η έκθεση σε χρόνιο στρες μεταβάλλει σημαντικά το πρωτογενές μικροπεριβάλλον του όγκου, η οποία μπορεί να διευκολύνει την μετάσταση σε απομακρυσμένα όργανα. Σημαντικά, η φαρμακολογική αναστολή της β-αδρενεργικών σηματοδότηση μπορεί να είναι μια νέα στρατηγική για την ελαχιστοποίηση της CRC μετάσταση στο ήπαρ. Τα αποτελέσματά μας είναι συνεπή με επιδημιολογικές ευρήματα που συνδέουν τη χρήση β-αναστολέα σε μειωμένη μετάσταση και τη θνησιμότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου [28, 29]. Τα δεδομένα μας αυξάνει την ενδιαφέρουσα δυνατότητα ότι η θεραπεία με β-αναστολείς, μπορεί να είναι μια νέα στρατηγική για τη διαχείριση του χρόνιου στρες σε ασθενείς με CRC. Επιπλέον, τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν τη σημασία της εξέτασης ψυχολογία των ασθενών στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για τον περιορισμό της εξέλιξης του καρκίνου και την ελαχιστοποίηση μεταστατικό τιμές στο CRC.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω τεχνικός Yuejin Gao στο Τμήμα του Εργαστηρίου Επιστήμης ζωικής Παραγωγής στην Πουτούο Νοσοκομείο συνδεδεμένες με το Πανεπιστήμιο της Σαγκάης Παραδοσιακής Κινέζικης Ιατρικής για την εξαιρετική καθοδήγηση σχετικά με τα πειράματα σε ζώα και τη φροντίδα του ποντικιού.