Αφηρημένο

Επίμονη HPV λοίμωξη παίζει σημαντικό ρόλο στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Η μελέτη αυτή έγινε για να προσδιορίσει τους τύπους του HPV σε μία ομάδα των ινδικών γυναικών με τοπικά προχωρημένο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, καθώς και για τον προσδιορισμό της φυσικής κατάστασης ή /και το site της ιογενούς ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του ξενιστή. Η προεπεξεργασία βιοψίες (n = 270) από ασθενείς εξετάστηκαν για HPV λοίμωξη με δοκιμασία HPV γονοτύπησης υψηλής απόδοσης βασισμένο σε Luminex τεχνολογία xMAP καθώς ΜΥ09 /11 PCR και SPF1 /2 PCR. Συνολικά θετικότητα HPV παρατηρήθηκε να είναι 95%, με HPV16 είναι οι πλέον συχνές (63%) που ακολουθείται από μόλυνση με HPV 18. κατάσταση ενσωμάτωσης του ιού εντοπίστηκε χρησιμοποιώντας Ενίσχυση των θηλωμάτων Oncogene μεταγραφές (APOT) δοκιμασία σε ένα υποσύνολο των θετικών δειγμάτων για HPV16 ή /και HPV18 (n = 86), και με την κατάλληλη παρακολούθηση. Τα δεδομένα συσχετίζονται με την κλινική έκβαση των ασθενών. Ενσωμάτωση του γονιδιώματος του ιού παρατηρήθηκε στο 79% των περιπτώσεων και μια προτίμηση για την ένταξη στην χρωμοσωμικές θέσεις 1π, 3q, 6q, 11q, 13q και 20q είχε δει. Κλινικών δεδομένων αποκάλυψε ότι η φυσική κατάσταση του ιού (ολοκληρωμένη ή επισωμική) θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός προγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Das P, Thomas A, Mahantshetty U, Shrivastava SK, Deodhar Κ, Mulherkar R (2012) HPV Γονοτυπικές και του δικτυακού τόπου της ιικής ενσωμάτωσης στους καρκίνους του τραχήλου στην ινδική γυναίκες. PLoS ONE 7 (7): e41012. doi: 10.1371 /journal.pone.0041012

Επιμέλεια: Torbjörn Ramqvist, του Ινστιτούτου Καρολίνσκα, στη Σουηδία

Ελήφθη: 17, Φεβ 2012? Αποδεκτές: 15 Ιούνη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 Ιούλη, 2012

Copyright: © 2012 Das et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς επιθυμούν να εκφράσουν την ευγνωμοσύνη τους για την οικονομική στήριξη από τον καρκίνο των Γυναικών Πρωτοβουλία IRG # 634. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ο τρίτος συχνότερος καρκίνος μεταξύ των γυναικών σε όλο τον κόσμο και η πιο κοινή μορφή καρκίνου που βρέθηκαν στην ινδική γυναίκες. HPV λοίμωξη έχει αποδειχθεί ότι παίζουν ένα κρίσιμο, αν και όχι επαρκή, ρόλο στην αιτιολογία των καρκίνων του τραχήλου. Μέχρι σήμερα έχουν περισσότερα από 200 τύπους HPV έχουν αναφερθεί, από τα οποία HPV16 είναι η πιο κοινή, ακολουθούμενη συνήθως από HPV18, HPV45, HPV31 και HPV33 [1], [2]. Οι περισσότεροι από τους HPV υψηλού κινδύνου (-HPV HR) λοιμώξεις (90%) υποχωρούν αυθόρμητα και μόνο σε περίπου 10% των περιπτώσεων η μόλυνση επιμένει και εξελίσσεται σε υψηλού βαθμού τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία. Αυτό συμβαίνει γενικά μέσω της ενσωμάτωσης του γονιδιώματος HPV στο χρωμόσωμα του ξενιστή με επακόλουθο την απώλεια ή διακοπή της Ε2 [3]. Σύμφωνα με τις διαθέσιμες αναφορές, ιικού γονιδίου Ε2 έχει την ικανότητα να καταστέλλουν την ιογενή Ε6 και Ε7 ογκογονίδια σε κύτταρα που φιλοξενούν ολοκληρωμένου HPV DNA [4]. Ως εκ τούτου, ενσωμάτωση του ιού με απώλεια ελέγχου μετεγγραφής από Ε2 ως αποτέλεσμα υπερέκφραση Ε6 και Ε7 οδηγεί σε αθανατοποίηση και τον μετασχηματισμό των κυττάρων [5]. Στις περισσότερες από τις περιπτώσεις ολοκλήρωσης του HR-HPV γονιδίωμα οδηγεί σε μεταγραφές σύντηξης περιλαμβάνοντας ιικών ογκογονιδίων Ε6, Ε7 και παρακείμενες αλληλουχίες κυτταρική [6], [7], [8], [9]. In vitro μελέτες έχουν δείξει ότι τα ιικά-κυτταρικά μεταγραφές σύντηξης είναι πιο σταθερά και προσδίδουν των κυττάρων με ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα ανάπτυξης σε σύγκριση με τα αντίστοιχά επισωματικό [10], [11].

μελέτες αναφέρουν ότι η εκδήλωση ολοκλήρωση είναι τυχαίο που αφορούν σχεδόν όλα τα χρωμοσώματα, και έχουν κατά συνέπεια αρκετές θέσεις ενσωμάτωσης του ιού-ξενιστή έχουν χαρτογραφηθεί μέχρι σήμερα [12]. Ωστόσο, υπάρχουν ορισμένα σημεία πρόσβασης, π.χ., εύθραυστη χώρους, σημεία διάλειμμα μετατόπιση και μεταγραφικά ενεργές περιοχές [3], [13], [14], [15] που προτιμώνται από τον ιό για την ενσωμάτωσή της στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Την ολοκλήρωση εντός ή κοντά σε ένα γονίδιο, ο ιός μπορεί να επιφέρει μια αλλαγή στην έκφραση του, που μπορεί τελικά να οδηγήσει σε μεταβολές στην κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό. Επίσης, ιική ενσωμάτωση μπορεί να καταστήσει τα δύο ιικών γονιδίων που κωδικοποιούν, καθώς και τα κυτταρικά γονίδια ευαίσθητα σε επιγενετικές μεταβολές που μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση τους. Ως εκ τούτου, η ενσωμάτωση του HPV εντός του ανθρώπινου γονιδιώματος θεωρείται ένα σημαντικό γεγονός στην αυχενική καρκινογένεση.

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν HPV γονότυπου και ταυτοποίηση του site της ένταξης των δύο τύπων HR-HPV (16 και 18) , μαζί με την αξιολόγηση της προγνωστικής αξίας του site ολοκλήρωσης, στον τοπικά προχωρημένο καρκίνων του τραχήλου στην ινδική γυναίκες.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

η προεπεξεργασία βιοψίες τραχήλου της μήτρας όγκων, κυρίως από ΦΥΓΩ στάδιο IIIB, ελήφθησαν από ασθενείς (μέση ηλικία, 50 ετών? ηλικιακό εύρος, 33 έως 80 ετών) που υποβάλλονται σε ακτινοθεραπεία μόνη ή παράλληλη χημειο-ακτινοβολία στο Τμήμα Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας, Memorial Hospital Tata, Βομβάη, μετά την απόκτηση IRB έγκριση. Μια γενική συναίνεση για τη βασική έρευνα είχε χορηγηθεί πριν από τη λήψη των βιοψιών. Ωστόσο, για την τρέχουσα μελέτη ελήφθη μια παραίτηση συναίνεση από την επιτροπή δεοντολογίας Νοσοκομείο. Οι βιοψίες ελήφθησαν από ιστολογικά αποδεδειγμένο, πρωταρχικός του τραχήλου της μήτρας όγκου, πριν από την έναρξη της θεραπείας με ακτινοβολία ρίζα και κωδικοποιήθηκαν για de-προσδιορισμό από τον ιατρό πριν από τη δοκιμή. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση. Όλα τα δείγματα είχαν ανατεθεί ένα εργαστήριο κώδικας για τη διατήρηση της εμπιστευτικότητας.

Επεξεργασία των δειγμάτων όγκου

Κατεψυγμένα ιστοί cryocut για την εξαγωγή του DNA και του RNA. Για την εκχύλιση του DNA, πέντε 30 μm τομές συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό STE (0.1 Μ NaCl, 0,05 Μ Tris ρΗ 7,5, 1 mM EDTA, 1% SDS) που περιείχε 10 mg /ml πρωτεϊνάση Κ (USB, Cleveland, ΟΗ, ΗΠΑ). Το DNA απομονώθηκε με τυποποιημένη μέθοδο φαινόλης-χλωροφορμίου. Για την απομόνωση του συνολικού RNA, RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) χρησιμοποιήθηκε. Δέκα τομές 30 μm συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει RLT θειοκυανικό γουανιδίνης παρέχεται στο κιτ και υποβάλλονται σε επεξεργασία σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. DNAse θεραπεία των δειγμάτων RNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας DNA free kit (Ambion, Austin, ΤΧ, ΗΠΑ).

HPV γονοτυπική με συστοιχία Luminex υψηλής απόδοσης

γονοτυπικός 24 HPV τύπους που περιελάμβανε 15 υψηλού κινδύνου τύπους (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,52, 56, 58, 59, 68, 73, και 82), 3 υποθετικό υψηλού κινδύνου τύπους (26, 53, και 66 ), και 6 τύπους χαμηλού κινδύνου (6, 11, 42, 43, 44, και 70) [1], [2] διεξήχθη χρησιμοποιώντας συστοιχία πολυπλεξίας HPV προσδιορισμού του γονότυπου (Multimetrix GmbH, Heidelberg, Germany) με βάση Luminex τεχνολογία xMAP . Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, η PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας σετ βιοτινυλιωμένων εναρκτήρων ευρύ φάσμα σε έναν συνολικό όγκο 50 μL που περιέχει 3.5 mM MgCl

2, 200 μΜ dNTPs, 0,75 μονάδα Taq DNA πολυμεράσης και 1 μΐ μίγματος εκκινητή. Τα στάδια ενίσχυσης περιελάμβανε αρχική μετουσίωση του DNA στους 94 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους αποδιάταξης για 20 s στους 94 ° C, ανόπτηση για 30 s στους 38 ° C, και επέκταση για 1 min, 20 s στους 71 ° C , πριν από μία τελική επέκταση για 4 λεπτά στους 71 ° C. PCR θετικά δείγματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε τρέξιμο Luminex. Δέκα μικρολίτρα του PCR προϊόν αναμίχθηκε με το μίγμα που περιέχει Luminex σφαιριδίων διακριτοί πληθυσμοί σφαιρίδιο συζευγμένο με 24 τύπους HPV. Μετά θερμική μετουσίωση, οι αλληλουχίες στόχοι υβριδοποιήθηκαν σε δεσμευμένο σε σφαιρίδια ανιχνευτές. Τα προϊόντα της PCR υβριδοποιήθηκε σημάνθηκαν με σύνδεση προς Ρ-φυκοερυθρίνη συζευγμένη στρεπταβιδίνη. Η ανάγνωση του τίτλου στη Luminex BioAnalyzer (Luminex Corporation, Austin, TX, USA). Οι HPV τύποι διακρίθηκαν σύμφωνα με τη μοναδική υπογραφή σφαιριδίου, ενώ η παρουσία των προϊόντων PCR προσδιορίστηκε με φυκοερυθρίνη φθορισμού. Μια αναλυτική ευαισθησία αποκοπής υπολογίστηκε με βάση τον αρνητικό μάρτυρα ο οποίος αφαιρείται από κάθε ένα από τα διαβάσει-out.

HPV του γονότυπου με PCR χρησιμοποιώντας MY09 /11 και SPF1 /2 εκκινητών

Από η ποσότητα του DNA που διατίθενται για την μελέτη περιορισμό, β-ακτίνη PCR έγινε μόνο σε εκείνα τα δείγματα τα οποία απέτυχαν να δείξουν ενίσχυση με GP5

+ /6

+ εκκινητές (n = 92). Αυτά υποβλήθηκαν σε περαιτέρω διαλογή για HPV με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές ΜΥ09 /11 L1 (Πίνακας S1) και SPF1 /2 εκκινητές [16]. PCR πραγματοποιήθηκε σε έναν όγκο αντίδρασης 25 μΐ που περιείχε 1,5 mM MgCl

2, 10 μΜ από κάθε εκκινητή, 200 μΜ dNTPs και 0.75 Μονάδα Taq ϋΝΑ πολυμεράσης. Τα δείγματα που βρέθηκαν θετικά για HPV είτε με MY09 /11 ή SPF1 /2 ή και τα δύο περαιτέρω γονότυπου για τις δύο πιο κοινές HR-HPV τύπους-HPV16 και HPV16 18 χρησιμοποιώντας /18 ειδικούς εκκινητές (Πίνακας S1). Δεδομένου ότι η ποσότητα του DNA έγινε περιορισμό, SPF 1/2 PCR δεν θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί σε 4 από τα 92 δείγματα.

Σύλλογος HPV16, HPV18 και HPV16 /18 μόλυνση με την κλινική έκβαση

τα δεδομένα του γονότυπου για τους δύο τύπους HR-HPV, HPV16, HPV18 και HPV16 /18 μαζί, όπου ήταν διαθέσιμα επαρκή δεδομένα παρακολούθησης συγκρίθηκε με την κλινική έκβαση των ασθενών. Η ανάλυση Kaplan-Meier (SPSS 15.0) έγινε για να καθοριστεί συσχέτιση μεταξύ της μόλυνσης με αυτούς τους τύπους HR-HPV και υποτροπή της νόσου. Επιβίωσης χωρίς νόσο θεωρήθηκε από την έναρξη της θεραπείας με ακτινοβολία για τη στιγμή που επήλθε υποτροπή ή μέχρι την τελευταία παρακολούθηση. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank (SPSS 15.0).

Αναγνώριση του site ολοκλήρωσης με APOT

δοκιμασία

Τα δείγματα (n = 86) θετικές για HPV16, HPV18 ή και τα δύο και με ένα επαρκή κλινική παρακολούθηση (τουλάχιστον 1 έτος ή μέχρι την εμφάνιση των πρώτων περίπτωση, ανάλογα με το ποια ήταν νωρίτερα) ελήφθησαν για να μελετήσει την ιική ολοκλήρωση χρησιμοποιώντας ενίσχυση των θηλωμάτων Oncogene μεταγραφές (APOT) δοκιμασία, όπως περιγράφεται από Klaes

et al

[6 ]. Εν συντομία, ολικό RNA (0.5-1 μg) μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας oligo (dT) 17-εκκινητή συνδέεται με μία συνδετική αλληλουχία [(dT) 17-P3] [17] και 50 μονάδες Superscript II αντίστροφη μεταγραφάση (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) για 1 ώρα στους 42 ° C. PCR με β-ακτίνη εκκινητές διεξήχθη για να ελέγξει την ακεραιότητα του cDNA. Ο πρώτος κλάδος cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας HPV Ε7-ειδικό εναρκτήρα (P1-16 ειδικό για HPV16 και p1-18 ειδικό για HPV 18) ως εμπρόσθια εναύσματα και συνδετήρα Ρ3 ως εκκινητή (Πίνακας S1). Η PCR ενίσχυση πραγματοποιήθηκε σε έναν όγκο αντίδρασης 50 μL που περιέχει 2.5 mM MgCl

2, 200 μΜ dNTPs, 25 μΜ από κάθε εκκινητή και 1 μονάδα Taq DNA πολυμεράσης. Η αντίδραση αποτελείται από ένα αρχικό στάδιο μετουσίωσης στους 94 ° C για 2 λεπτά, ακολουθούμενη από 35 κύκλους αποδιάταξης στους 94 ° C για 30 s, ανασύνδεση στους 58 ° C για 30 s, και επέκταση στους 72 ° C για 4 λεπτά. Αυτό ακολουθήθηκε από μία τελική επέκταση στους 72 ° C για 20 λεπτά. Στη συνέχεια, 7 μΐ του προϊόντος της PCR χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για ένθετη PCR χρησιμοποιώντας εναύσματα ειδικά για P2-16 HPV16 ή p2-18 ειδικά για HPV18 και (dT) 17-p3 ως αντίστροφος εκκινητής (Πίνακας S1). Οι συνθήκες PCR ήταν ίδια με εκείνη της πρώτης PCR εκτός του ότι η θερμοκρασία αναδιάταξης ήταν 66 ° C.

Κλωνοποίηση των μεταγραφών συγχωνεύσεως

Αμπλικόνια εκτός από τις μεγάλες μεταγραφές επισωματικό (~1050 bp για HPV16 και περίπου 1000 bp για HPV18) ήταν ύποπτα ότι προέρχεται από την ολοκληρωμένη γονιδιώματα HPV. Αυτά αποκόπηκαν από την πηκτή και το DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας GFX PCR DNA και Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Το απομονωμένο ΟΝΑ είτε αλληλουχήθηκε απ ‘ευθείας είτε μετά την κλωνοποίηση στο φορέα pTZ57R /Τ με τη χρήση του Insta PCR Cloning Kit (Fermentas, Lithuania, ΕΕ), επί αλληλουχητή ϋΝΑ (3100 Avant Genetic αναλυτή, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Οι τόποι ένταξης χρωμοσωμική προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας Εθνικό Κέντρο Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (BLAST) και το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας στη Σάντα Κρουζ (UCSC) hg19 (Φεβ 2009) (BLAT) συνελεύσεις του ανθρώπινου γονιδιώματος. Περαιτέρω, οι θέσεις ενσωμάτωσης ελέγχθηκαν για την παρουσία των ευαίσθητων χώρων και οποιαδήποτε γονίδια γνωστής ταυτότητας χρησιμοποιώντας NCBI εύθραυστη θεατή site map και το εργαλείο UCSC Blat αντίστοιχα.

Σύλλογος ιική ενσωμάτωση με την κλινική έκβαση

τα δεδομένα που ελήφθησαν συγκρίθηκαν με την κλινική έκβαση των ασθενών. Η ανάλυση Kaplan-Meier (SPSS 15.0) έγινε για να προσδιοριστεί η σχέση του ιικού κατάσταση (επισωματική /ολοκληρωμένο) με υποτροπή της νόσου. Επιβίωσης χωρίς νόσο θεωρήθηκε από την έναρξη της θεραπείας με ακτινοβολία για τη στιγμή που επήλθε υποτροπή ή μέχρι την τελευταία παρακολούθησης (διάμεση παρακολούθηση για 86 περιπτώσεις ήταν 44 μήνες). Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank (SPSS 15.0).

Αποτελέσματα

HPV γονοτυπική από σειρά Luminex υψηλής απόδοσης

Αν και υπάρχουν λίγες αναφορές σε διαφορετικές υψηλής HPVs κινδύνου στην ινδική γυναίκες, εδώ αναφέρουμε τις 15 υψηλής ιοί HPV κινδύνου, 3 ενδιάμεσο κίνδυνο και 6 χαμηλού κινδύνου τύπους του HPV, χρησιμοποιώντας τον πίνακα Luminex υψηλής απόδοσης. Οι εκκινητές που παρέχονται στο κιτ σειρά Luminex για HPV γονοτυπική βιοτινυλιώθηκαν, ευρύ φάσμα GP5

+ /GP6

+ εκκινητές. Χρησιμοποιώντας αυτή εναρκτήριων για PCR, λάβαμε 178 από 270 δείγματα θετικά για HPV (σχήμα 1). Οι HPV θετικά δείγματα υποβλήθηκαν περαιτέρω σε υβριδοποίηση με δεσμευμένο σε σφαιρίδια ανιχνευτές με συστοιχία Luminex όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Εκατόν εξήντα εννέα δείγματα βρέθηκαν να υβριδίζονται με τους διάφορους ανιχνευτές HPV ενώ 9 δείγματα ήταν αρνητικά. Αυτά τα 9 δείγματα θα μπορούσαν να έχουν λοίμωξη από HPV που δεν περιλαμβάνονται στους 24 τύπους ανιχνεύονται από το κιτ. Από 169 HPV θετικά δείγματα, 168 δείγματα ήταν θετικά για ένα ή περισσότερα HR-HPV τύπους υποδεικνύοντας μία ισχυρή συσχέτιση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας με HR-HPV λοίμωξη. Μεταξύ αυτών, HPV16 και /ή μόλυνση HPV18 ήταν πιο κοινά – 114 δείγματα που είναι θετικά για HPV16 και μόνο, 6 δείγματα για μόνος HPV18 και 16 δείγματα τόσο για HPV16 και HPV18 (Σχήμα 2)

γονοτυπικός διεξήχθη επί. 270 προχωρημένο στάδιο του τραχήλου της μήτρας δείγματα καρκίνου με υψηλής απόδοσης, GP5

+ /6

+ εκκινητές με βάση σειρά Luminex? συναίνεση MY09 /11 και SPF1 /2 εκκινητές. HPV θετικότητας ήταν 95% (257/270). δοκιμασία APOT έγινε στις 86 HPV16

+ ή /και HPV18

+ δείγματα, με την καλή κλινική παρακολούθηση και καλή ποιότητα του RNA. Σε 18 δείγματα, μόνο επισωματική μορφή του HPV εντοπίστηκε, το υπόλοιπο 68 άφησε να εννοηθεί προς την ενδεχόμενη ένταξη. Ιστοσελίδα της ένταξης θα μπορούσε να προβλεφθεί με υψηλή βαθμολογία από BLAST ή /και BLAT σε 48 δείγματα.

Η

Το γράφημα απεικονίζει τη συχνότητα των 24 τύπων HPV σε 178 τραχηλικών δειγμάτων βιοψίας καρκίνου που βρέθηκαν να είναι θετικά GP5

+ /6

+ εκκινητές. μόλυνση HPV16 κυριάρχησε στα δείγματα. Κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει διαφορετικούς τύπους του HPV.

Η

HPV του γονότυπου με PCR χρησιμοποιώντας MY09 /11 και SPF1 /2 εκκινητών

Για να εκτιμηθεί η πραγματική HPV θετικότητα στις 270 περιπτώσεις, το 92 βιοψίες καρκίνου του τραχήλου αρνητικό για τον HPV από σειρά Luminex, για πρώτη φορά υπεβλήθη σε PCR χρησιμοποιώντας β-ακτίνη εκκινητές για να ελέγξετε την ποιότητα του DNA. Όλα βρέθηκαν να είναι θετικά για β-ακτίνη. Στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε PCR χρησιμοποιώντας ΜΥ09 /11 και SPF1 /2 εκκινητές. Είκοσι πέντε από τις 92 δείγματα βρέθηκαν να είναι θετικοί για τον HPV με ΜΥ09 /11 PCR. Δεδομένου ότι η ποσότητα του DNA ήταν περιοριστική, SPF 1/2 PCR δεν θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί σε 4 από τα 92 δείγματα. Screening με SPF1 /2 εκκινητών αποκάλυψε 79 δείγματα να είναι HPV θετικές. Αυτά τα 79 δείγματα που περιλαμβάνονται, επίσης, τα 25 δείγματα που εξετάστηκαν HPV θετικά από MY09 /11 PCR. Ως εκ τούτου, η HPV θετικότητας ήταν υπολογίζονται λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα από σειρά Luminex και SPF1 /2 PCR. Η συνολική HPV θετικότητα στην ομάδα αυτή βρέθηκε να είναι 95% (257/270). Περαιτέρω γονοτύπησης των 79 δειγμάτων, χρησιμοποιώντας HPV 16/18 ειδικούς εκκινητές, έδειξε 49 δείγματα ως θετικά για HPV16. Κανένα από αυτά τα 79 δείγματα ήταν θετικά για HPV18. Ως εκ τούτου, η επικράτηση του HPV 16 ή /και HPV 18 σε αυτή την ομάδα ήταν 69% (185/270) (Σχήμα 1).

Σύλλογος HPV16, 18 και διπλής μόλυνσης με την κλινική έκβαση

Kaplan ανάλυση των δεδομένων επιβίωσης -Meier για 125 ασθενείς με HPV type16, 18 και διπλή μόλυνση και με επαρκή κλινική παρακολούθηση (διάμεση παρακολούθηση για 125 περιπτώσεις ήταν 54 μήνες), αποκάλυψε ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ της μόλυνσης με αυτά τα δύο HR- τύπους του HPV από την άποψη της έκβασης της νόσου (Εικόνα S1).

Φυσική κατάσταση του ιού και της κλινικής έκβασης

από 125 HPV16, HPV18 ή διπλή HPV θετικών δειγμάτων, ένα υποσύνολο των 86 δειγμάτων με καλή ποιότητα του RNA, ελήφθησαν για τη μελέτη της φυσικής κατάστασης ή /και το site της ιικής ενσωμάτωσης με τη δοκιμασία APOT. Στις περισσότερες από τις περιπτώσεις, το ιικό γονιδίωμα βρέθηκε να ενσωματωθούν (n = 68), ενώ στο 21% (n = 18) μόνο θα μπορούσαν να προσδιοριστούν μεταγραφές επισωματική. Σε 12 περιπτώσεις με ενσωματωμένο ιικό γονιδίωμα, επισωματική μορφή του HPV ανιχνεύθηκε επίσης (Σχήμα 1). Η φυσική κατάσταση του ιού (επισωματικού /ολοκληρωμένο) συνδέθηκε με την έκβαση της νόσου. Τα δεδομένα επιβίωσης αποκάλυψε ότι 16 από 18 ασθενείς με μόνο επισωματική μορφή του HPV (16 και /ή 18), είχαν νόσο επιβίωση ελεύθερη σε σύγκριση με εκείνους με ολοκληρωμένη μορφή του ιού, υποδεικνύοντας μία καλή κλινική έκβαση (p = 0.067, που αντιπροσωπεύουν ένα οριακή σημασία) (Σχήμα 3). Η κλινική έκβαση όλων των ασθενών όπου η ιική ενσωμάτωση μελετήθηκε παρουσιάζεται στον Πίνακα S2.

καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier για ασθενείς με επισωματική μορφή του ιού (n = 18) έναντι ολοκληρωμένη μορφή (n = 68 ) απεικονίζεται. Οι περισσότεροι από τους ασθενείς με επισωματική μορφή (16 από 18) είχαν επιβίωσης χωρίς νόσο σε σύγκριση με ασθενείς με ολοκληρωμένη μορφή, υποδεικνύοντας μία καλή κλινική έκβαση, αν και με οριακή σημασία (ρ = 0.067).

Η

Αναγνώριση του site ιική ολοκλήρωση

για να καταλάβετε αν η εκδήλωση ολοκλήρωσης είναι τυχαία ή υπάρχει κάποια προτίμηση για ορισμένες τοποθεσίες εντός των χρωμοσωμάτων, τα δεδομένα αλληλουχίας για 68 περιπτώσεις προέρχονται από δοκιμασία APOT ερευνήθηκαν από έκρηξη και ή /και Blat. Η ιστοσελίδα της ένταξης θα μπορούσε να προβλεφθεί με υψηλή βαθμολογία σε 48 περιπτώσεις (Πίνακας S3a), για τις υπόλοιπες 20 περιπτώσεις το σκορ ήταν χαμηλό (Πίνακας S3b). Μόνον εκείνες τις περιπτώσεις όπου η θέση ολοκλήρωσης είχε προβλεφθεί με υψηλή βαθμολογία (n = 48) αναλύθηκαν περαιτέρω για διαφορετικά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την ίδια. Οι θέσεις της ολοκλήρωσης βρέθηκαν να διανέμονται σε όλο το γονιδίωμα. Ωστόσο, η ενσωμάτωση ήταν περισσότερο συχνή στην 1ρ χρωμοσωμικό loci (n = 7), 3q (n = 8), 13q (n = 4), 6q (n = 4), 11q (n = 4) και 20q (n = 4 ) (Σχήμα 4). Μόνο ένα δείγμα έδειξε ολοκλήρωση HPV σε δύο χρωμοσωμικές θέσεις ταυτόχρονα. Μερικές από τις περιοχές επαναλαμβανόμενες ολοκλήρωση ελέγχθηκαν επίσης στο επίπεδο του γονιδιώματος διεξάγοντας γονιδιωματικό DNA PCR με HPV Ε7 εκκινητές όπως το πρόσθιο εκκινητή και εκκινητές ειδικούς σε μια δεδομένη χρωμοσωμική περιοχή ως το αντίστροφο ενός (Εικόνα S2).

ιστοσελίδα της ολοκλήρωσης, όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία APOT σε 48 περιπτώσεις θετικές για HPV16, HPV18 ή και τα δύο και με υψηλή πρόβλεψη βαθμολογία χρησιμοποιώντας BLAST /BLAT. γεγονός ολοκλήρωσης βρέθηκε να είναι πιο κοινή σε 1p και 3ο τρίμηνο χρωμοσωμικών γενετικών τόπων. Κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει διαφορετική χρωμοσωμική θέση.

Η

Χαρακτηριστικά που συνδέονται με τον HPV ένταξη

Χρησιμοποιώντας NCBI εύθραυστη θέση Χάρτης Viewer παρατηρήθηκε ότι το 60% των ολοκληρώσεις (29/48) βρίσκονται εντός ή κλείσει με ένα κοινό ή σπάνια εύθραυστη θέση. Το υπόλοιπο των θέσεων ενσωμάτωσης δεν συνδέθηκαν με οποιαδήποτε εύθραυστο θέσεις (Πίνακας 1). Χρησιμοποιώντας το UCSC Blat εργαλείο 58% των ακολουθιών (28/48) παρατηρήθηκαν να είναι είτε εντός είτε κοντά σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνη. Τα γονίδια αυτά ανήκαν σε διάφορες κυμαίνονται από ογκογονίδια, παράγοντες μεταγραφής, και ογκοκατασταλτικά γονίδια (Πίνακας 1) κατηγορίες.

Η

Συζήτηση

Είναι αποδεδειγμένο πέραν πάσης αμφιβολίας ότι η μόλυνση από τον ιό HPV παίζει σημαντικό ρόλο στην αιτιολογία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Αναφορές από διάφορα μέρη του υπο-ήπειρο δείχνουν μια επικράτηση του HPV κυμαίνονται 73-99% [18] – [30]. Στην παρούσα μελέτη αναφέρουμε το 95% του HPV θετικότητας χρησιμοποιώντας τρία διαφορετικά σύνολα αστάρι. Όπως προκύπτει από τη μελέτη αυτή ότι ένα ενιαίο σύνολο εκκινητών δεν είναι επαρκής για να εκτιμηθεί η πραγματική HPV μολυσματικότητα. Από τα διάφορα HPV γονότυπων HPV 16 ήταν πιο συχνές (60%), ακολουθούμενη από την μόλυνση με HPV 18 μόνο (2%). Παρατηρήθηκε επίσης διπλής μόλυνσης με HPV 16/18 (6%) και HPV16 /45 (3%). Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με άλλες μελέτες από την ινδική υποήπειρο που αναφέρει 57-65% θετικότητα HPV16, που ακολουθείται από HPV18, 45, και 33 του τραχήλου της μήτρας νεοπλασία [19], [20], [29].

Ενσωμάτωση του ιού είναι κοινή σε καρκίνους του τραχήλου προχωρημένο στάδιο και θεωρείται ένα σημαντικό γεγονός στην εξέλιξη της νόσου. Ενσωμάτωση εμφανίζεται γενικά κατάντη των πρώιμων γονιδίων Ε6 και Ε7, συχνά στην περιοχή Ε1 ή Ε2. Το γονίδιο Ε2 είναι μεταγραφικά αδρανοποιημένο φορά ο ιός παίρνει ολοκληρωμένη λόγω της διακοπής του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης. Viral γονίδιο Ε2 έχει μελετηθεί εκτενώς και είναι γνωστό ότι παίζει ένα ρόλο στην αντιγραφή του ιού, καθώς και αρνητική ρύθμιση των Ε6 και Ε7 γονίδια [31].

Διάφορες τεχνικές έχουν χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη ενσωμάτωση του ιού, όπως ως Απολίνωση μεσολάβηση PCR [32], Περιορισμός τοπο-PCR [15] και δοκιμασία APOT [6]. Για να περιοριστεί η μελέτη μας για θέσεις ενσωμάτωσης με ένα μεταγραφικά ενεργή ιικό γονιδίωμα, δοκιμασία APOT επιλέχθηκε. Επίσης, δοκιμασία APOT επιτρέπει την ανίχνευση της ολοκληρωμένης ιικού γονιδιώματος σε κλινικές αλλοιώσεις, ακόμη και με την παρουσία μιας μεγάλης περίσσειας μη ολοκληρωμένος επισωματική μορφή ιϊκών γονιδιωμάτων [6], [33]. Η συχνότητα της ιικής ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του ξενιστή σε καρκινώματα του τραχήλου της μήτρας έχει αναφερθεί να είναι τόσο υψηλή όσο το 100% σε HPV18

+ όγκους [34] και έως 80% σε HPV16

+ όγκους [35]. Στη μελέτη μας βρήκαμε τέσσερις HPV18

+ δείγματα όπου ο ιός εντάχθηκε και ένα HPV18

+ δείγμα, όπου ο ιός ήταν επισωματική. Η συχνότητα εμφάνισης της ένταξης στην HPV16

+ δειγμάτων ήταν υψηλότερη. Ο μηχανισμός της ολοκλήρωσης HR-HPV δεν είναι πλήρως κατανοητός. Πιθανολογείται ότι η ενσωμάτωση θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν περιστατικό πιθανότητα, η πιθανότητα της οποίας αυξάνει με την συχνότητα του δίκλωνα σπασίματα (DSBs) σε ξενιστή και το ιικό DNA. Εύθραυστες χρωμοσωμικές περιοχές θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν τα hotspots για την ένταξη HR-HPV.

Η φυσική κατάσταση και /ή την περιοχή της ολοκλήρωσης μελετήθηκε σε 86 δείγματα του τραχήλου της μήτρας όγκου μολυνθεί με ένα ή και τα δύο από δύο HR-HPV, HPV16 και HPV18, και με επαρκή κλινική παρακολούθηση. επισωματική μορφή του HPV παρατηρήθηκε σε 18 περιπτώσεις. Παρουσία μόνο επισωματική μορφή σε αυτούς τους ασθενείς με προχωρημένη νόσο σταδίου (κυρίως FIGO στάδιο ΙΙΙΒ), θα μπορούσε να δείξει ότι είτε HPV ένταξη δεν είναι αποκλειστικά υπεύθυνη για την εξέλιξη της νόσου? ή θα μπορούσε να είναι ένας περιορισμός της τεχνικής με αποτέλεσμα την αποτυχία της ενίσχυσης της παράγωγης ενσωμάτωμα μεταγραφής. Πρόσφατες μελέτες έχουν επιβεβαιώσει την παρουσία του μόνο επισωματική μορφή του ιού σε προχωρημένο τραχηλικό καρκινώματα πλακωδών κυττάρων [33], [36]. Επιπλέον, δεδομένου ότι APOT λειτουργεί βάσει της ανόπτησης του εκκινητή Frohman στην ουρά πολυΑ, περιπτώσεις στις οποίες polyA ουρά βρίσκεται σε μεγάλη απόσταση από τον πρόσθιο εκκινητή, μπορεί να μην είναι επιδεκτικές σε ενίσχυση με PCR.

στην παρούσα μελέτη, παρατηρήσαμε 12 δείγματα όπου τόσο ολοκληρωμένο όσο και επισωμικές μορφές του ιού ήταν παρόντες. Σε τέτοιες περιπτώσεις, Ε2 μπορεί να είναι διαθέσιμη σε

trans

να ρυθμίζει τα επίπεδα έκφρασης των ογκογόνων Ε6 και Ε7 [37]. Επίσης, σύμφωνα με την έκθεση του Pett

et al

., Απώλεια επισώματα είναι τόσο σημαντική όσο και την ενσωμάτωση του ιού στο γονιδίωμα του ξενιστή για την εξέλιξη των αλλοιώσεων του τραχήλου της μήτρας σε νεοπλασία [38]. Θα ήταν ενδιαφέρον να δούμε την έκφραση της Ε2 και Ε6 /Ε7 σε περιπτώσεις όπου HR-HPV είναι παρούσα σε επισωμικό καθώς και ολοκληρωμένη μορφή ή σε δείγματα όπου HPV είναι μόνο επισωματική.

Υπάρχουν αναφορές ότι HR- HPV πρωτεΐνες πλην Ε6 /Ε7 επάγουν χρωμοσωμική αστάθεια και το μετασχηματισμό [39]. Έχει αναφερθεί ότι σταθεροποιεί Ε2 Skp2, ένα ογκογονίδιο και αυτό θα μπορούσε να οδηγήσει σε ενεργοποίηση της εισόδου S-φάσης [39]. Χαμίντ et. al., [40] έχουν επίσης προτείνει έναν ρόλο για την Ε2 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Δεδομένου ότι τα κύτταρα στη φάση S ανταποκρίνονται περισσότερο στην ακτινοβολία, καρκίνους με επισωματικό Ε2 θα μπορούσε να είναι περισσότερο ανταποκρίνεται σε θεραπεία ακτινοβολίας. Σύγκριση της φυσικής κατάστασης του ιού (επισωματικό /ολοκληρωμένα) με το κλινικό αποτέλεσμα μετά από ριζική ακτινοθεραπεία αποκάλυψε ότι οι ασθενείς με επισωματική μορφή του ιού είχε αυξηθεί ελεύθερη νόσου επιβίωση σε σύγκριση με εκείνους με ολοκληρωμένη μορφή. Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζεται από διάφορες εκθέσεις που αναφέρουν ότι η εκδήλωση ένταξη συνδέεται με μειωμένο ελεύθερο νόσου [41], [42]. Ωστόσο, υπάρχουν αντικρουόμενες αναφορές, καθώς, σύμφωνα με την οποία η φυσική κατάσταση του ιού δεν συσχετίζεται με τη νόσο επιβίωση χωρίς [43], [44]. Αυτό πρέπει να μελετηθεί περαιτέρω.

Αν και οι περιοχές ολοκλήρωσης διανεμήθηκαν σε όλο το γονιδίωμα σε διαφορετικά δείγματα, υπήρχε μια προτίμηση για κάποια χρωμοσωμική τόπους όπως 1p, 3q, 6q, 11q, 13q, 20q 6q και. Ορισμένες συγκεκριμένες περιοχές σε ορισμένες από αυτές τις θέσεις, όπως 1p36.23, 1p36.33, 3q26, 3q28 και 20q11.21 έδειξε επαναλαμβανόμενες ολοκληρώσεις, υποδεικνύοντας ότι η ένταξη δεν μπορεί να είναι ένα τυχαίο γεγονός. Οι εκθέσεις από τις μελέτες που αφορούν τη δυτική πληθυσμών δείχνουν ότι η ενσωμάτωση του ιού εμφανίζεται πιο συχνά σε 8q χρωμοσωμική θέση [3], [45], [46]. Ενσωμάτωση στον τόπο 8q στη μελέτη μας παρατηρήθηκε μόνο σε 1 από τις 48 περιπτώσεις. Αυτό μπορεί να οφείλεται στη διαφορά στην εθνικότητα των δύο πληθυσμών.

Ο 3q, 13q και 20q loci εκτός του ότι είναι προτιμησιακά στόχος για την ολοκλήρωση του HPV έχουν αναφερθεί να είναι θέσεις για γονιδιωματική αστάθεια που σχετίζεται με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Κέρδος του 3q και 20q, ενώ η απώλεια του 13q έχει αναφερθεί σε διάφορα στάδια της νόσου [47] – [49]. Επίσης πιο πρόσφατες εκθέσεις δείχνουν ότι υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ γονιδιακή αναδιάταξη και την ολοκλήρωση του HPV [46]. Επομένως, θα ήταν ενδιαφέρον να μελετήσει κατά πόσον η προτιμησιακή ενσωμάτωση του ιού σε αυτές τις θέσεις πρέπει να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην πρόκληση γενωμική αστάθεια.

Οι περισσότερες από τις ολοκληρώσεις (28/48) βρέθηκαν να βρίσκονται εντός ή κοντά ορισμένα γονίδια. Αυτό θα μπορούσε να δείξει ότι ο ιός προτιμά μεταγραφικά ενεργές περιοχές για την εκδήλωση ολοκλήρωσης. Τέτοια γονίδια περιλαμβάνονται ογκογονίδια όπως myc, μεταγραφικοί παράγοντες όπως TP63, MECOM, κλπ Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζεται από προηγούμενη έκθεση του Wentzensen

et al

όπου έχουν δείξει συμμετοχή των γονιδίων που σχετίζονται με όγκο (myc και TP63) σε HPV διαδικασία ολοκλήρωσης [50]. Μελέτες στο εργαστήριο μας έχουν δείξει ότι μερικά από τα γονίδια εντός του οποίου παρατηρήθηκε ολοκλήρωσης, όπως ABCB10, SLC25A36, IL8, COX4I2, HNF1B, myc, διαπιστώθηκε αυξημένη έκφραση (αδημοσίευτα δεδομένα), υποδεικνύοντας έτσι ότι με την ολοκλήρωση εντός ή κοντά σε ένα συγκεκριμένο γονίδιο ο ιός μπορεί να επιφέρει αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση

Ένταξη του ιού κοντά ή μέσα σε εύθραυστες περιοχές συχνά έχει αναφερθεί [15], [45], [50] -. [52]. Εύθραυστη περιοχές είναι συγκεκριμένες περιοχές στα χρωμοσώματα που υφίσταται nonrandomly σπάσει σε απάντηση σε ορισμένα στρες. Το γεγονός αυτό καθιστά τα γονίδια σε ή κοντά σε αυτές τις θέσεις ευαίσθητα στην ενσωμάτωση ξένου DNA. Στη μελέτη μας 29/48 εντάξεις βρίσκονται εντός ή κοντά σε μια κοινή ή σπάνια εύθραυστη θέση που βρίσκεται σε συμφωνία με προηγούμενες εκθέσεις. Μια άλλη παρατήρηση της μελέτης μας ήταν ότι οι ασθενείς με ιογενή ένταξης σε χρωμοσωμικές θέσεις 3q, 13q και 20q έδειξε τη χειρότερη πρόγνωση μεταξύ όλων. Είτε αυτό μπορεί να έχει οποιαδήποτε κλινική επίπτωση στην πρόγνωση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας θα είναι ενδιαφέρουσα και προκλητική τη μελέτη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. Ανάλυση

Kaplan-Meier για δύο τύπους HR-HPV – HPV16 και /ή HPV18 και την έκβαση της νόσου. ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier για HPV16 ή /και HPV18 σε 125 ασθενείς που είχαν μια καλή κλινική παρακολούθηση πραγματοποιήθηκε. Ασθενείς με λοίμωξη από HPV 16 και μόνο έδειξε μια τάση προς την καλύτερη επιβίωσης χωρίς νόσο σε σύγκριση με λοίμωξη HPV 18 μόνο και διπλή μόλυνση με HPV 16/18

doi:. 10.1371 /journal.pone.0041012.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Γονιδιωματικό DNA PCR των τόπων επαναλαμβανόμενες ολοκλήρωσης. Αντιπροσωπευτικές εικόνες γέλης (a, b) δείχνει την ενσωμάτωση HPV στο επίπεδο του γονιδιώματος. Επαναλαμβανόμενες ολοκληρώσεις σε χρωμοσωμικές θέσεις 1p36.23, 3q28, 6q23.3, 8p11.21 και 11q13.1 απεικονίζεται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0041012.s002

(ΔΕΘ)

Πίνακας S1 .

Primer ακολουθίες.

doi: 10.1371 /journal.pone.0041012.s003

(DOCX)

Πίνακας S2.

κλινικοπαθολογοανατομικές στοιχεία για όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες μελετήθηκε η ιική ενσωμάτωση.

doi: 10.1371 /journal.pone.0041012.s004

(DOCX)

Πίνακα S3.

Ακολουθία των τόπων HPV ολοκλήρωση στο γονιδίωμα σε 68 περιπτώσεις. α) περιοχές Ένταξης για 48 περιπτώσεις με υψηλή βαθμολογία πρόβλεψη. β) περιοχές ολοκλήρωσης για 20 περιπτώσεις με χαμηλή βαθμολογία πρόβλεψη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0041012.s005

(DOCX)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς επιθυμούν να Αναγνωρίζετε αργά Δρ KA Dinshaw και όλα τα άτομα από την ασθένεια ομάδα διαχείρισης Γυναικολογία, Memorial Hospital Tata, οι οποίοι συμμετείχαν στη σύνεση την κατάρτιση του κλινικό ιστορικό και τη συλλογή και την αποθήκευση των βιοψιών από ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Βοήθεια από την κα Sadhana Kannan (ACTREC) στη στατιστική ανάλυση και η κα Tabish Hussain (ACTREC) για την πολύτιμη εισόδους της στην προετοιμασία του χειρογράφου είναι ευγνωμοσύνη.