Αφηρημένο

Στόχοι

ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου δεν είναι μόνο σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του όγκου αλλά επίσης εξαρτάται από την αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων του όγκου και το μικροπεριβάλλον στρωματικών. Μια νέα κατανόηση του ρόλου του μικροπεριβάλλον του όγκου υποδηλώνει ότι η απώλεια του στρωματικά caveolin-1 (Cav-1) ως ένα βασικό ρυθμιστή μπορεί να γίνει ένας πιθανός στόχος θεραπείας. Η μελέτη αυτή έχει ως στόχο να διευκρινίσει αν στρωματικά Cav-1 έκφρασης σε καρκίνο του παγκρέατος μπορεί να είναι ένας ισχυρός βιοδείκτης πρόγνωση.

Μέθοδοι

Τα δείγματα ιστών από 45 ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος μελετήθηκαν. Παρέγχυμα και στρώμα διαχωρίστηκαν και καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας σύλληψη λέιζερ μικροδιατομή. Στρωματικά Cav-1 έκφραση μετρήθηκε από καρκίνο του παγκρέατος, παρανεοπλασματικό, και κανονικό ιστό χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. Αναλύσαμε τη συσχέτιση των στρωματικών Cav-1 έκφρασης με κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά και προγνωστικοί δείκτες, όπως ο δείκτης όγκου HER-2 /neu γονίδιο.

Αποτελέσματα

Τα δείγματα από έξι ασθενείς (13,3%) παρουσίασαν υψηλά επίπεδα στρωματικών χρώσης Cav-1, εκείνων που προέρχονται από οκτώ ασθενείς (17,8%) έδειξε ένα χαμηλότερο, ενδιάμεσο επίπεδο χρώσης, ενώ αυτά από 31 ασθενείς (68,9%) έδειξε την απουσία χρώσης. Cav-1 έκφραση στον καρκίνο που σχετίζεται με ινοβλάστες ήταν χαμηλότερη από ότι σε paracancer που σχετίζονται και σε φυσιολογικούς ινοβλάστες. Στρωματικά Cav-1 απώλεια συνδέθηκε με το στάδιο TNM (

P =

0.018), λεμφαδένα μετάσταση (

P

= 0,014), μακρινή μετάσταση (

P

= 0,027) και HER-2 ενίσχυσης /neu (

P

= 0,007). Οι σχέσεις του ηλικία, το φύλο, η ιστολογική ποιότητα, και το μέγεθος του όγκου με στρωματικά έκφραση Cav-1 δεν ήταν σημαντικές (

P

& gt? 0,05). Μια αρνητική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων και στρωματικών Cav-1 (

P

& lt? 0,05).

Συμπέρασμα

Η απώλεια των στρωματικών Cav-1 στα παγκρεατικά καρκίνος ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης, υποδεικνύοντας έτσι ότι στρωματικά Cav-1 μπορεί να είναι ένας αποτελεσματικός θεραπευτικός στόχος για τους ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Shan Τ, Lu η, Ji η, Li Υ, Guo J, ο Τσεν Χ, et al. (2014) Απώλεια στρωματικά Η caveolin-1 Έκφραση: Ένα μυθιστόρημα στο μικροπεριβάλλον του όγκου βιοδεικτών που μπορεί να προβλέψει Κακή κλινική έκβαση για τον καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 9 (6): e97239. doi: 10.1371 /journal.pone.0097239

Επιμέλεια: Bernard Μαρί, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Γαλλία

Ελήφθη: 25 Οκτωβρίου, 2013? Αποδεκτές: 16 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 20 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Shan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από την επιστημονική Μεγάλο της Shaanxi (2012SXKG-21). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος έχει ένα ποσοστό επιβίωσης λιγότερο από 25% σε πέντε χρόνια μετά την μερική pancreaticoduodenectomy και είναι ένα από τα πιο επιθετική και δυσεπίλυτο ανθρωπίνων κακοηθών όγκων [1]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το μικροπεριβάλλον εξυπηρετούν μια λειτουργία στην εξέλιξη των κακοήθων επιθηλιακών όγκων, τονίζοντας έτσι τη σημασία της κατανόησης των στρωματικών κυττάρων στην πρόληψη του καρκίνου του κυττάρου επιθετικότητας και στρατηγικές θεραπείας κατά του καρκίνου [2]. Για να κατανοήσουμε πλήρως τον μηχανισμό οδήγησης υποτροπή του όγκου, μετάσταση, και την κλινική έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο, πρέπει να εξεταστεί ο ρόλος της μικροπεριβάλλον του όγκου. Συγκεκριμένα, ο καρκίνος σχετίζεται με ινοβλάστες (CAFS) έχουν βρεθεί να εξυπηρετήσει μια κρίσιμη λειτουργία μέσω παρακρινούς αλληλεπιδράσεων με γειτονικά επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα [3], [4].

Caveolins (Cav) περιλαμβάνουν μία οικογένεια πρωτεϊνών ικριωμάτων ότι εγκολπώσεις μεμβράνη παλτό 50 nm έως 100 nm στο πλάσμα [5]. Η οικογένεια Cav αποτελείται από τρία ισόμορφα: Cav-1, Cav-2, και Cav-3. Το γονίδιο Cav-1 βρίσκεται σε χρωμόσωμα 7 (locus 7q31.1) και περιλαμβάνει τρία εξώνια (30, 165, και 342 bp) και δύο εσόνια (1,5 και 32 kb). Cav-1 είναι ένα δομικό συστατικό μικροσπηλαίων εμπλέκονται σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες, όπως φυσαλιδώδης μεταφορές, ομοιόσταση της χοληστερόλης, και την μεταγωγή σήματος [6]. Παρά την αυξανόμενη δέσμη ενδείξεων επί Cav-1 επίπτωση στην ογκογένεση, αν Cav-1 χρησιμεύει ως καταστολέας όγκου ή ως ένα ογκογονίδιο παραμένει ασαφής. Αυτά τα αντιφατικά αποτελέσματα προέρχονται κατά πάσα πιθανότητα από τη μελέτη των κακοήθων επιθηλιακών όγκων [7], [8], [9]. Ένα νέο πρότυπο του «αυτοφαγικά μοντέλο στρώματος του όγκου του μεταβολισμού του καρκίνου» εισήχθη πρόσφατα για να διευκολύνει την κατανόηση της λειτουργίας του μικροπεριβάλλοντα του όγκου [10], [11]. Σε αυτό το μοντέλο, η απώλεια του στρωματικά Cav-1 ως βασικός ρυθμιστής είναι ένας πιθανός στόχος της θεραπείας, γεγονός που υποδηλώνει την προγνωστική σημασία των στρωματικών Cav-1 [12]. Απώλεια στρωματικά Cav-1 είναι ο μοναδικός ανεξάρτητος προγνωστικός της πρώιμης υποτροπής και εξέλιξης του καρκίνου του μαστού [7]. Ayala et al. ανέφεραν ότι η απώλεια του στρωματικά Cav-1 συνέβαλε στην μεταστατική συμπεριφορά των κυττάρων καρκίνου του προστάτη μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει την αυξητική ρύθμιση του TGF-β1 και SNCG μέσω Akt ενεργοποίησης [13]. Zhao et al. ανέφεραν ότι Cav-1 επίπεδο έκφρασης σε CAFS προβλεπόμενη γαστρικό καρκίνο αποτελέσματα [14]. Karen et al. δήλωσε ότι η απώλεια του στρωματικά Cav-1 έκφραση σε κακοήθη μεταστάσεις μελανώματος προβλεπόμενη κακή επιβίωση [15]. Ωστόσο, στρωματικά Cav-1 σε καρκίνο του παγκρέατος, καθώς και η κλινική σημασία του, παραμένει ασαφής. Για να αποσαφηνιστεί η λειτουργία του στρωματικά Cav-1 σε καρκίνο του παγκρέατος, ερευνήσαμε την στρωματικά Cav-1 έκφραση σε παγκρεατικά δείγματα καρκίνου, μαζί με την συσχέτιση των στρωματικών έκφρασης Cav-1 με δείκτη όγκου HER-2 /neu και ένας αριθμός των κυκλοφορούντων καρκινικών κύτταρα (CTCs).

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα Ασθενών

από Ιανουάριος 2007-Δεκέμβριος 2012, του παγκρέατος καρκινικούς ιστούς (συμπεριλαμβανομένης επαρκούς μεγέθους δείγματα καρκινικού ιστού και δείγματα ιστών που λαμβάνονται από περιοχές εντός 2,0 εκατοστό του όγκου) ελήφθησαν από 45 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε μερική pancreaticoduodenectomy (Whipple εκτομή) για τον καρκίνο του παγκρέατος στο Τμήμα του ήπατος και του παγκρέατος Χειρουργική, πρώτο και δεύτερο συμβεβλημένα νοσοκομεία της Xi’an Jiaotong Πανεπιστημίου. Ένα μέρος του κάθε δείγματος πάγωσε και προετοιμάστηκε για τη σύλληψη λέιζερ μικροδιατομής (LCM)? άλλα τμήματα δείγμα μονιμοποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη για ιστολογικές μελέτες. Δέκα δείγματα που περιέχουν κανονική παγκρεατική ιστούς από τους ασθενείς που έλαβαν μερική παγκρεατεκτομή για καλοήθεις όγκους χρησιμοποιήθηκαν ως φυσιολογικοί μάρτυρες. Από τους ασθενείς της μελέτης 45, 24 ήταν άνδρες και 21 ήταν γυναίκες. Η διάμεση ηλικία κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης ήταν 64,5 έτη (εύρος από 44 χρόνια για 82 χρόνια). Όλες οι 45 ασθενείς είχαν αδενοκαρκίνωμα παγκρεατικού πόρου. το στάδιο του όγκου και ιστοπαθολογικές ταξινόμησης καταγράφηκαν σύμφωνα με την κατάταξη της Διεθνούς Καρκίνου Ένωσης κατά. Τρεις ασθενείς είχαν όγκους σταδίου Ι, 11 είχαν σταδίου ΙΙ, 27 είχαν σταδίου ΙΙΙ, και 4 ασθενείς είχαν σταδίου IV όγκους. Ιστολογική τάξεων όγκου ήταν ως εξής: 7 ασθενείς είχαν βαθμού Ι, 20 είχαν βαθμού II, και 18 είχαν όγκους βαθμού III. Όλοι οι ασθενείς συμμετείχαν στη διαδικασία παρακολούθησης. Ο διάμεσος χρόνος για την παρακολούθηση ήταν 22 μήνες (εύρος από 4 μηνών έως 52 μήνες). Αυτά τα δείγματα ελήφθησαν από δότες ή τον πλησιέστερο συγγενή ο οποίος υπέγραψε γραπτή συγκατάθεση. Οι μελέτες εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Συμβούλιο και την Επιτροπή Δεοντολογίας Θεσμικών Επανεξέταση της Xi’an Jiaotong Πανεπιστήμιο, Κίνα.

Η ανοσοϊστοχημεία

Cav-1 πρωτεΐνη ανιχνεύεται με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας το τυποποιημένο στρεπταβιδίνης-υπεροξειδάσης μέθοδο. Τομές ιστού (4 μm) επωάστηκαν όλη τη νύχτα με μια τυπική συγκέντρωση πρωτογενούς αντισώματος. Οι πλάκες επωάστηκαν για 30 λεπτά με IgG αντι-κουνελιού βιοτινυλιωμένο κατσίκα, που ακολουθείται από επώαση με συζευγμένη με υπεροξειδάση στρεπταβιδίνη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το χρώμα αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας 0,02% διάλυμα 3, 3′-διαμινοβενζιδίνη σε ρυθμιστικό διάλυμα 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.6) για 5 λεπτά έως 7 λεπτά. Τέλος, οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη, ξεπλένεται με νερό, αφυδατώθηκε, εκκαθαρίζονται και κάλυμμα γλίστρησε. Σε αρνητικούς ελέγχους για ανοσοχρώση, το πρωτογενές αντίσωμα αντικαταστάθηκε με μη άνοσο αίγας ή ορό κουνελιού. Ο αριθμός βαμμένων κυττάρων ανά 1000 προσδιορίσθηκε υπό ένα μικροσκόπιο (Olympus Optical Co, Ltd, Tokyo, Japan) σε τρία οπτικά πεδία, με μεγέθυνση × 400. Όταν ο συνολικός αριθμός των κυττάρων που παρατηρούνται κάτω από το μικροσκόπιο ήταν λιγότερο από 1000, όλα τα κύτταρα μετρήθηκαν. Η χρώση βαθμολογήθηκε ημιποσοτικά ως αρνητικό (μηδέν? Καθόλου χρώση), ασθενές (1? Είτε διαχέονται ασθενής χρώση ή ισχυρή χρώση σε λιγότερο από το 30% των στρωματικών κυττάρων), ή ισχυρά (2? Ορίζεται ως ισχυρή χρώση του 30% ή περισσότερο του στρωματικά κύτταρα). Αντισώματα έναντι Cav-1, βιμεντίνη, και β-ακτίνης αγοράστηκαν από Abcam (Cambridge, ΜΑ, USA ή Santa Cruz, California, USA).

LCM

Κατεψυγμένες τομές (πάχους 5 μm ) του καρκίνου του παγκρέατος, παρανεοπλασματικό, και φυσιολογικό ιστό μικροτομή χρησιμοποιώντας ένα σύστημα PixCell II LCM (Αρκτούρος Μηχανικών, Mountain View, California, USA). Το σύστημα καταγραφής λέιζερ ήταν εξοπλισμένο με PixCell II λογισμικό αρχειοθέτησης εικόνων. Οι ρυθμίσεις του λέιζερ ήταν ως ακολούθως: κηλίδα διαμέτρου 15 μm, διάρκεια παλμού 50 ms, και τροφοδοσίας για 50 mW. Ο ιστός μικροτομή σε 10 τμήματα από κάθε δείγμα με ένα ξεχωριστό «καπάκι» που χρησιμοποιείται για να συλλάβει το υλικό από κάθε τμήμα. Τυπικά, 2500 να 3000 παλμούς λέιζερ χρησιμοποιήθηκαν για κάθε καπάκι. Μετά μικροδιατομής, η πλαστική μεμβράνη που περιέχει τα κύτταρα σε μικροδιατομή απομακρύνθηκε από το υπόλοιπο του πώματος, και όλες οι ταινίες που περιέχουν υλικό από ένα μόνο δείγμα τοποθετήθηκαν σε ένα σωλήνα μικροφυγοκέντρησης και καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο ή αποθηκεύονται στους -80 ° C για εκχύλιση mRNA . Κατεψυγμένες τομές κόπηκαν σε κρυοστάτη. Τμήματα τήχθηκαν και τοποθετήθηκαν σε μη επικαλυμμένες γυάλινες πλάκες. Οι κατεψυγμένες τομές μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη για 30 s και χρωματίστηκαν με Η &? Ε, που ακολουθείται από τρία βήματα αφυδάτωση 5 s κάθε σε 70%, 95%, και 99,5% αιθανόλη, και η τελική 5 λεπτά αφυδάτωση σε ξυλόλιο. Δύο σημαντικοί παράγοντες για την εξασφάλιση ικανοποιητικής μικροδιατομής και τον έλεγχο των μεροληψία επιλογής χρησιμοποιώντας LCM είναι: (1) η ανάγκη για έναν εκπαιδευμένο παθολόγο να διακρίνουν συγκεκριμένους πληθυσμούς των ασθενών κυττάρων, όπως CAFS, οπτικά? και (2) την απουσία καλύμματος ολίσθησης στην ανάλυση τμήμα μικροδιατομή ιστού. Η απουσία μιας καλυπτρίδας και προσαρμογής του δείκτη μεταξύ των μέσων στερέωσης και του ιστού προκαλεί το τμήμα ξηρό ιστό για να έχουν μια ποιότητα διαθλαστικά που αποκρύπτει την κυτταρική λεπτομέρεια σε υψηλές μεγεθύνσεις. Για τη βελτίωση της απεικόνισης, μία σταγόνα ξυλολίου προστίθεται στον ιστό για την παροχή διαβροχής και να διευκολυνθεί η αντιστοίχιση δείκτη διάθλασης.

RT-PCR και Real-time PCR

Ολικό RNA εξήχθη από τα παγκρεατικά όγκου, παρανεοπλασματικό, και δείγματα φυσιολογικού ιστού χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Gibco BRL, Τεχνολογία Life, Grand Island, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ).

πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκε από 2 μg ολικού RNA χρησιμοποιώντας το RevertAid Kit ( Fermentas ΜΒΙ, Waltham, Μασαχουσέτη, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Τα σύνολα εκκινητών PCR σχεδιάστηκαν ως εξής: 1) για CAV-1 (140 bp), διαβιβάζει CTGGGCTGTTCTCGCTTCG-3 ‘και αντίστροφος 5′-CTCTCCTCTTCCTTCTCTTCTTCC-3′? και 2) για β-ακτίνη (179 bp), προς τα εμπρός 5’-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3 ‘και αντίστροφος 5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’. Οι συνθήκες της PCR περιελάμβανε ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης για 5 λεπτά στους 94 ° C ακολουθούμενη από 22 κύκλους ενίσχυσης: 30 sec στους 94 ° C, 30 sec στους 55 ° C, και 30 sec στους 72 ° C. Μετά τον τελευταίο κύκλο, μια τελική επέκταση πραγματοποιήθηκε στους 72 ° C για 10 λεπτά. Το γονίδιο housekeeping, β-ακτίνη, χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε με Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen, USA) χρησιμοποιώντας το Rotor-Gene RG-3000 (Corbett έρευνα, Doncaster Victoria, Αυστραλία). Για κάθε αμπλικόνιο, η ποσότητα της Cav-1 και β-ακτίνης προσδιορίζεται από μία πρότυπη καμπύλη που δημιουργείται με σειριακή αραίωση. Πριν από την ενίσχυση, τα δείγματα επωάστηκαν στους 95 ° C για 10 λεπτά, και κάθε κύκλος ενίσχυσης αποτελείτο από αποδιάταξη για 45 δευτερόλεπτα στους 95 ° C, ανόπτηση για 30 sec στους 57 ° C, και την επέκταση επί 30 δευτερόλεπτα στους 73 ° C. Η ποσότητα των γονιδίων στόχων στα δείγματα cDNA υπολογίστηκε με βάση τον κύκλο κατωφλίου (Ct). Τα σήματα PCR ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρική ανάλυση με χρήση Ποσότητα Ένα λογισμικό ανάλυσης.

απομόνωση και καλλιέργεια του πρωτογενών ανθρώπινων ινοβλαστών

CAFS και φυσιολογικών ινοβλαστών (NFS) απομονώθηκαν από καρκίνο του παγκρέατος και μη-καρκινικές μερική δείγματα παγκρεατεκτομή, αντίστοιχα. Τα δείγματα συλλέχθηκαν και μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο. Μετά από αρκετές πλύσεις με στείρο αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) 1 cm

2 τμήματα των ιστών τοποθετήθηκαν στα φρεάτια των φιαλών καλλιέργειας. Μόλις ο ιστός φαίνεται να αποδίδουν στις φιάλες (5 ώρες έως 6 ώρες), προστέθηκε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. Τα δείγματα επιθεωρήθηκαν καθημερινά για την εμφάνιση των ινοβλαστών, και το μέσο αλλάχθηκε μετά από 24 ώρες και κάθε τρίτη ημέρα, στη συνέχεια. Δείγματα ιστών απομακρύνθηκαν από τις καλλιέργειες ινοβλαστών κάποτε έφθασε το 70% συρροή (περίπου δύο εβδομάδες), και ινοβλάστες μεταφέρθηκαν σε μεγάλα δοχεία καλλιέργειας ιστού. Όλες οι ινοβλάστες που χρησιμοποιούνται για αυτή τη μελέτη ήταν από περάσματα 3 έως 5. Οι ινοβλάστες ελέγχθηκε από βιμεντίνη χρώση θετική ανοσοϊστοχημεία.

Δοκιμασία ανοσοφθορισμού

Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα σπάρθηκαν σε 25 mm η καλυπτρίδες από γυαλί τοποθετείται σε 35 χιλιοστά τρυβλία καλλιέργειας διαμέτρου. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη για 5 λεπτά, διαπερατά με 0.2% διάλυμα Triton Χ-100 σε PBS, και αποκλείστηκαν με αλβουμίνη βόειου 2% ορού (BSA) -PBS για 30 λεπτά. Τα πλακίδια επωάστηκαν με αντι-Cav-1 επί μία νύκτα. Φθορισμού απεικόνισης λήφθηκε με μικροσκόπιο συνεστιακό λέιζερ σάρωσης (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.).

in situ υβριδοποίηση φθορισμού

-HER 2 γονίδιο /neu ενισχύθηκε με dual-χρώμα (φθορισμός σε situ υβριδισμού) FISH χρησιμοποιώντας ένα Passvision HER-2 σετ ανιχνευτή DNA (Vysis Inc. Downers Grove, Illinois, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, 4 μm τομές πάχους του ιστού ψήθηκαν επί μία νύκτα στους 56 ° C και υποβλήθηκαν σε αποπαραφινοποίηση, πέψη ενζύμου, και στερέωση. Οι πλάκες στη συνέχεια μετουσιώθηκαν σε 70% φορμαμίδιο /δύο φορές κιτρικό πρότυπο αλατούχο στους 72 ° C για 5 λεπτά. Μετά πλύση ρυθμιστικού, 10 μL από ένα μίγμα από δύο άμεσα σημασμένων ανιχνευτών (/neu HER-2 ειδικό ανιχνευτή αλληλουχίας) προστέθηκε στα τμήματα ιστών, και ο υβριδισμός διεξήχθη στους 37 ° C για 14 ώρες έως 18 ώρες. Τα πλακίδια στη συνέχεια πλύθηκαν σε ένα πλυντήριο μετα-υβριδισμού στους 72 ° C, αντίθετα με 4, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ), συναρμολογημένα, και αποθηκεύονται στο σκοτάδι πριν από την απαρίθμηση του σήματος. /Neu-φάσματος πορτοκαλί ανιχνευτή HER-2 περιέχει μια αλληλουχία DNA ειδικά για το HER-2 γονιδιακό τόπο /neu και υβριδοποιήθηκαν στην περιοχή 17q11.2-q12 ανθρώπινων χρωμοσωμάτων. Χρωμόσωμα ιχνηλάτης απαρίθμηση 17 (CEP17) /φάσμα πράσινο ανιχνευτή που περιέχει άλφα-δορυφορικό DNA που υβριδοποιείται στη θέση D17Z1 (περιοχή κεντρομεριδίου του χρωμοσώματος 17) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Τα πλακίδια παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού εξοπλισμένο με μια ψηφιακή κάμερα (DP50? Της Olympus, Tokyo, Japan). Για κάθε δείγμα, ενίσχυση του γονιδίου ήταν σκόραρε όταν τουλάχιστον 20 καρκινικών κυττάρων πυρήνες ο λόγος του HER-2 /CEP17 ≥2 ή όταν παρατηρήθηκε μια συστάδα HER-2 σήμα.

Η δειγματοληψία αίματος και Εμπλουτισμός της ΚΜΑ

μορφές συναίνεσης εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας αναθεώρηση του Ανθρώπου Θέματα επιτροπή της Xi’an Jiaotong University, η Κίνα και υπογράφεται από όλους τους ασθενείς της μελέτης. Πρώτον, 7.5 ml δειγμάτων περιφερικού αίματος συλλέχθηκαν σε BD Vacutainer σωλήνες (Becton, Dickinson and Company, Franklin, New Jersey, USA) και πλύθηκαν με PBS. Για να αποφευχθεί η μόλυνση των επιθηλιακών κυττάρων κατά τη διάρκεια της φλεβοκέντησης, όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν αφού απομακρυνθούν οι πρώτες 2 mL αίματος. Ερυθρά αιμοσφαίρια (RBCs) αναμίχθηκαν με 45 mL ρυθμιστικού λύσης (155 mM ΝΗ

4Cl, 10 mM KHCO

3, 0,1 mM EDTA), ακολουθούμενη από περιστροφή για 8 λεπτά και φυγοκέντρηση (600 g για 5 λεπτά ) για την αφαίρεση ερυθροκυττάρων. Το προκύπτον κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με 0.5 mL δείκτη επιφανείας antileukocyte CD45 μονοκλωνικό μαγνητικά σφαιρίδια επικαλυμμένα με αντίσωμα για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από διαχωρισμό των μαγνητικών σφαιριδίων χρησιμοποιώντας μία μαγνητική βάση (Promega, Madison, Wisconsin, USA). Τα υπερκείμενα μεταφέρθηκαν σε ένα νέο σωλήνα, και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 800 g για 3 λεπτά. Οι σβώλοι κυττάρων κηλιδώθηκαν σε γυάλινες πλάκες, και ακολουθεί με (ανοσοφθορισμό in situ υβριδοποίηση) imFISH χρώση.

imFISH χρώσης (CEP8-CD45-ϋΑΡΙ)

Αρνητική εμπλουτισμό των κυττάρων όγκου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ανοσομαγνητικής σφαιρίδια, που ακολουθείται από προσδιορισμό με ανάλυση κυτταρολογίας. FISH διεξήχθη χρησιμοποιώντας ανιχνευτές κεντρομερίδιο DNA του χρωμοσώματος 8 (κίτρινο) (Vysis Inc. Downers Grove, Illinois, USA), και ανοσοφθορισμό δοκιμασία διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-CD45 (κόκκινο) (Santa Cruz, California, USA). Τα πλακίδια πλύθηκαν τρεις φορές με τρις-ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (TBS) (10 mM Tris, 2.8 mM KCI, 137 mM NaCl, ρΗ 7,4) που περιέχει 0,2% BSA επί 3 λεπτά και στη συνέχεια ξεπλένονται με TBS μία φορά. Τα κύτταρα τοποθετούνται με μέσο στερέωσης περιέχει το DAPI πυρηνική βαφή. Μια τύφλωσε επισκόπηση των εικόνων φθορισμού από τρεις τεχνικούς επιβεβαίωσε την ταυτότητα του ΚΜΑ από τριών χρωμάτων φθορισμού εικόνες που είχαν μεγεθυνθεί 400 φορές. Κριτήρια αξιολόγησης για τον προσδιορισμό της CTC από φθορίζουσες εικόνες που περιλαμβάνονται τόσο CEP8≥3 και CD45 (-) χρώση μοτίβο επικαλύπτει τη χρώση DAPI του πυρήνα

στατιστική ανάλυση και τα αποτελέσματα των ασθενών

Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση. η chi-square test (χ2) ή δύο όψεων ακριβές τεστ Fisher, ανάλογα με την περίπτωση. Pearson συντελεστής συσχέτισης χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η αντοχή του συνδέσμου ανάμεσα Cav-1, απαρίθμηση των ΚΜΑ, και τα επίπεδα έκφρασης /neu HER-2. Το ποσοστό επιβίωσης υπολογίστηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier, και οι διαφορές εξετάστηκαν με τη δοκιμασία log-rank. Παράγοντες που βρέθηκε να είναι σημαντική στη συνέχεια επιλέγονται για τη σταδιακή πολυμεταβλητή αναλογικό μοντέλο κινδύνου Cox να καθορίσουν προγνωστική αξία τους.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS έκδοση 13.0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA).

Αποτελέσματα

Η έκφραση της στρωματικά Cav-1 σε καρκίνο του παγκρέατος

Cav-1 εκφράζεται τόσο στη μεμβράνη και στο κυτόπλασμα των κυττάρων [16]. Για να εξεταστεί η κατάσταση έκφρασης του στρωματικά Cav-1 σε καρκίνο του παγκρέατος, χρησιμοποιήσαμε ανοσοϊστοχημεία για την αξιολόγηση της καρκίνο του παγκρέατος, παρανεοπλασματικό, και τομές φυσιολογικού ιστού. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν αντιπροσωπευτικών εικόνων από Cav-1 τομές ιστού αντίσωμα χρωματίστηκαν (Εικ. 1), αναδεικνύοντας έτσι τις διαφορές που παρατηρούνται σε Cav-1 ανοσοχρώση στην ινοβλαστική στρωματικό διαμέρισμα. Είναι ενδιαφέρον ότι, Cav-1 έκφραση ήταν ισχυρό και περιορίζεται κυρίως στο στρώμα στην παρανεοπλασματική και φυσιολογικούς ιστούς αλλά ήταν μόνο ανιχνεύθηκε περιστασιακά σε στρώματος του όγκου. Σε 45 δείγματα καρκίνου, 6 (13,3%) ασθενείς έδειξαν υψηλά επίπεδα στρωματικών χρώσης Cav-1, ενώ 8 (17,8%) έδειξε ένα χαμηλότερο ενδιάμεσο επίπεδο χρώσης, και 31 (68,9%) έδειξε την απουσία στρωματικών χρώσης Cav-1 .

τομές παραφίνης ανοσοχρώστηκαν όπως περιγράφεται στο τμήμα των μεθόδων. (Ν) Κανονική ιστός έντονα θετικό για Cav-1 έκφραση? (Ρ) Paracancer ιστός μέτρια για Cav-1 έκφραση? (C) όγκου ιστού με αρνητική έκφραση Cav-1 (× 400).

Η

PCR Αναλύστε το λέιζερ Συλλαμβάνονται δείγματα

Απώλεια στρωματικά Cav-1 είναι ένα ενιαίο ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα της πρόωρης μαστού υποτροπής του καρκίνου και την εξέλιξη [17]. ανοσοϊστοχημικά δεδομένα μας έδειξαν επίσης χαμηλότερο στρωματικά έκφραση Cav-1 σε καρκίνο του παγκρέατος. Για την επαλήθευση των ανοσοϊστοχημική δεδομένων, χωρίσαμε και καθαρισμένο στρώμα χρησιμοποιώντας LCM. Το στρώμα κυττάρων της παγκρεατικής δείγματα μικροτομή επιτυχώς από τον όγκο, παρανεοπλασματικό, και φυσιολογικά τμήματα. Η τεχνική LCM δεν προκάλεσε ορατή μεταβολή στη μορφολογία των δειγμάτων ανατομή (Εικ. 2Α). Αναλύσαμε διαδοχικά την έκφραση του mRNA του Cav-1 στα δείγματα στρώμα λέιζερ-συλλαμβάνεται από RT-PCR και Real-time PCR (qPCR). Το επίπεδο του mRNA της Cav-1 ήταν σημαντικά υποβαθμισμένη σε δείγματα στρώματος του όγκου λέιζερ-συλλαμβάνονται σε σύγκριση με την παρανεοπλασματικό και φυσιολογικό ιστό (Σχ 2Β, 2C). (

P

& lt? 0,05).

Α: Σχηματικό διάγραμμα που αντιπροσωπεύει την τεχνική LCM. Β: mRNA έκφραση του στρωματικά Cav-1 σε λέιζερ δεν σταματούν δείγματα όπως προσδιορίζεται με RT-PCR. Γ: Ποσοτικοποίηση του mRNA με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR. Δεδομένα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα με εις διπλούν προσδιορισμούς εκφράζονται ως μέσοι ± SEM. (Ν) Κανονική ιστό? (Ρ) Paracancer ιστό? (Γ) του ιστού του όγκου. *

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Η

Η έκφραση της Cav-1 στα CAFS, PAFs, και του NFS

Για να κατανοήσουμε περαιτέρω την στρωματική Cav-. έκφραση 1 πρωτεΐνης σε παγκρεατικά στρώμα (κυρίως ινοκύτταρα), εξάγαμε πρώτα CAFS από παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, paracancer σχετιζόμενη ινοβλάστες (PAFs), paracancerous ιστού και NFS από μη-καρκινικές δείγματα μερική παγκρεατεκτομή. Διαφορετικά επίπεδα έκφρασης vimentin στο CAFS στρώμα, PAFs, και του NFS αξιολογήθηκαν με ανάλυση ανοσοϊστοχημείας. Τα αποτελέσματα αυτά επαληθεύονται επίσης ότι η εξόρυξη των κυττάρων μας ήταν επιτυχής (Εικ. 3Α, 3Β). Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε και αναλύθηκαν στρωματικά Cav-1 έκφραση σε CAFS και του NFS χρωματίστηκαν με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη αντίσωμα σήμανσης-IgG με συνεστιακή μικροσκόπηση. Cav-1 σήμα φθορισμού σε CAFS ήταν χαμηλότερη από ότι σε δείγματα PAF και NF (Σχήμα 3C.), Γεγονός που υποδηλώνει ότι Cav-1 χάνεται σε ένα παγκρεατικό μικροπεριβάλλον του καρκίνου

Α:. Κυττάρων μορφολογικό χαρακτηριστικό του CAFS, PAFs, και του NFS (× 100). Εξάγεται CAFS από καρκίνο του παγκρέατος και PAFs και NFS από paracancerous ιστού και μη-καρκινικές μερική δείγματα παγκρεατεκτομή. Β: Τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης vimentin στο CAFS στρώμα, PAFs, και του NFS αξιολογήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία (× 200). C: Cav-1 έκφραση πρωτεΐνης σε CAFS και του NFS χρωματίστηκαν με αντίσωμα FITC σήμανση-IgG και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία. Cav-1 σήμα φθορισμού στο ΚΠΑ είναι χαμηλότερο από το ΠΔΠ και του NFS (× 200). (CAFS) Καρκίνος συνδέεται ινοβλάστες? (ΠΔΠ) Paracancerous συνδέονται ινοβλάστες? (NFS) Κανονική συνδέονται ινοβλάστες.

Η

Σχέσεις μεταξύ στρωματικά Cav-1 Έκφραση και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων

Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τις ενώσεις των στρωματικών Cav-1 πρωτεϊνική έκφραση και κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους στον καρκίνο του παγκρέατος . Η στρωματικά Cav-1 ήττα παρατηρήθηκε σε έξι από τις περιπτώσεις ΙΙ (42,9%) και 14 σταδίου Ι και ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι στο στάδιο III (77,8%, 21 από 27 περιπτώσεις) και περιπτώσεις σταδίου IV (100,0%, 4 από 4 περιπτώσεις ) (

P =

0.018). Στρωματικά Cav-1 ήττα συσχετίστηκε επίσης με λεμφαδένα μετάσταση (

P

= 0,014) και μακρινή μετάσταση (

P

= 0,027). Διερευνήσαμε επίσης τη σχέση της ηλικίας, του φύλου, η ιστολογική ποιότητα, και το μέγεθος του όγκου με στρωματικά έκφραση Cav-1. Ωστόσο, στατιστικά σημαντικές σχέσεις δεν παρατηρήθηκαν (

P

& gt? 0,05).

Η

Απώλεια στρωματικά Cav-1 συσχετίζεται με HER-2 /neu Γονιδιακή Ενίσχυση

HER-2 /neu είναι ένας υποδοχέας αυξητικού παράγοντα διαμεμβρανικού, η υπερέκφραση των οποίων αναγνωρίζεται ως ανεξάρτητο δυσμενή προγνωστικό παράγοντα σε διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος [18], [19], [20], [21], [22 ], [23], [24], [25]. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το εάν τα στρωματικά Cav-1 ήττα είναι μια αρνητική προγνωστική βιολογικός δείκτης στον καρκίνο του παγκρέατος, ο συσχετισμός μεταξύ στρωματικά Cav-1 έκφρασης και ενίσχυση του γονιδίου /neu HER-2 αναλύθηκε. HER-2 γονιδιακής ενίσχυσης /neu αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας FISH, η οποία θεωρείται το χρυσό πρότυπο για τη μέτρηση του ποσοστού των θετικών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι 64,4% των παγκρεατικών αδενοκαρκινώματα εμφάνισαν HER-2 /neu ενίσχυση του γονιδίου (Εικ. 4). Στρωματικά Cav-1 ήττα είχε θετική συσχέτιση με HER-2 /neu ενίσχυση γονιδίου (r = -0,697,

P

= 0.000? Πίνακας 2). Τετραπλή στρωματικά Cav-1 απώλεια παρατηρήθηκε σε δείγματα που εμφανίζουν ενίσχυση γονιδίου HER-2 /neu. Αντίθετα, στην περιογκική και φυσιολογικά δείγματα, στρωματικά Cav-1 έκφραση ήταν υψηλή όταν γονίδιο /neu HER-2 δεν ενισχύθηκε. Συμπερασματικά, στρωματικά Cav-1 απώλεια συσχετίστηκε θετικά με την ενίσχυση του γονιδίου HER-2 /neu

(Ν) Η κανονική ιστός αρνητικοί για ενίσχυση γονιδίου HER-2 /neu.? (Ρ) Paracancer ιστός μέτρια για ενίσχυση του γονιδίου HER-2 /neu? (C) του όγκου θετικά για HER-2 /neu ενίσχυση του γονιδίου ιστού (× 1000).

Η

Απώλεια στρωματικά Cav-1 συσχετίζεται με CTC Καταμέτρηση

ΚΜΑ είναι όγκου κύτταρα που αποβάλλονται από τον πρωτογενή όγκο στην κυκλοφορία του αίματος. Η παρουσία του CTCs στο περιφερικό αίμα ασθενών έχει συσχετισθεί με τη μετάσταση και κακή επιβίωση, αν και η βιολογική σημασία των CTCs αποδίδονται σε όγκο γενωμική αστάθεια και το δυναμικό μεταστατικό αναποτελεσματικότητα έχει συζητηθεί [26]. Με βάση την κλινική σημασία της, CTC συνιστάται από την Αμερικανική Εταιρεία Κλινικής Ογκολογίας να είναι ένα αποδεκτό δείκτη του καρκίνου [27]. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το εάν τα στρωματικά Cav-1 ήττα είναι μια δυσμενή προγνωστικό βιοδείκτη, ο συσχετισμός μεταξύ στρωματικά Cav-1 έκφρασης και CTC απαρίθμηση αναλύθηκε. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ΚΜΑ ανιχνεύθηκαν σε 35,71% (5/14) των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος στρωματικά Cav-1 έκφραση έναντι 77,42% (24/31) των ασθενών με στρωματικά Cav-1 απώλεια (Εικ. 5). Επιπλέον, σημαντικά υψηλότερα απαρίθμηση CTC παρατηρήθηκε σε ασθενείς με στρωματικά Cav-1 απώλεια συγκριτικά με τους ασθενείς με στρωματικά Cav-1 έκφραση (18,5 ± 2,0 σε 7,5 mL αίματος έναντι 6,0 ± 1,5 σε 7,5 mL αίματος). Εν κατακλείδι, στρωματικά απώλεια Cav-1 συσχετίστηκε θετικά με την CTC απαρίθμηση

Α:. CTCs αρνητικά σε ασθενείς με στρωματικά Cav-1 ήττα. Β: ΚΜΑ θετικά σε ασθενείς με στρωματικά Cav-1 ήττα. C: ΚΜΑ αρνητικά σε ασθενείς με στρωματικά έκφραση Cav-1. D: CTCs θετικά σε ασθενείς με στρωματικά έκφραση Cav-1. Η λευκή γραμμή κλίμακας δείχνει 10 μm (χ400).

Η

Προγνωστική τιμές των Απώλεια στρωματικά Cav-1 σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος

Για να προσδιορίσετε την προγνωστική αξία των στρωματικών Cav-1 για τον καρκίνο του παγκρέατος, αναλύσαμε την αθροιστική επιβίωση των ασθενών σύμφωνα με Cav-1 κατάστασή τους (Εικ. 6). Στρωματικά Cav-1 απουσία, όπως υποδεικνύεται από την έλλειψη χρώσης, θεωρήθηκε ως αρνητικό, ενώ αδύναμη ή ισχυρή χρώση θεωρήθηκε ως θετική. Το αθροιστικό ποσοστό επιβίωσης σε στρωματικά Cav-1 αρνητικών ασθενών (n = 31) στα τρία χρόνια ήταν 8,8% (διάμεσος χρόνος επιβίωσης των 16 μήνες). Αντίθετα, το αθροιστικό ποσοστό επιβίωσης σε στρωματικά Cav-1 θετικούς ασθενείς (n = 14) ήταν 20,2% (διάμεσος χρόνος επιβίωσης των 28 μήνες), μια διαφορά που ήταν στατιστικά σημαντική (

P

& lt? 0,05).

η

με βάση την πολυπαραγοντική ανάλυση, η συνοπτική ή της μετάστασης λεμφαδένα σε σωρευτική χρόνους επιβίωσης στα τρία χρόνια ήταν 1,32 (95% CI, 1,10 – 1,63), και ΤΝΜ (III + IV /II + I ) στάδιο (OR = 1,27, 95% CI, 1,15-1,46) ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για το συνολικό χρόνο επιβίωσης σε ασθενείς της μελέτης με καρκίνο του παγκρέατος. Η απώλεια των στρωματικών πρωτεΐνης Cav-1 ήταν επίσης ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για το συνολικό χρόνο επιβίωσης (

P =

0.006). Ωστόσο, η διάμετρος του όγκου και άλλες κλινικές παράμετροι εξαρτώνται προγνωστικούς παράγοντες.

Συζήτηση

Συμπαγείς όγκοι δεν θεωρούνται πλέον απλώς ως κλωνική επεκτάσεις των καρκινικών κυττάρων. Εκτός απέκτησε τις εγγενείς ιδιότητες των κυττάρων, την έναρξη και την ανάπτυξη του όγκου υποστηρίζονται από μια πληθώρα παρεγχύματος, τύπους κυττάρων φλεγμονής, και στρωματικά, που διεισδύουν και να περιβάλλουν τον όγκο [28]. Τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν τη σημασία μιας εξελισσόμενης μικροπεριβάλλον και δείχνουν ότι η θεραπεία θα πρέπει να στοχεύουν τόσο τα νεοπλασματικά κύτταρα και υποστηρικτική στρωματικά κύτταρα [29]. Το αυτοφαγικά μοντέλο στρώματος του όγκου του μεταβολισμού του καρκίνου [30] δείχνει ότι η απώλεια του στρωματικά Cav-1 ως βασικός ρυθμιστής είναι ένας πιθανός στόχος θεραπείας, υποδηλώνοντας περαιτέρω ότι στρωματικά Cav-1 έκφραση σε στρωματικά κύτταρα μπορεί να είναι προγνωστική σημασία. Επιπλέον, μια απώλεια του στρωματικά Cav-1 έχει αναφερθεί ότι είναι ένας προγνωστικός δείκτης της πρώιμης υποτροπής του όγκου, λέμφο μετάσταση στους λεμφαδένες, ταμοξιφένη αντίσταση, και την κακή κλινική έκβαση σε ασθενείς με ανθρώπινο καρκίνο του μαστού [17]. Ερευνήσαμε στρωματικά έκφραση Cav-1 σε καρκίνο του παγκρέατος να αξιολογήσει ένα δυνητικό ρόλο για στρωματικά Cav-1 ως προγνωστικός δείκτης. Στρωματικά Cav-1 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνο του παγκρέατος σε σύγκριση με παρανεοπλασματική και φυσιολογικό ιστό. Απώλεια στρωματικά Cav-1 συσχετίζεται στενά με προχωρημένο στάδιο TNM, λεμφικό μετάσταση στους λεμφαδένες, μακρινή μετάσταση και φτωχή πρόγνωση. Η απώλεια του στρωματικά Cav-1 συσχετίστηκε με την ενίσχυση του κλασικού δείκτες για την εξέλιξη του όγκου (γονίδιο HER-2 /neu). Το πιο σημαντικό, η απώλεια του στρωματικά Cav-1 συνδέεται με τη μετάσταση επειδή κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων βρέθηκαν στο αίμα του ασθενούς. Τα ευρήματα αυτά επεκτείνουν την κατανόηση της λειτουργίας του στρωματικά Cav-1 ως διαγνωστικός δείκτης. Το πιο σημαντικό, να γνωρίζουμε, αυτή η μελέτη είναι η πρώτη που δείχνει ότι η απώλεια του στρωματικά Cav-1 σε καρκίνο του παγκρέατος είναι ένας αρνητικός προγνωστικός δείκτης. Ωστόσο, το έργο της Witkiewicz et al. [31] έδειξε ότι η συν-έκφραση των FASN και Cav-1 μπορεί να είναι ένα ενημερωτικό κλινικό δείκτη. Witkiewicz et al. διαπίστωσε ότι Cav-1 και FASN είχαν υψηλότερες εκφράσεις σε PDAs από ό, τι στην PanIN. Εκτός από την κηλίδωση νεοπλαστικά επιθηλιακά κύτταρα, Cav-1 ήταν επίσης παρούσα σε ινοβλάστες του δεσμοπλαστικό στρώμα του καρκίνου. Στρωματικά κύτταρα σε φυσιολογικό πάγκρεας ή χρόνια παγκρεατίτιδα ιστό δίπλα σε καρκινικά κύτταρα ήταν αρνητικά, πράγμα που έρχεται σε αντίθεση με τα ευρήματα μας. Η διαφορά αυτή μπορεί να αποδοθεί στην πιθανότητα ότι η μελέτη από Witkiewicz et al. συνέβη κατά τη διάρκεια της ανοσοεντοπισμού των δύο μορίων (FASN και Cav-1), και τα αποτελέσματα μπορεί να αποδοθεί σε αμοιβαία παρεμβολή. Επιπλέον, το χρησιμοποιούμενο Cav-1 Ab είχε μια διαφορετική εξειδίκευση. Η μέθοδος που χρησιμοποιείται από Witkiewicz et al. (Ανοσοϊστοχημεία) είναι διαφορετική από εκείνη που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη, στην οποία PCR χρησιμοποιήθηκε σε σχέση με την ποσοτικοποίηση. Τέλος, η ετερογένεια του δείγματος ενδέχεται να έχουν επηρεάσει επίσης τα αποτελέσματα. Αν και τα ευρήματα της Witkiewicz et al. [17] είναι συνεπείς με αυτές της μελέτης μας, η περαιτέρω μελέτη θα πρέπει να διεξάγεται για το θέμα αυτό.

ΚΜΑ είναι τα καρκινικά κύτταρα να ρίξει από τον πρωτογενή όγκο σε κυκλοφορία του αίματος. Η παρουσία του CTCs στο περιφερικό αίμα ασθενών έχει από καιρό συνδέεται με τη μετάσταση και κακή επιβίωση [32] και σήμερα θεωρείται ένα αποδεκτό δείκτη του καρκίνου [27]. Ωστόσο, οι τρέχουσες τεχνικές είναι περιορισμένες. Η μόνη εμπορικά διαθέσιμη δοκιμασία CTC (Cell Αναζήτηση? Veridex LLC, Βόρεια Raritan, New Jersey, USA) έχει ένα ποσοστό ανίχνευσης 50% σε ασθενείς τελικού σταδίου [33].