Αφηρημένο

Στις μελέτες μας των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών έχουμε εντοπίσει υποπληθυσμών των κυττάρων που βρίσκονται σε μεταβατικό Ε /Μ υβριδικό στάδιο , δηλαδή κύτταρα που εκφράζουν ταυτόχρονα επιθηλιακών και μεσεγχυματικών δείκτες. κύτταρα /Μ δεν είναι ομοιογενείς, αλλά,

in vitro

και

in vivo

, περιέχουν υποσύνολα που μπορεί να διακριθεί με βάση έναν αριθμό των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών, συμπεριλαμβανομένης της υποκυτταρικό εντοπισμό του Ε-καδερίνης, και τα επίπεδα έκφρασης του Tie2, CD133, CD44 και. Ένα κυψελοειδές υποσύνολο (Ε /Μ-MP) (μεμβράνη E-cadherin

χαμηλή /κυτταροπλασματική E-cadherin

υψηλή /CD133

υψηλή, CD44

υψηλή, Tie2

χαμηλό) είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένο για καρκινικά κύτταρα σχηματισμού και εμφανίζει χαρακτηριστικά τα οποία γενικά συνδέονται με τον καρκίνο βλαστικά κύτταρα. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι τα κύτταρα Ε /Μ-MP μπορούν να διαφοροποιηθούν σε διαφορετικές καταγωγές, υπό ορισμένες προϋποθέσεις, και έχουν την ικανότητα για αυτο-ανανέωση, δηλαδή να διατηρήσει ένα υποσύνολο των αδιαφοροποίητα κύτταρα Ε /Μ-MP κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης. Trans-διαφοροποίηση των κυττάρων /Μ-ΜΡ σε μεσεγχυματικά ή επιθηλιακά κύτταρα συνδέεται με μια απώλεια δεικτών βλαστικών κυττάρων και ογκογονικότητα.

In vivo

ανάπτυξης όγκου ξενομοσχεύματος οδηγείται από κύτταρα Ε /Μ-ΜΡ, τα οποία δημιουργούν επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα ωοθηκών. Σε αντίθεση,

in vitro

, βρήκαμε ότι τα κύτταρα /Μ-ΜΡ διαφοροποιούνται σε μεσεγχυματικά κύτταρα, σε μια διαδικασία που περιλαμβάνει οδούς που σχετίζονται με μια μετάβαση επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά. Διαπιστώσαμε επίσης φαινοτυπική πλαστικότητα που εξαρτάται από εξωτερικούς παράγοντες, όπως το στρες που δημιουργείται από την πείνα ή την επαφή είτε με επιθηλιακά ή μεσεγχυματικών κυττάρων σε συν-καλλιέργειες. Η μελέτη μας παρέχει μια καλύτερη κατανόηση της φαινοτυπική πολυπλοκότητα του καρκίνου των ωοθηκών και έχει συνέπειες για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Strauss R, Li Ζ-Υ, Liu Υ, Beyer Ι, Persson J, Sova P, et al. (2011) Ανάλυση Τα επιθηλιακά και μεσεγχυματικά δείκτες στον καρκίνο των ωοθηκών Αποκαλύπτει φαινοτυπική ετερογένεια και την πλαστικότητα. PLoS ONE 6 (1): e16186. doi: 10.1371 /journal.pone.0016186

Επιμέλεια: Donald Gullberg, Πανεπιστήμιο του Μπέργκεν, Νορβηγία

Ελήφθη: 27 του Αυγούστου του 2010? Αποδεκτές: 13 Δεκεμβρίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 14 Γενάρη 2011

Copyright: © 2011 Strauss et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ χορηγεί R01 CA080192, R01 HLA078836, και του Ειρηνικού ωοθηκών Cancer Research Consortium /εξειδικευμένο πρόγραμμα της ερευνητικής αριστείας σε καρκίνο των ωοθηκών Grant P50 CA83636. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

έχει προταθεί ότι ο όγκος εκ νέου ανάπτυξη, καθώς επίσης και αντίσταση χημειοθεραπεία και μετάσταση, εξαρτώνται από ένα μικρό υπο-πληθυσμό των καρκινικών κυττάρων εντός του όγκου που πιστεύεται ότι αντιπροσωπεύουν καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ). Ένα καθοριστικό χαρακτηριστικό των βλαστικών κυττάρων, τόσο φυσιολογικό και κακοήθη ιστό, είναι η ικανότητα να αυτο-ανανέωση, αλλά ταυτόχρονα να οδηγήσει σε θυγατρικά κύτταρα που έχουν δεσμευτεί για διαφοροποίηση σε φαινοτύπους οι συχνά σταυρό καταγωγές. Για να επιτευχθεί αυτό, τα βλαστικά κύτταρα μπορούν να υποστούν ένα ασύμμετρο κυτταρικής διαίρεσης με τις οποίες διαχωρίζουν τους καθοριστικούς παράγοντες της κυτταρικής μοίρας σε ένα μόνο από τα δύο θυγατρικά κύτταρα [1]. Σε ενήλικα θηλαστικά, τα βλαστικά κύτταρα έχουν χαρακτηριστεί για έναν αριθμό ιστών, συμπεριλαμβανομένου του συστήματος του αίματος, του κεντρικού νευρικού συστήματος, των μυών, του παχέος εντέρου, του μαστού και του οστού /χόνδρου.

Για τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων σε στερεούς όγκους, πολύ μπορούν να αντληθούν από τις μελέτες των αιμοποιητικών αρχέγονων κυττάρων (HSC) για τις οποίες έχει αποδειχθεί ότι η μεταμόσχευση ενός μόνο κυττάρου σε ένα myeloablated παραλήπτης μπορεί να ανασυστήσει το σύνολο του συστήματος του αίματος. Αυτή η οριστική HSC δημιουργεί μια ιεραρχία των πολυδύναμων προγονικών κυττάρων που γίνονται σταδιακά περιορίζεται στο δυναμικό διαφοροποίησης τους. Λευχαιμία πιστεύεται ότι προέρχονται είτε από HSCs που αποκτήθηκαν γενετική ή επιγενετικές μεταβολές και έγινε μερικώς διαφοροποιημένο και ογκογόνο ή από προγόνους που απέκτησε την ικανότητα να αυτο-ανανέωση [2]. Η ύπαρξη των βλαστικών κυττάρων για ορισμένους τύπους λευχαιμίας υποστηρίζεται σθεναρά από λεντοϊού tagging ανθρώπινων οξείας μυελογενούς λευχαιμίας κυττάρων και την παρατήρηση των μεμονωμένων κλώνων που υπάρχουν στο NOD-SCID ποντίκια μετά από σειριακή μεταμόσχευση των κυττάρων με ετικέτα [3]. Μελέτες της λευχαιμίας βλαστικών κυττάρων έδειξε επίσης μεγάλη πλαστικότητα φαινοτυπική ανάλογα με το στάδιο της ανάπτυξης του όγκου, μικροπεριβάλλον του όγκου, καθώς και εξωγενείς παράγοντες, όπως το στρες που δημιουργείται από το ραδιόφωνο-ή χημειοθεραπεία [2].

Η παρουσία των ΚΕΠ σε συμπαγείς όγκους έχει προταθεί για ανθρώπινους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του μαστού [4], τον εγκέφαλο [5], του παχέος εντέρου [6], το κεφάλι και το λαιμό [7], παγκρεατικό [8], του προστάτη [9], των ωοθηκών [10], [11], [12 ], και τον καρκίνο του δέρματος [13]. Οι Στερεά όγκου βλαστικά κύτταρα έχουν οριστεί ως «ένα μικρό υποσύνολο των καρκινικών κυττάρων εντός ενός καρκίνου που συνιστούν απόθεμα αυτοσυντηρούμενη κυττάρων με αποκλειστική δυνατότητα να αυτο-ανανέωση και να προκαλέσουν τα ετερογενή καταγωγές των καρκινικών κυττάρων που αποτελούν τον όγκο» [ ,,,0],14]. Αρκετοί δείκτες κυτταρικής επιφάνειας, συμπεριλαμβανομένων των CD24, CD44, CD133, CD166, EpCAM, ή βαφή εκροής προσδιορισμοί έχουν χρησιμοποιηθεί για να ταξινομήσει τους πληθυσμούς των υποθετικών καρκινικά βλαστικά κύτταρα από καλλιέργειες πρωτογενούς όγκου ή κυτταρικά εναιωρήματα που λαμβάνονται από βιοψίες όγκων. Μετά τη μεταμόσχευση σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια, όγκοι σχηματίζουν από αρκετές εκατοντάδες κύτταρα δείκτη-θετικό, ενώ για τα κύτταρα δείκτη-αρνητικός Οι τάξεις μεγέθους μεγαλύτερους αριθμούς που απαιτούνται για να επιτευχθεί το ίδιο συχνότητα του σχηματισμού όγκου (για μια ανασκόπηση βλέπε [15] Πρόσφατα, με τη χρήση. μια βελτιωμένη τεχνική ξενομεταμόσχευση, μια μελέτη με ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος έδειξε σχηματισμό όγκων μετά από τον εμβολιασμό ενός καρκινικών κυττάρων [16] και με αυτόν τον τρόπο ένα σημαντικό βήμα προς την απόδειξη της CSC ύπαρξη έγινε.

Για τα περισσότερα καρκινώματα, η πρόοδος προς την κακοήθεια συνοδεύεται από απώλεια της επιθηλιακής διαφοροποίησης και μια στροφή προς μια μεσεγχυματικά φαινότυπο (EMT) [17]. EMT επιδεινώνει την κινητικότητα και τη διεισδυτικότητα των πολλών τύπων κυττάρων και θεωρείται συχνά προϋπόθεση για τη διείσδυση όγκου και μετάσταση. EMT χαρακτηρίζεται από αυξημένη έκφραση των μεσεγχυματικών δείκτες (βιμεντίνη, θρομβοσπονδίνη, Ν-cadherin, βιτρονεκτίνη), αυξημένη έκφραση των ενώσεων εξωκυτταρικής μήτρας (κολλαγόνο IV και ινονηκτίνη), μειωμένη έκφραση των επιθηλιακών δεικτών (Ε-καδερίνης, occludin, δεσμοπλακίνη, και Mucin1), αλλοιωμένη θέση των παραγόντων μεταγραφής ( β-κατενίνης, σαλιγκάρι, Slug, Twist, Sox 10, και ΝΡκΒ) και ενεργοποίηση των κινασών (ERK1, ERK2, και ΡΙ3Κ /ΑΚΤ) [17]. Υπάρχουν επίσης πολυάριθμα παραδείγματα προηγμένων καρκινωμάτων που δείχνουν ότι μεσεγχυματικά κύτταρα μπορούν να επανακτήσουν τα χαρακτηριστικά των επιθηλιακών κυττάρων, μία διαδικασία που ονομάζεται μεσεγχυματικών σε επιθηλιακό μετάβαση (ΚΟΑ) [18]. Προφανώς, η επιθηλιακή φαινότυπος των καρκινικών κυττάρων και την ικανότητα να σχηματίζουν φυσικά εμπόδια αντιπροσωπεύουν ένα μηχανισμό που περιορίζει την πρόσβαση των φαρμάκων, αντισώματα, ή κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος στις θέσεις των όγκων. Έχει σκεφτεί ότι τόσο EMT και ΚΟΑ περιλαμβάνει κύτταρα σε μία μετασταθή υβριδική κατάσταση, π.χ. κύτταρα με χαρακτηριστικά των δύο επιθηλιακών και μεσεγχυματικών κυττάρων [19].

Οι μελέτες μας έχουν επικεντρωθεί στον καρκίνο των ωοθηκών. Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις γυναίκες και έχει το υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας όλων των καρκίνων του γυναικείου αναπαραγωγικού συστήματος. Περίπου 90% του ανθρώπινου καρκίνου των ωοθηκών προκύπτει από το επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών (ΟΣΕ). Η μεσοδερμικά προέρχεται κανονική ΟΣΕ δείχνει επιθηλιακών και μεσεγχυματικών χαρακτηριστικά, η οποία χαρακτηρίζεται από την έκφραση τόσο της κερατίνης και βιμεντίνης [20]. Είναι ενδιαφέρον, μόνο χαμηλά επίπεδα της E-cadherin είναι εμφανή στα κύτταρα του ΟΣΕ [21] και η έκφρασή του περιορίζεται σε κύστες ένταξης και βαθιές σχισμές, εντυπωσιακά σε περιοχές όπου οι αρχές της κακοήθη γεγονότα που πιστεύεται ότι συμβαίνουν [22]. Η ακεραιότητα του ΟΣΕ στρώματα διατηρείται κυρίως από Ν-cadherin, η οποία επισημαίνει περαιτέρω ο φαινότυπος επιθηλιακά /μεσεγχυματικά σε αυτόν τον ιστό [23], [24]. Πιστεύεται ότι τα κύτταρα του ΟΣΕ να προσαρμοστούν στις αλλαγές στο κυτταρικό μικροπεριβάλλον από μεταβάσεις μεταξύ επιθηλιακών και μεσεγχυματικών στάδια [20]. Αυτές οι ικανότητες συνήθως περιορίζεται σε ανώριμα, αναγέννηση, ή νεοπλασματικών επιθήλια και ως εκ τούτου καθιστούν ένα μοναδικό φαινοτυπική πλαστικότητα. Θεωρείται ότι αυτή η πλαστικότητα αποτελεί την αιτία του καρκίνου των ωοθηκών. Αξιοσημείωτα, καρκίνωμα ωοθήκης δείχνουν ένα μοναδικό χαρακτηριστικό, σε σύγκριση με άλλες μορφές καρκίνου που προέρχεται επιθηλιακά. Ενώ οι τελευταίες χαρακτηρίζονται από την απώλεια των επιθηλιακών ιδιοτήτων κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου, η αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης παρατηρείται για την πρωτογενή νεοπλαστικών επιθηλίων των ωοθηκών [25]. Ωστόσο, αυτή η αρχική μετατόπιση προς ένα πιο διαφοροποιημένο φαινότυπο νωρίς στην πρόοδο του όγκου φαίνεται τότε να ακολουθείται από μια επανάκτηση των χαρακτηριστικών μεσεγχυματικών σε πιο προχωρημένο όγκους των ωοθηκών, που περιλαμβάνει μια δευτερεύουσα απώλεια Ε-καδερίνης [26], [27], [28] . Είναι ενδιαφέρον ότι η επιθηλιακή /μεσεγχυματικά φαινότυπο εμφανής σε κύτταρα OSE [29] βρίσκεται επίσης στο μεταναστευτικό μέτωπο του παχέος εντέρου [30] και του καρκίνου του μαστού [31], και στην κανονική του επιδερμικού ιστού κατά τη διάρκεια αποκατάστασης τραύματος [32].

σε αυτή τη μελέτη, παρέχουμε συμπληρωματικά στοιχεία για ένα από τα βασικά χαρακτηριστικά της CSC, αποδεικνύοντας πλειοδυναμία, δηλαδή την ικανότητα να προκαλούν φαινοτυπικά ετερογενή θυγατρικά κύτταρα. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών αυτά τα χαρακτηριστικά συνδέονται αναπόσπαστα με τα φαινόμενα της EMT και ΚΟΑ.

Αποτελέσματα

πρωτογενείς καλλιέργειες καρκίνου των ωοθηκών περιλαμβάνει υποθετικό ΚΕΠ

Ιδρύσαμε 51 πολιτισμών καρκίνου των ωοθηκών από βιοψίες /ασκίτη βαθμού ΙΙΙ και IV καρκινώματα (Πίνακας S1). Μετά την πέψη των βιοψιών όγκου με κολλαγενάση και θρυψίνη, εναιωρήματα κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε επιθηλιακά βασικό μέσο συμπληρωμένο με EGF, ινσουλίνη, υδροκορτιζόνη, εκχύλισμα υπόφυσης βοοειδών (MEGM) και 1-2% FBS για μέχρι 5 ημέρες. Προκειμένου να επιβεβαιωθεί ογκογόνο δυναμικό τους και να εξαλειφθούν οι ινοβλάστες και τα λευκοκύτταρα, τα πρωτογενή κύτταρα εγχύθηκαν εντός του μαστικού στρώματος λίπους των ανοσοανεπαρκή SCID-beige (C.B-Igh-1b /GbmsTac-Prkdcscid-Lystbg Ν7) ποντικούς. Εννέα πρωτογενείς καλλιέργειες που σχηματίζεται ξενομοσχεύματος όγκους μετά την μεταμόσχευση του 1 × 10

6 κύτταρα (βλέπε πίνακα S1). Τα ξενομοσχεύματα συνέχεια αποκόπηκε, υπέστη πέψη με πρωτεάσες και καλλιεργήθηκαν σε MEGM με 10% FBS. Για έναν πολιτισμό, δευτερογενή και τριτογενή ξενομεταμόσχευση πραγματοποιήθηκε. Τμήματα και αναστολές της αρχικής βιοψίες που ονομάζεται ΕΗΦ-βιοψία, ovc805-βιοψία, κλπ? πρωτογενείς καλλιέργειες που προέρχονται από βιοψίες ασθενών ονομάστηκαν ovc316-PC, ovc805-PC, κλπ? τμήματα ή εναιωρήματα όγκου από ξενομοσχεύματος όγκους που προέρχονται από πρωτογενείς καλλιέργειες ονομάστηκαν ovc316-X, ovc805-X, κλπ? καλλιέργειες που προέρχονται από ξενομοσχεύματα ονομάστηκαν ovc316-XC, ovc805-XC, κλπ

Οι καλλιέργειες περιείχαν διαφορετικούς τύπους κυττάρων, με σαφώς διακριτά υποσύνολα που εκφράζουν διαφορετικούς δείκτες καρκίνου (π.χ. CA-125 ή CEA), η οποία θύμιζε το ετερογένεια των κυττάρων του όγκου φαίνεται από ανάλυση των τμημάτων του αρχικού όγκου ή του ξενομοσχεύματος όγκου (Σχήμα 1Α, αριστερά τρία πάνελ). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η ετερογένεια των κυττάρων του όγκου ήταν λιγότερο έντονη σε καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 όπως-IP1 (Σχήμα 1Α, δεξιό πλαίσιο).

Α) βιοψίες όγκων και πρωτογενείς καλλιέργειες χρωματίζονται θετικά για δείκτες καρκίνου των ωοθηκών CA-125 ( πράσινο) και CEA (κόκκινο) και δείχνουν υψηλότερη ετερογένεια από την καθιερωμένη κυτταρική γραμμή SKOV3-IP1. Εμφανίζονται είναι ovc316-biospy, ovc316-PC, και ovc316-X. Ανάλυση των ovc1208-βιοψία, ovc1208-PC, ovc0117-βιοψία, ovc0117-PC, ovc100506-βιοψία, και ovc100506-PC αποκάλυψε η ίδια ετερογένεια. Β) Φως μικροσκόπιο των ωοθηκών πολιτισμού καρκίνου ovc316-XC. Η καλλιέργεια περιέχει δύο διακριτά πληθυσμούς σε σχέση με θρυψίνη ευαισθησία. Αριστερός πίνακας: μια πρώιμη καλλιέργεια πέρασμα χωρίς θεραπεία (αριστερά), μετά από 10 λεπτά θεραπείας θρυψίνη (κέντρο), και μετά από θρυψίνη ευαίσθητα κύτταρα απομακρύνθηκαν (δεξιά). Δεξιό πλαίσιο: σχηματισμός όγκου μετά από μεταμόσχευση θρυψίνη ανθεκτικά (TR) και θρυψίνη-ευαίσθητων κυττάρων (TS) σε SCID-beige ποντικούς. σχηματισμός όγκου αξιολογήθηκε 3 μήνες μετά τον εμβολιασμό. TIC TR: 1/185, TIC TS: 1/109. Chi-square = 0,0524. Ανάλυση C) ανοσοφθορισμού για έναν δείκτη ανθρώπινο ειδικό μιτοχονδριακή (ΜΧ), το CEA δείκτη καρκίνου, της επιθηλιακής δείκτη Ε-καδερίνης, και το μεσεγχυματικών λαμινίνη δείκτη σε κλωνικές καλλιέργειες που προέρχονται από ovc316-XC. Κλωνικές καλλιέργειες περιέχουν ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα είτε με επιθηλιακά (άνω πάνελ), μεσεγχυματικά (κέντρο) ή και τα δύο φαινοτύπους (Ε /Μ υβριδικό κλώνο, χαμηλότερα). Δ) τις ικανότητες των όγκων που σχηματίζουν μετά τη μεταμόσχευση των 10

5 κύτταρα Ε, Μ, ή Ε /Μ σε SCID-μπεζ ποντίκια. σχηματισμός όγκου αξιολογήθηκε 4 μήνες μετά τον εμβολιασμό. Ε) ξενομοσχεύματος όγκους που προέρχονται από Ε /Μ υβριδικούς κλώνους. Η ανθρώπινη προέλευση των κυττάρων του όγκου δείχνεται με χρώση για έναν άνθρωπο ειδικό δείκτη μιτοχόνδρια (πράσινο). Η χρώση για το επιθηλιακό αντιγόνο AE1 /3 και του αντιγόνου όγκου CEA αποκαλύπτει φαινοτυπική ετερογένεια σε όγκους που προέρχονται από κλωνική /Μ καλλιέργειες. Λαμινίνη-έκφραση περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό vascularized περιοχές. ΣΤ) Η &? Ε χρώση ενός ξενομοσχεύματος που προέρχεται από ένα ovc316-XC E /M κλώνος και από βιοψία ασθενή (ovc316-βιοψία) δείχνοντας ότι ξενομοσχεύματα από μοιάζουν με το ιστολογία των ανθρώπινων όγκων

in situ

. Το μπαρ κλίμακα είναι 40μm.

Η

Λαμβάνοντας υπόψη την φαινοτυπική ετερογένεια του καρκίνου των ωοθηκών, ο στόχος της μελέτης μας ήταν να απομονωθούν διαφορετικά κυττάρων υποσύνολα πρωτογενείς καλλιέργειες καρκίνου των ωοθηκών και να τα ελέγξετε για τις παραμέτρους που έχουν συσχετιστεί με τον καρκίνο βλαστικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, pluripotency και ογκογονικότητα. Φως ανάλυση μικροσκοπία καλλιεργειών ξενομοσχεύματος (π.χ. ovc316-XC) αποκάλυψε χαρακτηριστικό επιθηλιακά υποσύνολα που περιείχαν πολυμορφικά κύτταρα, τα οποία εκφράζονται επίσης μεγάλες ποσότητες της εξωκυττάριας μήτρας πρωτεΐνης λαμινίνη στο ενδιάμεση φάση να περιβάλλει μη επιθηλιακά κύτταρα. Σε καλλιέργεια τα επιθηλιακά κυτταρική υποσύνολα έδειξαν υψηλότερη αντοχή σε επεξεργασία με θρυψίνη (Σχήμα 1Β). Εμείς διαχωρίζονται τα κύτταρα από νωρίς περάσματα. (Ρ & lt? 6) σε δύο κλάσματα με βάση την θρυψίνη αντίσταση, και δοκιμαστεί ογκογονικότητα τους σε SCID-beige ποντικούς, αλλά καμία διαφορά στην ικανότητα σχηματισμού όγκου παρατηρήθηκε (Σχήμα 1Β, δεξιό πλαίσιο)

Όπως έγινε στο παρελθόν σε μια προηγούμενη μελέτη που ανέλυσε την κυτταρική αντίσταση στην ογκολυτικού αδενοϊούς [33], ιδρύσαμε 100 καλλιέργειες των κλώνων κυττάρων που προέρχονται από νωρίς το πέρασμα κύτταρα ovc316-XC. Οι κλώνοι επεκτάθηκαν και αναλύθηκαν για ειδική ανθρώπου και του καρκίνου δείκτες (για να αποκλειστεί η παρουσία στρωματικών κυττάρων ποντικού), καθώς και τα επιθηλιακά και δείκτες μεσεγχυματικών (Σχήμα 1 C). Ένα σύνολο 20% των προκυπτόντων καλλιέργειες περιορίζονται σε έναν επιθηλιακό φαινότυπο (Ε-καδερίνης θετικό? «Επιθηλιακά κλώνος»), ενώ το 19% ήταν μεσεγχυματικά (λαμινίνη θετικό «, μεσεγχυματικά κλώνος»). Το υπόλοιπο 61% των κλώνων καλλιέργειες περιείχαν αμφότερα τα επιθηλιακά και μεσεγχυματικά κύτταρα, εκτός από τα κύτταρα που ήταν θετικά για τους δύο δείκτες επιθηλιακής και μεσεγχυματικής (Σχήμα 1 C). Ζητήσαμε αυτά τα επιθηλιακά κύτταρα /μεσεγχυματικά (Η /Μ) υβριδικά κύτταρα. Κλωνική επιθηλιακών και μεσεγχυματικών πολιτισμοί είχαν περιορισμένη μακροπρόθεσμη πολλαπλασιαστικού δυναμικού (20-25 περάσματα μεσεγχυματικά, 20-40 περάσματα επιθηλιακά πολιτισμών, αντίστοιχα). Αξίζει να σημειωθεί ότι, κατά τη διάρκεια πέρασμα, τα κύτταρα σε μία από τις 20 επιθηλιακών κλώνοι έχασαν μεμβράνη Ε-καδερίνης και κλαουδίνης 7 και απέκτησε την παραλλαγή μεσεγχυματικά μεταγραφή του ρ120 κατενίνης [33], υποδεικνύοντας ότι υποβλήθηκε σε ΕΜΤ (Σχήμα S1).

Είναι σημαντικό, μόνο καλλιέργειες που περιέχουν Ε /Μ κύτταρα ήταν σε θέση να σχηματίσουν όγκους σε SCID-μπεζ ποντίκια μέσα σε 4 μήνες, όταν 10

5 κύτταρα (δίοδος 6) ενέθηκαν (Σχήμα 1D). Οι όγκοι που εμφανίζονται φαινοτυπική ετερογένεια, που περιέχονται στρώματος του όγκου και οι αγγείωση (Σχήμα 1Ε). Συνολικά, ιστολογία όγκων που προέρχονται από μεταμοσχευμένα κλωνική E κύτταρα /M ήταν παρόμοια με εκείνη του όγκου του ασθενούς (Σχήμα 1 F). Serial μεταμόσχευση κυττάρων που προέρχονται από αυτούς τους όγκους έδωσε επίσης την ανάπτυξη νέων όγκων (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Σημαντικά, αυτή η μελέτη δείχνει ότι ένα μόνο κύτταρο μπορεί να σχηματίσει έναν κλώνο που είναι μεταγενέστερα σε θέση να σχηματίσουν μια ετερογενή όγκου. Αυτό υποδεικνύει ότι η αρχική κελί ήταν ένας πιθανός καρκίνος βλαστοκυττάρων, με την ικανότητα διαφοροποίησης, αυτο-ανανέωση, και σχηματίζουν έναν όγκο. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι πρωτογενείς καλλιέργειες καρκίνου των ωοθηκών είναι φαινοτυπικά ετερογενής και ότι τα ογκογενή κύτταρα φαίνεται να έχουν γνωρίσματα των μεσεγχυματικών και επιθηλιακών κυττάρων (Ε /Μ).

Cells στην περιφέρεια του θρυψίνη ανθεκτικών υποσύνολα περιέχει επιθηλιακά-μεσεγχυματικά υβριδικό (Η /Μ) κύτταρα που συν-λεκέ με δείκτες βλαστικών κυττάρων

Έχοντας βρει μια πιθανή σύνδεση μεταξύ των κυττάρων, όπως επιθηλιακά και /μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά ογκογόνων καρκινικών βλαστικών στις καλλιέργειες κλώνων από ovc316-XC, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις ανοσοφθορισμού των πρωτογενείς καλλιέργειες καρκίνου των ωοθηκών (που προέρχεται από βιοψίες ή ξενομοσχεύματα) με έναν αριθμό δεικτών επιθηλιακών και μεσεγχυματικών (Σχήμα 2). Εμείς επικεντρώθηκε ανάλυσή μας σε κύτταρα που απομονώθηκαν από ξενομοσχεύματα και είχε μόλις (πέρασμα 0/1) ή πρόσφατα (διόδους 6-10) προσαρμοσμένο να ιστοκαλλιέργειας, και περιείχε μεγάλες αναλογίες τρυψίνης ανθεκτικών υποσύνολα. Αυτά τα υποσύνολα χρωματίστηκαν θετικά για τους δείκτες επιθηλιακής Ε-καδερίνης, claudin7 και EpCAM στην πλευρική κυτταρικές μεμβράνες (Σχήματα 2Α, Β). Κύτταρα που περιβάλλουν τα επιθηλιακά υποσύνολα ήταν αρνητικά για αυτούς τους δείκτες στην πλευρική μεμβράνες τους και χρωματίστηκαν για μεσεγχυματικών πρωτεΐνες βιμεντίνη και λαμινίνη. Περαιτέρω ανάλυση για το E-cadherin αποκάλυψε φαινοτυπική ποικιλότητα εντός των πολιτισμών ovc316-XC. Παρατηρήθηκαν δύο τύπους κυττάρων που εντοπίζονται Ε-καδερίνης σε μεμβράνες τους, μεμβράνη Ε-καδερίνης

υψηλή και μεμβράνη Ε-καδερίνης

χαμηλή (Σχήμα 2Α, κάτω πάνελ, εισάγετε # 2 και 3 #). Ένας τρίτος τύπος κυττάρων που γειτνιάζουν με μεμβράνη Ε-καδερίνης

υψηλής κύτταρα περιείχαν σαφώς ανιχνεύσιμη Ε-καδερίνης στο κυτταρόπλασμα /πυρήνα (Σχήμα 2Α, κάτω πάνελ, εισάγετε # 2). Κυτταροπλασματικά E-cadherin

υψηλής κύτταρα χρωματίστηκαν επίσης θετικά για δείκτες μεσεγχυματικών κυττάρων, όπως λαμινίνη, καθώς και καλδεσμόνη-1 (α μυελοειδή δείκτη), η ενδοθηλιακή /δείκτες ενδοθηλιακών προγονικών CD31, και VCAM-1 (Σχήμα S2A). E-cadherin

υψηλή E /M-κύτταρα εξέφρασαν επίσης υψηλά επίπεδα της αγγειοποιητίνη υποδοχέα Tie2 (Σχήμα S2A, δεξί πάνελ). Αξίζει να σημειωθεί ότι, Tie2 είναι ένας δείκτης για αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα που βρίσκεται επίσης σε μια σειρά επιθηλιακών όγκων [34], [35].

Α) Ανάλυση της Ε-καδερίνης (πράσινο) και λαμινίνη (κόκκινο) σε καλλιέργειες καρκίνου των ωοθηκών. Μεγέθυνση σήμανση περιοχών εμφανίζεται στο κάτω μέρος: Α1) E-cadherin

αρνητικά κύτταρα εκφράζουν λαμινίνη. Α2) Επιθηλιακά /μεσεγχυματικά (Ε /Μ) υβριδικών κυττάρων: Ε-καδερίνης

χαμηλή κύτταρα εμφανίζουν κυρίως κυτταροπλασματική εντόπιση της Ε-καδερίνης και υψηλή έκφραση λαμινίνης. E-cadherin

υψηλής κύτταρα περιέχουν αυξημένα επίπεδα της μεμβράνης E-cadherin και μικρότερες ποσότητες λαμινίνη. Α3) E-cadherin

θετικά κύτταρα έχουν ένα αυξημένο μέγεθος κυττάρων και διατηρεί χαμηλότερα επίπεδα σαφώς μεμβράνη εντοπισμένη Ε-καδερίνης από Ε-καδερίνης

υψηλής κύτταρα. έκφραση λαμινίνη είναι σχεδόν απούσα στο E-cadherin

θετικά κύτταρα (επάνω δεξιά πάνελ). Β) Ανάλυση για επιπλέον δείκτες επιθηλιακά (πράσινο) και τα μεσεγχυματικά (κόκκινο) επιβεβαιώνει την ύπαρξη των υβριδικών κυττάρων Ε /Μ σε καλλιέργειες ovc316-XC. Επιθηλιακά δείκτη

υψηλής κύτταρα είναι σε άμεση γειτνίαση με μεσεγχυματικά δείκτη

υψηλής κύτταρα και λεκέ διπλά θετικά σε περιοχές που περιέχουν σφαίρες. Στο αριστερό και το μεσαίο πάνελ, σημειώστε ότι όλα τα κύτταρα είναι θετικά για βιμεντίνη και CD44. Γ) CD133 σηματοδοτεί περιοχές που περιέχουν Ε-cadherin

υψηλή και E-cadherin

χαμηλή κύτταρα. Δ) E-cadherin

υψηλή και E-cadherin

χαμηλή κύτταρα δείχνουν ισχυρή συν-σήμανση με τα EMT-επαγωγείς σαλιγκάρι, Twist, και NGAL. Το μπαρ κλίμακα είναι 40μm. Εμφανίζονται είναι εικόνες από ovc316-XC. Ανάλυση ανοσοφθορισμού της ovc0117-PC, ovc0122-PC, ovc100506-XC, και ovc100728-XC αποκάλυψε παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Πολιτισμών στο πέρασμα 0/1 γενικά έδειξαν υψηλότερη συνολική έκφραση των δεικτών των επιθηλιακών και μεσεγχυματικών από τις καλλιέργειες σε περάσματα 6-10 και σχηματίστηκε 3 διαστάσεων συγκροτήματα κύτταρο /σφαιρίδια που περιέχουν υβριδικά κύτταρα Ε /Μ σε υψηλά πολλαπλασιαστική περιοχές (Σχήμα 2Β). Η Ε /Μ υβριδικό στάδιο των κυττάρων (μέσα σε σφαίρες) επιβεβαιώθηκε με διπλή χρώση με άλλα επιθηλιακά δείκτες (EpCAM, claudin7) και δείκτες μεσεγχυματικών (Ν-cadherin, βιμεντίνη). Επιπλέον, σφαίρες χρωματίστηκαν για EpCAM και τον δείκτη κυττάρων μεσεγχυματικού στελέχους CD44. Συγκεκριμένα, τα περισσότερα κύτταρα χρωματίστηκαν για EpCAM, CD44, και βιμεντίνη (Σχήμα 2Β), υποδηλώνοντας ότι τα σήματα ΕρΟΑΜ /CD44 υποτιμούν την φαινοτυπική ποικιλομορφία εντός πρώιμο πέρασμα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Η καλύτερη διάκριση μεταξύ των διαφόρων υποσυνόλων επιτεύχθηκε με Ε-καδερίνης σε συνδυασμό με ένα μεσεγχυματικά δείκτη ή CD44. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε αυτό το συνδυασμό δείκτης για τον χαρακτηρισμό περισσότερα από τα επακόλουθα πειράματα. Όταν αναλύθηκαν για E-cadherin και την υποτιθέμενη καρκινικά βλαστικά δείκτη CD133, δύο υποκλάσματα του CD133 θετικά κύτταρα γίνονται εμφανείς CD133

+ /E-cadherin

υψηλή και CD133

+ /E-cadherin

χαμηλή κύτταρα (Σχήμα 2C). Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζει περαιτέρω το ρόλο της E-cadherin ως πιθανό δείκτη διακρίσεις για τον καρκίνο των κυττάρων υποσύνολα. Τα κύτταρα εντός του Ε /Μ πληθυσμό κυττάρων (ιδιαίτερα Ε-καδερίνης

χαμηλή κύτταρα) εξέφρασε επίσης άλλους δείκτες που είναι χαρακτηριστικές των βλαστικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων Nanog, Oct 4, και Sox2 (Σχήμα S2B). E /M κύτταρα, ιδιαίτερα τα κύτταρα στις σφαίρες, ήταν επίσης πολύ θετικό για τους επαγωγείς EMT σαλιγκάρι, Twist και NGAL (Σχήμα 2D). Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι τα κύτταρα που ήταν χαμηλή σε μεμβράνη κλαουδίνης 7 εντοπίζεται κατά κύριο λόγο β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα /πυρήνα (Σχήμα S2C). Μετάβαση της βήτα-κατενίνης από την κυτταρική μεμβράνη προς τον πυρήνα είναι ένα πρώιμο γεγονός στην EMT

Σε γενικές γραμμές, οι μελέτες ανοσοφθορισμού δείχνουν την ύπαρξη δύο CD133

+ κλάσματα.? i) μεμβράνη E-cadherin

υψηλή και ii) κυτταροπλασματική E-cadherin

υψηλή /μεμβράνη E-cadherin

χαμηλή κύτταρα. Κυτταροπλασματική E-cadherin

υψηλή /μεμβράνη E-cadherin

χαμηλή κύτταρα φέρουν τα χαρακτηριστικά των άλλων κυτταρικών σειρών και, ως εκ τούτου, το πιθανότερο, αντιπροσωπεύουν πρωτόγονα προγονικά κύτταρα ή αρχέγονα κύτταρα.

Αλλαγή του φαινοτύπου, EMT και διαφοροποίηση

in vitro

: κυτταρομετρία ροής μελέτες

για την ποσοτικοποίηση του αριθμού των κυττάρων με επιθηλιακών και μεσεγχυματικών φαινοτύπων σε καλλιεργημένα κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε κυτταρομετρία ροής και μετά από κύτταρα παρακολούθησης για το επιθηλιακό EpCAM δείκτη, καθώς και παρακολούθησης για vimentin ή CD44 σήμανση των κυττάρων με χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά. Επιπλέον, για να οριοθετηθούν φαινοτυπικές αλλαγές υπερωρίες όπως έναρξη της EMT, αναλύσαμε διαφορετικά περάσματα των κυττάρων ovc316-XC (Σχήμα 3). Αυτές οι μελέτες αποκάλυψαν μια σειρά από ενδιαφέρουσες παρατηρήσεις. i) Σε καρκινικών κυττάρων αναστολές που είχαν πρόσφατα απομονωθεί από ξενομοσχεύματα, η πλειονότητα των κυττάρων ήταν είτε κύτταρα Ε /Μ (EpCAM

υψηλή /βιμεντίνης

υψηλή, EpCAM

υψηλή /CD44

υψηλή) Ε ή β-κύτταρα (EpCAM

υψηλή /βιμεντίνης

χαμηλή, EpCAM

υψηλή /CD44

χαμηλή), ωστόσο, στο χωρίο θα μπορούσε να ανιχνευθεί 1 μόνο κύτταρα Ε /Μ, υποδεικνύοντας ότι η πλειονότητα των κυττάρων που λαμβάνονται από ξενομοσχευμάτων που προσαρμόζονται σε καλλιέργεια ιστού είναι E /Μ (Σχήμα 3Α). Αυτό σημαίνει ότι, ακόμη και σε πρώιμο πέρασμα, πολιτισμών δεν αντανακλούν επαρκώς την κυτταρική σύνθεση του όγκου

in situ

. Πέρασμα 1 περιείχε EpCAM

υψηλή /CD44

υψηλή /βιμεντίνης

υψηλή και EpCAM

υψηλή /CD44

χαμηλή /βιμεντίνης

χαμηλή κύτταρα. ii) Είναι σημαντικό κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας των κυττάρων σε MEGM περιέχουν αυξητικούς παράγοντες /FBS (βλέπε αποσπάσματα 1, 5, 7, 20), τόσο το EpCAM

υψηλή /CD44

υψηλή /βιμεντίνης

υψηλή ή EpCAM

υψηλή /CD44

χαμηλή /βιμεντίνης

χαμηλή τύπους κυττάρων εξαφανίστηκαν και αντικαταστάθηκαν από EpCAM

χαμηλή /CD44

υψηλή /βιμεντίνης

υψηλής κύτταρα. Αυτό δείχνει ότι τα κύτταρα Ε /Μ διαφοροποιούνται σε μεσεγχυματικά κύτταρα

in vitro

σε μια EMT-όπως τρόπο. iii) Η πλειοψηφία των CD133

+ κύτταρα είναι Ε /Μ υβριδικά κύτταρα. Μετά την δίοδο σε καλλιέργεια κυττάρων ovc316-XC χάνουν γρήγορα την έκφραση CD133 ταυτόχρονα με την απώλεια των επιθηλιακών χαρακτηριστικά.

Α) Triple-χρώματος ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των αναστολών ξενομοσχεύματος /βιοψία κυττάρων και καλλιεργημένα κύτταρα

in vitro

σε διάφορα περάσματα. Αριστερό πλαίσιο: EpCAM /CD44 /CD133. Δεξιά πίνακα: EpCAM /vimentin /CD133. Β) Πέρασμα 1 και 5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε 14 ημέρες αυξητικού παράγοντα /FCS πείνα και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Εμφανίζονται είναι τα δεδομένα από ovc316-X και ovc316-XC. Τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν σε αιωρήματα κυττάρων από βιοψίες και πρωτογενείς καλλιέργειες (ovc100506-βιοψία, ovc100506-PC, ovc100728-βιοψία, και 100914). Γ) Ανάλυση ανοσοφθορισμού της διόδου 3 και 18 καλλιέργειες ovc316-XC. Τα κύτταρα στα πρώτα περάσματα (δίοδος 3) έχουν αυξημένα επίπεδα της Ε-καδερίνης και λαμινίνη σε σύγκριση με πέρασμα 18. Τα κύτταρα τα μεγέθη αυξήθηκαν και σφαίρα-ανάπτυξη σε υψηλές πυκνότητες κυττάρου μειώνεται σημαντικά σε υψηλές περάσματα. Ποσοστό πλευρά πληθυσμού (SP) θετικά κύτταρα παρουσιάζονται παρακάτω. Το μπαρ κλίμακα είναι 40μm. Δ) Ο σχηματισμός όγκου μετά τη μεταμόσχευση των 3 και 18 κύτταρα ovc316-XC πέρασμα σε SCID-μπεζ ποντίκια (αξιολογούνται τέσσερις μήνες μετά τον εμβολιασμό). TIC P3: 1/110, TIC Ρ18: 1/744. Chi-square:. 0.245

Η

Βρήκαμε επίσης ότι για μια σειρά από περάσματα πείνα μπορεί να καθυστερήσει τη διαφοροποίηση και την απώλεια του επιθηλιακού φαινοτύπου, ενώ τα επίπεδα της CD133 μειωθεί ελαφρώς κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας (Σχήμα 3Β). Συνολικά, βρήκαμε ότι πρωτογενείς καλλιέργειες καρκίνου των ωοθηκών δείξει περισσότερα σφαίρα σχηματισμός όταν καλλιεργούνται χωρίς αυξητικούς παράγοντες (Σχήμα S3).

Έχοντας εντοπίσει Ε-καδερίνης ως δείκτη ικανά διαφοροποίησης κυτταρικών υποσυνόλων, επαναλάβαμε αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής με E -cadherin (Σχήμα S3). Διαφοροποίηση αντανακλάται επίσης από τη μείωση των επιπέδων της Ε-καδερίνης και λαμινίνη μετά πέρασμα. Ενώ χαμηλές καλλιέργειες πέρασμα περιείχαν υψηλούς αριθμούς σφαιρών, Ε-καδερίνης

υψηλής κύτταρα και υπερβολικές ποσότητες λαμινίνη, κύτταρα υψηλής διαβιβάσεως έδειξαν σημαντικά μειωμένη ανάπτυξη σφαίρα και τα χαμηλά επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών ενώ το μέγεθος των κυττάρων αυξήθηκαν (Εικόνα 3C). Αυτό επιβεβαιώθηκε επίσης σε κυτταρομετρία ροής μελέτες των αποσπασμάτων 1, 3, και 7 (Σχήματα S3A-C). Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η μεσεγχυματικά (E-cadherin

αρνητική /χαμηλή) υπο-κλάσματος αυξάνεται κατά τη διάρκεια διαβίβαση και την ταυτόχρονη EMT. CD133

+ κυττάρων ήταν ιδιαίτερα θετικά για CD44 (Σχήμα S3A). Αναλύσαμε επίσης μεμβράνης Τίε2 σε συσχετισμό με E-cadherin (Σχήμα S3b). Με ανάλυση ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα Tie2 έχουν επιθηλιακά φαινότυπο και είναι χαμηλότερες σε CD44 από CD133

+ κύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ένας συσχετισμός μεταξύ Ε /Μ φαινότυπο, CD133 /CD44-θετικότητα, και ογκογονικότητα υποστηρίζεται επίσης από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κλωνικών καλλιεργειών (Σχήμα S3C). Μόνο Ε /Μ κλώνους περιείχε σημαντικές ποσότητες CD133

+ κυττάρων με αυξημένη έκφραση του CD44 (και όπως φαίνεται νωρίτερα, μόνο Ε /Μ κλώνοι σχηματίζονται όγκοι). Η απώλεια της «βλαστικών κυττάρων» χαρακτηριστικά κατά τη διάρκεια της ανακαλλιέργεια αντανακλάται επίσης με αναγωγή του κλάσματος του πληθυσμού πλευρά (SP) κύτταρα από 7,8 ± 0,5% κατά δίοδος 3) σε 2,1 ± 0,3% κατά διόδου 18 (σχήμα 3C). Ο φαινότυπος SP κύτταρο έχει συσχετιστεί με τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων σε προηγούμενες μελέτες του καρκίνου των ωοθηκών [36]. Τέλος, η απώλεια του CD133

+ και Η /Μ κυττάρων συσχετίζεται με μειωμένη ικανότητα να σχηματίζουν όγκους (Σχήμα 3D).

Γενικά, παρατηρήσαμε μια εντυπωσιακή διαφορά των φαινοτύπων μεταξύ των κυττάρων

in vivo

και

in vitro

. Τα κύτταρα που προσαρμόζονται σε ιστοκαλλιέργεια ήταν κύτταρα CD133

+ E /M. Μετά την δίοδο Ε /Μ κύτταρα διαφοροποιούνται σε μεσεγχυματικά κύτταρα σε ένα EMT τον ίδιο τρόπο. Η διαδικασία αυτή συνοδεύεται από μια μείωση της ογκογονικότητας.

Παρουσία των υποσυνόλων κυττάρων Ε /Μ

in situ

Η

Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι πολιτισμοί των ωοθηκών καρκίνο, ιδιαίτερα σε αργά περάσματα, μόνο αντανακλούν ανεπαρκώς τον φαινότυπο των όγκων

in situ

, εστιάσαμε ανοσοφθορισμό μας και κυτταρομετρία ροής αναλύσεις σε τομές βιοψιών όγκου ή ξενομοσχευμάτων, ή εναιωρήματα κυττάρων που αποκτάται με πέψη κολλαγενάσης των όγκων (Σχήμα 4). Ανοσοφθορισμός αναλύσεις τομών από ξενομοσχεύματα που συγκομίζονται την εβδομάδα 10 μετά τη μεταμόσχευση των κυττάρων του όγκου (Σχήμα 4) ή τμήματα του βιοψιών ασθενούς (Πίνακας S1, Εικόνα S4) έδειξαν ότι οι όγκοι

in situ

έχουν ομάδες κυττάρων /Μ (EpCAM

+ /vimentin

+), καθώς και συστάδες των επιθηλιακών κυττάρων (E-cadherin

+ /βιμεντίνης

-) (Εικόνα 4Α). Σε ξενομοσχεύματα, φωλιές των Ε /Μ και επιθηλιακά κύτταρα που περιβάλλονται από στρώματα λαμινίνη. Παρατηρήσαμε επίσης costaining Ε-καδερίνης και Tie2 (Σχήμα 4Β). CD133

υψηλής κύτταρα (μπλε) είναι Τίε2

χαμηλή και E-cadherin

χαμηλή (Σχήμα 4Β, κάτω πάνελ). Μια ενδιαφέρουσα μοτίβο παρατηρήθηκε όταν διπλή χρώση με E-cadherin και CD133 ως CD133 θετικά κύτταρα βρέθηκαν στην περιφέρεια του όγκου, σε περιοχές της ενεργού ανάπτυξης του όγκου (Σχήμα S5A). Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν είναι όλα τα

+ κύτταρα CD133 ήταν κύτταρα Ε /M. Εντός CD133

+ κύτταρα, βρήκαμε δύο υποομάδες κυττάρων /Μ όπως περιγράφεται προηγουμένως για τις in vitro μελέτες (Εικόνα 4C, τα μεγαλύτερα μεγέθυνση στην Εικόνα S5B). Είναι ενδιαφέρον ότι το CD133

υψηλή /μεμβράνη E-cadherin

χαμηλή υποσύνολο

in situ

έδειξε την παρουσία της E-cadherin μέσα κυτταροπλασματική κυστίδια περισσότερα προφανώς από

in vitro

. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με τη χρήση ξενομοσχευμάτων όγκων ήταν αντιπροσωπευτικές για τη χρώση των τμημάτων όγκου από εννέα διαφορετικούς ασθενείς (Πίνακας S1, Εικόνα S4).

Α) Ύπαρξη υβριδικών κυττάρων Ε /Μ

in situ

. E-cadherin

+ /vimentin

+ κύτταρα είναι παρόντα βιοψίες και ξενομοσχεύματα όγκου. Εμφανίζονται είναι εικόνες των ovc316-βιοψία και ovc316-X. Παρόμοια χρώση βρέθηκε για ovc100506-βιοψία /ovc100506-X, ovc100728-βιοψία /ovc100728-Χ, και ovc100914-βιοψία /ovc100914-X. Β) Συσχέτιση της Ε-καδερίνης (πράσινο) και Tie2 (κόκκινο) θετικότητα σε βιοψίες καρκίνου των ωοθηκών. CD133

υψηλής κύτταρα (μπλε) είναι Τίε2

χαμηλή και E-cadherin

ενδιάμεσο. Εμφανίζονται είναι εικόνες των ovc316-βιοψία και ovc316-X. Παρόμοια χρώση βρέθηκε για ovc100506-βιοψία /ovc100506-X, ovc100728-βιοψία /ovc100728-Χ, και ovc100914-βιοψία /ovc100914-X. Γ) CD133

υψηλής κύτταρα έχουν χαμηλά επίπεδα της μεμβράνης E-cadherin. E-cadherin

υψηλής κύτταρα δείχνουν punctated μεμβράνης χρώση CD133. Εμφανίζονται είναι εικόνες των ovc316-βιοψία και ovc316-X. Παρόμοια χρώση βρέθηκε για ovc100506-βιοψία /ovc100506-X, ovc100728-βιοψία /ovc100728-Χ, και ovc100914-βιοψία /ovc100914-X. Το μπαρ κλίμακα είναι 40μm. D-F) Τρι-χρώμα ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του ovc316-X για τα επιθηλιακά δείκτες (χ-άξονας), τα χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά (άξονας γ), και για τον καρκίνο του δείκτη βλαστικών κυττάρων CD133 (οικόπεδα ιστόγραμμα). Δ) Ξενομοσχεύματα περιέχουν επιθηλιακά κύτταρα, επιθηλιακά /μεσεγχυματικά (Ε /Μ) υβριδικά κύτταρα, και τα κύτταρα που είναι αρνητικά για όλους τους δείκτες. CD133

+ κύτταρα είναι σχεδόν αποκλειστικά σε Ε /Μ υβριδικό στάδιο βασίζεται στην ανάλυση EpCAM /CD44. CD133

υψηλής κύτταρα είναι EpCAM

υψηλή, CD44

υψηλή και βιμεντίνης

χαμηλή. Ε) Αντικατάσταση του EpCAM με E-cadherin αποκαλύπτει μεγαλύτερη ποικιλότητα εντός ξενομοσχευμάτων. CD44

υψηλής κύτταρα E-cadherin

χαμηλή /ενδιάμεση. CD133 είναι

+ κύτταρα διαιρούνται σε δύο σαφείς υπο-κλάσματα. Κλάσμα 1: E-cadherin

χαμηλή /ενδιάμεση /CD44

υψηλή και το κλάσμα 2: E-cadherin

υψηλή /CD44

ενδιάμεσο.