Αφηρημένο

Η δεξαμεθαζόνη (Dex) αντιμετωπίζεται σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) ήταν περιγραφεί προηγουμένως ως αναπτυσσόμενες αδενοκαρκίνωμα του πεπτικού μετά μαζική μόλυνση με

Cryptosporidium parvum

συντομότερο 45 ημέρες μετά τη μόλυνση (ΡΙ). Επιδιώξαμε να προσδιοριστεί ο ελάχιστος αριθμός ωοκύστεων ικανή να επάγει τη μόλυνση και συνεπώς γαστρεντερικούς όγκους σε αυτό το μοντέλο. Τα ποντίκια προκλήθηκαν με βαθμονομημένο εναιωρήματα ωοκύστη που περιέχουν προορίζεται δόσεις: 1, 10, 100 ή 10

5 ωοκύστες του

C. parvum

στέλεχος Αϊόβα. Όλες οι χορηγούμενες δόσεις ήταν μολυσματικός για τα ζώα αλλά αυξάνοντας το προβάδισμα πρόκληση ωοκυστών σε αύξηση σε ποντικούς μολυσματικότητα (Ρ = 0,01). Αποβολή ωοκύστεων.Τα ανιχνεύθηκε στις 7 ημέρες Ρ.Ι. μετά τον εμβολιασμό με περισσότερα από 10 ωοκύστες, και μετά από 15 ημέρες σε ποντικούς που προκλήθηκαν με ένα ωοκυστών. Σε ομάδες προκλήθηκαν με χαμηλότερο εμβόλια, φάση ανάπτυξης του παρασίτου ήταν σημαντικά υψηλότερη (Ρ = 0,005) σε σύγκριση με ποντίκια που εμβολιάστηκαν με υψηλότερες δόσεις. Μετά από 45 ημέρες μετά τον εμβολιασμό Όλες οι ομάδες ποντικών είχαν μέση του ωοκύστης ρίχνοντας ανώτερη 10.000 ωοκύστεων /g κοπράνων. Η πιο εντυπωσιακή παρατήρηση αυτής της μελέτης ήταν η απόδειξη ότι

C. parvum

επαγόμενη αδενοκαρκίνωμα του πεπτικού μπορούσε να προκληθεί από λοίμωξη με χαμηλές δόσεις του

Cryptosporidium

, ακόμη και με ένα μόνο ωοκύστη: σε ποντίκια που εμβολιάστηκαν με χαμηλές δόσεις, νεοπλασματικές αλλοιώσεις ανιχνεύθηκαν ήδη 45 ημέρες μετά τον εμβολιασμό τόσο στο στομάχι και ειλεοτυφλική περιοχή και αυτών των βλαβών θα μπορούσε να εξελιχθεί σε μια επεμβατική αδενοκαρκίνωμα. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν μεγάλη επίδραση ενίσχυσης των παρασίτων σε ιστούς ποντικού μετά από πρόκληση με χαμηλές δόσεις όπως επιβεβαιώνεται με ποσοτική PCR. Η ικανότητα του

C. parvum

να μολύνει ποντίκια με ένα ωοκυστών και να αναπτύξουν αδενοκαρκίνωμα του πεπτικού υποδηλώνει ότι και άλλα είδη θηλαστικών συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων θα μπορούσε να είναι επίσης ευαίσθητα σε αυτή τη διαδικασία, ειδικά όταν είναι σοβαρά ανοσοκατεσταλμένους

Παράθεση:. Benamrouz S, Guyot Κ , Gazzola S, Mouray Α, Chassat Τ, Delaire Β, et al. (2012)

Cryptosporidium parvum

μόλυνση σε SCID ποντίκια μολυσμένα με μία μόνο ωοκύστες: qPCR Αξιολόγηση των παρασίτων αναπαραγωγής στους ιστούς και την ανάπτυξη του καρκίνου του Πεπτικού. PLoS ONE 7 (12): e51232. doi: 10.1371 /journal.pone.0051232

Επιμέλεια: Gordon Langsley, Institut national de la Santé et de la recherche médicale – Institut Cochin, Γαλλία

Ελήφθη: 16 Σεπτεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 31 του Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 13, Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Benamrouz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Ειδική στήριξη παρασχέθηκε από καθολικούς Ινστιτούτο της Λιλ (ICL) συμπεριλαμβανομένου επιχορήγηση για Sadia Benamrouz. Το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Έρευνας, Γαλλία (EA3609 /4547 Université de Lille 2), Ομοσπονδιακής Ινστιτούτο Ερευνών 142 (Institut Pasteur de Lille), και η Γαλλική Εθνική Υπηρεσία Ερευνών (χορηγεί Νο ANR-09-ALIA-009 και ANR-10-ALIA-004). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Cryptosporidium

είδη παγκόσμια εξάπλωση apicomplexan παρασιτικές πρώτιστα που μολύνουν κυρίως το γαστρεντερικό σωλήνα του ψάρια, αμφίβια, ερπετά, πουλιά και περισσότερα από 150 είδη θηλαστικών, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων [1]. Η λοίμωξη αποτελέσματα από την κατάποση του

Cryptosporidium

ωοκύστεις μέσω της κατανάλωσης fecally μολυσμένων τροφίμων ή νερού, είτε μέσω άμεσης πρόσωπο

–

σε άνθρωπο ή ζώο-με-πρόσωπο επαφή [2]. Η σοβαρότητα της νόσου σε ασθενείς ποικίλλουν από ασυμπτωματική σε θανατηφόρες κρυπτοσποριδίωση, ανάλογα με μολύνοντας είδη, θέση τους της λοίμωξης, την ηλικία και την ανοσολογική κατάσταση του ξενιστή. Μολυσμένα ανοσοεπαρκή άτομα συχνά αναπτύσσουν οξεία γαστρεντερίτιδα, ενώ ανοσοκατασταλμένα άτομα γίνονται χρόνιες και μερικές φορές μοιραία επηρεάζονται [2].

Σήμερα, περισσότερα από 20

Cryptosporidium

είδη θεωρούνται έγκυρες [3], και δύο μεγάλες είδη,

Cryptosporidium parvum

και

C. hominis

, ευθύνονται για το μεγαλύτερο μέρος της ανθρώπινης περιπτώσεις κρυπτοσποριδίασης [4]. Μια υψηλή μολυσματική δύναμη του

Cryptosporidium

απομονώνει από την ανθρώπινη ή ζωικής προέλευσης αναφέρθηκε [5]. Έτσι, σε υγιείς εθελοντές χωρίς ορολογικές ενδείξεις της προηγούμενης λοίμωξης με

Cryptosporidium

, μία από του στόματος δόση 30

C. parvum

ωοκύστες προκάλεσε τη μόλυνση [5]. Η ίδια ομάδα ανέφερε ότι

Cryptosporidium hominis

ID50 ήταν 10 ωοκύστες [4]. Επιπλέον, αναφέρθηκε επίσης ότι ένα μόνο ωοκύστη του

C. meleagridis

μπορεί να παράγει μια μόλυνση των διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας σε στεροειδή θεραπεία C57BL /6 ποντίκια [6].

Για να διερευνήσουν τις βιολογικές και παθολογικές αποκλίσεις μεταξύ των

Cryptosporidium

είδη ή στελέχη και να συμβάλουν στην κατανόηση της δυναμικής της λοίμωξης, Certad και συνεργάτες ανέπτυξαν ένα αναπαραγώγιμο ζωικό μοντέλο χρόνιας κρυπτοσποριδίωση χρησιμοποιώντας ποντίκια SCID Dex-αγωγή ενηλίκων [7]. Τα ζώα εμβολιάστηκαν είτε με

C. parvum

οποία παράσιτα του εντερικού σωλήνα, είτε με

C. muris

η οποία έχει ένα τροπισμό για το στομάχι των ποντικών. Απροσδόκητα, βρήκαν τη χρήση αυτού του μοντέλου, ότι ένα εμβόλιο 10

5 ωοκύστες του

C. parvum

αλλά όχι

C. Μούρις

ήταν σε θέση να προκαλέσει την ανάπτυξη των χωροκατακτητικών πεπτικού αδενοκαρκινώματος [7]. Ωστόσο, το οποίο είναι ο αριθμός ελάχιστες ωοκύστεων ικανό να παράγει τόσο τη μόλυνση και το πεπτικό νεοπλασίας σε αυτό το μοντέλο; Το ζήτημα είναι σημαντικό όσον αφορά αυτό το μοντέλο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να διερευνήσει τις ιδιότητες φαινοτυπική του

Cryptosporidium

δείγματα απομονώθηκαν από ανθρώπινα κόπρανα ή το περιβάλλον (κυρίως νερό και τρόφιμα), όπου τα ποσά ωοκύστεων μπορεί συχνά να είναι πολύ χαμηλή. Για να περιγράψει καλύτερα ζωικό μοντέλο μας, διερευνήσαμε την πιθανή ικανότητα πρόσφατα απομονωθεί

Cryptosporidium

ωοκύστες για την πρόκληση τόσο μόλυνσης των διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας και το γαστρεντερικό νεοπλασματικές αλλοιώσεις όταν χορηγείται σε πολύ χαμηλή δόση.

Υλικά και Μέθοδοι

Cryptosporidium parvum

ωοκύστες

C. parvum

ΑΪΌΒΑ ωοκύστες αγοράστηκαν από Waterbo

RNE ™, Inc.

(Νέα Ορλεάνη, Λουιζιάνα). Το απόθεμα διαλύματος ωοκύστεων ήταν αποθηκευμένα σε ναυτιλιακές μέσο (αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό ή PBS με πενικιλίνη, στρεπτομυκίνη, γενταμυκίνη, αμφοτερικίνη Β και 0,01% Tween 20) στους 4 ° C μέχρι τη χρήση. Απουσία βακτηρίων και μυκήτων ήταν εξασφαλισμένη από τον έλεγχο των αναστολών ωοκύστης στο πιάτο Count Agar (37 ° C, 1 εβδομάδα) και σε πλάκες Sabouraud (37 ° C, 1 εβδομάδα).

πηγή των ζώων

CB17-SCID θηλυκά ποντίκια 6-7 εβδομάδων ελήφθησαν από μια αποικία που εκτρέφονται και ελέγχεται τακτικά για την αξιολόγηση των λοιμώξεων (συμπεριλαμβανομένης

Helicobacter

spp.) στο Ινστιτούτο Παστέρ του Lille (Γαλλία). Τα ζώα διατηρήθηκαν κάτω από άσηπτες συνθήκες σε έναν απομονωτή κατά τη διάρκεια ολόκληρου του πειραματισμού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7], [8], [9], [10]. πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν στις εγκαταστάσεις ζώων του Ινστιτούτου Pasteur της Λίλλης (αριθμός ερευνητικών διαπίστευσης, A59107). Το πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από τη γαλλική περιφερειακή ηθική (αριθμός έγκρισης ΣΕΚΑΠ 112.011) επιτροπή. Αξιολόγηση των πτυχών της κατάστασης του ζώου έγινε τακτικά για την ανίχνευση πόνο. Κλινικά σημεία που θα μπορούσαν να αποτελέσουν μια παράμετρο περιλαμβάνονται, αλλά δεν περιορίζονται σε: ταχεία ή προοδευτική απώλεια βάρους, εξουθενωτική διάρροια, τραχύ τρίχωμα, κυρτή στάση του σώματος, λήθαργος ή οποιαδήποτε κατάσταση παρεμβαίνει με τις καθημερινές δραστηριότητες (π.χ. το φαγητό ή το ποτό, βάδιση, ή εξάλειψη) .

Πειραματικός σχεδιασμός

ποντίκια SCID χορηγήθηκαν με 4 mg /L νατριούχος φωσφορική δεξαμεθαζόνη (Dex) (Merck, Λυών, Γαλλία) μέσω του πόσιμου νερού [7], [11]. χορήγηση δεξαμεθαζόνης άρχισε δύο εβδομάδες πριν από του στόματος εμβολιασμό με

Cryptosporidium

ωοκύστεις (βλέπε παρακάτω) και διατηρήθηκε κατά τη διάρκεια όλης πειραματισμό. Dex-προστιθέμενο νερό αντικαταστάθηκε τρεις φορές την εβδομάδα.

Οι ωοκύστες εμβολιάστηκαν σε ποντικούς με στοματική-γαστρικό καθετηριασμό χρησιμοποιώντας 18-20 σωλήνες σίτισης μετρητή. Κάθε ποντίκι ενοφθαλμίστηκε με 200 μΐ PBS που περιείχε διαφορετικό ποσό ωοκύστεων: 1, 10, 100 ή 10

5. Για κάθε δόση 4 έως 8 ποντίκια εμβολιάστηκαν (ομάδα 1 έως ομάδα 4). Αρνητικός ποντίκια ελέγχου εμβολιάστηκαν με PBS (η = 4) ή με ένα εμβόλιο 10

5 θερμικά αδρανοποιημένο ωοκύστες (90 ° C, 15 λεπτά) (η = 4). Μετά τα ποντίκια καθετηριασμό στεγάσθηκαν σε αποστειρωμένο καλυμμένο κλωβούς. Μολυσμένα ποντίκια εξατομικεύεται να αποφεύγεται η φυσική επαφή και να ελαχιστοποιήσουν τον κίνδυνο μόλυνσης από τη διασταυρούμενη μόλυνση και την αρνητική ποντίκια ελέγχου ομαδοποιούνται. Οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν για 100 ημέρες μετά τον εμβολιασμό για την αξιολόγηση της μολυσματικότητας και νεοπλασματικών βλαβών ανάπτυξης.

Προετοιμασία βαθμονομηθεί αναστολές ωοκύστεων

Η συγκέντρωση ωοκύστη του

C. parvum

μητρικό διάλυμα Αϊόβα επιβεβαιώθηκε με τη μέτρηση εις τριπλούν 10 μl-κλάσματα. Ελήφθησαν δείγματα κλάσματα τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρο πλάκα πολλαπλών φρεατίων, αφέθηκαν να στεγνώσουν και σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη. Μια άμεση δοκιμασία ανοσοφθορισμού (DFA) χρησιμοποιώντας ένα συζευγμένο με FITC αντι-

Cryptosporidium

μονοκλωνικό αντίσωμα (Cellabs Pty. Ldt., Croissy-Beaubourg, Γαλλία) έγινε. Wells εξετάστηκαν με μεγέθυνση × 400 και τα φθορίζοντα ωοκύστες μετρήθηκαν σε 10 τυχαία επιλεγμένα μικροσκοπικά πεδία. Πριν από τον εμβολιασμό, ωοκύστη βιωσιμότητα του στοκ διαλύματος εκτιμήθηκε με ένα τεστ θρυψίνη-ταυροχολικού αποκύστωση [12]. Με βάση το ποσοστό αποκύστωση (50%), σειριακές αραιώσεις πραγματοποιήθηκαν για την παρασκευή όλων των δόσεων. Οι δόσεις του ≤100 ωοκύστεων παρασκευάστηκαν σε 6 δείγματα των 200 μΙ: 5 δείγματα ελέγχθηκαν για την εκτίμηση δυνητικών αποκλίσεων με την προβλεπόμενη εμβόλιο και το τελευταίο κλάσμα ενοφθαλμίστηκε σε ποντικούς. Επαλήθευση του ποσού των ωοκύστεων σε κάθε κλάσμα έγινε με δείγματα διήθησης διαμέσου ενός 0,4 μm 25 mm μαύρα πολυανθρακικό φίλτρο. Στη συνέχεια, ένα DFA έγινε με φίλτρο, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Το σύνολο του ηθμός στη συνέχεια τοποθετείται πάνω σε ένα γυάλινο πλακίδιο με Citifluor στερέωσης μέσο (Biovalley). Ωοκύστες παρόντες σε όλη την επιφάνεια του φίλτρου μετρήθηκαν (σε μεγέθυνση 400) με χειροκίνητη σάρωση σε μικροσκόπιο επιφθορισμού (Αχίορίαπ 2, Zeiss). Ο μέσος όρος των μολυσματικών ωοκυστών υπολογίζονται μετά από επαλήθευση των κλασμάτων απεικονίζεται στον Πίνακα 1.

Η

αποβολή ωοκύστεων.Τα αξιολόγηση

Για να αξιολογηθεί η ωοκύστη ρίχνοντας κατά τη διάρκεια του

Cryptosporidium

μόλυνση, προσφάτως απεκκρίνεται συλλέχθηκαν σφαιρίδια των κοπράνων τρεις φορές την εβδομάδα. Κάθε ποντικός μεταφέρθηκε σε ένα άτομο καθαρό κλουβί κατά την διάρκεια 30-60 λεπτών. Περιττώματα τοποθετήθηκαν σε ένα μικροσωλήνα και σταθμίζονται πριν από την προσθήκη και ομογενοποίηση σε αποστειρωμένο νερό MilliQ. Η ανίχνευση και ποσοτικοποίηση της ωοκύστης σκόρπισμα έγιναν με ανοσο-μαγνητικού διαχωρισμού (IMS) χρησιμοποιώντας Dynabeads αντι-

Cryptosporidium

kit (Invitrogen, Cergy Pontoise, Γαλλία) σύμφωνα με τη σύσταση προμηθευτή και όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8] , [10]. Η αναστολή ωοκύστεων ήταν καθορίζουν σε διαφάνειες ανοσοφθορισμού, και να επισημαίνονται με ένα συζευγμένο με FITC αντι-

Cryptosporidium

μονοκλωνικό αντίσωμα (Cellabs Pty.Ldt., Croissy-Beaubourg, Γαλλία). Καταμέτρηση ωοκυστών διεξήχθη σε όλη την επιφάνεια του κάθε φρεάτιο σε μεγέθυνση χ 400 και ο αριθμός των παρασίτων εκφράστηκε ανά γραμμάριο κοπράνων. Μολυσματικότητα εκφράστηκε ως το ποσοστό των ζώων που μολύνθηκαν σε κάθε δόση.

Η ιστολογική ανάλυση και ανοσοϊστοχημεία

Σε τακτά χρονικά διαστήματα ή όταν εμφανίστηκαν σημάδια επικείμενου θανάτου, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 εισπνοής . Στομάχι και ειλεοτυφλική περιοχές αφαιρέθηκαν από κάθε ποντικό, σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Τμήματα των 5 μm πάχους βάφτηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (Leica Autostainer-XL, Rueil-Malmaison, Γαλλία) ή να χρησιμοποιηθούν για ανοσοϊστοχημεία.

Οι βλάβες σε διάφορα σημεία βαθμολογήθηκαν σύμφωνα με την «ονοματολογία για ιστολογική αξιολόγηση της Εντερική οι όγκοι στα τρωκτικά «, και σε σύγκριση με την» κατάταξη της Βιέννης «των επιθηλιακών νεοπλασιών του γαστρεντερικού σωλήνα για τον άνθρωπο», όπως προηγουμένως με ελαφρές τροποποιήσεις [8], [10]. Εν συντομία: 0, δεν βλάβη? 1, φλεγμονή ή /και την αναγεννητική αλλαγές? 2, χαμηλής ποιότητας ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας (LGIEN)? 3, υψηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (HGIEN), καρκίνωμα in situ (περιορίζονται στην επιθήλιο) ή εντός του βλεννογόνου αδενοκαρκινώματος (εισβολή μέσα στον ίδιο υμένα μέσω της βασικής μεμβράνης των αδένων). 4, αδενοκαρκίνωμα υποβλεννογόνια όταν αδένες διεισδύσουν μέσω του βλεννογόνου muscularis? 5, διηθητικό αδενοκαρκίνωμα με την εισβολή μέσω των muscularis στο subserosa.

Οι ακόλουθες ιστοχημικές και ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της μονάδας BenchMark χρώσης XT (Ventana ιατρικό σύστημα, Meylan, Γαλλία).

ο λεκές Volgens-Gomori (ρετικουλίνη) [13] χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της ακεραιότητας της βασικής μεμβράνης. Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού για κυτοκερατίνη (μη αραιωμένο) (AM071-5 Μ? Biogenex, Ολλανδία) χρησιμοποιήθηκε για να σηματοδοτήσει επιθηλιακά κύτταρα. μυϊκές ίνες χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-άλφα λείου μυός ακτίνης (αραίωση 1:100) (M0851? Dako, Δανία). Οι τομές εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Leica DMRB εξοπλισμένο με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Leica συνδέεται με ένα σύστημα Imaging Research MCID ανάλυση (λογισμικό MCID, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο).

Ποσοτικοποίηση των παρασίτων σε ιστό ποντικού

εξαγωγή DNA από δείγματα ιστών εγκλεισμένων σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη.

παραφίνης embeded ιστούς από ειλεοτυφλική περιοχή από 17 ποντικούς ήταν διαθέσιμα για μοριακή ανάλυση. DNA εκχυλίστηκε από ένα μίγμα 2 τμήματα 25 μm από κάθε μπλοκ ιστού. Ιστολογικές τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση ξυλόλιο και αιθανόλη για την αφαίρεση παραφίνη και κατόπιν επανυδατώθηκαν. Να διαταράξουν την ωοκύστες, τα δείγματα καταψύχθηκαν (-80 ° C, 5 λεπτά) και αποψύχθηκε (99 ° C, 4 λεπτά) έξι φορές και ήταν επιτέλους σε υπερήχους κατά τη διάρκεια 1 λεπτού. DNA στη συνέχεια εκχυλίσθηκε χρησιμοποιώντας τον ιστό NucleoSpin (Machery Nagel, Düren, Germany) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή εκτός του ότι η πέψη με πρωτεϊνάση Κ διεξήχθη όλη τη νύχτα.

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR (qPCR) δοκιμασίες.

αναπτύχθηκαν δύο συστήματα TaqMan: το

Cryptosporidium

δοκιμασία Taqman και η δοκιμασία Taqman ποντίκι in-house. Η εκκινητές και TaqMan ανιχνευτής που χρησιμοποιήθηκε για το

Cryptosporidium

δοκιμασία qPCR ήταν αυτές που αναφέρθηκαν από Fontaine και Guillot (2002) [14] η οποία τοποθετείται μέσα σε μια συγκεκριμένη ακολουθία bp 452 (αριθμός πρόσβασης GenBank AF188110) που υπάρχει σε ένα μόνο αντίτυπο στην το γονιδίωμα. Οι εμπρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές ενίσχυσαν ένα θραύσμα 138 bp. Το φθορίζον ανιχνευτής TaqMan σημάνθηκε στο 5 ‘άκρο με 6-καρβοξυ-fluorescine (FAM) χρωστική αναφοράς και στο 3′ άκρο με τη μαύρη τρύπα απόσβεσης 1 χρωστική (BHQ-1). Για τη δοκιμασία Taqman ποντίκι, ο στόχος ήταν η β-ακτίνης γονίδιο (GenBank αριθμός πρόσβασης AC144818), ένα γονίδιο housekeeping μονού αριθμού αντιγράφων. Η προς τα εμπρός (5’-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3 ‘) και ανάστροφα (5′-CTGAGAAGCTGGCCAAAGAGA-3′) σχεδιάστηκαν εκκινητές για την ενίσχυση ενός θραύσματος 68-pb. Το φθορίζον ανιχνευτής TaqMan (5’-CCCAGGTCAGTATCCCGGGTAACCC-3 ‘) σημάνθηκε στο 5’ άκρο με εξαχλωρο-6-καρβοξυ-φλουορεσκεΐνη (hex) χρωστική αναφοράς και στο 3 ‘άκρο με την BHQ-1 απόσβεσης χρωστική.

κάθε ενίσχυση πραγματοποιήθηκε σε ένα 25 μΙ μείγμα αντίδρασης που περιείχε 1 × iQ ™ Supermix (Bio-Rad, Γαλλία), 400 ηΜ του κάθε

Cryptosporidium

εκκινητή ή 200 ηΜ του κάθε εκκινητή ακτίνης, 100 nm του

Cryptosporidium

ανιχνευτή ή 50 ηΜ του βήτα-ακτίνης διερευνητή και 5 μΐ δείγματος DNA. Οι αντιδράσεις qPCR εκτελέστηκαν σε Rotor-Gene 6000 όργανο (Corbett Research, Qiagen, Γαλλία) και περιελάμβανε μια αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 15 λεπτά που ακολουθείται από 49 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C κατά τη διάρκεια 15 s και ανόπτηση /επέκταση στους 60 ° C κατά τη διάρκεια 1 λεπτού. απόκτηση φθορισμού έγινε αμέσως μετά από κάθε βαθμίδα ανόπτησης /επέκτασης.

Όλα τα δείγματα μετρήθηκαν εις τριπλούν σε κάθε δοκιμασία και αρνητικοί μάρτυρες χωρίς μήτρα συμπεριλήφθηκαν σε κάθε εκτέλεση PCR. Προκειμένου να παρακάμψει την επίδραση των αναστολέων της PCR, κάθε εκχυλίσματος DNA ελέγχθηκε καθαρό ή αραιωμένο 10 και 100 φορές. Ενίσχυση και ανάλυση δεδομένων έγιναν με το 6000 Λογισμικό Rotor-Gene.

πρότυπα Ποσοτικοποίηση και ομαλοποίηση των παρασίτων στους ιστούς.

Ειδικά εξωτερικά πρότυπα κατασκευάστηκαν για αμφότερα τα γονίδια στόχο ενδιαφέροντος με κλωνοποίηση του θραύσματος σε ένα πλασμίδιο. Οι

Cryptosporidium

και ιστών πρότυπες καμπύλες στη συνέχεια δημιουργήθηκαν από έξι διαδοχικές αραιώσεις του πλασμιδιακού DNA με γνωστές ποσότητες αριθμούς αντιγράφων εισόδου σε κάθε αντίδραση. Γραμμική παλινδρόμηση της σειράς αραίωσης πρότυπα και υπολογισμός του αντίστοιχου R

2 τιμές πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Rotor-γονιδίου. Ακρίβεια της απόλυτης ποσοτικοποίηση βασίζεται στην υπόθεση ότι αποτελεσματικότητες ενίσχυσης DNA είναι παρόμοιες μεταξύ του προτύπου και των δειγμάτων που ελέγχθηκαν. Για να δοκιμαστεί μια πιθανή επιρροή του πλασμιδιακού DNA σε γενωμικό DNA ποσοτικοποίηση, γραμμικότητα και αποδοτικότητα των δύο προσδιορισμών qPCR αξιολογήθηκαν επίσης με τόσο γονιδιωματικό

Cryptosporidium

και DNA ποντικού. Ο αριθμός των

Cryptosporidium

γονιδίωμα και βήτα-ακτίνης αντίγραφα του γονιδίου ποντικού σε αντιδράσεις ενίσχυσης υπολογίζεται αυτόματα από το λογισμικό σε σχέση με τις εξωτερικές πρότυπες καμπύλες πλασμιδιακό. Για την ακριβή σύγκριση των παρασιτική λοίμωξη σε δείγματα ιστού, η ποσότητα του συνολικού DNA ξενιστή σε κάθε δείγμα ομαλοποιήθηκε με TaqMan qPCR του γονιδίου βήτα-ακτίνης ποντικού. Ως εκ τούτου, Ποσοτικά στοιχεία παράσιτο βάρος εκφράστηκε ως η αναλογία του

Cryptosporidium

αριθμό γονιδιώματος πάνω από τον αριθμό γονιδίωμα του ποντικού για κάθε δείγμα. Ωστόσο, για ευκολότερη σύγκριση μεταξύ των δειγμάτων, οι διακυμάνσεις του φορτίου δείγματος διορθώθηκαν με την ομαλοποίηση του

Cryptosporidium

γονιδίωμα αντίτυπα σε 10

6 beta-ακτίνη αντίγραφα.

Η στατιστική ανάλυση

ακριβής δοκιμασία Fisher (two-tailed) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση μολυσματικότητας (συγκρίνοντας τις ομάδες που έχουν μολυνθεί με δόσεις κατώτερες έως 10 ή ανώτερη από 10 ωοκύστες) ή φορτία παρασίτου σε ιστούς. Μια ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) διεξήχθη για να λαμβάνονται υπόψη οι επιδράσεις των σχετικών παραγόντων (εμβόλια, ημέρα Ρ.Ι.) και οι αλληλεπιδράσεις τους στην καθημερινή απέκκριση ωοκυστών. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με το στατιστικό λογισμικό Graphpad. Η σημαντικότητα ορίστηκε ως Ρ & lt? 0,05

Αποτελέσματα

Προκειμένου να αξιολογηθεί η μόλυνση επιδεκτικότητα ποντικών που προκλήθηκαν με βαθμονομημένο αιωρήματα που περιέχουν διαφορετικές δόσεις επιδιωκόμενο, το ποσό της ωοκύστης στα κόπρανα υπολογίζεται περιοδικά.. Όλες οι χορηγούμενες δόσεις που περιέχουν διαφορετικές ποσότητες ωοκυστών αποκαλύφθηκε για να είναι μολυσματικά για Dex-αγωγή ποντικούς SCID αλλά αυξάνοντας τις δόσεις ωοκυστών να οδηγήσει σε αύξηση του επιπέδου του μολυσματικότητα (Ρ = 0,01). Δύο από 7 ποντικούς (28,5%) εμβολιάστηκε με προβλεπόμενη δόση 1 ωοκύστεων, 6/8 ποντικούς (75%) που λαμβάνει προβλεπόμενη δόση 10 ωοκύστες, και όλα τα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με τον προορισμό δόσεις των 10

2 και 10

5 βιώσιμες ωοκύστες αναπτύξει χρόνια λοίμωξη μέχρι την ευθανασία (45-100 ημέρες ΡΙ). Κανένας από τους ποντικούς-αρνητικούς μάρτυρες απορρίπτονται ωοκύστεων μετά εμβολιασμό από του στόματος είτε με PBS ή 10

5 θερμοαπενεργοποιημένο ωοκύστες (Πίνακας 1).

Το μοτίβο της ωοκύστης απόπτωση των διαφόρων ομάδων φαίνεται στο Σχ. 1. Κατά την ημέρα 7 Ρ.Ι. ωοκύστης αποβολή ανιχνεύθηκε σε ποντίκια από τις ομάδες 2, 3 και 4 (προκλήθηκαν με 10, 100 και 10

5 ωοκύστες), αλλά όχι σε ζώα από την ομάδα 1 (προκλήθηκαν με μία ωοκύστη). Παράσιτο αποβολή των ζώων από αυτή την τελευταία ομάδα ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά μετά από 15 ημέρες Ρ.Ι. ANOVA ανάλυση ολόκληρου του συνόλου δεδομένων έδειξε ότι η ημέρα Ρ.Ι. και το μέγεθος εμβολίου επηρεάζουν σημαντικά τις γεωμετρικές μέσες τιμές της ωοκύστης sheding (Ρ = 0,02 και 0,005, αντίστοιχα): σε 75 ημέρες ΡΙ, ποντίκια που εμβολιάστηκαν με τον προορισμό δόσεις των 1, 10, 100 και 10

5 ωοκύστες είχε ένα πολλαπλασιασμό των 3,3 , 3,25, 2,26 και 1,45 log αντίστοιχα σε σύγκριση με το αρχικό εμβόλιο. Μετά από 45 ημέρες μετά τη μόλυνση, όλες οι ομάδες ποντικών έχουν μέση τιμή ωοκύστης ρίχνοντας ανώτερη 10.000 ωοκύστεων /g επιβεβαιώνοντας το υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού της ανάπτυξης του παρασίτου σε χαμηλότερες δόσεις.

Πειραματικές ομάδες εμβολιάσθηκαν με τον προορισμό δόσεις του 1 , 10, 100 και 10

5 ωοκύστες. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει ένα ποντίκι, οι γραμμές είναι οι γεωμετρικές μέσες τιμές της ωοκύστης ρίχνοντας ανά ομάδα. Μόνο τα ζώα με ωοκύστεων ρίχνοντας σε μια συγκεκριμένη στιγμή της ημέρας εκπροσωπούνται. Κανένας από ποντίκια μολυσμένα με ένα ωοκύστη απελευθερώνονται παράσιτα μέχρι την ημέρα 15 (βλέπε υλικά και μεθόδους για την αποβολή ωοκύστης εκτίμηση).

Η

Μετά την ιστολογική εξέταση των ιστών, γαστρεντερικές νεοπλασματικές αλλοιώσεις (Πίνακας 1) παρατηρήθηκαν σε όλες Dex κατεργασμένα SCID ποντίκια που έχουν μολυνθεί από τον

C. parvum

, ανεξάρτητα από το εμβόλιο (Σχήμα 2).

Α. Διηθητικό αδενοκαρκίνωμα του antropyloric περιοχής (βέλη) σε ένα ποντίκι 100 ημέρες μετά την έγχυση .. Bar = 1,250 μm (αιματοξυλίνη και ηωσίνη). Β διηθητικό αδενοκαρκίνωμα του antropyloric περιοχής σε ένα ποντίκι 100 ημέρες Ρ.Ι. δείχνοντας παράσιτα στο εσωτερικό των αδένων (βέλη). Bar = 50 μm (αιματοξυλίνη και ηωσίνη). Γ αδένωμα της ειλεοτυφλική περιοχή σε ένα ποντίκι 45 ημέρες Ρ.Ι .. Bar = 625 μm. Δ Υψηλής ποιότητας ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας στην περιοχή ειλεοτυφλική σε ένα ποντίκι 45 ημέρες μετά τον εμβολιασμό με πολυάριθμα παράσιτα (βέλος) στο εσωτερικό των αδένων. Bar = 25 μm (αιματοξυλίνη και ηωσίνη).

Η

Στο στομάχι, νεοπλασματικές αλλοιώσεις εντοπίζονται στο antropyloric περιοχή και είχαν εντοπιστεί ήδη από την ημέρα 45 Ρ.Ι. σε όλες τις ομάδες των ποντικών που έχουν μολυνθεί. Την ημέρα 45 Ρ.Ι. Αυτές οι βλάβες χαρακτηρίστηκαν ως χαμηλής ποιότητας νεοπλασία ενδοεπιθηλιακή (LGIEN) ή επεμβατική αδενοκαρκινώματος για τις ομάδες 1 και 2, και ως υψηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (HGIEN) ή επεμβατική αδενοκαρκινώματος για τις ομάδες 3 και 4 (Πίνακας 1). Την ημέρα 100 ΡΙ, παρατηρήσαμε την παρουσία του αδενοκαρκινώματος του submucosa εισβάλλουν στην εξωτερική στοιβάδα muscularis στην Άντρο-pylorique περιοχή ενός ποντικού εμβολιάσθηκαν με ένα μόνο ωοκύστη (Σχήματα 2Α, 2Β).

Στο ileo- τυφλού περιοχή, με τον προορισμό δόσεις των 1 και 10 ωοκυστών polypoid βλεννογόνο (αδένωμα) που περιέχει LGIEN και HGIEN αλλοιώσεων παρατηρήθηκε αντίστοιχα σε 45 και 100 ημέρες ΡΙ (Σχήματα 2C, 2D). Με μεγαλύτερες εμβόλιο (100 ωοκύστες) HGIEN παρατηρήθηκε νωρίτερα (ημέρα 45 Ρ.Ι.). χρώση ρετικουλίνη και κυτοκερατίνη ανοσο-επισήμανση επέτρεψε την επιβεβαίωση της HGIEN: παρατηρήθηκε μια κατακερματισμένη βασική μεμβράνη και νεοπλασματικά επιθηλιακά κύτταρα στο propia ελάσματος. Οι αλλαγές αυτές, οι οποίες είναι τυπικές της εντός του βλεννογόνου αδενοκαρκινώματος, παρατηρήθηκαν σε ποντίκια της ομάδας 3, μετά από μόνο 80 ημέρες ΡΙ. Νεοπλασματικές αλλοιώσεις φάνηκε να είναι πιο σοβαρή στο στομάχι σε σχέση με την περιοχή ειλεοτυφλική.

Για την ποσοτική ανάλυση του

Cryptosporidium

DNA σε ειλεοτυφλική ιστούς, επελέγησαν 17 ποντικοί. Οι πρότυπες καμπύλες που δημιουργούνται τόσο για

Cryptosporidium

και βήτα-ακτίνη έδειξε επαναλήψιμη γραμμική σχέση μεταξύ της τιμής Ct και το μετασχηματισμένο log αριθμό των αντιγράφων πάνω σχεδόν πέντε τάξεις μεγέθους αραίωσης DNA. συντελεστής συσχέτισης που λαμβάνεται με ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ήταν R

2 = 0.99 τόσο για

Cryptosporidium

και το ποντίκι πλασμίδια. αποδοτικότητες ενίσχυση του DNA ήταν 99% για το

Cryptosporidium

και 89% για το ποντίκι. Πρότυπες καμπύλες πραγματοποιήθηκαν επίσης με

Cryptosporidium

γενωμικού DNA, καθώς και γονιδιωματικό DNA ποντικού. Και για τα δύο, σχεδιάζοντας τις τιμές δέλτα Ct (Ct πλασμιδιακού DNA – Ct γονιδιωματικό DNA) έναντι του λογαρίθμου των παραγόντων αραίωσης οδήγησε σε κλίση της καμπύλης μικρότερη από 0,1 (δεδομένα δεν δείχνονται), καταδεικνύοντας ότι το πλασμίδιο DNA θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την ποσοτικοποίηση γενωμικού DNA .

ο αριθμός των

Cryptosporidium

και η ποσότητα του μυϊκού DNA που υπάρχει σε κάθε δείγμα ποσοτικοποιείται με παρεμβολή από τις αντίστοιχες τιμές Ct στις τυπικές καμπύλες για

Cryptosporidium

DNA και για το γονίδιο της β-ακτίνης ποντικού. Τα επίπεδα του παρασίτου DNA σε ιστούς που μελετήθηκαν ζώα φαίνονται στον Πίνακα S1. Συνολικά, 14 από τα 15 που μελετήθηκαν εμβολιάστηκαν τα ποντίκια αποικιστεί με

Cryptosporidium

.

Το φορτίο του παρασίτου σε ιστούς των ποντικών που εμβολιάστηκαν με το υψηλότερο εμβόλιο (10

5) ήταν υψηλότερες σε σύγκριση με ποντίκια που εμβολιάστηκαν με χαμηλές δόσεις (≤100 ωοκύστες) (p & lt? 0.001). Ωστόσο, κατά τη σύγκριση φορτία ιστός συγχρόνως Ρ.Ι. (45 ημέρες) μεταξύ της χαμηλότερης και της μέγιστης εμβόλιο, το ποντίκι Αρ 12, εμβολιάστηκαν με 100.000 φορές περισσότερο από ό, τι ωοκύστες Ν ποντίκι ° 1, είχε μόνο 3,6 φορές περισσότερο παράσιτο φορτία. Όχι

Cryptosporidium

DNA βρέθηκε σε ένα ποντίκι (Ν ° 7) εμβολιάστηκαν με 10 ωοκύστες (Πίνακας S1). Αυτό το ποντίκι αναπτύχθηκε ούτε μόλυνση ούτε νεοπλασματικές αλλοιώσεις, όπως επιβεβαιώνεται και από την IMS-DFA.

Για 6 δείγματα, η

Cryptosporidium

qPCR δεν ήταν θετική για όλες τις 3 επαναλήψεις υποθέτοντας μια κατανομή Poisson του προτύπου, όταν ανίχνευση πολύ χαμηλούς αριθμούς αντιγράφων του στόχου. Για αυτά τα δείγματα, οι λαμβανόμενες τιμές Ct ήταν μεταξύ 39 και 40 σημαίνει ότι η αντίδραση PCR περιείχε θεωρητικά 1 αντίγραφο γονιδιώματος. Στην πραγματικότητα, το όριο ανίχνευσης της ανάλυσης επιτεύχθηκε και δεν μπορούσαμε να επιχειρήσουμε ποσοτικοποίηση με ένα αποδεκτό επίπεδο ακρίβειας και αξιοπιστίας. Τρέχει του

Cryptosporidium

qPCR δοκιμάστηκαν με δείγματα σε χαμηλότερο σημείο αραίωση προκειμένου να επιτύχει χαμηλότερες τιμές Ct. Απίθανο, αυτοί δεν είχαν επικυρωθεί οφείλεται σε αρνητικό αποτέλεσμα PCR (απουσία CT) ή επειδή οι μέσες μετατοπίσεις στην Ct δεν παράγει την αναμενόμενη μεταβολή (σέβεται το 10-πλάσια αραίωση).

Οι ιστολογικές αλλοιώσεις ήταν πάντα που σχετίζονται με η παρουσία παρασίτων όπως παρατηρήθηκε με μικροσκοπία (Σχήματα 2Β, 2D) και qPCR (Πίνακας S1). Η ανίχνευση DNA των παρασίτων μέσω qPCR επιβεβαιώνει ότι ακόμα και ποντίκια με χαμηλότερο παράσιτα φορτία στους ιστούς είχε νεοπλασματικές αλλοιώσεις. Ούτε παράσιτα ούτε βλάβες εντοπίστηκαν σε αρνητικό ομάδες ελέγχου (ποντίκια που εμβολιάστηκαν με PBS χωρίς παράσιτα ή με θερμικά απενεργοποιημένο ωοκύστες) (Πίνακες 1, S1).

Συζήτηση

Τα παρόντα ευρήματα αποκαλύπτουν ότι Dex κατεργασμένα ποντίκια SCID είναι ευαίσθητα σε μόλυνση με εξαιρετικά χαμηλή

C. parvum

μεγέθη εμβόλιο του 1 και 10 ωοκύστες. Αυτά εμβολιάσθηκαν βαθμονομημένη δόσεις αξιολογήθηκαν αρκετές φορές με μικροσκοπική παρατήρηση (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι και Πίνακας 1). Αυτό το ζωικό μοντέλο Dex αγωγή SCID ποντίκια αποκάλυψε ότι έχει υψηλή ευαισθησία σε

C. parvum

μόλυνση και θα μπορούσε να είναι πολύ χρήσιμη για την αξιολόγηση της παρουσίας αυτού του παρασίτου σε κλινικά ή περιβαλλοντικά δείγματα στα οποία ωοκύστεις ποσοστά μπορεί να είναι πολύ χαμηλή (π.χ. νερό της βρύσης, βρώσιμα λαχανικά, έντομα).

σύγκριση μας αποτελέσματα με στοιχεία που αναφέρθηκαν προηγουμένως για ένα άλλο ζωικό μοντέλο κορτικοειδούς αγωγή ποντικών C57BL /6N μολυνθεί με ένα ωοκύστη από το ίδιο

C. parvum

Αϊόβα απομονώσει [15]. Βρήκαν 17% της μολυσματικότητας μετά τον εμβολιασμό με μία μόνο ωοκυστών σε σύγκριση με 29% στη μελέτη μας [15]. Όπως συζητήθηκε επίσης αυτοί οι συγγραφείς, διαφορετικούς λόγους μπορεί να εξηγήσει το γεγονός ότι δεν είναι κάθε ποντίκι μολύνθηκαν με ένα μόνο παράσιτο [15]: η ωοκύστη δεν ήταν παρούσα στο εμβόλιο λόγω της μεθόδου σειριακής αραίωσης, η ωοκύστη θα μπορούσε να παραμείνει μέσα στο σωλήνα τροφοδοσίας μετρητή κατά τη διάρκεια του εμβολιασμού, η ωοκύστη δεν ήταν σε θέση να φτάσει στο έντερο ή δεν ήταν βιώσιμη τη στιγμή του εμβολιασμού (ποσοστό βιωσιμότητας 50% μετρήθηκε στο εναιώρημα απόθεμα).

Επιπλέον, στα ζώα μελέτη μας αμφισβητηθεί με χαμηλό εμβόλιο που αναπτύχθηκε χρόνια λοίμωξη και να ρίξει ωοκύστες χωρίς σταθερή ή μείωση φάση μέχρι το τέλος του πειράματος.

το μοντέλο της ανοσοκαταστολή C57BL /6 ενήλικου ποντικού [15] εξετάστηκε επίσης για τη διάδοση του

ΝΤΟ. meleagridis

(είδη από πουλιά) και 50% των ποντικών που προκλήθηκαν με ένα μόνο

C. meleagridis

ωοκύστεων μολύνθηκαν [16]. Ωστόσο, παρά την βαθιά ανοσοκαταστολή της SCID ποντίκια, ενισχύεται περαιτέρω από Dex χορήγηση, τα ζώα αυτά ήταν προφανώς μη ευπαθή σε απομονωμένα στελέχη άλλων

Cryptosporidium

είδη όπως

C. meleagridis

(αδημοσίευτες παρατηρήσεις),

C. hominis

(από τον άνθρωπο) ή

C. molnari

(από το ψάρι

Sparus auratus

) [10]. Έτσι, όπως έχει περιγραφεί για άλλες ευκαιριακές παρασιτικές ασθένειες, ανοσοκαταστολή θα μπορούσε να είναι όχι αρκετά για να σπάσει το φράγμα των ειδών (ή εξειδίκευση ειδών ξενιστών) [17].

Ωστόσο, το πιο εντυπωσιακό παρατήρηση της παρούσας εργασίας είναι η απόδειξη ότι η μόλυνση με χαμηλές δόσεις, ακόμη και με ένα μόνο ωοκύστη από

C. parvum

μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη του πεπτικού επεμβατική αδενοκαρκινώματος. Αποδείξαμε πριν από αυτό το μοντέλο μας του Dex-αγωγή SCID ποντίκια ήταν χρήσιμο να αξιολογηθεί η ικανότητα του

C. parvum

να επάγει αδενοκαρκίνωμα του πεπτικού σε ζώα που εμβολιάστηκαν με δόσεις μεταξύ των 10

5 και 10

8 ωοκύστες [7], [8], [10], αλλά ο ελάχιστος αριθμός ωοκύστεων ικανά να επάγουν αυτό το είδος των αλλοιώσεων δεν ήταν γνωστό μέχρι τώρα. Στην πραγματικότητα, δεδομένου ότι στο παρελθόν παρατηρήθηκε, μετά τη μόλυνση με υψηλότερο εμβόλια (10

5-10

7) του

C. parvum

στέλεχος Αϊόβα [7], [10], στις νεοπλασματικές αλλοιώσεις παρούσα μελέτη (LGIEN και HGIEN) ανιχνεύθηκαν ήδη από την ημέρα 45 Ρ.Ι. τόσο στο στομάχι και στο ειλεοτυφλική περιοχή του Dex αγωγή SCID ποντίκια που προκλήθηκαν με προορίζεται δόσεις των 100, 10 ή ακόμη και ένα ωοκύστη, και οι βλάβες αυτές θα μπορούσαν επίσης να εξελιχθεί σε μια επεμβατική αδενοκαρκινώματος προχωρούν μέσω όλων των στιβάδων του στομάχου και ειλεοτυφλική περιοχή.

με συνέπεια, παρατηρήσαμε ότι στα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με χαμηλή εμβόλια την απέκκριση παράσιτο αυξήθηκαν γρήγορα, φθάνοντας κατά μέσο όρο ωοκύστεων ρίχνοντας πάνω από 10.000 ωοκύστεων /g κοπράνων σε 45 ημέρες ΡΙ. φαίνεται ότι τα λίγα ωοκύστες εμβολιάστηκαν σε ποντίκια είχε ένα σημαντικό πολλαπλασιασμό, και ότι η αύξηση της ωοκύστης εμβολιάζονται δόσεις αυξήσουν το επίπεδο της μολυσματικότητας, αλλά όχι κατ ‘ανάγκη η απόπτωση των παρασίτων και η παθολογική αποτέλεσμα.

σε πειραματικές λοιμώξεις ζώων ανοσοεπαρκών, διαφορετικές παρατηρήσεις έχουν έχουν αναφερθεί. Στα βοοειδή, μετά τον εμβολιασμό με τόσο λίγο όσο μία ερυθρών αιμοσφαιρίων που έχουν μολυνθεί με το

Babesia bovis

, ένα άλλο apicomplexan παράσιτο, υπήρξε μια αύξηση στην λανθάνουσας περιόδου (όπως παρατηρήσαμε επίσης), αλλά η υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα των ζώων δεν μεταβλήθηκε σε σύγκριση με εκείνα που μολύνθηκαν με την υψηλότερη εμβόλια [18]. Αυτά τα ευρήματα είναι σε αντίθεση με εκείνους για τις μολύνσεις με την haemoparasite

Theileria parva

, όπου η μόλυνση των βοοειδών με χαμηλό εμβόλιο οδήγησε σε μειωμένη σοβαρότητα της ασθένειας και χαμηλότερη θνησιμότητα [19]. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε μελέτες του

Eimeria

μόλυνση των κοτόπουλων και αρουραίους, ήταν ιδιαίτερα αξιοσημείωτο ότι με τη μεγαλύτερη δόση μολυσματικός, ο αριθμός των ωοκύστεων που παράγονται ανά ωοκύστη εμβολιάστηκαν ήταν μικρότερη [20].

Στις από την άλλη πλευρά, σε προηγούμενη μελέτη μας, η ωοκύστη ρίχνοντας μετά τον εμβολιασμό με 10

5 ωοκύστες ήταν πολύ υψηλότερο [8].