Αφηρημένο

Ο ρόλος του πολλαπλασιαστή περοξυσώματος – γονίδιο ενεργοποιείται υποδοχέα δ (PPAR δ) στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου παραμένει εξαιρετικά αμφιλεγόμενη. Εδώ, ιδρύσαμε άτριχων ποντικών μοντέλο ξενομοσχεύματος χρησιμοποιώντας ένα ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου KM12C κυτταρική γραμμή είτε με PPAR δ σιγήσει ή κανονική. Τα ξενομοσχεύματα σε PPAR δ-σιγήσει ομάδα αυξήθηκε σημαντικά μεγαλύτερα και βαρύτερα με λιγότερη διαφοροποίηση, προώθησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αυξημένη έκφραση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και παρόμοιο δείκτη απόπτωσης σε σύγκριση με εκείνες του PPAR δ-φυσιολογική ομάδα. Μετά θεραπεία με το ειδικό bevacizumab αναστολέα VEGF, οι ικανότητες ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού των ξενομοσχευμάτων μειώθηκαν και στις δύο ομάδες, ενώ ακόμα σημαντικά υψηλότερη σε PPAR δ-σιγήσει ομάδα από ό, τι σε PPAR δ-φυσιολογική ομάδα. Η χορήγηση του PPAR δ αγωνιστή μειώθηκε σημαντικά έκφραση VEGF σε PPAR δ-φυσιολογικά κύτταρα KM12C αλλά όχι σε PPAR δ-σιγήσει κύτταρα. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι, knockdown του PPAR δ προάγει την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου επάγοντας λιγότερο διαφοροποίησης, την επιτάχυνση της διάδοσης και VEGF έκφραση των καρκινικών κυττάρων in vivo, και μειώνει την ευαισθησία του όγκου σε bevacizumab. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι οι PPAR δ εξασθενεί καρκινογένεση του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Yang L, Zhou J, Ma Q, Γουάνγκ C, Chen Κ, Meng W, et al. (2013) Νοκ ντάουν του Gene PPAR δ Προωθεί την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου και μειώνει την ευαισθησία να Bevacizumab σε άτριχα ποντίκια μοντέλο. PLoS ONE 8 (4): e60715. doi: 10.1371 /journal.pone.0060715

Επιμέλεια: Alan P. πεδία, Mayo Clinic College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 του Απρ 2012? Δεκτές: 2, Μαρτίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 του Απρίλη, 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς Αναγνωρίζετε την υποστήριξη επιχορήγηση από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30.801.332? https://www.nsfc.gov.cn/), Ph.D. Προγράμματα Ίδρυμα του Υπουργείου Παιδείας της Κίνας (Νο 200 806 100 058? https://www.chinapostdoctor.org.cn/), και το Ίδρυμα Καρκίνου Σουηδική (https://www.cancerfonden.se/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πολλαπλασιαστή περοξυσώματος – ενεργοποιημένου υποδοχέα-δ (PPAR δ), ένα μέλος της οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων ΡΡΑΚ συμπλοκοποιητή ενεργοποιημένη [1], εκφράζεται παντού στους περισσότερους ιστούς και εκφράζεται υψηλά σε επιθήλιο, ιδιαίτερα του δέρματος και του εντέρου [2], [3]. Παρόμοια με άλλους υποδοχείς πυρηνικής ορμόνης, ετεροδιμερίζεται PPAR δ με τον υποδοχέα ρετινοειδούς Χ και ασκεί τις δράσεις της μέσω της ρύθμισης της γονιδιακής μεταγραφής κατά την σύνδεση του προσδέματος [4]. Το καλύτερο χαρακτηρισμένο ρόλο για PPAR δ μέχρι σήμερα είναι στη ρύθμιση του μεταβολισμού των λιπιδίων και την ομοιόσταση ενέργειας, όπως επαγωγή αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, ανυψώνοντας λιποπρωτεΐνη υψηλής πυκνότητας, αυξάνοντας την οξείδωση των λιπαρών οξέων και την ενέργεια αποσύνδεση [5], [6]. Επιπλέον, PPAR δ εμπλέκεται επίσης στην εμφύτευση του εμβρύου, την επούλωση των πληγών, φλεγμονώδη απόκριση, πολλαπλασιασμό ενδοθηλιακών κυττάρων, αγγειογένεση, ο καρκίνος του δέρματος και του παχέος καρκινογένεση [7], [8].

Σε αντίθεση με την καλά χαρακτηρισμένο ρόλους των PPAR δ σε μεταβολικές και ενεργητικός ομοιόσταση, ο ρόλος των PPAR δ σε ορθοκολικό καρκινογένεση παραμένει αβέβαιη. Ορισμένες μελέτες παρέχουν ενδείξεις ότι PPAR δ προάγει την καρκινογένεση ενώ άλλα δώσει αντικρουόμενα αποτελέσματα, καθώς επανεξετάζονται στο παρελθόν [9]. Αυτά τα αντιφατικά αποτελέσματα υπαγορεύουν την ανάγκη να εξεταστεί περαιτέρω η λειτουργία των PPAR δ στην παθογένεια του καρκίνου του παχέος εντέρου. Πρόσφατα, έχουμε δημιουργήσει με επιτυχία τα μοντέλα του PPAR δ-knockdown κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου (KM12C κ.λπ.) από φακοϊό μεσολάβηση RNA παρεμβολής (RNAi) [10]. Βρήκαμε ότι PPAR δ knockdown επάγεται σημαντικά λιγότερο διαφοροποίηση και προωθούνται πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων [9], [10]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι PPAR δ μπορεί να παίζει ένα ρόλο καταστολέα όγκων με τη διευκόλυνση της διαφοροποίησης και αναστολή του πολλαπλασιασμού του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ωστόσο, εξακολουθούν να υπάρχουν ελλείψεις in vivo πείραμα για να καταθέσει αυτά τα in vitro ευρήματα. Να προσδιοριστεί με μεγαλύτερη αυστηρότητα ρόλο PPAR δ στον ορθοκολικό καρκινογένεση, εξετάσαμε την επίδραση της PPAR δ νοκ ντάουν στα γυμνά ξενομοσχεύματα ποντικών ιδρύθηκε με κύτταρα KM12C στην παρούσα μελέτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Το ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου KM12C κυτταρική σειρά (από τον καθηγητή IJ Fidler, Anderson Cancer Center, TX), ακατέργαστα ή κατεργασμένα από φακοϊό μεσολάβηση RNA παρεμβολής (RNAi) έναντι γονίδιο PPAR δ από προηγούμενη μελέτη μας [10], είχαν χρησιμοποιήθει. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο Eagle (ΜΕΜ) με άλατα Earle, L-γλουταμίνη και μη βασικά αμινοξέα (Sigma-Aldrich), συμπληρωμένο με 1.5% NaHCO3, 1 mM Να-πυροσταφυλικό (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1 × ΜΕΜ Vitamin Solution (Invitrogen), 1% Πενικιλλίνη-Στρεπτομυκίνη (Invitrogen), 1 μg /ml πουρομυκίνη (μόνο για τα κατεργασμένα κύτταρα να διατηρήσουν την καθαρότητα) και 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (Invitrogen). Η έκφραση του ΡΡΑΚ δ έχουν σταθερώς σιγήσει στα κύτταρα αντιμετωπίζονται από φακοϊό μεσολάβηση RNAi, όπως εξετάζονται με προηγούμενη μελέτη μας [10].

Δημιουργία νεοπλασματικών ξενομοσχευμάτων σε γυμνά ποντίκια

Σαράντα οκτώ γυναικείο γυμνό ποντίκια έξι εβδομάδων αγοράστηκαν από το Πανεπιστήμιο Εργαστήριο Κέντρο ζώων Σιτσουάν (Chengdu, Κίνα). Οι ποντικοί διατηρήθηκαν για 7 ημέρες σε μία συμβατική μονάδα φροντίδας ζώων πριν από την έναρξη της μελέτης.

Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση πεντοβαρβιτάλης (65 mg /kg, Catalogue No.p3636, Sigma-Aldrich, Σουηδία). Τα KM12C κυττάρων είτε με σταθερώς σιγήσει PPAR υποδορίως δ ή ακατέργαστο στη συνέχεια εγχύθηκαν (2 × 10

6 κύτταρα /ποντικό σε 100 μΐ PBS) στη δεξιά πλευρά κάθε ποντικού (24 ποντικοί ανά ομάδα). Εικοσιτέσσερις ώρες μετά τον εμβολιασμό, δώδεκα τυχαία επιλεγμένων ποντικών κάθε ομάδας εγχύθηκαν με bevacizumab (Avastin ™, Genentech, CA) μέσω της φλέβας της ουράς σε δόση 5 mg /kg σωματικού βάρους. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε σε τακτά χρονικά διαστήματα με μέτρηση δύο διαμέτρων όγκου χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικό παχύμετρο. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με τον ακόλουθο τύπο: (μήκος Χ πλάτος

2) /2. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν 25 ημέρες μετά τον εμβολιασμό, και οι όγκοι σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη φορμαλίνη. Οι διαδικασίες αυτές λειτουργούν με τυφλό τρόπο από έναν ερευνητή (L. Yang), χωρίς γνώση της ομαδοποίησης πληροφοριών

ηθική δήλωση:. Ο χειρισμός των ζώων έγινε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για την Φροντίδα και Χρήση των Εργαστηριακών ζώων του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από το εγκεκριμένο από το Πειραματικό Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων του Πανεπιστημίου Σιτσουάν. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) Χρώση

Τα ξενομοσχεύματα από ποντίκια τακτικά ενσωματωμένα σε παραφίνη και, στη συνέχεια, χωρισμένο σε ένα πάχος 5 μm. Οι τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σε αιθανόλη, ξεπλύθηκε σε απεσταγμένο νερό, και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη, χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη Ehrlich και ηωσίνη (Sigma-Aldrich) που ακολουθείται από αφυδάτωση σε διαβαθμισμένη αλκοόλη. Τα πλακίδια στερεώθηκαν και αναλύθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός.

Ανοσοϊστοχημική Δοκιμασία (IHC)

Τα immunostaings διεξήχθησαν στις 5 μm τομών εγκλεισμένων σε παραφίνη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [9]. Τα πρωτογενή αντισώματα ήταν κουνελιού πολυκλωνικό αντι-PPAR δ IgG (ARP37889, Aviva Systems Biology, CA), αντι-Κί67 Ig G (ab15580, Abcam, ΜΑ) και μονοκλωνικά ποντικού αντι-VEGF IgG (ab68334, Abcam, ΜΑ). Η Οραματιστείτε Σύστημα Ονομάσθηκε Polymer-HRP Anti-Rabbit (DakoCytomation, CA) χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα. Τμήματα που είναι γνωστό ότι παρουσιάζουν θετική χρώση για PPAR δ, Κί67 ή VEGF συμπεριλήφθηκαν σε κάθε κύκλο, που λαμβάνουν είτε το πρωτεύον αντίσωμα ή PBS, ως θετικά ή αρνητικά δείγματα αναφοράς. Σε όλες τις διαδικασίες χρώσης, οι θετικοί έλεγχοι έδειξαν σαφή χρώση, ενώ δεν υπήρχε χρώση στους αρνητικούς μάρτυρες.

Τα πλακίδια IHC εξετάστηκαν ανεξάρτητα με τυφλό τρόπο από δύο ερευνητές (LY και JZ) χωρίς γνώση της ομαδοποίησης πληροφορίες. Οι ερευνητές δέχεται κάθε τμήμα από την ένταση χρώση των καρκινικών κυττάρων ως εξής: 0 (αρνητική χρώση), 1 (ασθενής χρώση εκτίθενται ως ανοιχτό κίτρινο), 2 (μέτρια χρώση εκτίθενται ως κίτρινο καφέ), και 3 (ισχυρή χρώση εκτίθενται ως καφέ) . Για να αποφευχθεί η τεχνητή αποτέλεσμα, τα κύτταρα στο περιθώριο των τμημάτων και σε περιοχές με κακή μορφολογία δεν μετρήθηκαν. Στις περιπτώσεις όπου η βαθμολογία χρώση είχαν αντιφατικά αποτελέσματα, συναίνεση σκορ επιτεύχθηκε μετά την εκ νέου αξιολόγηση

κυτταρικής απόπτωσης Ανίχνευση

Το επίπεδο απόπτωσης προσδιορίστηκε από τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης (TdT). – μεσολάβηση dUTP nick τέλος σήμανσης (TUNEL) δοκιμασίας χρησιμοποιώντας το In Situ κυτταρικού θανάτου Detection Kit (Catalogue Νο 11684817910, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, οι τομές-παραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν, διαπερατά και εξισορροπείται. Μετά την αντίδραση σήμανσης, τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Leica DM IL HC μικροσκόπιο φθορισμού. Σύνολο κύτταρα έγιναν ορατά στα 330-380 nm για χρώση ϋΑΡΙ και αποπτωτικά κύτταρα έγιναν ορατά στα 465 έως 495 nm για χρώση FITC. Τμήματα χωρίς την προσθήκη TdT ή λήψη DNase Ι συμπεριλήφθηκαν σε κάθε κύκλο ως αρνητική ή θετική μάρτυρες αντίστοιχα. Για κάθε δείγμα, πέντε πεδία υψηλής ισχύος (Χ 200) επιλέχθηκαν τυχαία, και ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων μετρήθηκε για κάθε πεδίο. δείκτης απόπτωσης (AI) = αριθμός των θετικών κυττάρων /αριθμός συνολικών κυττάρων.

Σε πραγματικό χρόνο αντίστροφης μεταγραφής (RT) PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη από όγκους χρησιμοποιώντας TurboCapture mRNA Kit (Qiagen , Γερμανία), που ακολουθείται από αντίστροφη μεταγραφή με υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, CA). Τα mRNAs που κωδικοποιούν VEGF, Ki67, λιποκύτταρα διαφοροποίησης που σχετίζονται με πρωτεΐνη (ADRP), πρωτεΐνη δέσμευσης ηπατικής λιπαρό οξύ (L-FABP), και εντερική αλκαλική φωσφατάση (ALPI) ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση με SYBR πράσινο ανίχνευσης. αντίδραση PCR διεξήχθη επί του Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο συγκριτικής κύκλος κατωφλίου (Ct) (△△ Ct) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση mRNAs είχαν παρατίθενται στον Πίνακα 1. Η έκφραση ρυθμίζεται σύμφωνα με αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH), και ο 1 × μίγμα εκκινητών GAPDH (Pre-αναπτυχθεί TaqMan Δοκιμασία Αντιδραστήρια, Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση . Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν.

Η

Μέτρηση του VEGF Παραγωγής από KM12C κύτταρα

παραγωγή VEGF από τα κύτταρα KM12C μετρήθηκε με ένα κιτ Human VEGF Χρωματομετρική ELISA (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL). Εν συντομία, κύτταρα KM12C (1 × 10

6) με PPAR δ αθόρυβη ή χωρίς αγωγή καλλιεργήθηκαν σε μέσο άνευ ορού για 18 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή ένδειξη συγκέντρωσης του GW501516, του ειδικού αγωνιστή PPAR δ (0, 1, 2, 4, 8 μΜ) για 24 ώρες. Τα υπερκείμενα υποβλήθηκαν σε ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ένταση του χρώματος της κάθε φρεάτιο προσδιορίστηκε σε αναγνώστη μικροπλακός (Anthos htIII, Αυστρία) στα 450 nm. Οι καμπύλες βαθμονόμησης δημιουργούνται για κάθε δοκιμή με τη γραφική αναπαράσταση των τιμών απορρόφησης έναντι της συγκέντρωσης για κάθε βαθμονομητή. Οι συγκεντρώσεις VEGF δείγματα στη συνέχεια από την καμπύλη βαθμονόμησης και κανονικοποιούνται σε νανογραμμάρια ανά 10

6 κύτταρα.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας είτε ένα t-test, ή , ανάλογα με την περίπτωση, τη δοκιμή αθροίσματος κατάταξης, ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ή Chi-square test χρησιμοποιώντας SPSS 13.0 λογισμικού. Η σχετική έκφραση του mRNA αναλύθηκε με χρήση του λογισμικού ΥΠΟΛΟΙΠΟ-XL

© (διαθέσιμο σε https://www.wzw.tum.de/gene-quantification/) με βάση την μέθοδο ΔΔCt [11].

P

& lt? 0.05 λήφθηκε ως το επίπεδο σημαντικότητας. Τα δεδομένα που εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις της κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

Αποτελέσματα

Νοκ ντάουν των προωθούμενων PPAR δ ανάπτυξη των όγκων και μείωσε την ευαισθησία να Bevacizumab

Για να εξεταστεί η επίδραση του knockdown PPAR δ σχετικά με την ανάπτυξη του όγκου in vivo, εμείς εμβολιασμένα κύτταρα KM12C είτε με αθόρυβη ή κανονικά σε γυμνά ποντίκια και μετρήθηκαν οι όγκοι του όγκου PPAR δ έως 25 ημέρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η κλίση της καμπύλης ανάπτυξης ξενομόσχευμα ήταν υψηλότερη σε όλο το μήκος για PPAR δ-σιγήσει ομάδα, και αυτή η διαφορά στα ποσοστά ανάπτυξης ήταν στατιστικώς σημαντική (

P

& lt? 0,05). Στο τέλος της περιόδου ανάπτυξης, ο μέσος όγκος του όγκου ήταν 2,1 φορές υψηλότερη για knockdown ομάδα από την ομάδα ελέγχου (2,8 cm

3 vs. 1,3 cm

3

P

= 0.015? Εικόνα 1Α-C), με μέσο βάρος 4,0 ± 1,4 g για νοκ ντάουν ομάδα και 2,5 ± 0,6 g για τον έλεγχο (

P

= 0,021, σχήμα 1Δ).

(Α). καμπύλη αύξηση ξενομοσχευμάτων. Σε κάθε χρονικό σημείο, τα ξενομοσχεύματα σε PPAR δ-σιγήσει ομάδα (n = 12) αυξήθηκε σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνα της ομάδας ελέγχου (n = 12) (*

P

& lt? 0,05), ακόμη και όταν αντιμετωπίζεται με bevacizumab (**

P

& lt? 0,05) (μέση τιμή ± SD, t-test). (ΣΙ). Αντιπροσωπευτικά φωτογραφία των ποντικών σε κάθε ομάδα ελήφθη 25 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. (ΝΤΟ). Τα ξενομοσχεύματα όταν γυμνά ποντίκια θυσιάζονται. (Δ) Τα ξενομοσχεύματα σε PPAR δ-σιγήσει ομάδας ήταν σημαντικά βαρύτεροι από εκείνους στην ομάδα ελέγχου, όταν γυμνά ποντίκια θυσιάζονται (μέση τιμή ± SD? *

P = 0,021

? **

P = 0,02

?. t-test)

η

Για να αξιολογηθεί η καταλληλότητα του συνδυασμού PPAR δ νοκ ντάουν με μπεβασιζουμάμπη θεραπεία, θα εγχέεται bevacizumab στα ποντίκια. Βρήκαμε ότι, η χορήγηση της bevacizumab μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου και των δύο ομάδων, ενώ οι όγκοι σε PPAR δ-σιγήσει ομάδα αυξήθηκε σημαντικά ταχύτερα από ό, τι PPAR δ-φυσιολογική ομάδα (

P

& lt? 0,05? Σχήμα 1Α). Ο μέσος τελικός όγκος των όγκων ήταν 1,4 φορές μεγαλύτερη σε νοκ ντάουν ομάδα από την ομάδα ελέγχου (0,9 ± 0,11 εκατοστά

3 έναντι 0,6 ± 0,15 εκατοστά

3

P

= 0.033? Σχήμα 1 Α- C), με μέσο βάρος 1.2 ± 0.5 g για knockdown ομάδα και 0,8 ± 0,2 g για έλεγχο (

P

= 0,02, σχήμα 1Δ).

ξενομοσχεύματα με PPAR δ knockdown ήταν λιγότερο διαφοροποιημένες

Μετά το ενιαίο πρότυπο του National Cancer παχέος Παθολογίας η έρευνα στην Κίνα, η διαφοροποίηση του όγκου βαθμολογήθηκε με το ποσοστό των αδενοειδών συστατικών δομής ως εξής: καλά διαφοροποιημένο (& gt? 95%), μέτρια (50 % -95%), ελάχιστα (5% -50%) και μη διαφοροποιημένων (& lt? 5%). Με χρώση HE, βρήκαμε πολύ περισσότερο λιγότερο διαφοροποιημένα (κακώς + αδιαφοροποίητη) ξενομοσχεύματα σε PPAR δ-σιγήσει ομάδα από εκείνες στην ομάδα ελέγχου (85% έναντι 17%,

P

= 0,025) (Εικόνα 2Α, ΣΙ). Εμείς ποσοτικοποιηθούν περαιτέρω τα γονίδια που συνδέονται με την τερματική διαφοροποίηση, και βρήκε ότι τα mRNA που κωδικοποιούν ADRP, L-FABP ή ALPI μειώθηκαν σημαντικά σε όλες-σιγήσει δ ομάδας του PPAR σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (

P

& lt? 0,05 ? Σχήμα 2C)

(Α).. Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες των ξενομοσχευμάτων με χρώση HE. Τα ξενομοσχεύματα σε PPAR δ-σιγήσει ομάδα (n = 12) ήταν προφανώς λιγότερο διαφοροποιημένα από εκείνα στην ομάδα ελέγχου (n = 12). × 400 μεγέθυνση. (ΣΙ). φιμώνονται ομάδα PPAR δ- είχαν σημαντικά περισσότερες λιγότερο διαφοροποιημένα ξενομοσχευμάτων από την ομάδα ελέγχου (85% έναντι 17%,

P

= 0,025? Chi-square test). (ΝΤΟ). Φαίνεται από ποσοτική RT-PCR, τα mRNA που κωδικοποιούν ADRP, L-FABP ή ALPI μειώθηκαν σημαντικά σε PPAR δ-αθόρυβη ομάδα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (

P

& lt? 0,05).

Η

PPAR δ Νοκ ντάουν προήγαγαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων όγκου

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι PPAR δ-σιγήσει κύτταρα KM12C είχε προωθηθεί ρυθμό ανάπτυξης in vitro [9]. Για να καταθέσουν in vivo, εξετάσαμε την έκφραση του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 στα ξενομοσχεύματα. Όπως φαίνεται από την ανάλυση IHC, ο PPAR δ-σιγήσει ομάδα είχαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση του Κί67 από PPAR δ-φυσιολογική ομάδα (μέση βαθμολογία: 3.5 ± 0.4 έναντι 2.0 ± 0.6,

P

= 0,026? Σχήμα 3Α, ΣΙ). Μετά bevacizumab κατεργασία, η έκφραση του Κί67 αξιοσημείωτα μειωμένη και στις δύο ομάδες, ενώ ακόμα σημαντικά υψηλότερη σε PPAR δ-σιγήσει ομάδα από ό, τι στην ομάδα ελέγχου (μέση βαθμολογία: 2.3 ± 0.5 vs. 1.2 ± 0.3,

P

= 0.031? Σχήμα 3Α, Β). Η ποσοτική RT-PCR έδωσε σύμφωνη αποτέλεσμα με τη δοκιμασία IHC (

P

& lt? 0,05? Εικόνα 3C).

(Α). Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες της έκφρασης Κί67 σε ξενομοσχεύματα βάφονται με IHC. × 400 μεγέθυνσης. (ΣΙ). φιμώνονται ομάδα PPAR δ- (n = 12) είχαν σημαντικά υψηλότερη βαθμολογία της χρώσης Κί67 από την ομάδα ελέγχου (n = 12) (*

P

= 0.026), ακόμη και μετά την αγωγή με bevacizumab (**

P

= 0,031) (μέση τιμή ± SD? t test). (ΝΤΟ). Το επίπεδο του mRNA του Κί67 ήταν σημαντικά υψηλότερη στην PPAR δ-σιγήσει ομάδα από ό, τι στην ομάδα ελέγχου (*

P

= 0,018), ακόμα και μετά από αγωγή με bevacizumab (**

P

= 0,025).

Η

PPAR δ Νοκ ντάουν δεν επηρέασε την απόπτωση των κυττάρων όγκου

Η επίδραση των νοκ ντάουν PPAR δ στην κυτταρική απόπτωση εξετάσθηκε με τη δοκιμασία TUNEL. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, σημαντική διαφορά του AI δεν βρέθηκε μεταξύ της ομάδας και του ελέγχου ΡΡΑΚ δ-σιγήσει ομάδα (6,2 ± 4,7% έναντι 7,0 ± 3,6%,

P

= 0,81), ακόμη και μετά τη θεραπεία bevacizumab ( 10,8 ± 4,1% vs.11.2 ± 2,9%,

P

= 0,75).

(Α). Εκπρόσωπος εικόνες της κάθε ομάδας. Τα συνολικά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν με DAPI κηλίδα, και τα θετικά κύτταρα απόπτωση ταυτοποιήθηκαν με FITC λεκέ. × 200 μεγέθυνση. (ΣΙ). Ποσοτικά στοιχεία του δείκτη απόπτωσης (AI). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά της γρίπης των πτηνών μεταξύ των ομάδων, ακόμη και μετά την αγωγή με bevacizumab (μέση τιμή ± SD, *

P

= 0,81, **

P

= 0,75? t-test).

εξόντωση Induced PPAR δ έκφραση VEGF σε ξενομοσχεύματα

Για να αναλυθεί η συσχέτιση του PPAR δ με VEGF, εξετάσαμε περαιτέρω την έκφραση του VEGF στα ξενομοσχεύματα. Με IHC, βρήκαμε ότι PPAR δ-σιγήσει ομάδα είχαν σημαντικά περισσότερες περιπτώσεις με υψηλής εξέφρασε VEGF (βαθμολογία ≥2.0) (77% έναντι 33%,

P

= 0,03) και υψηλότερη βαθμολογία ένταση από τον έλεγχο ομάδα (3,1 ± 0,3 έναντι 1,5 ± 0,2,

P

= 0,028? Εικόνα 5Α, Β). Ποσοτική RT-PCR ανάλυση έδειξε ότι, το mRNA του VEGF ήταν σημαντικά αυξημένα σε PPAR δ-σιγήσει ομάδα σε σύγκριση με τον έλεγχο. (

Ρ = 0.032

? Σχήμα 5C)

(Α). Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες της έκφρασης του VEGF σε ξενομοσχεύματα βάφονται με IHC × 400 μεγέθυνσης.? (ΣΙ). φιμώνονται ομάδα PPAR δ- (n = 12) είχαν σημαντικά υψηλότερη βαθμολογία της χρώσης του VEGF από την ομάδα ελέγχου (n = 12) (*

P

= 0,028? rank test άθροισμα). (ΝΤΟ). Ποσοτική RT-PCR αποτέλεσμα (*

P =

0.032).

Η

Η ενεργοποίηση του PPAR δ μειωμένη έκφραση VEGF σε χλμ 12C κύτταρα

Για να επιβεβαιώσετε τη σύνδεση μεταξύ του PPAR δ και VEGF, εμείς κατεργασμένα κύτταρα KM12C με GW501516 (το ειδικό αγωνιστή PPAR δ) ή όχημα, και να ποσοτικοποιηθεί το VEGF στο ελεύθερο κυττάρων υπερκείμενο με δοκιμασία ELISA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, η έκκριση του VEGF ήταν πολύ υψηλότερο σε σιγήσει δ κυττάρων του PPAR σε σχέση με εκείνους με φυσιολογική PPAR δ (κύτταρα ελέγχου) πριν από τη χορήγηση GW501516 (

P

= 0,035). Μετά τη θεραπεία με GW501516, ο VEGF μειώθηκε σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο στα κύτταρα ελέγχου (

P

= 0,018), ενώ δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή στην ΡΡΑΚ δ-σιγήσει κύτταρα σε όλο το μήκος (em

P

= 0,83).

τα κύτταρα KM12C υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σειριακές συγκεντρώσεις GW501516 ή του οχήματος, καθώς και τα ελεύθερα κυττάρων υπερκείμενα συλλέχθηκαν για τον VEGF ποσοτικοποίηση με ELISA. Επεξεργασμένα με GW501516, τα κύτταρα ελέγχου παρουσίασαν εξαρτώμενη από τη δόση μείωση της έκκρισης VEGF (*

P

= 0,018), ενώ η PPAR δ-σιγήσει κύτταρα δεν είχαν σημαντική αλλαγή σε όλο το μήκος (**

P

= 0,83?. ANOVA)

η

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι οι ξενομοσχεύματα σε PPAR δ-σιγήσει ομάδα αυξήθηκε σημαντικά γρηγορότερα με λιγότερη διαφοροποίηση, προώθησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ενώ παρόμοιες δείκτης απόπτωσης και την αυξημένη VEGF σε σύγκριση με εκείνες του PPAR δ-φυσιολογική ομάδα, ανεξάρτητα από το bevacizumab θεραπείας. Η χορήγηση του PPAR δ αγωνιστή μειώθηκε σημαντικά την έκφραση του VEGF σε PPAR δ-φυσιολογικά κύτταρα KM12C, ενώ δεν επηρέασε εκείνη του PPAR δ-σιγήσει κύτταρα. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι, knockdown του PPAR δ προάγει την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου, περιορίζοντας τη διαφοροποίηση και την προώθηση του πολλαπλασιασμού καθώς και την έκφραση του VEGF από τα κύτταρα όγκου in vivo, και μειώνει την ευαισθησία του όγκου σε bevacizumab. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ένα καταστολέα ρόλος των PPAR δ στην παθογένεση του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Στην παρούσα μελέτη, το εύρημα μας ότι οι ξενομοσχεύματα σε ποντικούς αυξήθηκε σημαντικά μεγαλύτερα και βαρύτερα μετά PPAR δ knockdown υποδεικνύει ότι PPAR δ μπορεί να μετριάσει όγκου ανάπτυξη in vivo. Σύμφωνα προς αυτό το εύρημα, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι ο σχηματισμός πολύποδα κόλου ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στην PPAR δ-ανεπαρκή ποντίκια σε σύγκριση με τα ζώα άγριου τύπου [12], [13]. Σε αντίθεση με αυτές τις παρατηρήσεις, Park et al. [14] ανέφεραν ότι PPAR δ-null HCT-116 κύτταρα είχαν μειωμένη ικανότητα να σχηματίζουν ξενομοσχεύματα σε γυμνά ποντίκια. Μια άλλη μελέτη κατέληξε στο συμπέρασμα ότι οι PPAR δ δεν είναι απαραίτητη για το σχηματισμό πολυπόδων στο παχύ έντερο του APC

min ποντίκια [15]. Ωστόσο, αυτά τα συμπεράσματα βασίστηκαν στην ανάλυση μικρότερη από 6 ποντίκια, με περιορισμένη στατιστική ισχύ. Αποτέλεσμα από την παρούσα μελέτη περιλαμβάνει δεδομένα από ένα σύνολο 48 ποντίκια, παρέχοντας πιο οριστική απόδειξη για ένα λειτουργικό ρόλο για PPAR δ στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου.

Για να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός βασίζεται η προώθησε την ανάπτυξη των όγκων μετά από PPARd νοκ ντάουν, εμείς περαιτέρω ανέλυσε την έκφραση διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση και VEGF στα ξενομοσχεύματα. Βρήκαμε ότι τα ξενομοσχεύματα έδειξαν σημαντικά μικρότερη διαχωριζόμενες ιστολογία μετά PPAR δ knockdown, με αυξημένη έκφραση των γονιδίων διαφοροποίησης που σχετίζονται με ADRP, L-FABP και ALPI. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν απόδειξη in vivo ότι PPAR δ μπορεί να διευκολύνει τη διαφοροποίηση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Αυτό το εύρημα είναι σύμφωνο με τις πρόσφατες μελέτες οι οποίες εμπλέκουν PPAR δ στη ρύθμιση της διαφοροποίησης επιθηλιακών: Η ενεργοποίηση του PPAR δ διεγείρει την τελική διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων [16] – [18]? PPAR δ προάγει την διαφοροποίηση των κυττάρων Paneth στο εντερικό κρύπτες [19]. Πρόσφατα, δείχνουμε ότι PPAR δ knockdown επάγει λιγότερο διαφοροποίηση καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, και υψηλή έκφραση του PPAR δ σχετίζεται με καλύτερη διαφοροποίηση του καρκίνου του ορθού [10]. Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με τις in vivo παρατηρήσεις στην παρούσα μελέτη. Ο κανονισμός για διαφοροποίηση μπορεί να βασίζεται η προώθηση της επίδρασης των νοκ ντάουν PPAR δ στην ανάπτυξη του όγκου, όπως φαίνεται σε αυτή τη μελέτη.

Το υπόλοιπο του πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης διαδραματίζει ζωτικό ρόλο στον έλεγχο της ανάπτυξης του όγκου. Η εξέλιξη της ανάπτυξης του όγκου χαρακτηρίζεται από αυξημένο πολλαπλασιασμό και /ή μειωμένη απόπτωση, ή και τα δύο. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ότι η έκφραση του Κί67 ήταν σημαντικά αυξημένη ενώ η απόπτωση των καρκινικών κυττάρων δεν άλλαξε μετά PPAR δ knockdown. Καταδεικνύει ότι PPAR δ knockdown μπορεί να προάγει τον πολλαπλασιασμό, ενώ δεν έχουν καμία επίδραση επί της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας in vitro, τα οποία δείχνουν ότι PPAR δ knockdown προάγει τον πολλαπλασιασμό των HCT-116 κυττάρων χωρίς επίδραση επί της απόπτωσης [20]. Η ανισορροπία του πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης είναι υπεύθυνη για την προωθούμενη αύξηση του όγκου μετά από PPAR δ νοκ ντάουν.

Η αγγειογένεση είναι ένας από τους κύριους παράγοντες που καθορίζουν την ανάπτυξη του όγκου, ως όγκος πρέπει να διεγείρουν τον ξενιστή για να δημιουργήσετε το δικό αγγείωση του να συνεχίσει να αυξάνεται, όταν μεγαλώνει μεγαλύτερο από 1-2 mm

3 [21]. Ο VEGF είναι ένα έναυσμα της αγγειογένεσης και απαραίτητη για την ανάπτυξη των αιμοφόρων αγγείων [22], [23]. Μαζί με VEGF, άλλα γονίδια που σχετίζονται με την ανάπτυξη εμπλέκονται στην αγγειογένεση. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η ενεργοποίηση του PPAR δ επάνω ρυθμισμένη VEGF σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [24], που εμπλέκουν PPAR δ στην αγγειογένεση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι ο VEGF ήταν σημαντικά αυξημένη σε αμφότερα τα κύτταρα KM12C και ξενομοσχεύματα μετά PPAR δ knockdown, και μειώθηκε σε PPAR δ-φυσιολογικά κύτταρα KM12C ενώ αμετάβλητη στα PPAR δ-σιγήσει κυττάρων μετά κατεργασία των GW501516. Καταδεικνύει ότι η ενεργοποίηση του PPAR δ αναστέλλει την έκφραση του VEGF και έτσι μπορεί να εξασθενούν την αγγειογένεση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με τις πρόσφατες μελέτες που δείχνουν ότι η PPAR δ μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων [7], [25], [26]. Η προώθηση του VEGF-μεσολάβηση αγγειογένεσης μπορεί να είναι ένας άλλος παράγοντας που διέπουν την προώθησε την ανάπτυξη του όγκου μετά από PPAR δ νοκ ντάουν.

Για να εξεταστεί η επίδραση των νοκ ντάουν PPAR δ σε χημειοθεραπευτικά ευαισθησία, έχουμε αντιμετωπίζεται το γυμνό ποντίκια με bevacizumab. Μετά τη θεραπεία, η ανάπτυξη του όγκου, καθώς και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ήταν προφανώς επιβραδύνεται και η απόπτωση αυξήθηκε σε αμφότερες τις ομάδες, ενώ ο PPAR δ-σιγήσει ομάδα έδειξε ακόμη υψηλότερες ικανότητες της ανάπτυξης του όγκου και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από PPAR δ-φυσιολογική ομάδα. Αυτό το εύρημα δείχνει ότι PPAR δ knockdown μειώνει την ευαισθησία του καρκίνου του παχέος εντέρου στη bevacizumab, υποκείμενη η οποία μπορεί να είναι το αυξημένο πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση ελαττώσει όγκων. Συνεπάγεται επίσης ότι, ο VEGF διαμεσολαβείται οδός δεν είναι ο μόνος μηχανισμός μέσω του οποίου PPAR δ ρυθμίζει την ανάπτυξη του όγκου. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη φορά να αναφέρουν την επίδραση της PPAR δ στην χημειοευαισθησία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Συνεπάγεται ότι, ο καρκίνος του παχέος εντέρου με φυσιολογική ή υψηλή έκφραση του PPAR δ μπορεί να έχουν καλύτερη ανταπόκριση στη bevacizumab από εκείνους με χαμηλή έκφραση του PPAR δ. Ως εκ τούτου, το επίπεδο έκφρασης του PPAR δ μπορούσε να είναι ένας πιθανός προγνωστικός αποτελεσματικότητα του bevacizumab, και η ανάπτυξη και εφαρμογή των PPAR δ-αγωνιστή παράγοντας μπορεί να είναι ένας ελπιδοφόρος τρόπος για την προώθηση της αποτελεσματικότητας της bevacizumab για τον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Συμπερασματικά, δείχνουμε εδώ ότι PPAR δ knockdown προάγει την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου, προκαλώντας λιγότερη διαφοροποίηση και την επιτάχυνση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, καθώς και την έκφραση του VEGF, ενώ δεν έχει καμία επίδραση επί της απόπτωσης, ανεξάρτητα από bevacizumab θεραπείας. Ενεργοποίηση με συνδέτη PPAR δ μειώνει την έκφραση του VEGF σε καρκινικά κύτταρα κόλου. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι, PPAR δ μπορεί να αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου με διέγερση διαφοροποίησης, εξασθένηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και VEGF-διαμεσολαβούμενη αγγειογένεση στην παθογένεση του καρκίνου του παχέος εντέρου, και τη διευκόλυνση της ευαισθησίας όγκου σε bevacizumab. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το σκεπτικό για την ανάπτυξη αγωνιστές PPAR δ για την πρόληψη ή /και θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Καθ Ι.Ι. Fidler (Anderson Κέντρο Καρκίνου, Houston, TX) για την προσφορά KM12C κυτταρική σειρά.