Αφηρημένο

Ο λιπώδης ιστός θεωρείται πλέον ως ενδοκρινές όργανο που εμπλέκονται σε μεταβολικές και φλεγμονώδεις αντιδράσεις. Αδιπονεκτίνη, ένα 244-αμινο πεπτιδική ορμόνη οξύ, συνδέεται με την αντίσταση στην ινσουλίνη και την καρκινογένεση. Η κουρκουμίνη (diferuloylmethane) είναι ο κύριος κουρκουμινοειδή της λαϊκής ινδικό μπαχαρικό, κουρκούμη. Η κουρκουμίνη έχει αντικαρκινική δράση, συμπεριλαμβανομένης της αναστολής της νεοαγγείωσης και της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της αδιπονεκτίνης και κουρκουμίνης σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) παραμένουν ασαφείς. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την έκφραση της αδιπονεκτίνης σε ζεύγη όγκους και φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων από 77 ασθενείς με NSCLC χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο, κηλίδωση Western, και ανοσοϊστοχημεία. Kaplan-Meier ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι οι ασθενείς με χαμηλή αδιπονεκτίνης αναλογία έκφρασης (& lt? 1) είχαν σημαντικά μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης από εκείνες με υψηλό δείκτη έκφρασης (& gt? 1) (

σ

= 0,015). Η κουρκουμίνη ανέστειλαν τη μεταναστευτική και επεμβατική ικανότητα των κυττάρων Α549 μέσω της αναστολής της αδιπονεκτίνης έκφρασης με τον αποκλεισμό του υποδοχέα αδιπονεκτίνης 1. θεραπεία κουρκουμίνη επίσης ανέστειλε την

in vivo

ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων Α549 και έκφραση αδιπονεκτίνης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αδιπονεκτίνη μπορεί να είναι ένας προγνωστικός δείκτης του NSCLC. Η επίδραση της κουρκουμίνης στη μείωση της μεταναστευτικής και επεμβατική ικανότητα των κυττάρων Α549 με την αναστολή της έκφρασης αδιπονεκτίνης πιθανώς με τη μεσολάβηση μονοπάτια NF-κΒ /MMP. Η κουρκουμίνη θα μπορούσε να είναι ένα σημαντικό δυνητικό επικουρικό θεραπευτικό μέσο για τον καρκίνο του πνεύμονα στο μέλλον

Παράθεση:. Tsai J-R, Liu P-L, Chen Υ-Η, Chou S-Η, Cheng Υ-J, Hwang J-J, et al. (2015) Η κουρκουμίνη αναστέλλει μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα Μετάσταση μέσα από την αδιπονεκτίνη /NF-κΒ /ΜΜΡ μονοπάτι σηματοδότησης. PLoS ONE 10 (12): e0144462. doi: 10.1371 /journal.pone.0144462

Συντάκτης: Jeremy J.W. Chen, Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Επιστημών, Ταϊβάν

Ελήφθη: 18 του Αυγούστου 2015? Αποδεκτές: 18 Νοεμβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 10 του Δεκεμβρίου του 2015

Copyright: © 2015 Tsai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση: η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από τις επιχορηγήσεις NSC 100 – 2320 – Β – 037 – 012 – MY2 από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της ROC, Ταϊβάν Jong-σκαλί Tsai.. Το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της R.O.C, η Ταϊβάν είναι μια κυβερνητική οργάνωση η οποία είναι εξωτερική στο πανεπιστήμιο των συγγραφέων. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο και στην Ταϊβάν. Παρά τις μεγάλες προόδους στην κατανόηση του πνεύμονα καρκινογένεσης και νέων θεραπειών κατά τις τελευταίες δεκαετίες, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5-ετών παραμένει φτωχή. πρέπει να κατευθυνθούν καινοτόμο ερευνητική προσπάθεια για τη διερεύνηση πιθανών δεικτών πρόγνωσης, οι μηχανισμοί του πνεύμονα καρκινογένεσης, και επικουρική θεραπεία.

Ο λιπώδης ιστός είναι προς το παρόν θεωρείται ως ενδοκρινές όργανο που εκκρίνει διάφορες κυτοκίνες (αντιποκινών) [1], συμπεριλαμβανομένης της αντιπονεκτίνης και της λεπτίνης. Η αδιπονεκτίνη είναι ένα 244-αμινοξέων πολυπεπτίδιο που διαμορφώνει πολυάριθμες μεταβολικές διεργασίες όπως καταβολισμό ρύθμιση της γλυκόζης και των λιπαρών οξέων [2]. Ασκεί σημαντικές επιδράσεις στο μεταβολισμό και την λιπογένεση, καθώς και για τη ρύθμιση της ανθρώπινης φλεγμονωδών αποκρίσεων [3]. Στους ενήλικες, οι συγκεντρώσεις αδιπονεκτίνης είναι αντιστρόφως ανάλογα με το ποσοστό σωματικού λίπους και αντίσταση στην ινσουλίνη [4]. Η αδιπονεκτίνη έχει αντιδιαβητική, αντιαθηρογόνες, αντι-φλεγμονώδη και αντι-αγγειογενετική ιδιότητες [5].

Ο ρόλος της αδιπονεκτίνης στην καρκινογένεση είναι αμφιλεγόμενη [5]. Στην παχυσαρκία σχετίζεται κακοήθειες όπως ο καρκίνος του ενδομητρίου, του καρκίνου του μαστού μετά την εμμηνόπαυση, ο καρκίνος του παχέος εντέρου, καρκίνο του νεφρού, και αιματολογικές κακοήθειες, αδιπονεκτίνης έκφραση συσχετίζεται θετικά με τον κίνδυνο κακοήθειας. Περαιτέρω, χαμηλές συγκεντρώσεις αδιπονεκτίνης έχουν αναφερθεί σε γαστρικό και του προστάτη [6]. Ωστόσο, σε μη-παχυσαρκία σχετίζεται καρκίνους, όπως ο καρκίνος του πνεύμονα, η αδιπονεκτίνη ορού δεν είναι ένα σημαντικό προγνωστικό παράγοντα κινδύνου [7].

υποδοχείς αδιπονεκτίνη 1 και 2 δρουν απευθείας επί κυττάρων όγκου με σύνδεση και ενεργοποίηση υποδοχέων αδιπονεκτίνη και κατάντη μονοπάτια σηματοδότησης [5]. Αδιπονεκτίνη διαθέτει αντι-αγγειογένεσης και κατά του όγκου ικανότητα, η οποία γίνεται μέσω της κασπάσης με τη μεσολάβηση των ενδοθηλιακών κυττάρων απόπτωση [8]. Μπορεί επίσης να αναστέλλουν την ανάπτυξη των όγκων του ήπατος και τη μετάσταση από την καταστολή της αγγειογένεσης των όγκων και προς τα κάτω ρύθμιση της ROCK /IP10 μεταλλο /μήτρας (ΜΜΡ) -9 οδό [9].

Ωστόσο, η αδιπονεκτίνη είναι μια πιθανή δείκτη του προστάτη εξέλιξης του καρκίνου [ ,,,0],10]. Σε χονδροσάρκωμα, αυτό προκαλεί την μετανάστευση των ανθρώπινων κυττάρων χονδροσαρκώματος από το μεταγραφικό προς τα πάνω ρύθμιση alpha2beta1 ιντεγκρίνης και ενεργοποίηση του υποδοχέα AdipoR, ΑΜΡΚ, ρ38, και μονοπάτια NF-κΒ [11]. Παρ ‘όλα αυτά, ο ρόλος του στον καρκίνο του πνεύμονα παραμένει ασαφής [12,13]. Πετρίδου et al. ανέφεραν ότι τα κυκλοφορούντα επίπεδα αδιπονεκτίνης δεν συσχετίζονται με τα στάδια του καρκίνου του πνεύμονα [14]. Η έκφραση του υποδοχέα αδιπονεκτίνης 1 είναι ένα ευνοϊκό προγνωστικό παράγοντα για τον καρκίνο του πνεύμονα [15].

Η κουρκουμίνη (diferuloylmethane), μια φυσική ένωση που εξάγεται από

Curcuma longa

, έχει χρησιμοποιηθεί από την αρχαιότητα στην το Orient ως θεραπευτικός παράγοντας για διάφορες ασθένειες. Η κουρκουμίνη έχει πολλές φαρμακολογικές δραστηριότητες, συμπεριλαμβανομένων αντι-φλεγμονωδών [16], αντιοξειδωτικό [16], αντιμικροβιακή [17], και αντικαρκινικές δράσεις [18-21]. Οι αντικαρκινικές επιδράσεις της εκδηλώνεται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, εισβολή, μετάσταση, απόπτωση και την αγγειογένεση [22]. Για παράδειγμα, η κουρκουμίνη μπορούν να επάγουν κυτταρική απόπτωση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [23,24]. Η μοριακή βάση του αντικαρκινική δράση του αποδίδεται στο αποτέλεσμα του επί αρκετούς στόχους, συμπεριλαμβανομένων των παραγόντων μεταγραφής, ρυθμιστές ανάπτυξης, τα μόρια προσκόλλησης, αποπτωτικών γονιδίων, ρυθμιστές της αγγειογένεσης, και κυτταρικά μόρια σηματοδότησης [25]. Παρά το γεγονός ότι η κουρκουμίνη αναστέλλει τη μετανάστευση καρκίνο του πνεύμονα και εισβολής μέσω Rac-1 ή Wnt /β-κατενίνης μονοπάτια, ο ρυθμιστικός μηχανισμός της κουρκουμίνης στον καρκίνο του πνεύμονα παραμένει άγνωστη.

Οι περισσότεροι καρκίνοι του πνεύμονα διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο στάδιο, όταν η θεραπεία είναι σχετικά αναποτελεσματική. Πώς να αυξήσει το παρόν διαθέσιμο χημειοθεραπευτικές αγωγές με συμπληρωματική φυτικά φάρμακα, τα οποία μπορεί να μειώσει τις παρενέργειες και τοξικότητα, χωρίς να διακυβεύεται η θεραπευτική αποτελεσματικότητα, έχει γίνει ένας δημοφιλής προσέγγιση κατά τις τελευταίες δεκαετίες. Η κουρκουμίνη είναι ένα τέτοιο δυνάμει υποψήφιες. Αυτή η μελέτη διερεύνησε τις διαγνωστικές και προγνωστικές ρόλους της αδιπονεκτίνης σε NSCLC. Χρησιμοποιώντας

in vitro

καλλιέργεια κυττάρων Α549 και ένα ζωικό μοντέλο, έχουμε καταδείξει τον πιθανό ρόλο της κουρκουμίνης για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. Ο ακριβής μοριακός μηχανισμός της κουρκουμίνης στη μεσολάβηση επίδραση αδιπονεκτίνης ερευνήθηκε επίσης. Κατά συνέπεια, θα πρέπει επίσης να διερευνηθεί η δυνατότητα της κουρκουμίνης ως πράκτορας επικουρική στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Αποτελέσματα

Δημογραφικά έκφραση αδιπονεκτίνης δεδομένων και σε ασθενείς με ΜΜΚΠ

Από το 77 NSCLC ασθενείς σε αυτή τη μελέτη, 58 (75%) είχαν ιστολογικά επιβεβαιωμένο αδενοκαρκίνωμα και 19 (25%) είχαν καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων. μέσος όρος ηλικίας τους ήταν 61,6 ± 10,3 χρόνια (εύρος, 36 έως 78 ετών). έκφραση της αντιπονεκτίνης δεν συσχετιζόταν με όγκο (Τ), λεμφαδένες (Ν), και τα στάδια. NSCLC ασθενείς με μετάσταση είχαν σημαντικά υψηλότερα αδιπονεκτίνης αναλογία έκφραση (Πίνακας 1). Η ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς με NSCLC με χαμηλή αναλογία έκφρασης αδιπονεκτίνης είχαν σημαντικά μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης από εκείνες με υψηλό δείκτη αδιπονεκτίνης έκφρασης (

σ

= 0,015) (Εικόνα 1). αναλογίες κινδύνου για πολλαπλές μεταβλητές υπολογίστηκαν από Cox παλινδρόμησης με τις πρόσθετες μεταβλητές του φύλου (αρσενικό έναντι των γυναικών), μετάσταση, του όγκου, η συμμετοχή των λεμφαδένων, και τα στάδια (Πίνακας 2). Η ομάδα έκφραση υψηλής αδιπονεκτίνης είχαν 2,40 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο θνησιμότητας (

σ

= 0.04) σε σχέση με την ομάδα χαμηλής έκφρασης.

Η

Η

Τα επίπεδα έκφρασης της αδιπονεκτίνης, υποδοχείς αντιπονεκτίνης, και MMPs σε ασθενείς με ΜΜΚΠ

Τα επίπεδα έκφρασης της αδιπονεκτίνης, αδιπονεκτίνης υποδοχείς, και MMPs των ασθενών με NSCLC αναλύθηκαν (Σχήμα 2). Η ανοσοϊστοχημική χρώση και κηλίδωση Western του ιστού καρκίνου του πνεύμονα έδειξαν αυξημένη έκφραση του αδιπονεκτίνης και αδιπονεκτίνης υποδοχέα 1 στον ιστό του καρκίνου του πνεύμονα σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό πνεύμονα (Σχήμα 2Α-2C). Όλες οι MMPs επίσης αυξήθηκαν στον ιστό του καρκίνου του πνεύμονα σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό πνεύμονα (Σχήμα 2D-2F).

(Α) Δείγματα (καρκίνος του πνεύμονα και οι αντίστοιχοι φυσιολογικοί γειτονικούς ιστούς των πνευμόνων) αναλύθηκαν με αντισώματα προς αδιπονεκτίνης , υποδοχέα αδιπονεκτίνης 1, και του υποδοχέα της αντιπονεκτίνης 2 με ανοσοϊστοχημική χρώση (χρώση DAB και αιματοξυλίνη αντιχρωματισμός). Για αρνητικούς ελέγχους, το αντίσωμα αντικαταστάθηκε με IgG ελέγχου. (Β-Ο) Τα επίπεδα έκφρασης της αδιπονεκτίνης, υποδοχέα αδιπονεκτίνης 1, και του υποδοχέα αδιπονεκτίνης 2 σε τρία ζεύγη καρκίνου του πνεύμονα και των φυσιολογικών ιστών αναλύθηκαν με western αποτύπωση. (D-F) ζυμογραφία ζελατίνης χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δραστηριοτήτων των ΜΜΡ-2 /ΜΜΡ-9, ΜΜΡ-1 /ΜΜΡ-3 και ΜΜΡ-13 /ΜΜΡ-14. *

σ

& lt? 0,05 vs. φυσιολογικό πνευμονικό ιστό, με αντιπροσωπευτικά δεδομένα από τρεις διαφορετικούς ασθενείς με NSCLC. Τ, όγκου? Ν, φυσιολογικό? ADN, αδιπονεκτίνη? AdipoR1, υποδοχέα αδιπονεκτίνης 1? AdipoR2, υποδοχέα αδιπονεκτίνης 2.

Η

κυτταροτοξική δράση της κουρκουμίνης στην έκφραση της αδιπονεκτίνης και αδιπονεκτίνης υποδοχείς σε κύτταρα Α549

Τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης. Η δοκιμασία ΜΤΤ έδειξε ότι η κουρκουμίνη είχε κυτοτοξικό αποτέλεσμα επί των Α549 κυτταρικές γραμμές σε συγκεντρώσεις & gt? 75 μΜ (Σχήμα 3Α). Κηλίδωση Western αποκάλυψε επίσης ότι η έκφραση της αδιπονεκτίνης σε κύτταρα Α549 μειώθηκαν σημαντικά σε συγκέντρωση κουρκουμίνη του & gt? 50 μΜ (Σχήμα 3Β). Η έκφραση της πρωτεΐνης του υποδοχέα αδιπονεκτίνης 1 και αδιπονεκτίνη υποδοχέα 2 δεν άλλαξε με τη θεραπεία κουρκουμίνη ακόμη και σε υψηλές συγκεντρώσεις. Η επιμόλυνση των κυττάρων Α549 με φορέα αδιπονεκτίνης ή μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) πλασμίδιο αυξήθηκε επιτυχώς ή σιγήσει η έκφραση της αδιπονεκτίνης, όπως αποδεικνύεται με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και κηλίδωση Western (Σχήμα 3C και 3D).

(Α) η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ. Η κυτταροτοξική επίδραση της κουρκουμίνης ήταν προφανής σε συγκεντρώσεις & gt? 75 μΜ. επίπεδα (Β) Έκφραση της αδιπονεκτίνης, υποδοχέα αδιπονεκτίνης 1, και του υποδοχέα αδιπονεκτίνης 2 σε κύτταρα Α549 αναλύθηκαν με western αποτύπωση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις κουρκουμίνη. (C-D) Εξωγενείς επαγωγή και αποσιώπηση της αδιπονεκτίνης έκφραση σε κύτταρα Α549. έκφραση /πρωτεΐνης αδιπονεκτίνη mRNA σε κύτταρα Α549 αυξήθηκαν σημαντικά μετά εξωγενή αδιπονεκτίνης έκφρασης όπως αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. έκφραση αδιπονεκτίνης μειώθηκαν σημαντικά μετά siRNA μεσολάβηση αδιπονεκτίνη αποσιώπηση. NC-siRNA χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Εκπρόσωπος φωτογραφίες από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

σ

& lt? 0,05 ενάντια στον έλεγχο. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Η

Επιδράσεις της κουρκουμίνης και αδιπονεκτίνης στη μεταναστευτική και επεμβατική ικανότητα των κυττάρων Α549

Κινητή μετανάστευση αναλύθηκε με τη δοκιμασία μηδέν πληγή, ενώ διεισδυτικότητα προσδιορίστηκε με επικαλυμμένα με Matrigel δοκιμασία θαλάμου Boyden. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητα των κυττάρων Α549 ήταν σημαντικά ανέστειλε με τη θεραπεία κουρκουμίνη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (

ρ

& lt? 0,05) (Σχ 4Α και 4Β). Από την άλλη πλευρά, η ανασυνδυασμένη αδιπονεκτίνη αύξησε την επεμβατική και μεταναστευτικών ικανότητα των κυττάρων Α549 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (

ρ

& lt? 0,05). (Εικόνα 4C και 4D)

(Α) Cellular μετανάστευση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία μηδέν πληγή και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Wimasis WimScratch. Η μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων Α549 αναστάλθηκε σημαντικά με την αύξηση της δοσολογίας κουρκουμίνης σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

ρ

& lt? 0,05). (Β) ικανότητα εισβολής καθορίστηκε με Matrigel επικαλυμμένα δοκιμασία θαλάμου Boyden. Η κουρκουμίνη μείωσε σημαντικά την επεμβατική ικανότητα των κυττάρων Α549 (

ρ

& lt? 0,05) όταν η συγκέντρωση κουρκουμίνη ήταν & gt? 25 μΜ. (C-D) Η εφαρμογή του ανασυνδυασμένου αδιπονεκτίνης (rADN) αυξήθηκε σημαντικά το μεταναστευτικό και επεμβατική ικανότητα των κυττάρων Α549 (

σ

& lt? 0,05). Τα αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων φαίνονται? οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Η

Ρυθμιστική ρόλους του υποδοχέα-1 και αδιπονεκτίνη υποδοχέα της αντιπονεκτίνης 2 στη μετανάστευση και εισβολής των κυττάρων Α549

Τα κύτταρα Α549 επιμολύνονται με αδιπονεκτίνη siRNA, αδιπονεκτίνης υποδοχέα 1 siRNA, και η αδιπονεκτίνη υποδοχέα 2 πλασμίδιο siRNA. διαμόλυνση πλασμιδίου μείωσε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης της αδιπονεκτίνης, υποδοχέα αδιπονεκτίνης 1, και του υποδοχέα αδιπονεκτίνης 2 σε κύτταρα Α549, όπως επιβεβαιώθηκε με στύπωση Western (Σχήμα 5Α-5C). Επιβάλλει σιωπή στο έκφραση αδιπονεκτίνης δεν επηρέασε την έκφραση τόσο του υποδοχέα αδιπονεκτίνης 1 και του υποδοχέα 2, αλλά αποσιώπηση της έκφρασης του υποδοχέα αδιπονεκτίνης 1 μπλοκάρει την επίδραση της αδιπονεκτίνης, η οποία ενίσχυσε την μεταναστευτικά και επεμβατική ικανότητα των κυττάρων Α549. Ωστόσο, αποσιώπηση της έκφρασης του υποδοχέα αδιπονεκτίνης 2 δεν ανταγωνίζεται τη δράση της αδιπονεκτίνης για τη μετανάστευση και την ικανότητα εισβολής των κυττάρων Α549 (Σχήμα 5D και 5Ε).

(Α-Γ) Τα επίπεδα έκφρασης της αδιπονεκτίνης, αδιπονεκτίνης υποδοχέα 1, και η αδιπονεκτίνη υποδοχέα 2 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western μετά από επιμόλυνση με φορέα αδιπονεκτίνης ή αποσιώπηση από siADN, siAdipoR1 και siAdipoR2. (Δ-Ε) Το μεταναστευτικό και επεμβατική ικανότητα των κυττάρων Α549 ανεστάλη μετά την φίμωση του 1 έκφρασης υποδοχέα αδιπονεκτίνης από επιμόλυνση με siAdipoR1.

Η

Ρυθμιστική μονοπάτια της κουρκουμίνης στην αδιπονεκτίνης έκφραση

τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορους τύπους αναστολέων, συμπεριλαμβανομένων των αναστολέων της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και ΜΑΡ πορείες κινάσης {ΡΙ3Κ (LY294002? 10 μΜ), ΑΚΤ (ΑΡΙ-59? 3 μΜ), και οι αναστολείς ΜΑΡΚ [PD98059 (10 μΜ) , SB203580 (10 μΜ), και SP600125 (10 μΜ) για ERK, p38-ΜΑΡΚ, και JNK, αντίστοιχα]}, για 1 ώρα και στη συνέχεια με κουρκουμίνη (50 μΜ) για 24 ώρες. Οι αναστολείς ERK και p38 μονοπάτι μπλοκάρει την ανασταλτική επίδραση της κουρκουμίνης επί αδιπονεκτίνης έκφρασης (Εικ 6Α). Επιπλέον, η ανασυνδυασμένη αδιπονεκτίνη αύξησε την έκφραση του ΑΚΤ (Σχήμα 6Β). δοκιμασία ηλεκτροφορητικής μετατόπισης κινητικότητας (EMSA) έδειξε ότι η αδιπονεκτίνη ρυθμισμένη έκφραση ΝΡ-κΒ μέσω της ΑΚΤ οδού (Σχήμα 6C).

(Α) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορους αναστολείς της οδού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και ΜΑΡ κινάσης {(ΡΙ3Κ (LY294002? 10 μΜ), ΑΚΤ (ΑΡΙ-59? 3 μΜ), αναστολείς ΜΑΡΚ [PD98059 (10 μΜ), SB203580 (10 μΜ), και SP600125 (10 μΜ) για ERK, p38-ΜΑΡΚ, και JNK, αντίστοιχα] } για 1 ώρα και στη συνέχεια με κουρκουμίνη (50 μΜ) για 24 ώρες. αδιπονεκτίνη έκφραση αναλύθηκε με κηλίδωση Western. έκφρασης (Β) ΑΚΤ αναλύθηκε με κηλίδωση Western με διαφορετικές συγκεντρώσεις αδιπονεκτίνης ανασυνδυασμού. (C) η δραστηριότητα της ρ65 /ρ50 των κυττάρων Α549 αναλύθηκε με EMSA μετά τη θεραπεία με ανασυνδυασμένη αδιπονεκτίνης ή αναστολέα ΑΚΤ (API-59? 3 μΜ)., αντίστοιχα

η

Co-ανοσο-καταβύθιση (Co-IP) δοκιμασία

Αυτή η δοκιμασία έδειξε ότι αποτελούνταν από αδιπονεκτίνης μονομερές, διμερές, και πολυμερές (Σχήμα 7Α). η κουρκουμίνη και φίμωσης διαμόλυνση αδιπονεκτίνη μείωσε επιτυχώς την έκφραση του μονομερούς αδιπονεκτίνης και διμερούς. Η κουρκουμίνη μείωσε επίσης την έκφραση ρ65, όπως φαίνεται από την Co-ΠΕ και προσδιορισμούς EMSA (Σχήμα 7Β και 7C). Ενισχυμένη έκφραση αδιπονεκτίνης με επιμόλυνση με αδιπονεκτίνη αύξησε επίσης την έκφραση ΝΡ-κΒ. Η αντιπονεκτίνη μπορεί να μετατοπίζονται στον πυρήνα να δεσμεύσει με πυρηνικά p65.

κύτταρα (Α) Α549 που έλαβαν θεραπεία με κουρκουμίνη, φιμώνονται, ή επιμολυσμένα με αδιπονεκτίνης λύθηκαν και η αδιπονεκτίνη ήταν συν-ανοσοκαταβυθίζεται χρησιμοποιώντας αντίσωμα αδιπονεκτίνης. Ανοσοστύπωμα με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα επιβεβαίωσε την συν-καθίζηση της αδιπονεκτίνης μονομερές, διμερές, και πολυμερές. (Β) συνανοσοκαθίζησης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντι-αδιπονεκτίνη και τα αντισώματα αντι-p65. Το έκλουσμα ρ65 διαχωρίστηκε σε SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με τα αντίστοιχα αντισώματα, η οποία έδειξε σημαντική συσχέτιση της αδιπονεκτίνης με το συστατικό ρ65. (Γ) Η ενεργοποίηση του NF-κΒ από υπερέκφραση ή αποσιώπηση της αδιπονεκτίνης προσδιορίστηκε από τον EMSA. Αδιπονεκτίνη αύξησε την πυρηνική μετατόπιση του p65 /p50 και την ενεργοποίηση του NF-κΒ, αλλά αποσιώπηση της έκφρασης αδιπονεκτίνης είχε το αντίθετο αποτέλεσμα.

Η

In vivo

και

in vitro

επίδραση της αδιπονεκτίνης επί ΜΜΡ έκφραση

Η επιμόλυνση με αδιπονεκτίνη αύξησε επιτυχώς τα επίπεδα έκφρασης της ΜΜΡ-2, -9, -1, και -14 σε κύτταρα Α549. Ωστόσο, η έκφραση του ΜΜΡ-3 και -13 δεν άλλαξε με ενισχυμένη ή σιγήσει έκφραση αδιπονεκτίνης (Εικόνα 8).

Η ζελατίνη zymography χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί με τις δραστηριότητες της ΜΜΡ-2 /ΜΜΡ-9, MMP- 1 /ΜΜΡ-3 και ΜΜΡ-13 /ΜΜΡ-14. (Α-Ρ) Οι δραστηριότητες της ΜΜΡ-9, -1, και -14 αυξήθηκαν μετά την υπερέκφραση της αδιπονεκτίνης και μειώθηκε με την αποσιώπηση της αδιπονεκτίνης. Έκφραση της ΜΜΡ-3 και -13 δεν αλλάζει, ανεξάρτητα από αύξηση αδιπονεκτίνης ή αποσιώπηση.

Η

In vivo

επίδραση της κουρκουμίνης στην αύξηση του όγκου και της έκφρασης της αδιπονεκτίνης και ΜΜΡ

θεραπεία κουρκουμίνη μείωσε σημαντικά το

in vivo

ανάπτυξης του όγκου και η έκφραση αδιπονεκτίνης σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (DMSO) (

ρ

& lt? 0,05) (Σχ 9Α και 9Β), αλλά η έκφραση τόσο αδιπονεκτίνης υποδοχέα 1 και υποδοχέα 2 δεν άλλαξε (Σχήμα 9Γ). θεραπεία κουρκουμίνη επίσης μείωσε σημαντικά τα επίπεδα όλων των MMPs, εκτός ΜΜΡ-1 που παρέμειναν ανεπηρέαστες, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 9D-9F).

(Α) Τα μεγέθη των όγκων των ποντικών που έλαβαν κουρκουμίνη ήταν μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με εκείνα της ομάδας ελέγχου μετά από 14 ημέρες. (Β) Tumor αδιπονεκτίνης έκφραση της κουρκουμίνης αγωγή ποντικούς ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με εκείνη της ομάδας ελέγχου. (C) έκφραση και των δύο αδιπονεκτίνης υποδοχέα 1 και 2 υποδοχέα στα ποντίκια κουρκουμίνη αγωγή δεν άλλαξε

in vivo

. (D-F) Τα επίπεδα έκφρασης της ΜΜΡ-2, -9, -3, -13, -14 και μειώθηκαν με θεραπεία κουρκουμίνη

in vivo

. MMP-1 έκφραση δεν μεταβλήθηκε.

Η

Συζήτηση

Η χημειοθεραπεία παραμένει η κύρια θεραπεία για τον προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα [26], αν και στοχευμένη θεραπεία είναι πιο δημοφιλής. Σοβαρές παρενέργειες της χημειοθεραπείας συνήθως περιορίζουν την κλινική εφαρμογή τους. Κατά συνέπεια, οι κλινικοί γιατροί ενδιαφέρονται ολοένα και περισσότερο στο φυτικό φάρμακο αφού τις τελευταίες δεκαετίες, λόγω της ασφάλειας και της αποτελεσματικότητας της ως επικουρική θεραπεία. Η κουρκουμίνη, μια φαινολική ένωση που προέρχεται από το φυτό

Curcuma longa

, έχει χρησιμοποιηθεί για αιώνες για αντι-φλεγμονώδη, χημειοπροληπτικές του, και το δυναμικό χημειοθεραπευτικών ιδιότητες. Μέχρι σήμερα, τα τρέχοντα στοιχεία δείχνουν ότι η κουρκουμίνη μπορεί να μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τον μετασχηματισμό, και εισβολή [27]. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι η κουρκουμίνη μπορεί να αναστείλει τη μεταναστευτική και επεμβατική ικανότητα των κυττάρων Α549

in vitro

με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, η κουρκουμίνη επίσης μείωσε σημαντικά την

in vivo

ανάπτυξης του όγκου.

Tumor εισβολή και μετάσταση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία πολλών σταδίων που περιλαμβάνει προσκόλληση, η υποβάθμιση του περιβάλλοντος μήτρας, μετανάστευση, πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση [ ,,,0],28]. Η κουρκουμίνη έχει υψηλή φυσική ικανότητα αντιμεταστατικά. Μπορεί να μειώσει την εισβολή του B16F-10 κύτταρα μελανώματος αναστέλλοντας την έκφραση του ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 και να ενισχύσει την έκφραση του αντιμεταστατική πρωτεϊνών (Ε-καδερίνης και αναστολείς ιστού των ΜΜΡ-2) [29,30]. Σε ένα μοντέλο όγκου ξενομοσχεύματος του προστάτη ή καρκίνο του μαστού, η κουρκουμίνη επίσης έδειξε υψηλή αντιμεταστατική επίδραση καταστέλλοντας την έκφραση της ΜΜΡ-9, ΝΡ-κΒ, και της κυκλοοξυγενάσης-2 [31,32]. Σε αυτή τη μελέτη, η κουρκουμίνη μπορεί να αναστέλλουν την μετανάστευση και την εισβολή του Α549 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο

in vitro

. Στο μοντέλο ξενομοσχεύματος μας με Α549, κουρκουμίνη μπορεί να μειώσει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου και έχει ένα παρόμοιο αποτέλεσμα καταστολής της έκφρασης των MMPs, με εξαίρεση τις ΜΜΡ-1 και -13.

Ο λιπώδης ιστός θεωρείται ως ένα ενδοκρινικό σύστημα που μπορεί εκκρίνουν πολλές ορμόνες και κυτοκίνες, οι οποίες είναι γνωστές ως Αδιποκυτοκίνες [33]. Αδιπονεκτίνη αντιπροσωπεύει την πιο άφθονη πρωτεΐνη λιπώδους ιστού με ινσουλίνη-ευαισθητοποιητικό, αντι-φλεγμονώδη και αντι-αθηρογόνες ιδιότητες [34,35]. Επιπλέον, η αδιπονεκτίνη μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των διαφόρων τύπων κακοηθειών [35]. Το επίπεδο αδιπονεκτίνης ορού αντίστροφα με τον κίνδυνο κακοηθειών παχυσαρκία, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του ενδομητρίου, και καρκίνων του προστάτη, αλλά συσχετίζεται θετικά με καρκίνο του στομάχου και λευχαιμία [35].

Ωστόσο, ο προγνωστικός ρόλος του κυκλοφορικού αδιπονεκτίνης στον καρκίνο του πνεύμονα παραμένει αμφιλεγόμενη [12,14]. Στην έκθεση αυτή, η αδιπονεκτίνη έκφραση δεν συσχετίζονται με πνεύμονα TN και τα στάδια του καρκίνου. ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα με χαμηλή αναλογία αδιπονεκτίνης έκφρασης έδειξε μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης από ό, τι τα άτομα με υψηλή έκφραση. Έτσι, η έκφραση της αδιπονεκτίνης μπορεί να είναι ένας προγνωστικός παράγοντας του NSCLC.

Σε αυτή τη μελέτη, επίσης, έδειξε ότι οι ασθενείς με NSCLC με μετάσταση έχουν σημαντικά υψηλότερη αναλογία έκφρασης αδιπονεκτίνης από εκείνους που δεν μετάσταση. Η υπερέκφραση της αδιπονεκτίνης με επιμόλυνση μπορεί να αυξήσει την επεμβατική και μεταστατική ικανότητα των κυττάρων Α549, ίσως μέσω της ενεργοποίησης των MMPs (1, 9, 14). Αδιπονεκτίνης μπορεί να αναστείλει την άνω και κάτω τελεία [36,37] και το συκώτι της μετανάστευσης [37] καρκινικών κυττάρων, αλλά προωθεί την ανάπτυξη καρκινώματος του προστάτη και του ενδομητρίου. Ως εκ τούτου, ο ρόλος της αδιπονεκτίνης στην καρκινογένεση είναι μεταβλητή σε διαφορετικούς τύπους καρκινικών κυττάρων

Μέχρι στιγμής, τρεις τύποι υποδοχέων αδιπονεκτίνης έχουν εντοπιστεί:. Οι δύο κύριες υποδοχείς AdipoR1 και AdipoR2 και έναν υποδοχέα παρόμοιο με την οικογένεια cadherin. AdipoR1 και AdipoR2 είναι επτά τρανς-μεμβράνη πρωτεΐνες που μπορούν να μεσολαβήσουν την οξείδωση των λιπαρών οξέων και την πρόσληψη γλυκόζης μέσω της δέσμευσης αδιπονεκτίνης. Τα λειτουργικά αδιπονεκτίνης υποδοχείς συνήθως εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα. Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική χρώση, Τζαμσίντ et al. έδειξαν ότι η έκφραση του AdipoR1 και AdipoR2 είναι χαμηλότερη σε NSCLC ιστό σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό πνεύμονα. Εδώ, δείξαμε αυξημένη έκφραση πρωτεΐνης AdipoR1 και ανοσοϊστοχημική χρώση σε ιστούς NSCLC. Επιβάλλει σιωπή στο έκφραση AdipoR1 μπορούν να μπλοκάρουν την επίδραση της αδιπονεκτίνης για τη μετανάστευση και την ικανότητα εισβολής των κυττάρων Α549. Παρεμποδίζουν την έκφραση AdipoR2 δεν επηρέασε τη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων Α549.

Η κουρκουμίνη έχει καταστεί ένας αποτελεσματικός παράγων επικουρική στην θεραπεία του καρκίνου, καθώς μπορεί να ρυθμίζουν τη δράση πολλών παραγόντων μεταγραφής και μονοπατιών σηματοδότησης τους [38]. Μπορεί να επάγει κυτταρική απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού ρ38 σε καρκίνο του πνεύμονα και των ωοθηκών όγκου [39]. Ωστόσο, ο ρυθμιστικός ρόλος της κουρκουμίνης στην αδιπονεκτίνης έκφρασης παραμένει ασαφής. Δείξαμε ότι η κουρκουμίνη αναστέλλει την έκφραση αδιπονεκτίνης μέσω του p38 και μονοπάτια ERK. Επιπλέον, η αδιπονεκτίνη μπορεί να επάγει την ενεργοποίηση του μονοπατιού ΑΚΤ, η οποία επίσης εμπλέκεται στην ενεργοποίηση του NF-κΒ οδού στον καρκίνο του πνεύμονα.

Εν κατακλείδι, η αδιπονεκτίνη μπορεί να είναι ένα νέο δυναμικό προγνωστικός δείκτης του NSCLC. Εκτός από το κλασικό χημειοθεραπεία,

in vivo

και

in vitro

αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι η κουρκουμίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένας παράγων ανοσοενισχυτικό στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα στο μέλλον. Ωστόσο, η κακή απορρόφηση, το μεταβολισμό, και η βιοδιαθεσιμότητα της κουρκουμίνης μπορεί να περιορίσει την κλινική εφαρμογή της. Αρκετές τυποποιήσεις έχουν παρασκευασθεί που περιλαμβάνουν νανοσωματίδια, λιποσώματα, μικύλλια, και τα σύμπλοκα φωσφολιπιδίων, η οποία θα μπορούσε να αυξήσει τη βιοδιαθεσιμότητα και την προώθηση πλέον κυκλοφορία, καλύτερη διαπερατότητα, και την αντίσταση σε μεταβολικές διαδικασίες της κουρκουμίνης [40].

Υλικά και Μέθοδοι

δείγμα του όγκου συλλογής

Ο NSCLC και τα αντίστοιχα των φυσιολογικών ιστών συλλέχθηκαν από 77 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή μεταξύ 2004 και 2011 της Διεύθυνσης Θωρακοχειρουργική, Τμήμα χειρουργικής, Kaohsiung Ιατρικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο. Τα δείγματα ιστού τοποθετήθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο για την αποστολή στο εργαστήριο και στη συνέχεια αποθηκεύονται σε καταψύκτες -80 ° C μέχρι την απομόνωση του RNA και εκχύλιση πρωτεΐνης. Πλήρης διαδικασίες στάσης, περιλαμβανομένων ακτινογραφία θώρακα, η βρογχοσκόπηση, αξονική τομογραφία του εγκεφάλου και θωρακική κοιλότητα, υπερηχογράφημα και σπινθηρογράφημα οστών, έγιναν για να προσδιορίσει με ακρίβεια τα χαρακτηριστικά του όγκου σύμφωνα με το σύστημα σταδιοποίησης ΤΝΜ Διεθνούς για τον καρκίνο του πνεύμονα [41]. Όλοι οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν μέχρι το Μάρτιο του 2012. Λεπτομέρειες των δημογραφικών και επιβίωση των δεδομένων τους έχουν ενημερωθεί.

Ηθική δήλωση

Institutional Review Board του koahsiung ιατρικό πανεπιστημιακό νοσοκομείο για την Έρευνα ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης (KMUH -IRB-990357). Όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν ενυπόγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση.

εκχύλιση RNA και PCR πραγματικού χρόνου

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από τους ιστούς όγκων κατεψυγμένων των πνευμόνων των ασθενών με NSCLC και σε αντίστοιχη κανονική παρακείμενους ιστούς των πνευμόνων. RNA απομονώθηκε από φυσιολογικό ιστό πνεύμονα, πνευμονικό ιστό του όγκου, και ο καρκίνος του πνεύμονα κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου, το οποίο διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42]. Οι ακόλουθοι εκκινητές για πραγματικού χρόνου PCR σχεδιάστηκαν με τη χρήση του λογισμικού Primer Express (RealQuant, Roche, Mannheim, Germany) χρησιμοποιώντας δημοσιευμένες αλληλουχίες: ανθρώπινη αστάρι αδιπονεκτίνης νόημα: 5′-GGT GAT GGC AGA GAT GGC AC-3 ‘και αδιπονεκτίνης αντιπληροφοριακό εκκινητή : 5’-GCC TTG TCC TTC TTG AAG AG-3 ‘και το ανθρώπινο GAPDH αίσθηση έναυσμα: 5′-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3′ και GAPDH αντιπληροφοριακό εκκινητή: 5’-GCC CAA GAC TAC CAA ATC C-3 ‘ .

τα δεδομένα φθορισμού αποκτήθηκαν στο τέλος της παράτασης. Melt ανάλυση πραγματοποιήθηκε για όλα τα προϊόντα για να προσδιοριστεί η ειδικότητα της ενίσχυσης. Επιπλέον, τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα 1% αγαρόζης για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του σωστά μεγέθη συγκροτήματος. Η σχετική έκφραση υπολογίστηκε ως λόγος της έκφρασης σε ιστό καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με την έκφραση στο φυσιολογικό γειτονικό ιστό (καρκινικής βλάβης /φυσιολογικού ιστού & gt? 1, υψηλή έκφραση, και & lt? 1, χαμηλή έκφραση) [42-44 ].

Immuno-ιστοχημική χρώση

δειγμάτων όγκου αποκόπηκαν από ανθρώπινο ιστό πνεύμονα, μονιμοποιήθηκαν σε 4% ρυθμισμένο διάλυμα φορμαλίνης όλη τη νύκτα, ενσωματωμένο σε παραφίνη, και κόπηκαν σε τμήματα πάχους 5-μm. Οι τομές παραφίνης από-παραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο και χρωματίστηκαν με αντι-ανθρώπου αδιπονεκτίνης (GeneTex, Irvine, CA, USA), υποδοχέα αδιπονεκτίνης 1 (AdipoR1), και αδιπονεκτίνη υποδοχέα 2 (AdipoR2) (Santa Cruz, CA, USA). Μετά από πλύσιμο με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), οι τομές επωάστηκαν με χρένο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Για τις αντιδράσεις χρώμα, διαμινοβενζιδίνη (DAB) χρησιμοποιήθηκε και αντίθετα με αιματοξυλίνη. Για αρνητικούς ελέγχους, το αντίσωμα αντικαταστάθηκε με IgG ελέγχου.

κηλίδωση Western

κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42], μετά την οποία οι μεμβράνες υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS που περιείχε 0,05% Tween 20 και 2% αποβουτυρωμένο γάλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν ξεχωριστά με ποντικού αντι-ανθρώπινο αδιπονεκτίνης (GeneTex, Irvine, CA, USA), AdipoR1, AdipoR2, ρ65, ρ50, MMPs (2, 9, 1, 3, 13, 14) (Santa Cruz, CA, USA), ιστόνη Η1, ΑΚΤ /ρΑΚΤ, P38 /ρρ38 (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, USA), και β-ακτίνη (Abcam, Cambridge, ΜΑ, USA) για 1 ώρα. Μετά το πλύσιμο, οι μεμβράνες επωάστηκαν με υπεροξειδάση αρμορακίας συζευγμένη με κουνελιού αντι-κατσίκας ή IgG ποντικού σε θερμοκρασία δωματίου. Ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντιδραστηρίου χημειοφωταύγειας συν NEN και η έκθεση σε Biomax MR Film (Kodak, Rochester, NY, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Πολιτισμός κυττάρων NSCLC

πνεύμονα κύτταρα αδενοκαρκινώματος Α549 (ATCC CCL-185) καλλιεργήθηκαν σε φιάλες που περιέχουν μέσο ανάπτυξης Ρ12Κ συμπληρωμένο με ορό 5% εμβρυϊκό ορό (FBS), 100 U /mL πενικιλλίνη, και 100 pg /mL στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2.

αποσιώπηση της έκφρασης της αδιπονεκτίνης, υποδοχέα αδιπονεκτίνης 1, και του υποδοχέα αδιπονεκτίνης 2 σε Α549 κύτταρα

siRNA, μια ειδική δίκλωνου RNA αλληλουχία 21 νουκλεοτιδίων ομόλογη προς το γονίδιο στόχο, ήταν χρησιμοποιούνται για να φιμώσουν την έκφραση AdipoR1 και AdipoR2. Ανθρώπινα αδιπονεκτίνης siRNA νοηματικό εκκινητή: 5′-GUG UGG UGG GAU AGA CUU ΑΤΤ-3 ‘και αντιπληροφοριακό εκκινητή: 5′-ΧΓΕ GUC UCC AAU CCC ACA CTT’-3 (Santa Cruz, CA)? ανθρώπινο AdipoR1 siRNA νοηματικό εκκινητή: 5′-GGA CAA CGA CUA UCU ΕΕΜ ACA-3 ‘και αντιπληροφοριακό εκκινητή: 5′-UCU AGC AGA UAG Πανεπιστημίου Στερεάς Ελλάδας UUG UCC-3′? και AdipoR2 siRNA νοηματικό εκκινητή: 5’-GGA Ουυ Πανεπιστημίου Στερεάς Ελλάδας UUU CAU GAU CGG-3 ‘και αντιπληροφοριακό εκκινητή: 5′-CCG AUC Αύγουστο ΑΑΑ CGA AAC UCC-3’. χρησιμοποιήθηκαν (Sigma-Aldrich, Σιγκαπούρη)

Η επίδραση της αποσιώπησης siRNA διαμόλυνση εκτιμήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου και ανοσοκηλίδωση. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μια πλάκα έξι και παροδικά επιμολυσμένα με 20 ηΜ siRNA χρησιμοποιώντας 8 μλ siPORT αμίνη (Ambion, Austin, ΤΧ, USA) για ένα συνολικό όγκο επιμόλυνση των 0.5 mL. Μετά από επώαση στους 37 ° C, υπό 5% CO2 για 5 ώρες, 1.5 mL του κανονικού μέσου ανάπτυξης προστέθηκε

, και τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες.

ΜΤΤ δοκιμασία για βιωσιμότητα των κυττάρων

προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42].

In vitro

μετανάστευση /εισβολή αναλύσεις

Η μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων αναλύθηκε σε ένα δοκιμασία απογύμνωση μονοστιβάδας, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42]. Τα συρρέοντα κύτταρα τραυματίστηκαν με απόξεση με ρύγχος πιπέτας 100 μL, οι οποίες απογυμνωμένη μια λωρίδα της μονοστιβάδας που ήταν 300 μm σε διάμετρο. Πλύναμε την καλλιέργεια δύο φορές με PBS και προστέθηκε 5% FBS ως μέσο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα θα μεταναστεύσει στην απογυμνωμένη περιοχή και φωτογραφήθηκαν. Οι περιοχές που αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Wimasis WimScratch, μια νέα γενιά web-based εργαλείο εικόνα για την ανάλυση της μετανάστευσης των κυττάρων. τεχνικές ανίχνευσης ακμών μπορεί να αναγνωρίσει εύκολα την αιχμή και την περιοχή κενό. Οι χρήστες μπορούν να φορτώσουν τις εικόνες και την ανάλυση θα ξεκινήσει αυτόματα.

Κινητά εισβολή ποσοτικά χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη δοκιμασία θαλάμου Matrigel Boyden. Ο θάλαμος εισβολή BIOCOAT Matrigel (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα (4 χ 10

4) σε μέσο χωρίς ορό σπάρθηκαν πάνω σε επικαλυμμένα με Matrigel φίλτρα. Στις κατώτερες θαλάμους, 5% FBS προστέθηκε ως χημειοελκτικό. Μετά από επώαση για 24 ώρες, η μεμβράνη πλύθηκε συνοπτικά με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη. Η άνω πλευρά της μεμβράνης σκουπίστηκε απαλά με ένα κομμάτι βαμβάκι. Η μεμβράνη στη συνέχεια χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη και να αφαιρεθεί. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.