Abstract

Η σημασία της οδού Piwi αλληλεπιδρώντα RNA (Pirna) για τη συντήρηση των γεννητικών κυττάρων, την ακεραιότητα του γονιδιώματος, μεθυλίωση DNA και τον έλεγχο ρετρομεταθετόνιων εγείρει πιθανοί ρόλοι αυτού του μονοπατιού στον καρκίνο. Πράγματι παρεκκλίνουσα έκφραση της ανθρώπινης ορθόλογα PIWI και

Maelstrom

έχει παρατηρηθεί σε διάφορους καρκίνους. Σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε την έκφραση και τη λειτουργία των γονιδίων οδού Pirna στον ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών, με βάση την πρόσφατη εργασία μας, η οποία έδειξε εκτεταμένη έκφραση των γονιδίων οδού Pirna στο θηλαστικών. εργασία παραστάσεις μας που

PIWIL1

και

MAEL

έκφραση είναι σημαντικά αυξημένη σε κακοήθη EOC (n = 25) σε σύγκριση με καλοήθη ιστούς όγκου (n = 19) και φυσιολογικό ωοθηκικό ιστό (n = 8) . Η έκφραση του

PIWIL3

είναι χαμηλότερη σε κακοήθεις και καλοήθεις ιστούς σε σύγκριση με την κανονική ωοθήκη. Αλληλούχιση του

PIWIL1

μεταγραφή απεκάλυψε ότι σε πολλούς όγκους διαγραφή του εξωνίου 17 οδηγεί στην εισαγωγή ενός πρόωρου κωδικονίου στοπ στο πεδίο PIWI, πιθανόν να οφείλεται σε σφάλμα ματίσματος.

In situ υβριδισμού

σε τμήματα του όγκου αποκάλυψε ότι

L1

,

PIWIL1

,

2

και

MAEL

είναι ειδικά εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα (καρκινικά κύτταρα) του EOC. Επιπλέον,

PIWIL2

και

MAEL

συν-εκφράζονται στα στρωματικά κύτταρα γειτονικά κύτταρα όγκου. Δεδομένου ότι

PIWIL1

και

MAEL

είναι μέχρι ρυθμίζονται σε κακοήθεις EOC και εκφράζονται στα επιθηλιακά κύτταρα, ερευνήσαμε αν αυτά τα δύο γονίδια επηρεάζουν διεισδυτικότητα των καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών που συνήθως δεν εκφράζουν αυτά τα γονίδια.

PIWIL1

και

MAEL

ήταν παροδικά πάνω εκφράζονται στην κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών SKOV3, ακολουθούμενη από μετρήσεις σε πραγματικό χρόνο του κυττάρου διεισδυτικότητα. Παραδόξως και τα δύο

PIWIL1

και

MAEL

υπερέκφραση μείωσε την ικανότητα εισβολής των κυττάρων SKOV3. Τα ευρήματά μας υποστηρίζουν ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία που δείχνουν ότι τα γονίδια σε αυτό το μονοπάτι αυξητικά στον καρκίνο. Στον καρκίνο των ωοθηκών δείχνουμε για πρώτη φορά ότι

Piwil1

μεταγραφή μπορεί συχνά να είναι μη φυσιολογικό αποτέλεσμα σε μη λειτουργικό προϊόν. Σε αντίθεση με ό, τι έχει παρατηρηθεί σε άλλους τύπους κυττάρων, βρήκαμε ότι

PIWIL1

και

MAEL

έχουν κατασταλτική επίδραση στο κύτταρο εισβολής

Παράθεση:. Lim SL, Ricciardelli C, Oehler ΜΚ, De Arao Tan IMD, Russell D, Grützner F (2014) Η υπερέκφραση του Pirna Διαδρομή γονίδια στο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 9 (6): e99687. doi: 10.1371 /journal.pone.0099687

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Ιαν 2014? Αποδεκτές: 19 Μαΐου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 16 Ιουνίου, 2014

Copyright: © 2014 Lim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Πανεπιστήμιο της Αδελαΐδας. F.G. υποστηρίζεται από μια υποτροφία ARC (Συμβούλιο Έρευνας της Αυστραλίας). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογικό καρκίνο, και η πέμπτη συχνότερη αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται μεταξύ των γυναικών στο δυτικό κόσμο [1]. Το σχετικό ποσοστό πενταετούς επιβίωσης για τις γυναίκες με καρκίνο των ωοθηκών είναι μόνο περίπου το 40% [1]. Των ωοθηκών καρκίνοι είναι ετερογενείς όγκοι που εμφανίζουν διακριτά μορφολογικά χαρακτηριστικά, γενετικές μεταλλάξεις και προέλευση. Υπάρχουν τρεις βασικοί τύποι καρκίνου των ωοθηκών – επιθηλιακών, των γεννητικών κυττάρων και φύλο στρωματικών όγκων του ομφάλιου λώρου. Ωοθηκών όγκους των γεννητικών κυττάρων και στρωματικών όγκων κορδόνι φύλο περιλαμβάνει το 10% των καρκίνων των ωοθηκών, και προέρχονται από πρωτόγονα ωοθηκών γεννητικά κύτταρα ή μεσεγχυματικά κύτταρα στο φύλο-καλώδιο προερχόμενου ιστού των ωοθηκών, αντίστοιχα [2]. EOCs αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το 90% των κακοηθειών των ωοθηκών. Βασισμένο σε EOCs ιστολογία κατατάσσονται σε τέσσερις κύριους υπότυπους (ορώδες, βλεννώδες, endometroid και σαφή καρκινώματα κυττάρων) με πάνω από το 70% των περιπτώσεων που διαγιγνώσκονται ως ορώδες καρκίνωμα (ΥΠ.Ε.Ε.) [3].

Μεταβολές της επιγενετικής τοπίου όπως η παγκόσμια υπομεθυλίωσης του DNA και γονιδίων ειδικών DNA υπερμεθυλίωση αναφέρονται συχνά σε καρκινικά κύτταρα [4]. Παγκόσμια υπομεθυλίωση του DNA επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό τις διαγονιδιακές και ιντρονικές περιοχές του γονιδιώματος, ειδικά επαναλάβετε ακολουθίες και μεταθετά στοιχεία (ΝΠ), οι οποίες αντιπροσωπεύουν περίπου το 55% του ανθρώπινου γονιδιώματος [5], συμπεριλαμβανομένου 17%

L1

επαναλαμβάνει [ ,,,0],6]. Σε σωματικά κύτταρα, μεθυλίωση του DNA του ΝΠ είναι ζωτικής σημασίας για την πρόληψη της έκφρασης τους, η οποία μπορεί να θέσει σε κίνδυνο την ακεραιότητα του γονιδιώματος. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των γεννητικών κυττάρων, υπάρχει μια παροδική περίοδο παγκόσμιας υπομεθυλίωσης DNA που έχει σαν αποτέλεσμα την προσωρινή ενεργοποίηση του ΝΠ [7].

Η οδός Pirna είναι εξελικτικά συντηρημένη σε μεγάλο βαθμό μετάζωα και αποτελείται από 21-26 nt piRNAs οποίες δεσμεύουν πρωτεΐνες PIWI να μεσολαβεί μετα-μεταφραστική έλεγχο της έκφρασης ΤΕ και παίζουν ένα ρόλο στην επιγενετικές αλλαγές (όπως DNA μεθυλίωση) μέσω αλληλεπίδρασης με άλλες πρωτεΐνες (όπως MAEL ή ΗΡ1) [8], [9]. Στα θηλαστικά υπάρχουν διάφορα

Piwi σαν

(

το Piwik

) γονίδια (τρεις σε ποντικούς, τέσσερα στον άνθρωπο). Η έκφραση του

το Piwik

γονιδίων και γονιδίων που σχετίζονται Pirna μονοπάτι έχει αποδειχθεί σε διάφορα στάδια της ανάπτυξης των γεννητικών κυττάρων, ιδίως σε όρχεις.

Piwil1

(

Miwi

) έχει ήδη χαρακτηριστεί ως ένα γονίδιο εκφράζεται αποκλειστικά σε όρχεις του ποντικιού και απαραίτητη για τη σπερματογένεση [10]. Πιο πρόσφατα έκφραση του

Piwil1

έχει επίσης καταδειχθεί σε ποντικού και ανθρώπου ωοθήκης [11]. Μετάλλαξη του

Piwil2

,

Piwil4

και

Mael

στο ποντίκι οδηγεί σε παρόμοιο φαινότυπο συμπεριλαμβανομένης της εξάλειψης των ΤΕ μεθυλίωσης του DNA και αρσενική στειρότητα [8]. Υπάρχουν πλέον όλο και περισσότερες ενδείξεις δραστηριότητας Pirna επίσης στην ωοθήκη θηλαστικών, ωστόσο νοκ-άουτ πειράματα γονιδιακής οδού Pirna σε ποντίκια μέχρι στιγμής έχει οδηγήσει μόνο στην ανδρική στειρότητα [12] – [14].

αποδείξεις υπάρχουν τοποθέτησης της δραστηριότητας της οδού Pirna σε διάφορους καρκίνους. Η έκφραση του

PIWIL1

και

PIWIL2

έχει βρεθεί σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκίνων όπως του στομάχου, του μαστού, του γαστρεντερικού σωλήνα και του ενδομητρίου [15] – [18] και πρόσφατα επίσης σε καρκίνωμα των ωοθηκών [19]. Αυξημένη έκφραση του

PIWIL1

σχετίζεται με αυξημένη ανάπτυξη του όγκου [20] αυξήθηκε τάξεων όγκου [21], η κακή διαγνωστικά αποτελέσματα [22] και της θνησιμότητας [23].

PIWIL2

εκφράζεται ευρέως σε πρώιμο στάδιο του μαστού και του τραχήλου της μήτρας και προ-καρκινικές βλαστικά κύτταρα που εμπλέκονται στην ογκογένεση [18]. Το πρότυπο έκφρασης του

PIWIL3

και

4

έχει μελετηθεί μόνο σε καρκίνους του παχέος εντέρου [24].

Maelstrom

(

MAEL

) είναι ένα γονίδιο γνωστό καρκίνο των όρχεων [25].

εύρημα μας έκφραση σε σωματικά κύτταρα των ωοθηκών [11] μαζί με μειωμένη μεθυλίωσης του DNA σε

L1

περιοχή προαγωγού που συνδέεται με την πρόοδο της τραχήλου της μήτρας και της μήτρας καρκίνους [26] και την κακή πρόγνωση σε καρκίνωμα ωοθήκης [27] μας οδήγησε να διερευνήσει κατά πόσον Pirna γονίδια οδού θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα ρόλο στην EOCs. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε την έκφραση του

PIWIL1

–

4

και

MAEL

σε 25 EOC, 19 δείγματα καλοηθών όγκων, και 8 φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών. Βρήκαμε σημαντικά αυξημένη έκφραση του

PIWIL1

και

MAEL

στην EOC σε σύγκριση με καλοήθεις και φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών. Ωστόσο,

PIWIL1

μεταγραφές στην EOC μπορεί να μην είναι λειτουργική λόγω διαγραφές που προσδιορίζονται στον τομέα PIWI αυτής της μεταγραφής. Επιπλέον, η υπερέκφραση του

PIWIL1

και

MAEL

προτείνει ένα ρόλο αυτών των γονιδίων στη μείωση των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα εισβολής

in vitro

.

Υλικά και Μέθοδοι

ιστοί

Ολικά RNAs από ανθρώπινους όρχεις και προ-εμμηνόπαυση ιστούς ωοθηκών αγοράστηκαν από την Stratagene (USA). Κακοήθεις, καλοήθεις και φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών (Πίνακας 1 και Πίνακας S3) συλλέχθηκαν με ενημέρωσε γραπτή συναίνεση του ασθενούς και την έγκριση από την επιτροπή δεοντολογίας του Royal Adelaide Hospital, Αδελαΐδα, Νότια Αυστραλία.

Η

τηλέφωνα γραμμές

ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών SKOV3 και OVCAR3 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, USA), ενώ OVCAR5 ελήφθη από τον Dr. Thomas Hamilton (Κέντρου Fox Chase Cancer, Philadelphia, ΡΑ) Johnson et al Cancer Res 57: 850-856 1997. οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσον RPMI 1640 συμπληρωμένο με L-γλουταμίνη (2 mM), πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (100 U /ml, 100 μg /ml) (Sigma). SKOV3 και OVCAR3 κύτταρα συμπληρωμένο με 5% FBS (Invitrogen), ενώ κύτταρα OVCAR5 συμπληρώθηκαν με 10% FBS και 7,5 μg /ml ινσουλίνη. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγρό θάλαμο με 5% CO

2.

απομόνωση RNA και σύνθεση cDNA

RNA απομονώθηκε από τους ιστούς και κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA επαναιωρήθηκε σε νερό χωρίς νουκλεάση, και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝάση Ι (New England Biolabs) πριν από την αντίστροφη μεταγραφή. 1 μg του RNA χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί cDNA χρησιμοποιώντας την III Σύστημα Super Script πρώτου κλώνου Synthesis (Invitrogen) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, RNA επωάστηκε με 1 μΐ 50 μΜ ολίγο (dT)

20 και 1 μΙ 10 mM dNTPs επί 10 λεπτά στους 65 ° C. Μετά την επώαση, 4 μ.λίτρα ρυθμιστικού διαλύματος 5χ RT, 2 μΙ διθειοθρεϊτόλης (DTT, 0,1 Μ), 1 μ.λίτρο RNaseOUT (40 U /μl) και 1 μΐ ενζύμου Super Script III RT (200 U /μΙ) προστέθηκαν και επωάστηκαν για 50 λεπτά σε 50 ° C. Η αντίδραση τερματίστηκε στους 85 ° C για 5 λεπτά. cDNAs φυλάχθηκαν στους -20 ° C.

αναλύσεις γονιδιακή έκφραση

RT-PCR πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το επίπεδο του mRNA για τα γονίδια πέντε Pirna οδού (Πίνακας S1) και βήτα ακτίνης (

ACTB

) σε 52 δείγματα ασθενών και 3 κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών. Κάθε 25 μΙ αντιδράσεως περιείχε 200 ng cDNA, 5 μΙ 5χ Go Taq Πράσινη Master Mix (Promega), 1 μΙ διαλύματος 5 mM dNTP (Roche), 0.5 μΐ του κάθε εκκινητή (20 pmol /μl) και 0.5 μΐ Taq DNA πολυμεράση. Οι συνθήκες PCR ήταν οι ίδιες για όλα τα γονίδια, εκτός από τη θερμοκρασία ανόπτησης (Πίνακας S1), και ήταν ως εξής: αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση σε συγκεκριμένη θερμοκρασία γονίδιο για 30 δευτερόλεπτα ( Πίνακας S1), επέκταση στους 72 ° C για 1 λεπτό, 32 κύκλοι. PCR του

ACTB

έλεγχος διεξήχθη με 27 κύκλους, που ακολουθείται από 5 λεπτά από τελική επέκταση στους 72 ° C. Τα προϊόντα PCR κατέστησαν ορατά σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1,5% που βάφτηκε με βρωμιούχο αιθίδιο. ένταση Band μετρήθηκε (Quantity One πρόγραμμα, Έκδοση 4, Bio-Rad), και η σχετική ένταση του κάθε γονιδίου κανονικοποιήθηκε με εκείνο του

ACTB

. Τα προϊόντα της PCR επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση (κιτ αλληλούχισης κύκλου v3.1 Big Dye Terminator, Applied Biosystems). RT-PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν για κάθε ζεύγος διεγερτών.

Στατιστικές αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως διάμεση σχετική έκφραση (πρώτη τεταρτημόριο σε τρίτες τεταρτημόριο). Το επίπεδο μεταγραφή του κάθε γονιδίου ομαλοποιήθηκε έναντι

ACTB

. Kolmogorov-Smirnov και δοκιμές Shapiro-Wilk πρότεινε ότι το επίπεδο έκφρασης του κάθε γονιδίου από το σύνολο των 52 δειγμάτων δεν διανέμεται κανονικά. Έτσι, μια δοκιμασία Kruskal-Wallis, η οποία χρησιμοποιεί ένα μη-παραμετρική μέθοδος, χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθεί η έκφραση γονιδίου από κακοήθεις, καλοήθεις και κανονικές ομάδες. δοκιμή συσχέτισης του Spearman του έγινε για να διερευνηθεί η συσχέτιση μεταξύ της ηλικίας του ασθενούς και την έκφραση επακόλουθη γονιδίου. R-value πιο κοντά στο 1 δείχνει μια σημαντικότερη θετική συσχέτιση, ενώ η R-value πιο κοντά στο -1 δείχνει μια ισχυρότερη αρνητική συσχέτιση. Στις δοκιμές Kruskal-Wallis και Spearman, ένα P-τιμή του & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

RNA

in situ υβριδισμού

Οι ανιχνευτές σημάνθηκαν με διγοξι. 11-UTP (Roche Diagnostics) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Φορμαλίνη σταθερές τομές ιστού εγκλεισμένες σε παραφίνη αφαιρείται η παραφίνη με ξυλόλιο και ακολούθως πλένονται σε διαβαθμισμένη αιθανόλη. Όλα τα διαλύματα παρασκευάστηκαν σε πυροανθρακικό διαιθύλιο (DEPC) κατεργασμένους H

2O να αδρανοποιήσουν δραστικότητα ριβονουκλεάσης. νουκλεοπρωτεΐνες mRNA δεσμευμένη απομακρύνθηκαν με επώαση με πρωτεϊνάση Κ (1.2μg /ml) (Roche Diagnostics) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα πλακίδια πλύθηκαν με 1χ PBS και ακετυλιωμένα (1 Μ τριαιθανολαμίνη /0,178% HCl /0,25% οξικό ανυδρίτη). Τα σλάϊντς προυβριδίσθηκε στους 65 ° C για 2 ώρες με ρυθμιστικό διάλυμα προϋβριδισμού (50% /διάλυμα απιονισμένο φορμαμίδιο 2χ SSC /1x του Denhardt /0.005 Μ ρυθμιστικού φωσφορικού /θειική δεξτράνη 10% /1 mg /ml ζύμη ολικού RNA /1 mg /ml σπέρματος σολομού DNA) και υβριδίσθηκαν με περίπου 200 ng του ιχνηλάτη cRNA σε ρυθμιστικό προϋβριδισμού διάρκεια της νύχτας στους 50 ° C σε υγρό θάλαμο. Τα πλακίδια πλύθηκαν σε 2Χ SSC, 1χ SSC, 0,5 χ SSC και 0.1 χ SSC για 15 λεπτά η κάθε μία σε 50 ° C. Για να αφαιρεθεί το μη δεσμευμένο ιχνηλάτες cRNA, ο ιστός υποβλήθηκε σε RNase Α (150μg /ml) πέψη για 30 λεπτά στους 37 ° C. Συγκεκριμένα δεσμεύεται ιχνηλάτες cRNA ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-DIG συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση με χλωριούχο νιτρομπλετετραζολίου /X-φωσφορικής-5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλφωσφορικό (ΝΒΤ /ΒΟΙΡ) (Roche Diagnostics) ως χρωμογόνο υπόστρωμα.

Η κλωνοποίηση και κατασκευή της προετοιμασίας για την εισβολή αναλύσεις

το

MAEL

(CCDS1257) και

PIWIL1

(CCDS9268) αλληλουχίες cDNA ελήφθησαν από τη βάση δεδομένων NCBI CCDS. αλληλουχία πλήρους μήκους cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα Expand High Fidelity PCR (Roche) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα έκφρασης θηλαστικού pcDNA3.1. Το πλασμίδιο DNAs συμπεριλαμβανομένων pcDNA 3.1 (Invitrogen) ή pEGFP-N1 κενούς φορείς (Clontech) επιμολύνθηκαν σε κύτταρα SKOV3 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη LTX (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. κύτταρα SKOV3 επιλέχθηκαν λόγω ενδογενών τους

L1

επίπεδα έκφρασης και το γεγονός ότι δεν έδειξε έκφραση γονιδίου ατραπού Pirna (Εικ. 1 C). Για κάθε επιμόλυνση, 8 × 10

4 SKOV3 κύτταρα σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκα 14 ώρες πριν από την επιμόλυνση και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640/5% FBS χωρίς πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Το πλασμίδιο DNA (500 ng) διαλύθηκε σε 100 μΐ μέσου Opti-ΜΕΜ (Invitrogen) και επωάστηκαν με 0.5 μΐ Plus αντιδραστηρίου (Invitrogen) και 2 μΙ Lipofectamine LTX (Invitrogen) για 30 λεπτά πριν να προστεθεί σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 6 ώρες, το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με νέο RPMI 1640/5% FBS μέσο και τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C, 5% CO

2 πριν από τη συγκομιδή για

in vitro

εισβολή αναλύσεις. Η επιμόλυνση ρΕΟΡΡ-Ν1 κενούς φορείς σε κύτταρα SKOV3 επέτρεψε στην αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης για να μετρηθεί, καθώς επιμολυσμένα με επιτυχία κύτταρα εξέφρασαν την πρωτεΐνη GFP. Ο φορέας pEGFP-Ν1 υποβλήθηκε στις ίδιες συνθήκες ανάπτυξης και την επιμόλυνση όπως περιγράφεται παραπάνω, για τον προσδιορισμό της αποτελεσματικότητας της επιμόλυνσης που ήταν περίπου 70% μετά από 24 ώρες.

RT-PCR αναλύσεις

PIWIL1-4

και

MAEL

έκφραση στο (Α) κακοήθης EOC, καλοήθεις καρκίνοι των ωοθηκών (Β) φυσιολογικές ωοθήκες και (C) των ωοθηκών καρκινικές κυτταρικές γραμμές. Αυτή είναι μια αναπαράσταση του 4 από 25 κακοήθων EOC και 19 καλοήθεις ιστούς καρκίνου των ωοθηκών. Αυξημένη έκφραση του

PIWIL1, 2, 4

και

MAEL

, αλλά όχι

PIWIL3

, βρίσκονται σε κακοήθεις καρκίνους σε σύγκριση με καλοήθεις όγκους. Όλες οι συνήθεις ωοθήκες εμφανίζουν

PIWIL2

και

PIWIL4

έκφραση, αλλά μόνο μερικοί έχουν

PIWIL1, 3

και

MAEL

έκφρασης. Αριθ ενδογενής

PIWIL1, 2, 4 και

MAEL

έκφραση ανιχνεύεται σε κύτταρα OVCAR3 και SKOV3. Ωαρίων * υποδηλώνει ιστού από ένα 20-year old προ-εμμηνοπαυσιακές ωοθηκών, ενώ άλλα ωοθήκες είναι από τα άτομα ηλικίας 44-76 ετών.

Η

In vitro

εισβολή αναλύει με xCelligence

η εισβολή των κυττάρων ελέγχθηκε με την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο ανάλυση εισβολή χρησιμοποιώντας συσκευές CIM και το σύστημα xCelligence DP (Roche Diagnostics) [28]. Εν συντομία, 4 ώρες πριν από τη δοκιμασία εισβολή, μία πλάκα CIM (Roche) επικαλύφθηκε με 1:20 αραιωμένο παράγοντα ανάπτυξης μειώνεται Matrigel μήτρα βασικής μεμβράνης (~450μg /ml) (BD Biosciences). Στη συνέχεια, 40.000 κύτταρα, μη επιμολυσμένα ή επιμολυσμένα με άδειο φορέα (EV) ή

MAEL

ή

PIWIL1

φορείς, σπάρθηκαν σε κάθε επικαλυμμένο καλά. δραστηριότητα των κυττάρων παρακολουθήθηκε για μια χρονική περίοδο 72 hrs με μέτρηση του σήματος αντίσταση στην πλάκα CIM. Η δραστηριότητα των κυττάρων καταγράφηκε κάθε λεπτό κατά τις πρώτες 12 ώρες και κάθε 5 λεπτά για τις ακόλουθες 12 ώρες. Στη συνέχεια, από τις 24 ώρες και μετά μέχρι το τέλος του πειράματος, η δραστηριότητα των κυττάρων καταγράφηκε κάθε 30 λεπτά. Σε κάθε πλάκα CIM, εις τριπλούν από κάθε ομάδα διεξήχθησαν για να ληφθεί η μέση τιμή και την τυπική απόκλιση. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

PIWIL1

μεταγραφή αλληλουχίας

Ο τομέας PIWI του

PIWIL1

μεταγραφή ενισχύθηκε με PCR και τα προϊόντα διαφορετικού μεγέθους κλωνοποιήθηκαν σε ρΟΕΜ-Τ Easy (Promega). Επελέγησαν συνολικά 30 θετικές αποικίες από διαφορετικές ζώνες PCR από κάθε αντίδραση απολίνωσης και το πλασμίδιο ϋΝΑ καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους αλκαλικής λύσης (Qiagen) [29]. 200 ng πλασμιδιακού DNA υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας (Big Dye Terminator v3.1 Kit Cycle Sequencing, Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας SP6 και Τ7 γενικών εκκινητών.

Αποτελέσματα

Η έκφραση των γονιδίων οδού Pirna αυξάνεται σε κακοήθεις EOC σε σύγκριση με καλοήθεις όγκους ή φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών

τα γονίδια της οδού Pirna εκφράζεται σταθερά στην ωοθήκη θηλαστικών [11]. Προκειμένου να διερευνηθεί ένα πιθανό ρόλο αυτής της οδού σε EOC, πραγματοποιήσαμε ημι-ποσοτική RT-PCR για τη διερεύνηση της έκφρασης του

PIWIL1

,

PIWIL2

,

PIWIL3

,

PIWIL4

και

MAEL

σε προχωρημένο στάδιο ορώδες EOC (n = 25), καλοήθεις όγκοι ωοθηκών (n = 19) και φυσιολογικό ωοθηκικό ιστό (n = 8) (Πίνακας 1, Πίνακας S3 και Σχ. 1Α, Β). Ημι ποσοτική ανάλυση αποκάλυψε ότι τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του

PIWIL1

και

MAEL

ήταν σημαντικά υψηλότερα σε κακοήθη EOC σε σύγκριση με καλοήθη και φυσιολογικούς ιστούς (Σχ. 2Α, Β). Τα επίπεδα σχετική έκφραση

PIWIL2

και

PIWIL4

σε κακοήθη ομάδες δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από εκείνη σε καλοήθη ή φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών (Σχ. 2C, D). Ωστόσο, η έκφραση του

PIWIL2

και

PIWIL4

είναι σημαντικά χαμηλότερες σε καλοήθεις όγκους συγκριτικά με φυσιολογικό ιστό των ωοθηκών, προτείνοντας μια μεταβολή της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της EOC. Η σχετική έκφραση του

PIWIL3

είναι διαφορετική σε άλλες

το Piwik

γονίδια έτσι ώστε η έκφραση αυτού του γονιδίου είναι σημαντικά υψηλότερο στην κανονική ωοθήκη, σε σύγκριση τόσο με κακοήθεις και καλοήθεις ιστούς (Σχ. 2Ε) . Επιπλέον, η σχετική έκφραση του

PIWIL3

σε κανονική ωοθήκη συσχετίζεται θετικά με την ηλικία του ασθενούς στους φυσιολογικούς ιστούς ωοθήκης (η = 8) (r = 0.750, p = 0.05) (Πίνακας 2). Σε αντίθεση με

PIWIL3

,

PIWIL1

έκφραση συσχετίζεται αρνητικά με την ηλικία των ασθενών (r = -0,737, P = 0,037).

PIWIL1

εκφράζεται σε αναπτυσσόμενων ωοθυλακίων σε προ-εμμηνοπαυσιακές ωοθήκες, αλλά σε αυτό το ήμισυ μελέτη των ωοθηκών που ελέγχθηκαν ήταν από τις γυναίκες λιγότερο από 50 ετών και είναι πιθανό να είναι προεμμηνοπαυσιακές.

Ημι-ποσοτική RT-PCR ανάλυση της έκφρασης mRNA (σε σχέση με το

ACTB

) (Α)

PIWIL1

, (Β)

MAEL

, (C)

PIWIL2

, (D)

PIWIL4

και (Ε)

PIWIL3

. (F) P-τιμή κάθε ομάδα σύγκρισης. Κακοήθης EOC (n = 25), η καλοήθης ιστούς καρκίνου των ωοθηκών (n = 19) και φυσιολογικές ωοθήκες (n = 8). Kruskal-Wallis τεστ εκτελέστηκε για σύγκριση του επιπέδου έκφρασης γονιδίου μεταξύ δύο ομάδων. Γεμιστά κουκκίδα υποδεικνύει μέση της κάθε ομάδας. * Υποδηλώνει 0.001 & lt? P & lt? 0,05? *** Υποδεικνύει P & lt? 0.001? NS, δεν είναι σημαντική.

Η

L1

και Pirna οδού γονίδια είναι πάνω από εκφράζονται σε κύτταρα ΕΓΚ

Για να αναλύσουμε το πρότυπο έκφρασης των γονιδίων της οδού Pirna και

L1

σε EOC, RNA

in situ

υβριδισμός διεξήχθη σε κακοήθη EOC (n = 5) και καλοήθεις όγκους των ωοθηκών (n = 2) (Πίνακας 3, Σχ. S1). Βρήκαμε ισχυρή έκφραση του

L1

στα επιθηλιακά κύτταρα, αλλά

L1

απουσίαζε στα στρωματικά κύτταρα σε όλα τα δείγματα (Σχ. 3Α, E). Επίσης σημειώνεται ότι η έκφραση του

L1

είναι μεταβλητή σε διαφορετικούς ασθενείς (Σχ. 3Α). Ισχυρή έκφραση του

PIWIL1

βρέθηκε στα επιθηλιακά κύτταρα σε όλους τους ιστούς EOC (Σχ. 3Β, F), ενώ

MAEL

και

PIWIL2

παρουσίασε ισχυρή έκφραση στα επιθηλιακά κύτταρα και στρωματικά κύτταρα όλων των EOC εξετάστηκαν (Σχ. 3C, G και D, H αντίστοιχα).

Η in situ ανάλυση

του (Α, Α ‘, Ε)

L1

, (Β, Β ‘, F)

PIWIL1

, (C, C’, G)

MAEL

, (Δ, Δ ‘, Η)

PIWIL2

στην δύο κακοήθεις EOC (AD από SC3 ενώ EH από SC2). (Α’-ϋ ‘) Amplification εικόνες A-D αντίστοιχα. Ισχυρή έκφραση των γονιδίων οδού Pirna και

L1

βρέθηκε στην πλακώδη-to-cuboidal όπως επιθηλιακά κύτταρα τόσο του κακοήθους EOC εκτός

PIWIL1

οποίο εκφράζεται μόνο σε SC2 αλλά όχι SC3.

L1

έχει αποσπασματική έκφραση σε κάποια EOC, έτσι ώστε κάποιοι επιθηλιακά κύτταρα φαίνεται να έχουν ισχυρότερη

L1

έκφρασης σε σύγκριση με τους άλλους.

MAEL

και

PIWIL2

αλλά όχι

PIWIL1

εκφράζονται επίσης στα στρωματικά κύτταρα και στις δύο ΕΓΚ. (Ε’-Η ‘) Οι αρνητικοί έλεγχοι με την αίσθηση καθετήρα

L1

,

PIWIL1

,

MAEL

και

PIWIL2

αντίστοιχα. Ep = επιθηλιακά κύτταρα? S = στρωματικά κύτταρα. Μπάρα κλίμακας = 50 μm.

Η

Πολλαπλές

PIWIL1

μεταγραφή υπάρχουν παραλλαγές σε κακοήθη ΕΓΚ

PCR ενίσχυση του τομέα PIWI από ΕΓΚ cDNA που παράγονται δύο διακριτές ζώνες σε σύγκριση με cDNA από κανονικό όρχεων ή των ωοθηκών (Εικ. 4), γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία πολλαπλών

PIWIL1

μεταγραφής παραλλαγών σε κακοήθεις EOC. Τα προϊόντα PCR από τους όρχεις και κακοήθεις EOC εκχυλίστηκαν, κλωνοποιήθηκαν και αλληλουχήθηκαν. Πολλαπλές στοιχίσεις αλληλουχιών του κλώνου έδειξε πολλές αλλαγές εντός του τομέα PIWI στο επίπεδο των νουκλεοτιδίων σε σύγκριση με την όρχεις και δημοσιεύθηκε

PIWIL1

αλληλουχία cDNA. Οι αλλαγές ζευγάρι ενιαίας βάσης έχουν εντοπιστεί σε

PIWIL1

μεταγραφές των κακοήθων EOCs (Πίνακας S2). Επιπλέον, οι περισσότερες από αυτούς τους κλώνους έχουν εξόνιο διαγραφή και μη ματισμένου ιντρόνια που εισάγουν πρόωρα κωδικόνια τερματισμού. Είναι σημαντικό ότι μία διαγραφή 75-nt που περιελάμβανε ολόκληρο το εξόνιο 17 βρέθηκε στα περισσότερα από τα αλληλουχία κλώνων σε 5 από 28 ασθενείς EOC (Εικ. 4Β). Επιπλέον, ορισμένοι κλώνοι έδειξαν μερική ματίσματος ιντρονίων 15 και 16 (Σχ. 4Β) έτσι ώστε 17 bp και 20 bp από το 5 ‘άκρο του ιντρονίου 15 και 16, αντίστοιχα, είναι μη συρραμμένο. Προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι οι μεταλλάξεις οφείλονται σε ματίσματος, γενωμικό DNA από δείγματα όγκου απομονώθηκαν και καθορίστηκε η αλληλουχία στην αντίστοιχη περιοχή. Δεν μεταλλάξεις εντοπίστηκαν ανάμεσα στα εξόνια 15-18 (όπου συνέβησαν τα λάθη splicing) στο γονιδιακό

PIWIL1

ακολουθία (Εικ. S2). Για να προβλέψουμε αν οι παραπάνω μετα-μεταγραφικό μεταβολές επηρεάζουν τη λειτουργία PIWIL1, σειρές μεταφράστηκαν και σε σύγκριση με τον έλεγχο (όρχεος cDNA) και δημοσιεύθηκε πεπτιδική αλληλουχία (AAC97371.2). Απώλεια του συνόλου του εξωνίου 17 (διαγραφή 73-nt) σε 11 κλώνους εισήγαγε ένα πρόωρο κωδικόνιο τερματισμού στον τομέα PIWI (Εικ. S3). Παρομοίως, κωδικόνια στοπ βρέθηκαν σε κλώνους που έχουν μη συρραμμένο εσώνια (δεν φαίνεται).

(Α)

PIWIL1

έκφραση σε ιστούς ελέγχου (ανθρώπινους όρχεις, η κανονική ωοθήκη (OV) 1, 2) και EOC SC1 ιστού και 2. σε θετικό έλεγχο, μια ζώνη 500 bp ενισχύθηκε, αλλά σε κακοήθη SC1, ελήφθησαν δύο ζώνες. (Β) cDNA πολλαπλή ευθυγράμμιση (μερική) δείχνουν ότι η πλειονότητα των κλώνων έχουν μια απαλοιφή του εξωνίου 17 (ΔΔ3) και 3 κλώνοι έχουν μερική ματίσματος του ιντρονίου 15 και 16 (). PIWIL1_ccds: δημοσιευθεί cDNA του

PIWIL1

(CCDS9268)? Όρχεις C1: όρχεων μεταγραφή κλώνος 1? Β1-3, Β6, Β9-Β14, C6, C8, C9, C10-C15, D1-D10: κλώνων με

PIWIL1

μεταγραφές

Η

Πάνω από έκφραση των γονιδίων οδού Pirna. μειώνει εισβολής

in vitro

η

για να διερευνήσουν τον πιθανό ρόλο των γονιδίων οδού Pirna στην εξέλιξη του καρκίνου, πλήρους μήκους

PIWIL1

ή

MAEL

μεταγραφές κλωνοποιήθηκαν και επιμολύνθηκαν παροδικά μέσα στο κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 και προσδιορίστηκαν για τη διεισδυτικότητα μετά από 24 ώρες από την επιμόλυνση. RT-PCR διεξήχθη για να επικυρώσει την εισαγωγή των πλασμιδίων σε αυτά τα κύτταρα. RT-PCR επιβεβαίωσε

GFP

,

PIWIL1

ή

MAEL

πάνω έκφρασης (Εικ. S4A). Έκφραση του

MAEL

και

PIWIL1

κατασκευές παρέμεινε υψηλή στα επιμολυσμένα κύτταρα 50 ώρες μετά την επιμόλυνση (Εικ. S4A).

MAEL

,

PIWIL1

και κενό φορέα (EV) επιμολυσμένα κύτταρα και μη επιμολυσμένα κύτταρα SKOV3 εφαρμόστηκαν στο σύστημα xCELLigence να ερευνήσει τις επιπτώσεις τους στην κυτταρική εισβολής [30]. Παραδόξως, η διηθητικότητα του

MAEL

και

PIWIL1

επιμολυσμένα κύτταρα ήταν χαμηλότερη σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα ή κενά κελιά φορέα (Εικ. 5). Κυττάρων εισβολής από κάθε ομάδα άρχισε να φτάσουν σε μια σταθερή μετά από 30 ώρες, έτσι μόνο κυτταρική δραστηριότητα από τις πρώτες 30 ώρες εμφανίζεται. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η υπερέκφραση του

PIWIL1

και

MAEL

έχουν κατασταλτική επίδραση στην ικανότητα εισβολής των κυττάρων SKOV3.

PIWIL1

και

MAEL

επιμολυσμένα κύτταρα έχουν χαμηλότερη διεισδυτικότητα σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα και

Ev

επιμολυσμένων κυττάρων. Σε κάθε πείραμα, κάθε ομάδα διεξήχθη εις τριπλούν και αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Αυτό είναι ένα συνδυασμένο διάγραμμα δεδομένων τριών ανεξάρτητων πειραμάτων για όλες τις ομάδες. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση.

WT

υποδεικνύει μη επιμολυσμένα κύτταρα SKOV3? κενό φορέα (EV),

MAEL

και

PIWIL1

δείχνουν κύτταρα επιμολυσμένα με

MAEL

ή

PIWIL1

φορείς.

Καμία

δείχνει καλά χωρίς κύτταρα.

Η

Συζήτηση

Η διαδρομή Pirna είναι σημαντική για την ΤΕ αποσιώπηση, επιγενετική ρύθμιση και βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση σε ένα ευρύ φάσμα οργανισμούς [31], [32]. Παγκόσμια υπομεθυλίωση του DNA και ΤΕ-καταστολής, όπως

L1, είναι

ένα κοινό χαρακτηριστικό των γονιδιωμάτων καρκίνο [33], [34] σε ανθρώπους

PIWIL1

και

2

υπερέκφραση έχει έχουν παρατηρηθεί σε όγκους από διάφορους ιστούς [15] – [18], [21] – [23]. Ωστόσο, εξακολουθεί να είναι ασαφές αν Pirna γονίδια οδού εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο των ωοθηκών ή έχουν ένα ρόλο στην πρόοδο του όγκου των ωοθηκών. Εξετάσαμε την έκφραση των γονιδίων της οδού Pirna

PIWIL1

–

4

,

MAEL

και

L1

σε κακοήθη EOC, καλοήθεις όγκους και φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών, και επίσης διερευνώνται πιθανοί ρόλοι του

PIWIL1

και

MAEL

σε κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών

Η έκφραση του

PIWIL1

-.

2

έχει διερευνηθεί σε διάφορους καρκινικούς ιστούς [15] – [18], [21], [23], [35], αλλά όχι

MAEL

,

PIWIL3

και

PIWIL4

. Αν και η έκφραση του

PIWIL2

και

4

εμφανίστηκε με υψηλή περιεκτικότητα σε δείγματα όγκων αυτό δεν ήταν σημαντικές, πιθανόν να οφείλεται στο γεγονός ότι

PIWIL2

και

PIWIL4

έντονα εκφράζεται σε φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών (σχ. 1Β) και η έκφραση τους μεταξύ κακοηθών ιστών είναι εξαιρετικά μεταβλητή. Η έκφραση του

PIWIL1

και

MAEL

ωστόσο είναι σημαντικά αυξημένη σε κακοήθη EOC σε σύγκριση με καλοήθεις όγκους.

PIWIL1

και

MAEL,

αλλά όχι

PIWIL2

και

4,

ήταν σημαντικά έως και ρυθμίζονται σε σύγκριση με φυσιολογικές ωοθήκες. Σε αντίθεση με

PIWIL2

και

4

που εκφράζονται σε όλους τους φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών που εξετάστηκαν, η έκφραση του

PIWIL1

και

MAEL

βρίσκεται μόνο στο ένα υποσύνολο των φυσιολογικών ιστών ωοθήκης από ασθενείς που ήταν λιγότερο από 50 χρονών. Στην κανονική ωοθήκη,

PIWIL1

και

MAEL

εκφράζονται στα cumulus κύτταρα των αναπτυσσόμενων ωοθυλακίων σε ανθρώπινο [11]. Η κανονική ωοθηκών ιστούς που εξετάστηκαν είναι από τα άτομα ηλικίας 44-76 ετών, και τα μισά από αυτά τα δείγματα προήλθαν από άτομα ηλικίας κάτω των 50 ετών. Έτσι, η μεταβλητή έκφραση του

PIWIL1

και

MAEL

στις φυσιολογικές ωοθήκες θα μπορούσε να εξηγηθεί από τη διαφορά σε αφθονία των αναπτυσσόμενων ωοθυλακίων, τα οποία εκφράζουν Pirna γονίδια οδού μεταξύ των δειγμάτων.

MAEL

είναι γνωστό ως ένα γονίδιο του καρκίνου /όρχεων, όπως εκφράζεται σε όρχεις και ένας αριθμός κυτταρικών σειρών καρκίνου [36]. Εδώ εντοπίστηκαν για πρώτη φορά την αυξημένη έκφραση του

MAEL

σε κακοήθη EOC και καλοήθεις όγκοι των ωοθηκών. Παρόμοια με PIWI, MAEL είναι απαραίτητη για να διασφαλιστεί η σωστή βλαστική διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων σε

Drosophila

και άλλα σπονδυλωτά [37]. Η υπερέκφραση των γονιδίων οδού Pirna σε EOC μπορεί να υποδεικνύει ότι ορισμένα χαρακτηριστικά βλαστικών κυττάρων είναι παρούσες σε κύτταρα όγκου ή ότι η οδός Pirna έχει ενεργοποιηθεί για παράδειγμα με δράση του ρετροτρανσποζόνια. Έκφραση αυτών των γονιδίων μπορεί επίσης να είναι μια υπογραφή της παρουσίας των ωοθηκών καρκινικά βλαστικά κύτταρα [38].

Η έκφραση των γονιδίων της οδού Pirna σε κανονική ωοθήκη και ορισμένους τύπους ΕΓΚ μπορεί να παρέχει μια νέα προοπτική για την προέλευση των καρκίνος ωοθηκών. Σωματικά κύτταρα της ωρίμανσης των ωοθυλακίων μπορεί να έρθει σε επαφή με την επιφάνεια του επιθηλίου των ωοθηκών κατά τη διάρκεια της ωορρηξίας ή μπορεί να είναι παρόντα στο κύστη συμπερίληψη η οποία πιστεύεται ότι παίζουν ένα ρόλο στην προέλευση του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών [3] αν και η παρουσία των κύστεων ένταξης φαίνεται να δεν per se να αυξήσει τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου των ωοθηκών [39]. Υπομεθυλίωση του

L1

περιοχή προαγωγού συσχετίζεται με αυξημένη

L1

έκφραση mRNA, σε κακοήθεις ιστούς του καρκίνου του μαστού και κυτταρικές σειρές [40], [41]. Η έκφραση του

το Piwik

γονίδια και

MAEL

τόσο φυσιολογική ωοθήκη και κακοήθεις ΕΓΚ συσχετίζονται με αυξημένη έκφραση των επαναλαμβανόμενων στοιχείων και αυξάνει την πιθανότητα ότι η οδός Pirna μπορεί να έχουν προκληθεί από την έκφραση ΤΕ. Ωστόσο, παρατηρήσαμε ότι

L1

έκφραση απουσίαζε σε προγενέστερο στάδιο κακοήθεις όγκους (n = 6), αλλά σταθερά παρόν σε όλα τα δείγματα όγκων στάδιο 3γ. Αυτό παρέχει κάποια έμμεσες αποδείξεις ότι η ενεργοποίηση των γονιδίων οδού Pirna μπορεί να προηγείται

L1

έκφρασης κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου. Αυτό είναι σύμφωνο με την εργασία σε άλλους όγκους που συσχετίζονται

L1

έκφρασης με την εξέλιξη του καρκίνου [42].

Maelstrom

νοκ άουτ οδηγεί σε μειωμένη μεθυλίωση του DNA σε γεννητικούς αδένες, αλλά όχι σε σωματικό ιστό. Σε γονάδες αυτό οδηγεί σε μια δραματική αύξηση στην έκφραση μεταθετό στοιχείο στα γεννητικά κύτταρα [43]. Η παρατήρησή μας της

MAEL

υπερέκφραση σε απουσία ανιχνεύσιμου

L1

έκφραση σε δείγματα όγκων πρώιμο στάδιο αυξάνει την πιθανότητα ότι οι μη λειτουργικές

MAEL

μπορεί να παίζει ρόλο στη μείωση του DNA μεθυλίωση προώθηση μετέπειτα

L1

έκφραση.

Αν και

PIWIL1

μεταγραφής επίπεδο ήταν σημαντικά αυξημένη σε κακοήθη EOC σε σύγκριση με καλοήθη και φυσιολογικούς ιστούς, κλωνοποίηση και αλληλούχιση αυτών των μεταγραφημάτων πρότεινε ότι αυτοί μεταγραφές μπορεί να παράγει παρεκκλίνουσα και μη λειτουργικές πρωτεΐνες PIWIL1. Πολλαπλές μεταλλάξεις βρέθηκαν σε

PIWIL1

μεταγραφές συμπεριλαμβανομένων μη συρραμμένο εσώνια, απώλεια εξωνίων καθώς και τις μεταβολές ενός ζεύγους βάσεως. Ενιαία αλλαγές ζεύγος βάσεων ίσως ένα αποτέλεσμα της επεξεργασίας του RNA [44].