Αφηρημένο

Η κατανόηση των μοριακών θεμελίων του χημειοαντίσταση είναι ζωτικής σημασίας για το σχεδιασμό θεραπειών για την αποκατάσταση της χημειοευαισθησίας. Ειδικότερα, metadherin (MTDH) έχει αποδειχθεί ότι έχουν ένα κρίσιμο ρόλο στη χημειοαντίσταση. Υπερ-έκφραση του MTDH συσχετίζεται με κακή κλινική έκβαση στον καρκίνο του μαστού, νευροβλάστωμα, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και ο καρκίνος του προστάτη. MTDH επίσης εντόνως εκφρασμένο σε προχωρημένο ενδομητρίου καρκίνου, μια ασθένεια για την οποία νέες θεραπείες χρειάζονται επειγόντως. Στην παρούσα μελέτη, επικεντρώθηκε στην θεραπευτικό όφελος της εξάντλησης MTDH ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα για την αποκατάσταση της ευαισθησίας σε κυτταρικό θάνατο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα συνδυασμό παράγοντα νέκρωσης όγκων-α σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL), το οποίο προωθεί τον θάνατο των κακοηθών κυττάρων του ανθρώπινου αναπαραγωγικού συστήματος, και αναστολείς (HDAC) αποακετυλάσης ιστόνης, οι οποίες έχουν αποδειχθεί ότι αυξάνουν την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων να TRAIL απόπτωση. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η εξάντληση των MTDH σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα οδήγησε σε ευαισθητοποίηση των κυττάρων που ήταν προηγουμένως ανθεκτικά σε απόκριση σε συνδυαστική θεραπεία με TRAIL και το LBH589 αναστολέα HDAC. MTDH knockdown μείωσε το ποσοστό των κυττάρων σε S και αυξημένη κυτταρική αναστολή σε G2 /M σε κύτταρα επεξεργασμένα μόνο με LBH589 ή LBH589 σε συνδυασμό με TRAIL, υπονοώντας ότι λειτουργεί MTDH στο σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου για να επιτευχθεί αντίσταση. Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία μικροσυστοιχιών, εντοπίσαμε 57 κατάντη γονιδίων στόχων του MTDH, συμπεριλαμβανομένων καλβιδίνη 1 και γαλεκτίνη-1, που μπορούν να συμβάλουν στην MTDH μεσολάβηση θεραπευτική αντίσταση. Από την άλλη πλευρά, σε MTDH εξαντλημένα κύτταρα, η αναστολή της ΡϋΚ1 και φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, μαζί με αυξημένη έκφραση Bim και την υποβάθμιση ΧΙΑΡ συσχετίζεται με αυξημένη ευαισθησία στο θάνατο του κυττάρου σε απόκριση προς TRAIL και LBH589. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η στόχευση ή καταστρέφουν MTDH είναι μια δυνητικά νέα λεωφόρο για την αναστροφή της θεραπευτικής αντίσταση σε ασθενείς με καρκίνο του ενδομητρίου

Παράθεση:. Meng Χ, Brachova P, Yang S, Xiong Ζ, Zhang Υ, Thiel KW, et al. (2011) Νοκ ντάουν της MTDH ευαισθητοποιεί κύτταρα καρκίνου του ενδομητρίου σε κινητό επαγωγή θανάτου από Θάνατος υποδοχέα ρίζας TRAIL και HDAC αναστολέα LBH589 Co-θεραπεία. PLoS ONE 6 (6): e20920. doi: 10.1371 /journal.pone.0020920

Επιμέλεια: Αντρέι Λ Gartel, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Δεκέμβρη του 2010? Αποδεκτές: 16, Μάη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 8 του Ιουνίου, 2011

Copyright: © 2011 Meng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) Επιχορήγηση R01CA99908 να KKL, και εν μέρει από το τμήμα Μαιευτικής και Γυναικολογίας Ταμείο Ανάπτυξης της Έρευνας, η Θεσμική Research Grant Αριθμός IRG-77-004-31 από την αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία σε XM, χορηγείται μέσω της Holden Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου στο Πανεπιστήμιο της Αϊόβα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ένα κοινό πρόβλημα με τη θεραπεία του καρκίνου είναι η ανάπτυξη αντοχής, καθώς και μια βελτιωμένη κατανόηση των υποκείμενων οδών που εμπλέκονται με αντοχή φαρμάκου μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων στρατηγικών για να ξεπεραστεί αυτή η αντίσταση. Ένα πρόσφατα ανακαλύφθηκε γονίδιο, metadherin (MTDH, επίσης γνωστή ως AEG-1 ή LYRIC) έχει αναδειχθεί ως ένα δυνητικά κρίσιμος μεσολαβητής της εξέλιξης του όγκου, μετάσταση, και την αντίσταση σε χημειοθεραπείες [1], [2], [3], [4] . MTDH προτείνεται να προωθήσει την εξέλιξη του όγκου μέσω της ενσωμάτωσης πολλαπλών οδών σηματοδότησης περιλαμβανομένων ras, myc, Wnt, ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, και NF-κΒ σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων [4], [5], [6], [7] , αν και ο μηχανισμός με τον οποίο MTDH ελέγχει αυτά τα γεγονότα σηματοδότησης είναι ασαφής. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε ο ρόλος των MTDH στον καρκίνο του ενδομητρίου και η αναστολή της ως μηχανισμό για να ξεπεράσει την αντίσταση των ναρκωτικών.

Αρχικό ενδιαφέρον MTDH ως παράγοντας χημειοαντίσταση προέκυψε ως συνέπεια της NCI60 φαρμακογονιδιωματικών δεδομένων, η οποία διαπίστωσε ότι η γονιδιωματική κέρδος αριθμός αντιγράφων για 8q22 είναι ένα καθοριστικό γεγονός στην χημειοαντίσταση [8]. Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι λεμφαδένα μετάσταση συνδέεται σημαντικά με τον αριθμό αντιγράφων κέρδη στο 8q22-q23 στο ενδομητρίου [9]. Μέχρι στιγμής, MTDH είναι το μόνο γνωστό γονίδιο στο 8q22 το οποίο έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζεται με κακή κλινική έκβαση σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους [8].

In vitro

και

in vivo

χημειοαντίσταση αναλύσεις επιβεβαίωσαν ότι MTDH knockdown ευαισθητοποιεί διάφορους τύπους όγκων – συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, τον καρκίνο του προστάτη, και neuroblastoma- σε πολλαπλές παράγοντες χημειοθεραπείας όπως 5- φθοροουρακίλη (5-FU), σισπλατίνη, πακλιταξέλη, και δοξορουβικίνη [1], [10], [11]. Ωστόσο, η ικανότητα των MTDH νοκ ντάουν να ευαισθητοποιήσει κύτταρα σε στοχευμένες θεραπείες, που έχουν έρθει για να συμβολίσει το μέλλον της θεραπευτικής του καρκίνου, δεν έχει ακόμη διερευνηθεί.

Ο παράγοντας νέκρωσης όγκων (TNF) -α-που σχετίζονται με την απόπτωση που επάγουν συνδέτης (TRAIL) πρόσφατα αναδύθηκε ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική στοχευμένη σε διάφορους τύπους καρκίνων, λόγω προ-αποπτωτικών χαρακτηριστικών του [12], [13]. Ως μέλος της οικογένειας TNF, TRAIL ενεργοποιεί ειδικά εξωγενής αποπτωτικά μονοπάτια σε καρκινικά κύτταρα με σύνδεση προς τους υποδοχείς θανάτου. Σημαντικά, TRAIL προωθεί επιλεκτικά απόπτωση των καρκινικών κυττάρων, αλλά δεν έχει καμία επίδραση επί των φυσιολογικών κυττάρων ανθρώπινης αναπαραγωγικής οδού συμπεριλαμβανομένων εκείνων στο ενδομήτριο, των ωοθηκών, του τραχήλου της μήτρας, ή σάλπιγγα [13]. Ορισμένα καρκινικά κύτταρα είναι ανθεκτικά σε TRAIL-επαγόμενη απόπτωση [14], [15], [16], επομένως έχουν συνδυαστικές αγωγές έχουν ληφθεί για την αποκατάσταση της ευαισθησίας [13], [17]. Σε αρκετές μελέτες, έχουν αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) αναστολείς έχει αποδειχθεί να αυξηθεί περαιτέρω η ευαισθησία σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που επάγεται από TRAIL [18], [19], [20], [21]. Δυστυχώς, μερικοί καρκινικά κύτταρα παραμένουν ανθεκτικά σε συνδυασμό TRAIL και θεραπεία αναστολέα HDAC [22], καθώς και νέες προσεγγίσεις για την αποκατάσταση της ευαισθησίας σε αυτές τις στοχευμένες θεραπείες είναι απαραίτητες.

Εξετάσαμε την επίδραση της καταστρέφουν επίπεδα MTDH στην αποκατάσταση της ευαισθησίας σε ρυμουλκουμένων με βάση στοχευμένες θεραπείες. Τα δεδομένα που αναφέρονται στο παρόν δείχνουν ότι η MTDH ρυθμίζει την κυτταρική επιβίωση του κυτταρικού κύκλου και σε απόκριση σε θεραπεία με αναστολείς HDAC και TRAIL, γεγονός που υποδηλώνει ότι MTDH είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτικός στόχος για την αύξηση της αποτελεσματικότητας του TRAIL και αναστολέα HDAC συνδυαστική θεραπεία.

Αποτελέσματα

έκφραση MTDH είναι αυξημένη σε καρκίνο του ενδομητρίου κυτταρικές σειρές και ιστούς

MTDH ήταν εντόνως εκφρασμένων σε πρωτεϊνικό επίπεδο σε όλους τους έξι ενδομητρίου καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν (RL95, AN3CA, KLE, Ishikawa, Hec50co και ECC1, Σχήμα 1Α). Σε ενδομητρίου ιστούς ασθενούς με καρκίνο, η έκφραση MTDH ανυψώθηκε σε σύγκριση με φυσιολογικά ενδομητρίου (Σχήμα 1Β). Συγκεκριμένα, η έκφραση του 80 kDa MTDH και υποθετικές 50-55 ισομορφών kDa MTDH ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ενδομητρίου δείγματα καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου θηλώδες ορώδες, σάρκωμα, και αδενοκαρκίνωμα, ενώ MTDH ήταν μη ανιχνεύσιμη σε φυσιολογικούς ιστούς του ενδομητρίου (Σχήμα 1Β). Επειδή καμία MTDH ανιχνεύθηκε σε κανονικό ιστό του ενδομητρίου, εμείς κηλιδώθηκε για την ογκοκατασταλτικό LKB1 ως έλεγχος (Εικόνα 1Β). Αυξημένη έκφραση των κυτταροπλασματικών MTDH σε αδενοκαρκίνωμα του ενδομητρίου και της πυρηνικής MTDH σε ορισμένα μεταστατικό καρκίνο του ενδομητρίου παρατηρήθηκε επίσης σε καρκινικούς ιστούς του ενδομητρίου όπως φαίνεται στο Σχήμα 1C με ανοσοϊστοχημεία με ένα MTDH-ειδικό αντίσωμα. ΧΙΑΡ και FLIP είναι δύο πρωτεΐνες προ-επιβίωσης που σχετίζεται με το θάνατο του υποδοχέα που προκαλείται από εξωγενή οδό αποπτωτικά [12]. Ως εκ τούτου, εξετάστηκε αν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των πρωτεϊνών προ-επιβίωσης ΧΙΑΡ και flip με την έκφραση MTDH. Ενώ η έκφραση του MTDH και ΧΙΑΡ δεν συσχετίζονται, είχαμε εντοπίσει έναν συσχετισμό με την έκφραση FLIP (Εικόνα 1Β). Η αυξημένη έκφραση του MTDH σε όλα τα καρκινικά κύτταρα και ιστούς που εξετάστηκαν δείχνει ότι μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην καρκινογένεση του ενδομητρίου

(Α) Εκφραση MTDH ανιχνεύθηκε σε όλες τις έξι κυτταρικές γραμμές δοκιμάστηκαν καρκίνου του ενδομητρίου:. RL95, AN3CA, ECC1, Ishikawa Η (Ιεσεί), KLE και Hec50 κύτταρα. (Β) Έκφραση MTDH ανιχνεύθηκε σε ενδομητρίου ιστούς από δύο φυσιολογικά άτομα, τέσσερις ασθενείς με θηλώδη ορώδης, τρεις ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα, και δύο ασθενείς με σάρκωμα του ενδομητρίου. Η έκφραση του γονιδίου LKB1 ογκοκατασταλτικό και δύο αντι-αποπτωτικών γονιδίων, ΧΙΑΡ και flip, ανιχνεύθηκε επίσης με κηλίδωση Western στα ίδια δείγματα. (C) έκφραση MTDH ανιχνεύθηκε με χρώση ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας το φάσμα των ασθενειών (ενδομητρίου εξέλιξης του καρκίνου) συστοιχίας ιστού με πάνω από 50 δείγματα ενδομητρίου ιστών από καλοήθη σε καρκίνο. (I) κανονική ενδομήτριου ιστού, (ii) αδενοκαρκίνωμα χαμηλής ποιότητας του ενδομητρίου, (iii) υψηλής ποιότητας ενδομητρίου αδενοκαρκίνωμα, και (iv) του ενδομητρίου μεταστατικό καρκίνο στην κοιλιακή κοιλότητα. Αρχική μεγέθυνση, × 400.

Η

εξόντωση MTDH μειώνει το σχηματισμό αποικιών

Λόγω της αυξημένης εκφράσεως MTDH στις διάφορες ενδομητρίου καρκινικές κυτταρικές γραμμές και ανθρώπινα ενδομητρίου δείγματα καρκίνου, εξετάσαμε έπειτα το ογκογόνο δυναμικό του MTDH στο Type II καρκίνο του ενδομητρίου κυτταρική σειρά Hec50co χρησιμοποιώντας μια σύντομη φουρκέτα RNA (shRNA) ειδικά για MTDH. Μία μείωση 3,49-φορές στην έκφραση γονιδίου MTDH ανιχνεύθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR) σε MTDH shRNA επιμολυσμένα κύτταρα Hec50co σύγκριση με τον έλεγχο κωδικοποιημένα shRNA-επιμολυσμένα κύτταρα (Πίνακας S1). Η εξάντληση των MTDH μειωμένο σχηματισμό αποικίας σε κύτταρα που εκφράζουν σταθερά MTDH shRNA σύγκριση με τους μάρτυρες shRNA (Σχήμα 2Α, Β). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας τρία κατασκευάσματα shRNA στοχεύουν διάφορες περιοχές της MTDH. Ένας παρόμοιος φαινότυπος παρατηρήθηκε επίσης μετά από νοκ ντάουν της MTDH σε Ishikawa H Τύπου Ι καρκίνο του ενδομητρίου κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η έκφραση αυξημένα MTDH γενικά απαιτείται για το σχηματισμό του ενδομητρίου αποικία καρκίνου.

κύτταρα Hec50co επιμολύνονται με έλεγχο ή φορείς έκφρασης MTDH shRNA . είναι (α) Οι αποικίες που σχηματίζονται από τον έλεγχο ή MTDH shRNA επιμολυσμένα κύτταρα Hec50co παρουσιάζεται μετά την επιμόλυνση Τα siRNAs και μετά την επιλογή με 2 μg /ml πουρομυκίνη για 3 εβδομάδες. (Β) Ποσοτικοποίηση της σχετικής σχηματισμού αποικίας στον έλεγχο έναντι MTDH νοκ ντάουν κύτταρα Hec50co.

Η

Αναγνώριση MTDH ρυθμιζόμενων γονιδίων σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του ενδομητρίου

Για την αναγνώριση μεταγενέστερων γονιδίων μεσολαβούν την ογκογόνο επιδράσεις των MTDH σε καρκίνο του ενδομητρίου κυτταρικές σειρές, μια Affymetrix ολιγονουκλεοτίδιο μικροσυστοιχιών (Human γονίδιο array 1,0 ST) χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε κύτταρα Hec50co σταθερώς επιμολυσμένα με είτε MTDH shRNA ή όργανα ελέγχου shRNA (τα στοιχεία έχουν κατατεθεί στις GEO, GSE26134) . Η εξάντληση των MTDH από knockdown είχε ως αποτέλεσμα τουλάχιστον δύο φορές μεταβολή γονιδιακής έκφρασης από 57 γονίδια (Σχήμα 3Α). Αρκετά από αυτά τα γονίδια επελέγησαν τυχαία για να επιβεβαιώσει τις αλλαγές από qRT-PCR (Σχήμα 3Β).

(Α) χάρτη θερμότητας από δύο φορές αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης (όπως προσδιορίζεται από δεδομένα συστοιχία Affymetrix) μεταξύ ελέγχου και MTDH νοκ ντάουν κύτταρα Hec50co. (Β) μεταβολές γονιδιακή έκφραση επικυρώθηκαν από qRT-PCR για τα υποδεικνυόμενα γονίδια που εντοπίζονται στην μικροσυστοιχία (* ρ & lt? 0,05). (Γ) έκφραση και /ή φωσφορυλίωση των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών εξετάστηκαν σε κύτταρα Hec50co σταθερώς εκφράζουν είτε τον έλεγχο shRNA ή MTDH shRNA. Σύνολο ΡϋΚ1 και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης. (D, Ε) Έκφραση ΡΙΡ3 ανιχνεύθηκε σε μάρτυρα (D) ή MTDH knockdown κυττάρων (Ε) Hec50co με χρώση ανοσο-φθορισμού ΡΙΡ3.

Η

Δεδομένα από τη συστοιχία έδειξαν ότι MTDH ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην εισβολή, σφικτών συνδέσμων, καθώς και χημειοαντίσταση (Πίνακας S1 και S2). Για παράδειγμα, γαλεκτίνη-1 (LGALS1) και καλβιδίνη 1 (Calb1) ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε mRNA (Σχήμα 3Β) και τα επίπεδα πρωτεΐνης (Εικόνα 3C) σε MTDH shRNA επιμολυσμένα κύτταρα Hec50co. Calb1 και γαλεκτίνη-1 είναι δύο υποθετικών MTDH κατάντη γονίδια που μπορούν να ρυθμίζουν το μεταβολισμό φωσφατιδυλινοσιτόλης, η οποία αποτελεί μέρος της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού σηματοδότησης συνήθως ρυθμίζεται αυξητικά στον καρκίνο του ενδομητρίου [23]. Εξετάσαμε επίσης τις αλλαγές στην έκφραση γονιδίων σε Ishikawa Η καρκίνο του ενδομητρίου κύτταρα σε απάντηση MTDH αποσιώπηση και παρατηρείται κάποια επικάλυψη με γονίδια που άλλαξαν σε κύτταρα Hec50co (Πίνακας S3 και S4).

Είμαστε δίπλα προσπάθησαν να καταλάβουν πώς MTDH ρυθμίζει την PI3K /Akt μονοπατιού. Έκφραση γαλεκτίνης-1 υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους όγκων και έχει αναφερθεί ότι μεσολαβεί εισβολή και μετάσταση όγκου αυξάνοντας την έκφραση του μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-2 και την προώθηση της αναδιοργάνωσης του κυτταροσκελετού ακτίνης [24]. Συνεπής με μια προηγούμενη μελέτη στην οποία η υπερέκφραση του MTDH προάγει την ενεργοποίηση της οδού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ σε νευροβλάστωμα [7], ανιχνεύσαμε μια αναστολή των συστατικών του ΡΙ3Κ μονοπατιού /σηματοδότησης ΑΚΤ σε κύτταρα Hec50co με απεμπλουτισμένο MTDH σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 3C) . Συγκεκριμένα, μια δραματική μείωση στην φωσφορυλίωση ΡϋΚ1 στο S241 και φωσφορυλίωση της ΑΚΤ τόσο T308 και S473 εμφανίστηκαν σε MTDH knockdown κυττάρων, αν και καμία σημαντική μεταβολή του συνολικού επιπέδου πρωτεΐνης ΡϋΚ1 ανιχνεύθηκε (Σχήμα 3C). Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D και Ε, μια δραματική μείωση του επιπέδου της ΡΙΡ3 ανιχνεύθηκε σε κύτταρα Hec50co με MTDH shRNA σε σύγκριση με κύτταρα με έλεγχο shRNA. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι MTDH μπορεί να ενεργοποιήσει τις οδούς προ-επιβίωσης PI3K /AKT μέσω up-ρύθμιση του ΡΙΡ3.

MTDH νοκ ντάουν ευαισθητοποιεί τα κύτταρα σε στοχευμένες θεραπείες του καρκίνου

Για να ξεπεραστεί η αντίσταση στην θεραπείες, HDAC οι αναστολείς όπως LBH589 έχουν χρησιμοποιηθεί για την αποκατάσταση TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε διάφορους τύπους καρκίνων [18], [19]. κύτταρα Hec50co είχαν προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι ανθεκτικά σε TRAIL-μεσολαβούμενη απόπτωση [13]. Ως εκ τούτου, για να δοκιμαστεί η επίδραση του MTDH για ευαισθησία σε TRAIL στα κύτταρα αυτά, εμείς κατεργασμένα κύτταρα Hec50co με ή χωρίς MTDH (έλεγχος έναντι MTDH knockdown) με συνδυασμένη TRAIL και θεραπεία LBH589 για τρεις ημέρες και στη συνέχεια εξετάστηκε η κυτταρική βιωσιμότητα. Σε σύγκριση με τα ανακατωμένα shRNA επιμολυσμένα κύτταρα Hec50co, σταθερή MTDH knockdown μετρίως αύξησε την ευαισθησία των κυττάρων Hec50co στη θεραπεία απλού παράγοντα (είτε LBH589 ή TRAIL μόνο, Σχήμα 4Α, Β). Ωστόσο, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Β, ένα πιο δραματική επαγωγή της ευαισθησίας εμφανίστηκαν σε σταθερή MTDH knockdown κυττάρων Hec50co με τον συνδυασμό LBH589 και TRAIL. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η έκφραση MTDH είναι ένας σημαντικός παράγοντας υποκείμενη αντίσταση στη συνδυασμένη αγωγή.

(Α) επαγωγή κυτταρικού θανάτου με LBH589 ως μονοθεραπεία ανιχνεύθηκε σε έλεγχο ή MTDH knockdown κυττάρων Hec50co. Μετά από 3 ημέρες, ο κυτταρικός θάνατος προσδιορίσθηκε με τη μέθοδο WST-1. (Β) Ο κυτταρικός θάνατος που προκύπτει από διαφορετικές συγκεντρώσεις του TRAIL (5 έως 50 ng /ml) μόνο του ή σε συνδυασμό με 5 ηΜ LBH589 αναλύθηκε σε έλεγχο ή MTDH knockdown κυττάρων Hec50co.

Η

ρυθμιστές απόπτωσης εμπλέκονται σε MTDH μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο

Για να μελετηθεί το μοριακό μηχανισμό του κυτταρικού θανάτου σε MTDH knockdown κυττάρων, έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση (τόσο προ και αντι-αποπτωτικό παράγοντες) εξετάστηκαν σε έλεγχο MTDH και knockdown κυττάρων μετά από εφάπαξ θεραπείας (LBH589 ή TRAIL) ή μετά από συνδυασμένη θεραπεία (LBH589 και TRAIL). Η θεραπεία συνδυασμού δεν ενίσχυσε την έκφραση των υποδοχέων TRAIL DR4 και DR5. Επιπλέον, δεν υπήρξαν αλλαγές στην έκφραση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων Bcl-XL, Mcl-1, ή αναστροφή στον έλεγχο MTDH και νοκ ντάουν κύτταρα Hec50co μετά τη συνδυαστική θεραπεία (Σχήμα 5).

Control ή MTDH νοκ ντάουν Hec50co κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 24 ώρες με τον έλεγχο του οχήματος, 20 ηΜ LBH589, 25 ng /ml TRAIL ή TRAIL LBH589 και στις συγκεντρώσεις που σημειώνονται. Τα προϊόντα λύσης συλλέχθηκαν. Έκφραση των DR4, DR5, και σχετίζονται με την απόπτωση της κασπάσης-3, κασπάσης-8, PARP-1, BID, flip, ΧΙΑΡ, Bim, MCL-1 και BCL-XL αναλύθηκε με κηλίδωση Western.

Η

Είναι ενδιαφέρον ότι η προ-αποπτωτική ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνη Bim ήταν ρυθμισμένη σε μη επεξεργασμένα MTDH knockdown κυττάρων Hec50co σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 5), γεγονός που δείχνει ότι η εξάντληση των μόνος MTDH μπορεί να οδηγήσει σε επαγωγή του προ-αποπτωτικών παραγόντων. Όταν κύτταρα ελέγχου Hec50co υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μόνη ή σε συνδυασμό με TRAIL LBH589, η έκφραση του Bim αυξηθεί. Σε αντίθεση, η έκφραση του Bim ήταν σημαντικά ενισχύθηκε MTDH knockdown κυττάρων Hec50co χωρίς καμία θεραπεία, ενώ η θεραπεία με είτε LBH589 ή TRAIL ενισχύεται περαιτέρω η έκφραση του Bim. Ωστόσο, Bim έκφραση μειώθηκε ελαφρά σε MTDH νοκ ντάουν κύτταρα μετά από συν-θεραπεία με LBH589 και TRAIL.

Στα κύτταρα ελέγχου, μετα-μεταφραστική τροποποίηση των ΧΙΑΡ σημειώθηκαν κατά την αγωγή με LBH589, όπως αποδεικνύεται από ένα υψηλότερο αποδημητικά είδη, και τη μείωση τόσο των συνολικών και τροποποιημένες ΧΙΑΡ ανιχνεύθηκε μόνο με LBH589 και TRAIL συνδυασμός θεραπείας (Σχήμα 5). Το αποτέλεσμα αυτό επιτείνεται όταν MTDH χτυπήθηκε κάτω, έτσι ώστε εντοπίσαμε μια μεγαλύτερη μείωση ΧΙΑΡ μετα-μεταφραστική τροποποίηση MTDH νοκ ντάουν κύτταρα Hec50co σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου μετά LBH589 και θεραπεία TRAIL. Επιπλέον, σημαντική επαγωγή της διάσπασης της κασπάσης-8, κασπάσης-3 και ΡΑΚΡ-1 ανιχνεύθηκε μετά από μόνο θεραπεία με LBH589 ή TRAIL, ή συνδυασμού σε MTDH knockdown κυττάρων Hec50co σύγκριση με κύτταρα ελέγχου. Μείωση της προσφοράς παρατηρήθηκε επίσης σε MTDH knockdown κυττάρων που έλαβαν το συνδυασμό του LBH589 και TRAIL. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι knockdown του MTDH μπορεί να αυξήσει εξωγενή απόπτωση που επάγεται από TRAIL και LBH589, και ο κύριος μηχανισμός είναι μέσω πάνω ρύθμιση Bim. Κάτω ρύθμιση των ΧΙΑΡ και την επακόλουθη ενεργοποίηση της κασπάσης-8 και κασπάσης-3 καθώς και οι μεταγενέστεροι υποστρώματα όπως PARP-1 εμφανίζεται επίσης.

ρύθμιση του σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου από MTDH

Για να προσδιοριστεί η ακριβής μηχανισμός με τον οποίο MTDH προσδίδει αντίσταση σε TRAIL και θεραπεία LBH589, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε ο ρόλος των MTDH στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Έλεγχος και MTDH knockdown κυττάρων Hec50co που ήταν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με TRAIL μόνο είχε παρόμοια προφίλ κυτταρικού κύκλου (Σχήμα 6Α). Σε αντίθεση, η αγωγή με το LBH589 αναστολέα HDAC σε κύτταρα που στερούνται MTDH οδήγησε σε μεγαλύτερη αναλογία κυττάρων επίμονα στη G2 /M φάση. Όταν Hec50co MTDH knockdown κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία τόσο με LBH589 και TRAIL, η μειωμένη αναλογία των κυττάρων ήταν σε φάση S και μία αυξημένη αναλογία των κυττάρων συνελήφθησαν στην G2 /M (Εικ. 6Α). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι MTDH έχει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της σημείου ελέγχου κύκλου κυττάρου, στο πλαίσιο της συνδυαστικής TRAIL και θεραπεία αναστολέα HDAC.

(Α) προφίλ κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκαν σε έλεγχο ή MTDH knockdown κυττάρων Hec50co στις 24 ώρες μετά την αγωγή με 20 ηΜ LBH589, 25 ng /ml TRAIL, ή LBH589 και TRAIL σε συνδυασμό. Το ποσοστό των κυττάρων στην G1, S και φάσεις G2 /M προσδιορίστηκαν. (Β) Η μεταβολή του Aurora Α, Aurora Β, ρ21, ιστόνης Η3 ακετυλίωση στη λυσίνη 9, Η3 φωσφορυλίωση ιστόνης στη σερίνη 10 και η συνολική Η3 ιστόνης αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western μετά από 24 ώρες θεραπείας με τις υποδεικνυόμενες αντιδραστηρίων. Σύνολο ιστόνης Η3 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Ένα μοντέλο για την διευκρινιστεί ο μηχανισμός με τον οποίο νοκ ντάουν της MTDH αυξάνει τον κυτταρικό θάνατο από TRAIL και την LBH589 αναστολέα HDAC. MTDH knockdown μειώνει φωσφορυλίωση ΡϋΚ1 και ΑΚΤ υπόστρωμά του, η οποία οδηγεί σε αυξημένη έκφραση του προαποπτωτική πρωτεΐνη Bim. έκφραση ΧΙΑΡ ρυθμίζεται μειωτικά σε απόκριση σε συνδυασμένη θεραπεία LBH589 και TRAIL, απελευθερώνοντας έτσι το ΧΙΑΡ παρεμπόδιση που προκαλείται της κασπάσης-3 και -8 ενεργοποίηση. Συλλογικά, η ρύθμιση αυτών των οδών προάγει τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

Η

Για να διερευνήσει το μηχανισμό με τον οποίο MTDH ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο, η έκφραση των ρυθμιστικών του κυτταρικού κύκλου μετρήθηκε. Αύξηση του Aurora Α στο πρωτεϊνικό επίπεδο παρατηρήθηκε σε MTDH knockdown κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 6Β). Όταν ο έλεγχος και MTDH knockdown κυττάρων Hec50co εκτέθηκαν σε LBH589, υπήρξε μία αύξηση στην Aurora Α, Aurora Β, ακετυλίωση της ιστόνης Η3 στη λυσίνη 9, φωσφορυλίωση ιστόνης Η3 στη σερίνη 10, και ρ53-ανεξάρτητη άνω ρύθμιση του p21 WAF1, ο αναστολέας της εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσες (Εικόνα 6Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία TRAIL είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του Η3 φωσφορυλίωση ιστόνης, που αντιστοιχούσε σε μείωση του ποσοστού των κυττάρων σε G2 /M φάση σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Συνολικά αυτά τα δεδομένα εμπλέκουν ένα νέο ρόλο για MTDH στη ρύθμιση των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου.

Συζήτηση

Αν και MTDH έχει συνδεθεί τόσο μετάσταση και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία σε διάφορους τύπους καρκίνων [1], [ ,,,0],25], ο μηχανισμός και η βιολογική λειτουργία των MTDH είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Η εξάντληση των MTDH μπορεί να ενισχύσει τις επιδράσεις των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων, όπως η δοξορουβικίνη, πακλιταξέλη και 5-FU [10], [11]. Εδώ αναφέρουμε ότι η έκφραση του MTDH είναι ιδιαίτερα αυξημένη σε ενδομητριακών καρκίνων ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ενδομήτριο. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η εξάντληση των MTDH με ένα ειδικό shRNA μπορεί επίσης να αυξήσει την κυτταρική ευαισθησία σε στοχευμένες θεραπείες, συμπεριλαμβανομένης της LBH589 αναστολέα HDAC, TRAIL και θεραπευτική αγωγή σε συνδυασμό με τα δύο παράγοντες. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 6C, έχουμε εντοπίσει το δυναμικό μηχανισμό με τον οποίο knockdown του MTDH αυξάνει τον κυτταρικό θάνατο σε απόκριση σε θεραπεία με TRAIL και το LBH589 αναστολέα HDAC. Συγκεκριμένα, κύτταρα που στερούνται MTDH έχουν μειωμένη φωσφορυλίωση ΡϋΚ1 και ΑΚΤ υπόστρωμά της, η οποία με τη σειρά της διεγείρει την έκφραση της προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bim. Συνδυασμένη LBH589 και θεραπεία TRAIL αποτελέσματα σε μειορύθμιση των ΧΙΑΡ, επιτρέποντας έτσι την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και -8. Αυτές οι μοριακές αλλαγές οδηγούν σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα που στερούνται MTDH. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι, ως εκ τούτου MTDH μεσολάβηση αντίσταση εμφανίζεται μέσω της ενεργοποίησης της προ-επιβίωσης μονοπάτια και δυνητικά σηματοδότησης από ανώμαλη ρύθμιση των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου.

Χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση των μικροσυστοιχιών, έχουμε εντοπίσει πολλά υποψήφια γονίδια που ρυθμίζονται διαφορικά σε κύτταρα λείπει (MTDH shRNA) ή την έκφραση (έλεγχος shRNA) MTDH. Ιδιαίτερου ενδιαφέροντος ήταν καλβιδίνη 1 (CALB1) και γαλεκτίνη-1, δύο πρωτεϊνών που έχουν προηγουμένως συνδεθεί με μονοπάτια σηματοδότησης προ-επιβίωσης. CALB1 είναι μία πρωτεΐνη δέσμευσης ασβεστίου με περιοχές δέσμευσης τέσσερα ενεργά ασβεστίου. CALB1 αναφέρθηκε να αλληλεπιδρά με μυο-ινοσιτόλη μονοφωσφατάση (IMPA) χρησιμοποιώντας εμφάνιση φάγου και να επάγουν δραστικότητα IMPA μέχρι 250 φορές [26], [27]. IMPA είναι ένα ένζυμο που αποφωσφορυλιώνει μυο-ινοσιτόλη μονοφωσφορικής, μυο-ινοσιτόλη-1,3-διφωσφορικό, και μυο-ινοσιτόλη-1,4-διφωσφορικό για τη δημιουργία ελεύθερης μυο-ινοσιτόλη η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο [28]. Γκαλεκτίνη-1, μια πρωτεΐνη δέσμευσης βήτα-γαλακτοσιδάση, εκφράζεται ισχυρά σε ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων και έχει δειχθεί ότι παίζουν ρόλο στην ΡΙ3Κ σηματοδότηση και η ενεργοποίηση Akt [29]. Σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος, νοκ ντάουν της γκαλεκτίνη-1 μειώνει την ικανότητα του αυξητικού παράγοντα (IGF1) διέγερση της ινσουλίνης που μοιάζει να ανυψώσει τα επίπεδα του κυτταρικού ΡΙΡ3 (Perry et al., 2010, AACR 101

ης ετήσιας αφηρημένη συνάντηση 301). Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι MTDH μεσολάβηση πάνω ρύθμιση γαλεκτίνης-1 και CALB1 μπορεί να είναι ο μηχανισμός με τον οποίο MTDH διεγείρει μια αύξηση στα επίπεδα ΡΙΡ3, ενεργοποιώντας έτσι την οδό ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /mTOR. Αυτή η οδός παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση του ενδομητρίου, είτε από τη μετάλλαξη του ΡΤΕΝ ή με άλλους μηχανισμούς, συστατική ενεργοποίηση είναι ο κανόνας. ταυτοποίηση μας της υπερ-έκφραση του MTDH οδηγώντας σε αυξημένα επίπεδα ΡΙΡ3 παρέχει ακόμη μία πιθανή εξήγηση για την υψηλή δραστικότητα της ΡΙ3Κ και ΑΚΤ βρίσκονται συχνά σε ενδομητριακών καρκίνων.

Αναστολή της MTDH έδειξε να αυξάνει τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από LBH589 και θεραπεία συνδυασμού TRAIL (Σχήμα 4). TRAIL μπορεί να προκαλέσει εξωγενή απόπτωση μέσω απευθείας δέσμευσης με τους υποδοχείς θανάτου. Ωστόσο, ενώ το TRAIL μπορούν να επάγουν εκλεκτικά απόπτωση σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα, δεν μπορεί να διεγείρει απόπτωση σε κανονικούς ιστούς του ενδομητρίου στην ίδια συγκέντρωση. Επιπλέον, η συγκέντρωση του TRAIL (200 ng /ml) που είναι αναγκαία για να διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του ενδομητρίου είναι πολύ υψηλότερη από εκείνη που χρησιμοποιείται προηγουμένως για κύτταρα από άλλους συμπαγείς όγκους (π.χ. 25-50 ng /ml σε καρκίνο του παγκρέατος) [13], [ ,,,0],30]. Αυτό υποδεικνύει πιθανή αντίσταση την έναρξη έως TRAIL στον καρκίνο του ενδομητρίου η οποία θα μπορούσε να συνδέεται με υψηλή έκφραση MTDH. Για να ξεπεραστεί η αντίσταση, αρκετές χημειοθεραπευτικούς παράγοντες ή στοχευμένες αναστολείς που έχουν αναφερθεί για την αύξηση της ευαισθησίας σε TRAIL επαγόμενη απόπτωση έχουν χρησιμοποιηθεί σε συνδυαστική αγωγές [12]. Εδώ αποδεικνύουμε ότι ο αναστολέας HDAC μπορεί να αυξήσει LBH589 που διαμεσολαβείται από TRAIL κασπάσης-8 ενεργοποίηση και την επακόλουθη εξωγενή κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα του ενδομητρίου. Εξόντωση MTDH μπορεί να διεγείρει περαιτέρω κασπάσης-8 διάσπαση που προκαλείται από LBH589, TRAIL, ή ο συνδυασμός των δύο. Μία αύξηση στην ΧΙΑΡ τροποποίηση μετά τη μετάφραση, η μείωση της συνολικής ΧΙΑΡ, και επαγωγή του γονιδίου Bim απόπτωση παρατηρήθηκαν σε κύτταρα κατεργασμένα με την LBH589 μόνο. Απώλεια της προσφοράς παρατηρήθηκε σε MTDH knockdown κυττάρων μετά κατεργασία LBH589 και TRAIL συνδυασμό, η οποία είναι πιθανό να οφείλεται στην ενεργοποίηση Bid μέσω διάσπασης. Το εύρημα της μειωμένης Bim με την ίδια θεραπευτική αγωγή ήταν κάπως απροσδόκητο. Ωστόσο, τα δεδομένα μας στο Σχήμα 3 υποδεικνύουν ότι MTDH knockdown ρυθμίζει αρνητικά την οδό Akt, η οποία μπορεί αρχικά να οδηγήσει σε αυξημένη έκφραση του Bim. Καθώς τα κύτταρα πρόοδος μέσω απόπτωσης, λιγότερο σταθερές πρωτεΐνες μπορεί να υπόκειται σε αποικοδόμηση. Από MTDH knockdown κυττάρων έχουν επιταχυνθεί κυτταρικό θάνατο σε απόκριση στη θεραπεία συνδυασμού (Σχήμα 4), είναι πιθανό ότι η μείωση των Bim είναι μια αντανάκλαση της ταχείας εναλλαγής πρωτεΐνης.

Σε απάντηση στη θεραπεία LBH589 μόνο του ή με TRAIL , οι δύο κύριες επιδράσεις της MTDH knockdown επί του κυτταρικού κύκλου ήταν μια μείωση στο ποσοστό των κυττάρων σε S και μια συνακόλουθη αύξηση στο ποσοστό των κυττάρων σε G2 /M, όπου τα κύτταρα φαίνεται να συλληφθεί. Σε κυτταρικό επίπεδο, ωστόσο, knockdown MTDH μόνος απουσία θεραπείας δεν επηρέασε την έκφραση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών κανονικού κυτταρικού κύκλου. Για παράδειγμα, LBH589 ενισχυθεί σημαντικά ιστόνης Η3 ακετυλίωση επί λυσίνη 9 (Σχήμα 6Β), η οποία μπορεί να επιτρέψει τη μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου ρ21 [31]. Ωστόσο, η τροποποίηση Η3 δεν επηρεάστηκε από shRNA νοκ ντάουν της MTDH. Πρωτεασώματος μεσολάβηση αποικοδόμηση του Aurora Α, Aurora Β και c-FLIP αναφέρθηκε ότι είναι υπεύθυνη για την αύξηση της ευαισθησίας προς TRAIL με επεξεργασία αναστολέα HDAC σε μερικά καρκινικά κύτταρα [15], [32]. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στην Aurora Α και τα επίπεδα Β ή C-FLIP στην ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με LBH589 στις μελέτες μας.

Αυτή είναι η πρώτη έκθεση του αντίκτυπου MTDH για αντίσταση στη στοχευμένη θεραπεία για τον καρκίνο του ενδομητρίου . Για τις μελέτες αυτές, εμείς επιλέξαμε το συνδυασμό LBH589 και TRAIL λόγω των επιπτώσεων αυτών των παραγόντων σε προ-αποπτωτικών μονοπατιών. Έχουμε αποδείξει στο παρόν ότι knockdown του MTDH ευαισθητοποιεί κύτταρα σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει αναστολή της ΡϋΚ1 και Akt φωσφορυλίωση, αύξηση Bim, και μείωση των ΧΙΑΡ. Ως εκ τούτου, μπορούμε να στοχεύσετε MTDH να ενισχύσει την ευαισθησία όχι μόνο χημειοθεραπεία, αλλά και στοχευμένες παράγοντες που λειτουργούν μέσω του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν πειστικές αποδείξεις ότι, από την προς τα κάτω ρύθμιση MTDH στον καρκίνο του ενδομητρίου, μπορούμε να μεγεθύνει τις προ-αποπτωτικών μονοπατιών και την ανταπόκριση στη θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Κανονική ενδομητρίου ιστών και του ενδομητρίου ιστών από ενδομητρίου καρκίνων συλλέχθηκαν με τη συγκατάθεση των ασθενών σύμφωνα με το Πανεπιστήμιο της Αϊόβα Institutional Review Boards εγκεκριμένο πρωτόκολλο. Πήραμε ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση από όλους τους συμμετέχοντες που εμπλέκονται σε αυτή τη μελέτη.

Γραμμές κυττάρων και κυττάρων Πολιτισμού

Ανθρώπινο καρκίνο του ενδομητρίου κυτταρικές σειρές Hec50co, RL95, AN3CA, ECC1, Ishikawa Η, και KLE διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (όλα από Gibco BRL, Carlsbad, CA) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα

2 και 95% αέρα 5% CO. Για να δημιουργηθεί ένα μοντέλο knockdown MTDH, κύτταρα Hec50co επιμολύνθηκαν με MTDH sh RNA ή ελέγχουν μη φίμωση shRNA κατασκευάσματα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (ΟηΟεηε, Rockville, MD). Ξεχωριστοί κλώνοι κυττάρων ανθεκτικές σε πουρομυκίνη επεκτάθηκαν και υποβλήθηκαν σε διαλογή για έκφραση MTDH με κηλίδωση Western.

ενδομητρίου Ιστοί και ιστικών συστοιχιών

Κανονικό ενδομητρίου ιστών και του ενδομητρίου ιστοί από ενδομητριακών καρκίνων συλλέχθηκαν από το Πανεπιστήμιο της Αϊόβα Νοσοκομεία και Κλινικές. Η συστοιχία ιστός φάσμα ενδομητρίου ασθένεια (ενδομητρίου εξέλιξης του καρκίνου) (UT 801) αγοράστηκε από την US Biomax, Inc. (Rockville, MD).

Αντιδραστήρια, αντισώματα και κηλίδωση Western

Ανθρώπινο ανασυνδυασμένο TRAIL (απόπτωση πρόσδεμα επαγωγή TNF σχετίζονται) αγοράστηκε από την R &? D Systems, Inc. (Minneapolis, ΜΝ). LBH589 αγοράστηκε από Σέλεκ (Houston, ΤΧ). Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-MTDH και αντι-β-ακτίνης αντισώματα ήταν από την Sigma (St Louis, ΜΟ, USA)? και αντι-διασπασμένη κασπάση-3, κασπάσης-8, DR4, DR5, Bim, Bid, flip, ΧΙΑΡ, p21, PARP-1 p-ΑΚΤ S473, π-ΑΚΤ T308, ΡϋΚ1, π-ΡϋΚ1 S204, της ιστόνης 3, σ -histone 3 serine10 και της ιστόνης 3 λυσίνη 9 ακετυλίωση αντισώματα ήταν από την Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, ΜΑ). λύματα πρωτεΐνη ολόκληρου κυττάρου παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34].

Έκφραση Array και RT-qPCR Ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε από MTDH knockdown και τον έλεγχο του ενδομητρίου καρκινικού κυττάρου γραμμές (σε βιολογικά τριπλούν για έλεγχο και MTDH νοκ ντάουν κύτταρα) χρησιμοποιώντας το

mir

Βάνα miRNA Απομόνωση Kit (Ambion, Austin, TX), και cDNA δημιουργήθηκε με τη χρήση της υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Ένα ανθρώπινο γονίδιο πίνακα 1.0 ST (Affymetrix, Santa Clara, CA) ανακρίθηκε με τη χρήση των βιολογικών τριπλούν στη διευκόλυνση DNA πυρήνα στο Πανεπιστήμιο της Αϊόβα, και Partek Γονιδιωματική Σουίτα (Partek Inc, St. Louis, ΜΟ) λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία τιμές γονιδιακής έκφρασης. Όλα τα δεδομένα είναι MIAME συμβατό και η ανεπεξέργαστα δεδομένα έχει κατατεθεί στην καταγγελία MIAME GEO βάσης δεδομένων, όπως αναλυτικά στην ιστοσελίδα https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/query/acc.cgi?acc= GSE26134. Ο αριθμός ένταξης για τα κύτταρα Hec50co είναι GSE26134 και για τα κύτταρα Ishikawa H είναι GSE27828. Αρκετές MTDH κατάντη γονίδια επελέγησαν τυχαία για την επικύρωση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας εκκινητές TaqMan και ανιχνευτές (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) για την ποσοτική ανάλυση RT-PCR.