Abstract

Είναι γνωστό ότι το Β-1 Β κύτταρα είναι ο κύριος τύπος κυττάρου που είναι υπεύθυνο για την παραγωγή του φυσικού ανοσοσφαιρίνης Μ (IgM) και μπορεί να ανταποκριθεί σε μόλυνση από την αύξηση της έκκρισης IgM. Ωστόσο, αναπάντεχα βρέθηκε ότι ορισμένα επιθηλιακά κύτταρα επίσης μπορεί να εκφράσει αναδιαταχθέντων μεταγραφή IgM που έχει φυσικά χαρακτηριστικά IgM, όπως βλαστικής σειράς κωδικοποιημένων και περιορισμένη μετάθεση μοτίβα. Εδώ μελετήσαμε την έκφραση IgM σε ανθρώπινο μη-Β κύτταρα και βρήκαν ότι IgM ήταν συχνά εκφράζονται από πολλά ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα όπως επίσης και επιθηλιακά κύτταρα μη-καρκίνου. Επιπλέον, CD79a και CD79B, δύο μόρια που είναι φυσικά συνδεδεμένο με μεμβρανώδη IgM στην επιφάνεια των Β κυττάρων για να σχηματιστεί το σύμπλοκο υποδοχέα αντιγόνου Β-λεμφοκυττάρων, ήταν επίσης εκφράζεται στην κυτταρική επιφάνεια των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων και συστεγάζεται με IgM. Όπως και το φυσικό IgM, ο καρκίνος των επιθηλιακών κυττάρων που προέρχονται από IgM αναγνωρίζεται μια σειρά μικροβιακών αντιγόνων, όπως μονόκλωνο DNA, δίκλωνο DNA, λιποπολυσακχαρίτη, και το αντιγόνο κυττάρου ΗΕρ-2. Πιο σημαντικό, η διέγερση του ΤοΙΙ υποδοχέα 9 (TLR9), η οποία μιμείται βακτηριακή λοίμωξη, αύξησε σημαντικά την έκκριση των IgM σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τα ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα, καθώς και τα επιθηλιακά κύτταρα μη-καρκίνου μπορεί να παράγει αυθόρμητα IgM με φυσική δραστηριότητα των αντισωμάτων

Παράθεση:. Hu F, Zhang L, Zheng J, Zhao L, Huang J, Shao W , et al. (2012) Αυθόρμητη παραγωγής ανοσοσφαιρίνης Μ σε ανθρώπινη επιθηλιακά κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 7 (12): e51423. doi: 10.1371 /journal.pone.0051423

Επιμέλεια: Jonas Fuxe, Ινστιτούτο Καρολίνσκα, στη Σουηδία

Ελήφθη: 27 Αύγ., 2011? Δεκτές: 7 Νοεμ 2012? Δημοσιεύθηκε: 12, Δεκεμβρίου του 2012

Copyright: © 2012 Hu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις 30973389 και 30772470 από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

είναι γνωστό ότι ως ένα κλασικό μόριο ανοσίας, ανοσοσφαιρίνης (Ig) παίζει σημαντικό ρόλο στο ανοσοποιητικό σύστημα [1]. Μπορεί να επισυνάψει σε ξένες ουσίες, όπως τα βακτήρια και να βοηθήσει στην καταστροφή τους [2]. Ig πιστευόταν παλαιότερα να παράγεται μόνο από τα Β λεμφοκύτταρα και κύτταρα πλάσματος. Κατά την τελευταία δεκαετία, εντούτοις, αυτή η έννοια έχει προσβληθεί από μια σειρά μελετών [3], [4], [5], [6],. Το 2003, αναφέρθηκε πρώτα IgG έκφραση σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα [3]. Από τότε, η ομάδα μας και άλλοι έχουν επιβεβαιώσει ότι πολλά ανθρώπινα καρκινικά μη Β κύτταρα και μερικά φυσιολογικά κύτταρα μπορούν να παράγουν Ig, ειδικά IgG ή IgA [4], [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Επιπλέον, αυτά τα μη-Β καρκινικό κύτταρο που προέρχεται από IgG ή IgA εμπλέκεται στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [3], [4], [18]. Ωστόσο, η έκφραση των IgM σε ανθρώπινο μη-Β κύτταρα σπάνια μελετηθεί [8]. Πρόσφατα, βρήκαμε ότι IgM βαριάς αλυσίδας (Ig μ) γονίδιο με μια ξεχωριστή ρεπερτόριο μεταγράφηκε σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα [8], υποδηλώνοντας ότι IgM μπορεί να εκφράζεται επίσης σε αυτά τα επιθηλιακά κύτταρα γράμμωσης.

Υπάρχουν δύο τάξεις IgM, φυσικά και το ανοσοποιητικό. Φυσικό IgM έχει σκεφτεί να παράγεται μόνο από έμφυτη-όπως B-1 Β κυττάρων απουσία των συναντήσεων παθογόνου, και το ανοσοποιητικό IgM παράγεται από τα δύο έμφυτη-όπως B-1 Β κύτταρα και προσαρμοστική Β-2 κύτταρα Β μετά από αντιγόνο ή συνάντηση παθογόνο. Φυσικό IgM αποτελεί το μεγαλύτερο μέρος του συνόλου των κυκλοφορούντων IgM. Οι περισσότεροι του φυσικού IgM είναι βλαστικής σειράς κωδικοποιείται και πολυδραστικά, και συνδέεται με χαμηλή συγγένεια για έναν αριθμό διαφορετικών αντιγόνων, όπως μικροβιακά παθογόνα, συμβάλλοντας στην έγκαιρη ανοσία πριν από την έναρξη της προσαρμοστικής χυμικής απόκρισης και να παίζουν θεμελιώδη ρόλο στην πρώιμη αντιμικροβιακή ασυλία [19]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες από Zhou et al. έδειξε ότι δεν είναι όλα τα πολυδραστικά φυσικά IgM που παράγουν δέσμευσης αντιγόνου Β κύτταρα εκφράζουν δείκτες κυτταρικής επιφάνειας Β-1 Β (π.χ., IgM

hi, IgD

lo, Β220

lo, Mac-1

hi , CD23

lo και CD5

hi) [20], γεγονός που υποδηλώνει ότι, εκτός από B-1 Β κύτταρα, άλλοι τύποι κυττάρων μπορούν επίσης να συμμετέχουν στην παραγωγή του φυσικού IgM.

ΤοΙΙ υποδοχέων (TLR) είναι μια τάξη πρωτεϊνών που διαδραματίζουν ένα θεμελιώδη ρόλο στο έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα. Αναγνωρίζουν «παθογόνο που σχετίζεται με μοριακά πρότυπα», που είναι δομικά συντηρημένες μόρια που προέρχονται από μικρόβια και διακρίνονται από μόρια υποδοχής, και να ενεργοποιήσετε το έμφυτο ανοσοποιητικό απαντήσεις [21]. Περισσότερα από 13 μέλη της οικογένειας των TLR έχουν ταυτοποιηθεί σε θηλαστικά. TLR9 αναγνωρίζει ειδικά μη μεθυλιωμένες ακολουθίες CpG στο μικροβιακό DNA [21], [22]. Συνθετικά ολιγοδεοξυνουκλεοτίδια (ODN) με μη μεθυλιωμένα μοτίβα CpG, τα οποία μπορούν να μιμηθούν τις επιδράσεις των μικροβιακών DNA, αναγνωρίζονται επίσης από TLR9 [23], [24], [25], [26]. Μόλις ενεργοποιηθεί, TLR9 και συναφείς προσαρμογείς της, όπως αντιγόνο διαφοροποίησης μυελοειδούς 88 (MyD88) [27], [28], προσλαμβάνουν μεσολαβητές σηματοδότηση ενδοκυτταρικά και επάγουν την ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα-κΒ (NF-κΒ) και ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση μονοπάτια, με αποτέλεσμα την παραγωγή κυτοκινών και Ig, κυρίως IgM [29].

Στους ανθρώπους, TLR9 εκφράζεται κατά προτίμηση σε κύτταρα Β, πλασματοκυτταροειδή δενδριτικά κύτταρα, μονοκύτταρα, και των φυσικών φονικών κυττάρων [22]. Λειτουργική TLR9 έχουν επίσης βρεθεί σε πολλά ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα, όπως ο καρκίνος του πνεύμονα, ο καρκίνος του μαστού και του καρκίνου του προστάτη [30], [31], [32], [33], [34]. Πιο σημαντικό, CpG ODN, και ακόμη και μη CpG ODN, μπορεί να ενεργοποιήσει TLR9 εκφράζεται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού και κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, με αποτέλεσμα την αυξημένη κυτταρική εισβολή [32], [33], [34]. Όταν ενεργοποιείται από μη μεθυλιωμένα CpG, TLR9 επάγει την έκκριση πολλών κυτοκινών, όπως η ιντερλευκίνη (IL) -1α, IL-6 και IL-8 [31], [35]. Είναι ακόμη ασαφές εάν TLR9 σε επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα μπορούν να μεσολαβήσουν παραγωγή και έκκριση IgM.

Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε έκφραση IgM σε ανθρώπινο μη-Β κύτταρα, και έδειξε ότι τα ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα καθώς και μη καρκίνο επιθηλιακά κύτταρα μπορούν να παράγουν αυθόρμητα φυσικό IgM. TLR9 αγωνιστές διέγειρε την έκκριση των IgM σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα. Όπως και το Β-1 Β κυττάρων που προέρχονται από φυσικές IgM, ο καρκίνος των επιθηλιακών κυττάρων που προέρχονται από IgM αναγνωρίζεται μια σειρά μικροβιακών αντιγόνων και κάποια αυτοαντιγόνου. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τα ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα όπως επίσης και επιθηλιακά κύτταρα μη καρκινικά μπορούν να παράγουν αυθόρμητα IgM με φυσικό δραστηριότητα των αντισωμάτων.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές Κυττάρων και Culture

το ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου κυτταρική σειρά HeLa MR, ένα

O

6-μεθυλγουανίνη-DNA μεθυλοτρανσφεράση ανεπάρκεια παράγωγο HeLa S3 [36], [37], [38], [39], [40 ], [41], ήταν ένα δώρο από τον Δρ Shouping Ji (Ακαδημία Στρατιωτικής Ιατρικής Επιστήμης, Πεκίνο, Κίνα). Όλες οι άλλες κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπινων τραχήλου καρκινική κυτταρική σειρά HeLa, καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές ΗΤ-29 και SW480, ηπατική κυτταρική σειρά καρκίνου HepG2, κυτταρική σειρά οστεοσαρκώματος U-2 OS, κυτταρικές σειρές εμβρυϊκού νεφρού 293 και 293Τ, και λευχαιμία κυττάρων Β λεμφοκυτταρική γραμμή Raji λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). HeLa MR, ΗΤ-29, SW480, HepG2, U-2 OS, 293 και 293Τ καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 1% αντιβιοτικά, ενώ HeLa και Raji καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% αντιβιοτικά στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Τα κύτταρα σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα.

Τα δείγματα ιστών

μικροσυστοιχίες ιστών αγοράστηκαν από το Τμήμα Παθολογίας, το Πεκίνο Φιλίας Νοσοκομείο. Μελετήσαμε συνολικά 202 δείγματα, τα οποία περιλαμβάνονται 26 διαφορετικά είδη όγκων, 19 ομόλογό δείγματα καλοηθών παθήσεων, και φυσιολογικούς ιστούς. Κόβουμε 4-μm τμήματα από τα προκύπτοντα μπλοκ μικροσυστοιχιών multitumor ιστός και να τοποθετηθεί κάθε τμήμα σε μια επικαλυμμένη με κολλητικό υλικό ολίσθησης (Instrumedics Inc., Hackensack, NJ, USA). Κατεψυγμένα καρκινικούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού (2 περιπτώσεις), καρκίνου του παχέος εντέρου (2 περιπτώσεις), ο καρκίνος του πνεύμονα (2 περιπτώσεις), και τον καρκίνο των ωοθηκών (1 περίπτωση) ήταν από το δοκίμιο τράπεζα ιστών του όγκου του Πανεπιστημίου του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο. 4-μm κατεψυγμένες τομές παρασκευάστηκαν και σταθεροποιήθηκαν με ακετόνη.

Ανοσοϊστοχημεία

Τομές ιστού microarray αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν μέσω πλύσεις αιθανόλης διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις, τοποθετήθηκαν σε 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0), και στη συνέχεια θερμάνθηκε δύο φορές σε ένα φούρνο μικροκυμάτων για 5 λεπτά η κάθε μία. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν με 3% υπεροξείδιο υδρογόνου για 5 λεπτά, πλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), και μπλοκαρίστηκαν σε PBS συν 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας για 10 λεπτά. Μετά την απομάκρυνση της περίσσειας ρυθμιστικού διαλύματος μπλοκαρίσματος, εκτελέσαμε έμμεση ανοσοϊστοχημική χρώση με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπου Ig μ (1:100, Dako, Carpinteria, CA, USA). Τα πλακίδια επωάστηκαν σε υγροποιημένο θάλαμο στους 37 ° C για 45 λεπτά, πλένονται καλά, και μετά επωάστηκαν με αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG-υπεροξειδάσης αρμορακίας (HRP) (1:100, Dako) στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τα πλακίδια πλύθηκαν και πάλι, και δεσμευμένα αντισώματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας 3,3′-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική (DAB, Dako). τομές ελέγχου βάφτηκαν με αντι-ποντικού κατσίκας μόνος IgG-HRP.

ανοσοφθορισμού χρώσης

Για να επιβεβαιωθεί η έκφραση των IgM σε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα, χρώση ανοσοφθορισμού δύο χρωμάτων διεξήχθη επί κατεψυγμένων ιστών διαφάνειες . Εν συντομία, τα κατεψυγμένα πλακίδια ιστού αποκλείστηκαν με 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας, και στη συνέχεια τα πλακίδια επωάστηκαν με αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπου Ig μ (Mabworks Biotech Co., Beijing, Κίνα) καθώς και αντι-ανθρώπινο παν-κυτοκερατίνης κουνέλι ή κουνέλι αντι-ανθρώπινου CD19 (Santa Cruz, CA, USA) στους 37 ° C για 1 ώρα, ακολουθούμενη από επώαση με TRITC-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG και Alexa Fluor® 488-συζευγμένο IgG αίγας αντι-κουνελιού (Santa Cruz) στους 37 ° C για 30 λεπτά. Μετά από αντίθετη χρώση με Hoechst 33342, τα πλακίδια παρατηρήθηκαν άμεσα κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus IX71-141, Tokyo, Japan).

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Πραγματοποιήσαμε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την αξιολόγηση της έκφραση των IgM και TLR9 σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα. Για την ανίχνευση των IgM και TLR9 στην επιφάνεια των κυττάρων, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές με PBS, αποκλείστηκαν με 2% FBS σε PBS στους 4 ° C για 30 λεπτά, χρωματίστηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού (mAb) κατά του ανθρώπινου Ig μ (Mabworks) ή TLR9 (IMG-305A, Imgenex, San Diego, CA, USA) στους 4 ° C για 40 λεπτά. Μετά από δύο πλύσεις με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν σε 100 μΐ PBS που περιείχε ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) κατσίκας αντι-ποντικού IgG (Santa Cruz) στους 4 ° C για 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και 10.000 κύτταρα αναλύθηκαν σε κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur χρησιμοποιώντας λογισμικό CellQuest (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA). φθορισμός του φόντου προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας κύτταρα επωάζονται με το δευτερεύον αντίσωμα, αλλά χωρίς το πρωτογενές αντίσωμα.

Για την αξιολόγηση των ενδοκυττάριων IgM και TLR9, τα μαζεμένα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεϋδη σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, πλύθηκαν με PBS , και διαπερατά δύο φορές με 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα διαπερατότητας (eBioscience, San Diego, CA, USA). Τα κύτταρα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 1500 rpm στους 4 ° C για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και τα κύτταρα σημάνθηκαν με κατάλληλη πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα, όπως περιγράφεται παραπάνω.

Για να αποκλειστεί η πιθανότητα μόλυνσης των κυτταρικών σειρών καρκίνου με Β λεμφοκύτταρα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές με PBS, αποκλείστηκαν με 2% FBS σε PBS για 30 λεπτά, και χρωματίστηκαν με μονοκλωνικό αντι-ανθρώπινο CD19-φυκοερυθρίνη (ΡΕ) (Becton Dickinson) στους 4 ° C για 40 λεπτά. Μετά από δύο πλύσεις, τα κύτταρα αξιολογήθηκαν για έκφραση CD19 σε ροή FACSCalibur κυτταρόμετρο. Το CD19

+ κυτταρική σειρά Raji χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. φθορισμός του φόντου προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας κύτταρα επωάστηκαν με ΡΕ-συζευγμένο IgG ποντικού (Becton Dickinson).

Αντίστροφη Μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) και σε πραγματικό χρόνο PCR αναλύσεις

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα ή δείγματα ιστών χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝάση TURBO (Ambion, Austin, ΤΧ, USA) για την εξάλειψη της μόλυνσης γονιδιωματικού DNA. Αντίστροφη μεταγραφή εκτελέστηκε με το κιτ σύνθεσης cDNA RevertAid First Strand (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το προκύπτον cDNA υποβλήθηκε σε PCR και αναλύσεις σε πραγματικό χρόνο PCR.

Η PCR πραγματοποιήθηκε για να αναλυθεί η έκφραση του Ig μ, κ Ig, CD79a, CD79B, TLR9 και MyD88 στις ανθρώπινες epithelical καρκινικών κυτταρικών γραμμών (εκκινητές που φαίνεται στο Πίνακας S1). Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτώματος σε 1% αγαρόζης. Η ταυτότητα των PCR προϊόντων επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με αλληλούχιση του DNA.

Δύο βήμα πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του IgM και CD19 στα ανθρώπινα επιθηλιακά ιστών καρκίνου χρησιμοποιώντας SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (εκκινητές φαίνονται στον πίνακα S2). Η αντίδραση τρέχει στο 7300 Fast Realtime PCR System (Applied Biosystems). Η γονιδιακή έκφραση προσδιορίστηκε ποσοτικά σε σχέση με την έκφραση του γονιδίου GAPDH οικοκυρική, και ομαλοποιήθηκε ως προς το θετικό μάρτυρα (ανθρώπινο μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος) με πρότυπες

2 -. △△ υπολογισμός CT

Protein Εκχύλιση και Western Blot Ανάλυση

για την εξαγωγή κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών, τα συλλεχθέντα κυτταρικά ιζήματα λύθηκαν σε δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικού λύσης (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA), και επωάστηκαν σε πάγο για 30 λεπτά. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 16.000 rpm στους 4 ° C για 30 λεπτά. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν για ανάλυση Western blot.

Για την απόκτηση εκκρινόμενες πρωτεΐνες, το υπερκείμενο της κυτταρικής καλλιέργειας χωρίς κυτταρικά συντρίμματα συλλέχθηκε, κατακρημνίσθηκε επί μία νύκτα με 100% κορεσμένο θειικό αμμώνιο (1:01), και φυγοκεντρήθηκαν στις 16.000 rpm για 20 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε. Το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 100 μΙ PBS, υποβλήθηκαν σε διαπίδυση δύο φορές με 0,05 Μ PBS για 24 ώρες, και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western.

ανάλυση κηλίδος Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας μειώνεται (με β-μερκαπτοαιθανόλη) ή μη μειώνεται ( χωρίς β-μερκαπτοαιθανόλη) δείγματα πρωτεΐνης που διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης SDS-πολυακρυλαμιδίου (PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Amersham Pharmacia, Little Chalfont, UK). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει 0.1% Tween-20 και 5% άπαχο γάλα ή 5% αλβουμίνη βόειου ορού (για την ανίχνευση φωσφοπρωτείνες) σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες, και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα, όπως αντι-ποντικού ανθρώπινη Ig μ mAb (Mabworks), κατσίκα αντι-ανθρώπινο Ig μ πολυκλωνικό αντίσωμα (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA), ποντικού αντι-ανθρώπινο CD79a και CD79B mAbs (Abcam, Cambridge, MA, USA), ποντικού αντι-ανθρώπου TLR9 mAb (Imgenex), αντι-φωσφο-PKC mAb, αντι-φωσφο-Ακί mAb, αντι-φωσφο-ΕΚΚ mAb, αντι-φωσφο-ΙκΒ mAb, και αντι-ΙκΒ mAb (όλα από την Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, USA ), αντι-ΕΚΚ πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (KangCheng Biotech Co., Σαγκάη, Κίνα), και αντι-ακτίνης mAb (Sigma), στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει 0.1% Tween-20 για 10 λεπτά το καθένα, και επωάζονται με IRDye 800- ή 700-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα (LI-COR Bioscience Inc., Lincoln, ΝΕ, USA) σε θερμοκρασία δωματίου θερμοκρασία στο σκοτάδι για 1 ώρα. Το σήμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα απεικόνισης Οδύσσεια (LI-COR Bioscience).

ενδοκυτταρικό ασβέστιο Flux Μέτρηση

Μέτρηση του ενδοκυτταρικού ροής ασβεστίου διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42]. Εν συντομία, κύτταρα HeLa MR αναπτύχθηκαν σε εξειδικευμένα πιάτα μικροκοιλοτήτων γυάλινο πυθμένα (MatTek Corp., Ashland, ΜΑ, USA) και φορτώθηκαν με 5 μΜ Fluo-3 /ΑΜ σε ΗΕΡΕδ-ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα στους 37 ° C στο σκοτάδι για 30 λεπτά . Τα κύτταρα πλύθηκαν με αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα HEPES και διεγέρθηκαν με 20 μg /ml αντισώματος κατσίκας αντι-ανθρώπινης IgM ή IgG αίγας. Ο φθορισμός παρακολουθήθηκε στα 488 nm (διέγερση) και 530 nm (εκπομπή) χρησιμοποιώντας ένα Leica TCS-NT ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού (Leica MicroImaging, Mannheim, Germany) με ένα φακό εμβάπτισης 40 × έλαιο (Wetzler, Heidelberg, Germany). Εικόνες συλλέχθηκαν σε 5 δευτερόλεπτα για την πέντε φορές πριν από τη διέγερση, και κάθε 1.5 δευτερόλεπτο για 60 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια κάθε 5 δευτερόλεπτα για άλλα 120 δευτερόλεπτα. Η μέτρηση ολοκληρώθηκε σε θερμοκρασία δωματίου, και το κάθε πεδίο των κυψελών επιλέχθηκε τυχαία. Οι εικόνες αναλύθηκαν για σχετικό φθορισμό χρησιμοποιώντας λογισμικό συνεστιακή Leica (Wetzler). Ολες οι δοκιμασίες ροής ασβεστίου εκτελέστηκαν με την παρουσία εξωκυτταρικού ασβεστίου και απουσία EDTA ή EGTA στα ρυθμιστικά διαλύματα δοκιμασίας. Ως εκ τούτου, και οι δύο ενδοκυτταρική απελευθέρωση ασβεστίου και εξωκυτταρικό εισροή ασβεστίου αναλύθηκαν.

Κυττάρων Η θεραπεία με ODN Διέγερση

κύτταρα HeLa MR καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS πριν ODN διέγερση. Το μέσο στη συνέχεια άλλαξε σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 2% FBS και 10 μg /ml ενός ερεθίσματος, όπως φωσφοροθειοϊκό τροποποιημένο, τα ανθρώπινα-ειδικά CpG 2006 [5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3 ‘], μη-CpG ODN ελέγχει CpG 2078 [5’-TGCTGCTTCCCCCCCCCCCC-3 ‘] και GpC [5′-TGCTGCTTTTG TGCTTTTGTGC ΤΤ-3′], ή εξουδετέρωση CpG-Ν ODN208 [5’-TGCCGCGGCAGA-3 ‘]) προστέθηκε με ή χωρίς 10 μmol /l χλωροκίνη ( Sigma) για 1 ώρα προεπώαση πριν ODN προστέθηκε. Μετά από 3 ημέρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για RT-PCR, κυτταρομετρία ροής, και ανάλυση στυπώματος Western. Το υπερκείμενο της κυτταρικής καλλιέργειας επίσης συλλέχθηκε για στύπωμα Western όπως περιγράφεται παραπάνω.

MyD88 knockdown δοκιμασία διεξήχθη χρησιμοποιώντας συνετέθη MyD88 siRNAs όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43]. Το siRNA μορφομετατράπηκε εντός κυτταρικής γραμμής HeLa MR με ηλεκτροπόρωση. Τα ανωτέρω αναφερθέντα ερέθισμα (CpG 2006, CpG 2078 ή GPC) προστέθηκε μέσα στην κυτταρική καλλιέργεια 24 ώρες μετά την elecroporation, και τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από άλλες 3 ημέρες για την RT-PCR, κυτταρομετρία ροής, και αναλύσεις κηλίδος Western.

Ομοεστιακή Ανάλυση Μικροσκοπίας

κύτταρα HeLa MR διεγέρθηκαν με ή χωρίς αντίσωμα κατσίκας αντι-ανθρώπινης Ig μ πολυκλωνικό αντίσωμα (20 μg /ml) για 5 λεπτά, και χρωματίστηκαν με διπλό PerCP /Cy5.5-συζευγμένο ποντικού αντι-ανθρώπου Ig μ (Biolegend, San Diego, CA, USA) και ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο CD79a (Abd SEROTEC, Kidlington, UK) ή ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο Ig μ και ΡΕ-συζευγμένο αντι- ποντικού ανθρώπινο CD79B (eBioscience). Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε συνεστιακή ανάλυση μικροσκοπίας, και οι εικόνες συλλέχθηκαν με Axioskop-2 μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan), ένα 63 × NA στόχος 0,75 Plan Αχρωματικός λάδι κατάδυσης και πρότυπο σετ φίλτρων (Leica MicroImaging), ένα 1300 × 1030 pixel-ψύχεται συζευγμένου φορτίου κάμερα της συσκευής (CCD-1300-Y? Princeton Instruments, Trenton, NJ, USA), και το λογισμικό Metavue (Visitron Systems, Puchheim, Γερμανία)

Ανάλυση του φυσικού αντισώματος Δραστηριότητα Επιθηλιακών. καρκίνος που προέρχεται από κύτταρα IgM

Για να αναλυθεί το κατά πόσον επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων που προέρχονται από IgM έχει φυσική δραστηριότητα των αντισωμάτων ενάντια στα μικροβιακά αντιγόνα όπως μονόκλωνο DNA (ssDNA), διπλού-κλώνου DNA (dsDNA), ή λιποπολυσακχαρίτη (LPS ), πραγματοποιήσαμε ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία αντιγόνου-ειδικά (ELISA) με τη χρήση υπερκείμενου κυτταρικής καλλιέργειας HeLa MR που περιέχουν IgM. Πλάκες μικροτίτλου επικαλύφθηκαν με 10 μg /ml ssDNA, το dsDNA ή LPS (όλα από Sigma). Ποντικού αντι-ανθρώπινης Ig μ mAb και HRP-σημασμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση IgM, με τετραμεθυλβενζιδίνη ως υπόστρωμα. OD450 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (Βίο-Tek, Winooski, VT, USA).

Πραγματοποιήσαμε επίσης έμμεση χρώση ανοσοφθορισμού για να αναλύσει δραστικότητα αυτοαντισώματος του επιθηλιακού καρκίνου που προέρχεται από κύτταρα IgM. Εμείς επωάζεται διαφάνειες HEp-2 κυττάρων (EUROIMMUN, Λίμπεκ, Γερμανία) με υπερκείμενο καλλιέργειας κυττάρων HeLa MR που περιέχουν IgM. Μετά την πλύση με PBS, ποντικού αντι-ανθρώπου Ig μ mAb και FITC-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση θετικό σήμα.

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το στατιστικό λογισμικού SAS έκδοση 8.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Οι διαφορές μεταξύ των διαφόρων ομάδων υπολογίστηκαν από

t

δοκιμών ή chi-square test του Student. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν

P

ήταν & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

IgM εκφράζεται κυρίως σε επιθηλιακά κύτταρα του Ανθρώπου

Αναλύσαμε μικροσυστοιχίες ιστό της 202 δείγματα ιστών για την έκφραση IgM με ανοσοϊστοχημεία, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου ή φυσιολογικούς ιστούς επιθηλιακής, μεσεγχυματικών, και νευρογλοιακά προέλευσης, καθώς και των γεννητικών κυττάρων (Πίνακας S3). Βρήκαμε ότι IgM εκφράστηκε συχνότερα σε επιθηλιακά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων 17 από 34 (50%) επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα, ειδικά τα καρκινώματα του πνεύμονα, του μαστού, του ήπατος και του παγκρέατος (Σχήμα 1Α-D), και 23 του 66 (34.8% ) επιθηλιακά κύτταρα μη καρκινικά (Σχήμα 1Ε, F). Σε αντίθεση, καθόλου ή χαμηλής συχνότητας IgM βρέθηκε σε νεοπλασματικά κύτταρα μεσεγχυματικά (1 από 47, [2,1%]? Συμπεριλαμβανομένων λίπωμα, ίνωμα, και λειομύωμα κυττάρων [Εικόνα 1Ι]) και σε φυσιολογικά μεσεγχυματικά κύτταρα (1 από 34, [2,9 %]? συμπεριλαμβανομένων λιποκυττάρων, οι ινοβλάστες, και κύτταρα λείου μυός). Κανένα από τα νευρογλοιακά κύτταρα αξιολογήθηκαν εξέφρασε IgM (0 από 13, [0%]). Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση IgM ανιχνεύθηκε σε υψηλά επίπεδα σε κύτταρα σεμίνωμα και σε μερικούς φυσιολογικούς γεννητικά κύτταρα στους όρχεις (Σχήμα 1Κ, L). Δύο περιπτώσεις λεμφώματος κυττάρων Τ δεν είχε καμία ανιχνεύσιμη έκφραση IgM, όπως αναμενόταν (Σχήμα 1J). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μη-Β κυττάρων που προέρχονται από IgM απαντάται κυρίως σε επιθηλιακά κύτταρα

Α, καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.? Β, κύτταρα καρκίνου του μαστού? C, καρκίνο του ήπατος κύτταρα? D, παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα? Ε, νεφρικών σωληναρίων επιθηλιακά κύτταρα? F, ενδομήτριο επιθηλιακά κύτταρα? G, νεφρικών σωληναρίων επιθηλιακά κύτταρα, χρωματίστηκαν με κατσίκα αντι-ποντικού IgG-HRP μόνο, ως αρνητικός έλεγχος? Η, ενδομήτριο επιθηλιακά κύτταρα, χρωματίστηκαν με κατσίκα αντι-ποντικού IgG-HRP μόνο, ως αρνητικός έλεγχος? Εγώ, κύτταρα leiomyoma? κύτταρα λεμφώματος J, Τ? K, τα κύτταρα σεμίνωμα? L, σπερματοκύτταρα.

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι το IgM εκφράζεται από τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα αλλά όχι τα κύτταρα Β διεισδύσει, χρώση ανοσοφθορισμού δύο χρωμάτων διεξήχθη επί κατεψυγμένων διαφάνειες επιθηλιακό καρκίνο των ιστών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου , ο καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος του πνεύμονα, και των ωοθηκών, με αντι-IgM και αντι-παν-κυτοκερατίνης αντισώματα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, ένα σημαντικό συν-εντοπισμό αποκαλύφθηκε bewteen την IgM και κυτοκερατίνη? μόνο λίγοι διήθηση των κυττάρων Β ανιχνεύθηκε σε αυτούς τους ιστούς, όπως αποδεικνύεται από IgM και CD19 διπλή χρώση (Σχήμα S1). Επιπλέον, σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση έδειξε ότι δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων των μεταγραφών IgM και Β-κυττάρου ειδικά μεταγραφές CD19 σε αυτούς τους ιστούς, καθώς εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα IgM από ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC), αλλά εξέφρασαν αρκετά χαμηλότερα επίπεδα του CD19 από PBMC (Σχήμα 2Β). Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το θετικό σήμα IgM προέρχεται από επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα.

Α, συν-εντοπισμό σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκίνους του IgM και κυτοκερατίνης. Ανθρώπινα επιθηλιακά καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου, ο καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος του πνεύμονα, και των ωοθηκών, υποβλήθηκαν σε διπλή χρώση με αντι-ανθρώπινο IgM (κόκκινο), αντι-ανθρώπινο παν-κυτοκερατίνης (πράσινο), και Hoechest 33342 (μπλε). Η συνεντόπισης των IgM και κυτοκερατίνης φάνηκε (κίτρινο). Καρκίνο του παχέος εντέρου χρωματίζονται με TRITC-συζευγμένο IgG αίγας αντι-ποντικού και Alexa Fluor® 488-συζευγμένο κατσίκας αντι-κουνελιού IgG μόνο χρησιμοποιήθηκε σαν αρνητικός έλεγχος. Β, δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων των μεταγραφών IgM και ειδικών Β-κυττάρου μεταγραφές CD19 σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκίνους. Ανθρώπινα επιθηλιακά καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου, ο καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος του πνεύμονα, και των ωοθηκών υποβλήθηκαν σε ανάλυση qRT-PCR της έκφρασης IgM και CD19. Ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για έκφραση IgM και CD19.

Η

IgM εκφράζεται ευρέως σε διάφορες γραμμές κυττάρων ανθρώπινων επιθηλιακών Cancer

Βρήκαμε προηγουμένως ο έκφραση των μονοκλωνικών, μετατεθεί Ig μ σε HeLa S3 και κύτταρα ΗΤ-29 [8]. Για να καθοριστεί εάν IgM ήταν ευρέως εκφράζεται σε μη-Β κύτταρα, ιδίως των επιθηλιακών καρκινικών κυτταρικών γραμμών, εκτιμήσαμε την έκφραση των γονιδίων κ Ig μ και Ig σε τέσσερα ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικών κυτταρικών γραμμών (γραμμές κυττάρων καρκίνου του τραχήλου της μήτρας HeLa και HeLa MR, ο καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρο γραμμή SW480, και καρκινική κυτταρική σειρά ήπατος HepG2), ένα οστεοσάρκωμα κυτταρική γραμμή (U-2 OS), και δύο ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές νεφρού εμβρυϊκών (293 και 293Τ) με RT-PCR. κύτταρα Raji χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι Ig μ και Ig μεταγραφές κ ανιχνεύθηκαν σε όλες αυτές τις κυτταρικές γραμμές (GenBank με αρ FJ197674, Σχήμα 3Α). Η ανάλυση αλληλουχίας αποκάλυψε ότι οι κ Ig είχαν ένα κυρίαρχο μοτίβο ανασυνδυασμού Vκ4-1 /Jκ3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α, ανίχνευση της Ig μ και Ig μεταγραφές κ σε πολλαπλές κυτταρικές γραμμές καρκίνου με ημι-ένθετη ΚΤ- PCR. HeLa και HeLa MR, του τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές σειρές? SW480, του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά καρκίνου? U-2 OS, οστεοσαρκώματος κυτταρική γραμμή? HepG2, καρκινική κυτταρική σειρά ήπατος? 293 και 293Τ, ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές νεφρού εμβρυϊκά. Raji, ανθρώπινη λεμφοκυτταρική λευχαιμία κυτταρική γραμμή Β, ως θετικός έλεγχος? GAPDH, εσωτερικού ελέγχου. Β, κυτταρομετρία ροής μελέτη χρησιμοποιώντας ποντικού αντι-ανθρώπου Ig μ mAb έδειξαν ότι IgM ήταν εντοπισμένη όχι μόνο επί της μεμβράνης του πλάσματος, αλλά και στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων, ιδιαίτερα κύτταρα HeLa MR. Κόκκινη γραμμή, ισοτόπου IgG 1 ελέγχου? Μπλε γραμμή, αντι-ανθρώπινο IgM. C, συνεστιακή μικροσκοπία ανάλυση των κυττάρων HeLa MR χρησιμοποιώντας ποντικού αντι-ανθρώπου Ig μ mAb έδειξαν ότι IgM ήταν παρούσα τόσο στην κυτταρική μεμβράνη και στο κυτόπλασμα. Mouse IgG, ως έλεγχος ισοτύπου. D, ολόκληρο IgM ανιχνεύθηκε σε κύτταρα HeLa MR από μη αναγωγική SDS-PAGE (χωρίς β-μερκαπτοαιθανόλη) και στύπωμα Western με αντίσωμα κατσίκας αντι-ανθρώπινης Ig μ πολυκλωνικό αντίσωμα. Ανθρώπινα IgM, ως θετικός μάρτυρας. E, έκφραση IgM ανιχνεύθηκε σε κύτταρα HeLa MR με αναγωγική SDS-PAGE (με β-μερκαπτοαιθανόλη) και στύπωμα Western με αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπου Ig μ mAb. Ανθρώπινα IgM, ως θετικός έλεγχος? β-ακτίνη, εσωτερικού ελέγχου. F, IgM ανιχνεύθηκε επίσης στο πολιτιστικό υπερκείμενο κυττάρων HeLa MR με αναγωγική SDS-PAGE και κηλίδα Western χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινο Ig μ mAb. Ανθρώπινα IgM, ως θετικός έλεγχος? Medium, ως αρνητικός έλεγχος.

Η

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε μεμβρανώδη και κυτταροπλασματική έκφραση των IgM σε κύτταρα HeLa MR, και λίγη ή καθόλου έκφραση του μεμβρανώδης IgM με χαμηλή έκφραση των κυτταροπλασματικών IgM σε κύτταρα HeLa και HepG2 ( Σχήμα 3Β). Στη συνέχεια, το HeLa MR επιλέχθηκε ως πρότυπο κύτταρο για περαιτέρω ανάλυση. Ομοεστιακό μικροσκόπιο επιβεβαίωσε τον εντοπισμό των IgM να είναι πάνω στη μεμβράνη και στο κυτόπλασμα (Σχήμα 3C). Μείωση και μη αναγωγικές ανάλυση κηλίδας Western απεκάλυψε την έκφραση της IgM στα κύτταρα καθώς και το υπερκείμενο της κυτταρικής καλλιέργειας (Σχήμα 3D-F).

Ως ένα από τα πιο σημαντικά στοιχεία ελέγχου, βρήκαμε ότι κανένα από τα καρκινικές κυτταρικές γραμμές αξιολογούνται εκφράζονται επιφάνεια CD19 εκτός Raji κυττάρου το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος (Εικόνα S2). Αυτά τα ευρήματα αποκλείουν την πιθανότητα μόλυνσης των κυτταρικών σειρών καρκίνου από Β λεμφοκύτταρα.

Η έκφραση του BCR-όπως Complex σε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του καρκίνου

CD79a και CD79B, δύο συγκεκριμένα μόρια των κυττάρων Β, είναι φυσικά που συνδέονται με μεμβρανώδη IgM στην επιφάνεια των Β κυττάρων, που σχηματίζουν τον υποδοχέα αντιγόνου Β κυττάρων (BCR) σύμπλοκο. Για την αντιμετώπιση είτε CD79a και CD79B επίσης συνδέονται με επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από IgM, σχηματίζοντας ένα BCR-σαν συγκρότημα, αναλύσαμε πρώτα αν αυτά τα μόρια θα μπορούσαν να εκφραστούν από αυτά τα κύτταρα. Με RT-PCR και στυπώματος Western αναλύσεις, καταδείξαμε την έκφραση του CD79a και CD79B σε επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 4Α, Β). Χρησιμοποιώντας HeLa MR ως πρότυπο κύτταρο, μπορούμε επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι αυτά τα μόρια συν-εντοπισμένη με την μεμβρανώδη IgM (Σχήμα 4C). Πιο σημαντικό, σημειώθηκε ότι πριν από τη διέγερση, το BCR-όπως σύμπλοκο ομοιόμορφα κατανεμημένη σε επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα. Μετά από διέγερση, αντι-IgM αντίσωμα εγκάρσια συνδεδεμένα το BCR-όπως συμπλόκου σε μικρά και μεγάλα μπαλώματα (Σχήμα 4C) και προκάλεσε μια αύξηση της ροής του ασβεστίου (Εικόνα 4D). Επιπλέον, η BCR κατάντη οδούς σηματοδότησης, φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) -Akt και φωσφολιπάση C (PLC) -γ2-PKC, ενεργοποιήθηκαν μετά από διέγερση με αντι-ανθρώπινο IgM (Σχήμα 4Ε). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι CD79a και CD79B συνδέονται με μεμβρανώδη IgM στην επιφάνεια των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων, σχηματίζοντας ένα σύμπλοκο BCR-όπως, η οποία μπορεί να μεσολαβήσει σήματα που οδηγούν στην ανάπτυξη και την επιβίωση των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων.

Α, RT-PCR έδειξε ότι CD79a και CD79B εντοπίστηκαν σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου, U-2 OS, ΗΤ-29, HeLa MR και HeLa, και ότι υπήρχαν δύο ισομορφές τόσο για CD79a και CD79B. Raji, ως θετικός έλεγχος? GAPDH, εσωτερικού ελέγχου. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτώματος σε 1% αγαρόζη και επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με αλληλούχιση του DNA. Β, ανάλυση κηλίδος Western κατέδειξε την παρουσία του μεγαλύτερου ισομορφής του CD79a και CD79B. β-ακτίνη, εσωτερικού ελέγχου. C, συνεστιακή ανάλυση μικροσκόπιο κατέδειξε συν-εντοπισμού (κίτρινο) του CD79a (FITC, πράσινο) και Ig Μ (PerCP /Cy5.5, κόκκινο) (άνω δύο πίνακες), ή CD79B (PE, κόκκινο) και Ig Μ (FITC, πράσινο) (κάτω δύο πλακών) σε κύτταρα HeLa MR με ή χωρίς διέγερση με αντι-IgM. Α, ανάλυση ροής ασβεστίου με συνεστιακή μικροσκοπία σε κύτταρα HeLa MR φορτώθηκαν με Fluo-3 /ΑΜ και διεγείρονται με κατσίκας αντι-ανθρώπινης IgM (α) ή κατσίκα IgG ως ισότυπος controle (β). Εικόνες συλλήφθηκαν μετά τη διέγερση για 0, 1, 15, 30, 60, και 150 δευτερόλεπτα. Η αντίστοιχη χρονική πορεία της ροής ασβεστίου παρουσιάζεται. Ο σχετικός φθορισμός από τις εικόνες υπολογίστηκε με το λογισμικό ομοεστιακό Leica. Κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει το σήμα που προέρχεται από ένα μόνο κύτταρο. Ε, φωσφορυλίωση της PKC και Akt κατάντη του PLC-γ2 και ΡΙ3Κ μονοπάτια σηματοδότησης, αντίστοιχα, ανιχνεύθηκε σε κύτταρα HeLa MR μετά από διέγερση με 20 μg /ml κατσίκα αντι-ανθρώπινο IgM για 5 και 15 λεπτά, αντίστοιχα.

Ανάλυση του φυσικού αντισώματος δραστηριότητας των ανθρώπινων επιθηλιακών Cancer Cell-εκκρίνεται IgM

η αυθόρμητη έκφραση των IgM στα ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα, χωρίς να υπάρχουν ενδείξεις μόλυνσης ή άλλων διέγερση μας προέτρεψε να ανιχνεύσει αν έχουν το δραστηριότητα των φυσικών IgM. Για το σκοπό αυτό, εξετάσαμε την ικανότητα των HeLa MR που προέρχεται από κύτταρα IgM να αναγνωρίσουν ssDNA, το dsDNA, και LPS. Με ELISA, ανακαλύψαμε ότι HeLa MR κύτταρο-εκκρίνεται IgM αναγνωρίζεται όλα αυτά τα τρία αντιγόνα (Σχήμα 5Α-C). Επιπλέον, αυτή η IgM είχαν δραστικότητα αυτοαντισώματος και αναγνώρισε τα καλά καθορισμένα αυτοαντιγόνα στον πυρήνα, κυτόπλασμα, και κυτταροσκελετού των κυττάρων ΗΕρ-2 (Σχήμα 5D).

Α-Ο, ELISA έδειξε ότι εκκρινόμενη IgM σε καλλιέργεια