Abstract

PRAME ανήκει σε μια ομάδα αντιγόνων του καρκίνου /όρχεων (CTA) που χαρακτηρίζονται από περιορισμένη έκφραση τους σε φυσιολογικούς ιστούς γαμετογονικής και μία ποικιλία όγκων. Η

PRAME

οικογένεια είναι ένα από τα πιο ενισχυμένου οικογένειες γονιδίων στον ποντικό και άλλων γονιδιωμάτων των θηλαστικών. Τα μέλη των πρωτεϊνών

PRAME

οικογένεια γονιδίων κωδικοποιούν πλούσιες σε λευκίνη επανάληψης (LRR) λειτουργούν ως ρυθμιστές της μεταγραφής σε καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, ο ρόλος του στην κανονική PRAME γονάδες είναι άγνωστη. Ο στόχος αυτής της μελέτης είναι να χαρακτηρίσει την χρονική και χωρική έκφραση του ποντικιού

Pramel1

γονίδιο, και να καθορίσει την κυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης PRAMEL1 κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης ποντίκι. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το ποντίκι

Pramel1

εκφράστηκε μόνο στους όρχεις. Το επίπεδο του mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης ήταν χαμηλή στα νεογέννητα όρχεις, και αυξάνεται σταδιακά από 1- έως 3-εβδομάδων όρχεις, και στη συνέχεια παρέμεινε σταθερός μετά από τρεις εβδομάδες της ηλικίας. χρώση ανοσοφθορισμού σε τομές όρχεων με το αντίσωμα ποντικού PRAMEL1 αποκάλυψε ότι PRAMEL1 εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα των σπερματοκυττάρων και της περιοχής ακροσωμιακή του γύρου, επιμηκύνοντας και επιμήκη σπερματίδια. Περαιτέρω αναλύσεις σχετικά με την προετοιμασία των όρχεων σκουός και σπερματοζωαρίων σε υποκυτταρικό επίπεδο έδειξε ότι τα πρότυπα πρωτεΐνη εντοπισμό των PRAMEL1 συντονίστηκαν με μορφολογικές αλλοιώσεις κατά τη διάρκεια acrosome σχηματισμό σε σπερματίδες, και ήταν σημαντικά διαφορετικό σε συνδετικό κομμάτι, μεσαίο κομμάτι και κύριο κομμάτι του μαστιγίου μεταξύ των όρχεων και επιδιδυμίδας τα σπερματοζωάρια. Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι PRAMEL1 μπορεί να παίζει ρόλο στην ακρόσωμα βιογένεση και την κινητικότητα του σπέρματος

Παράθεση:. Mistry BV, Zhao Υ, Chang Τ-C, Yasue Η, Chiba Μ, Oatley J, et al. (2013) διαφορική έκφραση του PRAMEL1, ενός Καρκίνου /όρχεων Antigen, κατά τη διάρκεια Σπερματογένεση στο ποντίκι. PLoS ONE 8 (4): e60611. doi: 10.1371 /journal.pone.0060611

Επιμέλεια: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 του Δεκέμβρη του 2012? Αποδεκτές: 28 του Φλεβάρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 2, Απριλίου 2013

Copyright: © 2013 Mistry et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από USDA-NifA (δεν χορηγούν. 2010-65205-20362) και εκκίνηση κονδύλια από το Πολιτειακό Πανεπιστήμιο της Πενσυλβάνια με W-SL. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η σπερματογένεση είναι μια πολύπλοκη βιολογική διεργασία που περιλαμβάνει την μιτωτική πολλαπλασιασμό σπερμογονίων, τη μειωτική διαίρεση των σπερματοκυττάρων, και τη μορφογενετική διαφοροποίηση των σπερματιδίων σε ώριμα σπερματοζωάρια. Κατά τη διάρκεια της σπερματογένεση, ο γύρος σπερματίδια υφίστανται δραματικές μορφολογικές και κυτταρικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένου του σχηματισμού του ακροσωματίου, επιμήκυνση και συμπύκνωση του πυρήνα, σχηματισμό του μαστιγίου και την απόρριψη των περιττών κυτταρόπλασμα, να παράγουν άκρως εξειδικευμένα και πολωμένο σπερματοζωαρίων [1], [2 ]. Το ακροσωματίου είναι ένα Golgi προερχόμενο κυστίδιο που βρίσκεται στην πρόσθια περιοχή της κεφαλής των σπερματοζωαρίων [3]. Παίζει σημαντικό ρόλο στην γονιμοποίηση με τη συμμετοχή του στη διαδικασία της πρόσδεσης του σπέρματος-αυγού και διαπερνούν το αυγό [4], [5]. Τα αρσενικά θηλαστικά που φέρουν μεταλλάξεις που επηρεάζουν acrosome βιογένεση είναι στείροι ή υπογόνιμο [4] – [7]. Acrosome βιογένεση από την όψιμη φάση spermatocyte παχυτενίου της μειωτικής διαδικασίας και συνεχίζεται καθ ‘όλη το πρώτο μισό του σπερμιογένεσης [4], [5], [8]. Αρχικά, οι proacrosomal κυστίδια σχηματίζονται από συσκευή Golgi και συναρμολογούνται στην περιπυρηνική περιοχή, κοντά σε ένα από τους πόλους του πυρήνα σε σπερματοκύτταρα παχυτενίου. Μετά την ολοκλήρωση της μειωτικής διαίρεσης, αυτά τα κυστίδια συγχωνεύονται μεταξύ τους για να σχηματίσουν ένα ενιαίο μεγάλο κυστίδιο ακροσωμιακή που αποδίδει στο πυρηνικό φάκελο του γύρου σπερματιδίων και συνεχίζει να διευρύνεται με την προσθήκη Golgi υλικό που προέρχεται από [4], [8]. Κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης των επιμηκύνοντας σπερματιδίων, το Golgi παύει να συμβάλουν γλυκοπρωτεΐνες στην ακροσώματος, και το συγκρότημα acrosome-πυρήνα υφίσταται εκτεταμένο μορφολογικές αλλαγές να αποκτήσουν ένα σχήμα χαρακτηριστικό του σπέρματος των εκάστοτε ειδών »[8].

Το μαστίγιο του σπερματοζωαρίου θηλαστικού είναι ένα σημαντικό και εξαιρετικά οργανωμένη μικροσωληνίσκων που βασίζεται πολύπλοκη δομή που παρέχει κινητικότητα που απαιτούνται για το σπέρμα να φτάσει και να γονιμοποιήσει ένα ωάριο [9]. Δομικά, αυτό χωρίζεται σε τέσσερα βασικά στοιχεία: το συνδετικό κομμάτι, το μεσαίο κομμάτι, το κύριο κομμάτι, και το τελικό τεμάχιο [10]. Συνέλευση του μαστιγίου ξεκινά στις αρχές του σπερματογένεση. Κατά τη διάρκεια μαστίγιο βιογένεση, ένα ζεύγος κεντριόλια κινείται προς την αντίθετη πλευρά του αναπτυσσόμενου ακροσωματίου στην περιπυρηνική χώρο του γύρου σπερματοζωιδίου, όπου ένα από τα δύο κεντριόλια σχηματίζει ένα flagellar axoneme. Στη συνέχεια, η axoneme προεξέχει από το σπερματοζωιδίου, αποδίδοντας το μαστίγιο [8]. Περισσότερες από 400 πρωτεΐνες έχουν βρεθεί στο μαστίγιο, αλλά μόνο ένα κλάσμα των πρωτεϊνών έχουν χαρακτηριστεί σε μοριακό επίπεδο και φαίνεται να λειτουργεί ως δομικό, μεταβολικές ή πρωτεΐνες σηματοδότησης [11], [12].

τα καρκινικά αντιγόνα /όρχεων (CTA) είναι μια ομάδα πρωτεϊνών που είναι εντόνως εκφράζονται σε μια ευρεία ποικιλία των κακοήθων όγκων, αλλά η έκφραση τους σε φυσιολογικούς ιστούς κυρίως περιορίζεται σε όρχεων και κυττάρων των ωοθηκών γεννητικά [13] – [15]. Λόγω χαρακτηριστικό πρότυπο έκφρασής τους, CTAs χρησιμοποιούνται ως προγνωστικοί δείκτες για μια σειρά των όγκων και θεωρούνται επίσης υποσχόμενους στόχους για ανοσοθεραπεία του καρκίνου [16] – [18]. Τουλάχιστον 70 οικογένειες γονιδίων CTA συμμετείχαν περισσότεροι από 240 μεμονωμένα γονίδια (ή ισομορφές) έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι σήμερα [19]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι CTAs, σε γενικές γραμμές, έχουν ένα ρόλο τόσο στην ογκογένεση και γαμετογένεση [14], [15], [20]. Ωστόσο, πληροφορίες σχετικά με την λειτουργία και την ακριβή κυτταρικός εντοπισμός CTAs σε γεννητικά κύτταρα και τους ιστούς του καρκίνου είναι αραιή σε σύγκριση με τα δεδομένα επί της έκφρασης και την ανοσογονικότητα [13] τους, [15].

εκφράζονται κατά προτίμηση αντιγόνο σε μελάνωμα (PRAME) είναι μέλος του CTAs, και ταυτοποιήθηκε αρχικά ως ένα αντιγόνο όγκου που εκφράζεται σε κύτταρα μελανώματος, προκαλώντας μια αυτόλογα κυτταροτοξικά Τ κυτταρική ανοσολογική απόκριση [21].

PRAME

είναι ένα γονίδιο πολλαπλών αντιγράφων που αντιπροσωπεύει ένα από τα πιο ενισχυμένου οικογένειες γονιδίων σε eutherian θηλαστικά, με ~ 90 αντίγραφα στον ποντικό, ~ 50 αντίγραφα στο ανθρώπινο και ~ 30 αντίγραφα στο γονιδίωμα των βοοειδών [19] , [22], [23]. Είναι ενδιαφέρον ότι,

PRAME

έχει μεταφερθεί προς και ενισχύθηκαν επί του χρωμοσώματος Υ στο βοοειδούς γενεαλογία, γεγονός που υποδηλώνει ένα ρόλο στην ανδρική αναπαραγωγή [19]. Μέλη του

PRAME

οικογένεια γονιδίων κωδικοποιούν LRR (πλούσια σε λευκίνη επανάληψη) πρωτεΐνες που διπλώνουν σε σχήμα πετάλου στον τριτογενή δομή τους. Η πρωταρχική λειτουργία των πρωτεϊνών LRR είναι να παράσχει ένα ευέλικτο δομικό πλαίσιο για τον σχηματισμό αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης σε διαδικασίες διαφορετικές μοριακής αναγνώρισης, συμπεριλαμβανομένων μεταγωγή σήματος, κυτταρική προσκόλληση, μεταγραφική ρύθμιση, επεξεργασία RNA, απόπτωση, ανοσοαπόκριση, και την κυτταρική πόλωση [24 ] – [28]. Έκφραση και λειτουργία του PRAME έχει μελετηθεί εκτενώς σε μία ποικιλία καρκινικών κυττάρων και η έκφραση υψηλού PRAME συσχετίζεται με την πρόοδο του καρκίνου [28] – [30]. Σε κύτταρα μελανώματος, λειτουργεί PRAME ως καταστολέας του ρετινοϊκού οξέος (RA) σηματοδότηση μέσω της αλληλεπίδρασης με τους υποδοχείς RA (RARs) και την πρόσληψη των πρωτεϊνών Polycomb [27], [31]. Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης προτείνει ότι λειτουργεί PRAME σαν ένας ενεργοποιητής της μεταγραφής. Costessi

et al.

(2011, 2012) ανέφεραν ότι PRAME είναι ένα συστατικό της Cullin2 βάση Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης και υποχρεούται να προσλάβει Cullin2 ουβικιτίνης λιγάση με το συγκρότημα EKC /KEOPS. Αυτό το συγκρότημα συνδέεται με τους δραστήριους φορείς που ρυθμίζονται από το

παράγοντα πυρηνικής μεταγραφής Υ

(

NFY

) [29], [32]. Υποθέτουμε ότι PRAME παίζει επίσης ένα ρόλο στην σπερματογένεση. Ως πρώτο βήμα για να ελέγξετε την υπόθεσή μας και να τεμαχίσει το μοριακό ρόλο της οικογένειας γονιδίων PRAME στην αναπαραγωγή, επιλέξαμε να εργαστούν για το ποντίκι

PRAME-όπως 1

(

Pramel1

) γονίδιο, ένας εκπρόσωπος του

PRAME

οικογένεια γονιδίων, τα οποία είναι ομόλογη με την ανθρώπινη

PRAME,

και βρίσκεται στο χρωμόσωμα του ποντικιού (MMU) 4. σε αυτή την εργασία, η οποία χαρακτηρίζεται η

Pramel1

γονίδιο σε σχέση με το πρότυπο έκφρασης του mRNA και πρωτεΐνης και κυτταρικό εντοπισμό κατά την ανάπτυξη των όρχεων και τη σπερματογένεση.

Αποτελέσματα

Χρονική και χωρική ανάλυση έκφρασης του ποντικιού

Pramel1

σε όρχεις

το πρότυπο έκφρασης του ποντικιού

Pramel1

γονίδιο (acc. αρ. NM_031377) εξετάστηκε σε 11 ιστούς ενήλικα ποντίκια με RT-PCR. Για συγκριτικούς σκοπούς, πέντε άλλα παράλογα από το ποντίκι

PRAME

οικογένειας (φυλοσύνδετη

PRAME

,

Pramel3

, και

Pramel

, και MMU4- συνδέονται

Pramef8

και

Pramef12

) αναλύθηκαν επίσης (Πίνακας 1). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι έξι παράλογα είχαν υψηλή έκφραση σε όρχεις, με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης σε άλλους ιστούς (Εικ. 1). Η

Pramel1

και

PRAME

mRNAs ήταν ειδικά εκφράζονται σε όρχεις, ενώ

Pramel

,

Pramel3

,

Pramef8

, και

Pramef12

mRNAs ήταν κυρίως εκφράζονται σε όρχεις με χαμηλή έκφραση σε ωοθήκη, ήπαρ, σπλήνα, νεφρά, τον εγκέφαλο, πνεύμονα, των μυών και του θύμου (Σχ. 1α). Να εξετάσει περαιτέρω τις χρονικές και χωρικές εκφράσεις του

Pramel1,

πραγματοποιήσαμε μια μελέτη πορεία του χρόνου κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των όρχεων. Μας αποτελέσματα RT-PCR δείχνουν ότι, ενώ ένα χαμηλότερο επίπεδο το

Pramel1

mRNA εκφράστηκε στο νεογέννητο όρχεις, ένα υψηλότερο επίπεδο σταθερής έκφρασης ανιχνεύτηκε σε 1-εβδομάδα- έως 8 εβδομάδων όρχεις (Εικ . 1β).

α. Χωρική ανάλυση της έκφρασης των έξι

PRAME

παράλογα μεταξύ 11 διαφορετικούς ιστούς του ενήλικα ποντίκια.

PRAME

και

Pramel1

εκφράστηκαν ειδικά στους όρχεις, ενώ

Pramel, Pramel3, Pramef8

και

Pramef12

εκφράστηκαν κυρίως σε γαμετογονικής ιστούς με χαμηλό επίπεδο έκφρασης σε ήπαρ, τους νεφρούς, τον εγκέφαλο, το λεπτό έντερο, τον πνεύμονα, τους μυς και θύμο. σι. Χρονική ανάλυση της έκφρασης του

Pramel1

κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των όρχεων. Χαμηλή έκφραση παρατηρήθηκε στο νεογέννητο όρχεις, ενώ σταθερά υψηλή έκφραση παρατηρήθηκε σε όρχεις από 1- έως 8 εβδομάδων ποντικούς.

Actb

χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. Μ: δείκτης? Ov: ωοθηκών? Te: όρχεις? Li: συκώτι? SP: σπλήνα? Ki: νεφρά? Br: εγκεφάλου? Si: το λεπτό έντερο? Ly: λεμφαδένων? Lu: πνεύμονα? Mu: μυς? Θ: θύμου? -:. Αρνητικός έλεγχος

Η

Για να προσδιοριστεί αν η πρωτεΐνη PRAMEL1 εκφράζεται στους όρχεις, μια ανάλυση κηλίδας western πραγματοποιήθηκε σε ολόκληρη λύμα όρχεις από το ώριμο ποντίκια χρησιμοποιώντας ένα PRAMEL1-ειδικό αντίσωμα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2α, το αντίσωμα PRAMEL1 εντόπισε συγκεκριμένη ζώνη με μοριακό βάρος ~ 57 kDa, η οποία είναι το προβλεπόμενο μοριακό βάρος για την πρωτεΐνη PRAMEL1 ποντικού (acc. Νο. NP_113554). Επιπλέον, ένα πολύ μικρό συγκρότημα (~ 42 kDa) παρατηρήθηκε (Εικ. 2α). Για να δοκιμαστεί η εξειδίκευση του αντισώματος, πραγματοποιήσαμε ένα έλεγχο προ-απορρόφηση με το πεπτίδιο που χρησιμοποιείται για να δημιουργηθεί το αντίσωμα PRAMEL1, στην οποία δεν ανιχνεύθηκε ζώνη (Εικ. 2α), υποδηλώνοντας ότι το αντίσωμα είναι PRAMEL1-ειδικά και η δευτερεύουσα ταινία απαιτεί περαιτέρω έρευνα. Μια ανάλυση χρονικής πορείας της πρωτεΐνης PRAMEL1 κατέδειξαν περαιτέρω ότι η έκφραση του σε όρχεις ήταν εξαρτώμενη από την ηλικία (Σχ. 2β). Το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης ήταν πολύ χαμηλή στο νεογέννητο στάδιο (Εικ. 2b), σύμφωνο με το χαμηλό επίπεδο της μεταγραφής ανιχνεύθηκε με RT-PCR (Σχ. 1β). Η έκφραση αυξήθηκε σταδιακά από 1- έως 3-εβδομάδων όρχεις, και στη συνέχεια παρέμεινε σταθερός μετά από τρεις εβδομάδες της ηλικίας (Σχ. 2β). Ως θετικός έλεγχος, ένα μονοκλωνικό β-ακτίνης (ACTB) αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει ACTB, και μια αναμενόμενη πρωτεΐνη 42 kDa ταυτοποιήθηκε (Εικ. 2α, 2β).

α. Ανάλυση κηλίδας Western των PRAMEL1. Εκχυλίσματα πρωτεΐνης από ενήλικους όρχεις ποντικού υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα PRAMEL1 ποντικού. Μια ανοσο-αντιδρώσα πρωτεΐνη με ένα αναμενόμενο μοριακό βάρος ~ 57 kDa ανιχνεύθηκε στους όρχεις, και παρατηρήθηκε επίσης μια πολύ μικρή ζώνη του ~ 42 kDa. Ως θετικός και φόρτωσης έλεγχος χρησιμοποιήθηκε ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ACTB, και παρατηρήθηκε μία αναμενόμενη ανοσολογική-αντιδρώσα πρωτεΐνη 42 kDa. Ως αρνητικός έλεγχος, πραγματοποιήσαμε ένα έλεγχο προ-απορρόφηση από το πεπτίδιο που χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργηθεί το αντίσωμα PRAMEL1, και καμία ζώνη ανιχνεύθηκε. σι. ανάλυση της χρονικής πορείας της έκφρασης της πρωτεΐνης PRAMEL1 κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των όρχεων. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από νεογέννητα (Nb), 1-εβδομάδα (1w), 2-εβδομάδων (2W), 3-εβδομάδων (3w), 4-εβδομάδων (4w) και 8-εβδομάδων (8W), παλιά όρχεις υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western με το αντίσωμα PRAMEL1 ποντικού. Το επίπεδο έκφρασης του PRAMEL1 αυξήθηκε βαθμιαία από Nb να 3W και στη συνέχεια παρέμεινε σταθερός μετά από 3-εβδομάδων. Οι αριθμοί στα αριστερά δείχνουν τα μοριακά βάρη των πρότυπων πρωτεϊνών.

Η

Εντοπισμός της πρωτεΐνης PRAMEL1 κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης

Ερευνήσαμε την κυτταρική, χωρική και χρονική έκφραση της πρωτεΐνης PRAMEL1 κατά τη διάρκεια των γεννητικών κυττάρων ανάπτυξη με έμμεση μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Αρχικά, εξετάσαμε την πρωτεΐνη εντοπισμού PRAMEL1 στις διατομές των όρχεων σε νεαρά ποντίκια, από νεογέννητα έως 3 εβδομάδων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, δεν υπήρχε συγκεκριμένο μοτίβο χρώσης που παρατηρήθηκε για το αντίσωμα PRAMEL1 σε ολόκληρη την ενότητα σε 1 εβδομάδων όρχεων (Εικ. 3α, γ), αν και παρατηρήθηκε ασθενώς μη ειδική χρώση υποβάθρου τόσο για το αντίσωμα PRAMEL1 (Εικ. 3α, γ) και προ-απορροφήθηκε ελέγχου πεπτίδιο (Σχ. 3d). Αυτό μπορεί να είναι συνέπεια της σχετικά χαμηλής έκφρασης της μεταγραφής και της πρωτεΐνης σε αυτό το στάδιο (Εικ. 1 b και 2b). Σε σύγκριση με την προ-απορροφήθηκε έλεγχος πεπτίδιο όπου παρατηρήθηκε κάποια μη-ειδική χρώση (Εικ. 3θ), ειδική χρώση παρατηρήθηκε για το αντίσωμα PRAMEL1 κυρίως στο κυτταρόπλασμα των σπερματοκυττάρων σε 2-εβδομάδων όρχεων (Εικ. 3στ, h) . Όταν τα ποντίκια έφθασε ηλικία 3 εβδομάδων, μια πολύ μοναδική και ισχυρή χρώση ανιχνεύθηκε από το αντίσωμα PRAMEL1 στην περιπυρηνική περιοχή του γύρου σπερματίδες (Εικ. 3k, m), όπου παρατηρήθηκε ένα κάλυμμα που μοιάζει με δομή στην πυρηνική επιφάνεια (Εικ . 3m).

διατομές από 1-εβδομάδα (α-ε), 2-εβδομάδων (f-j) και 3-εβδομάδων (k-o), παλιά όρχεις ποντικού βάφτηκαν με το ποντίκι PRAMEL1 αντίσωμα. Παρά το γεγονός ότι δεν υπήρχε ειδικό σήμα που παρατηρείται σε όλα τα σπερματικά σωληνάρια σε 1-εβδομάδα-old όρχεων, ειδική χρώση (πράσινη) παρατηρήθηκε στο κυτταρόπλασμα των σπερματοκυττάρων (f, h) σε 2-εβδομάδων όρχεων και περιπυρηνική περιοχή του γύρου σπερματιδίων ( k, m) εντός 3 εβδομάδων όρχεων. Πάνελ Α, F, Κ είναι η χρώση αντισώματος PRAMEL1. Τα πάνελ b, g και l αντίθετα με ϋΑΡΙ να απεικονίσει πυρήνες. Πάνελ c, h και m είναι συγχωνευμένη εικόνες για τη χρώση PRAMEL1 και DAPI. Τα βέλη δείχνουν προς μια περιοχή με περιγράφεται σήματα. Πάνελ d, i και η είναι πεπτίδιο-προαπορροφήθηκε χρώση αντίσωμα ως αρνητικός έλεγχος. Πάνελ e, j και ο είναι Η &? Χρώση Ε για να δείξει τη δομή και τη κυτταρικούς τύπους των σπερματικών σωληναρίων. Η μεγέθυνση είναι × 400. μπαρ κλίμακας = 20 μm.

Η

Για να εξετασθεί περαιτέρω κατά πόσον το καπάκι-όπως δομή για την πυρηνική επιφάνεια του γύρου σπερματιδίων βρίσκεται στην πρόσθια ή οπίσθια πλευρά, η PRAMEL1 αντίσωμα ποντικού μαζί με το β-τουμπουλίνης ( Tubb) αντίσωμα που είναι ειδικά χρωματισμένο στην οπίσθια πλευρά του σπερματιδίων [33], εφαρμόστηκαν σε διατομές των όρχεων από ενήλικα ποντίκια. Σύμφωνα με χαμηλή μεγέθυνση (χ 400), καθώς η διαφοροποίηση των σπερματικών προχωρά επιθήλιο, PRAMEL1 μπορεί να φανεί στην περιπυρηνική περιοχή των μετα-μειωτικά γεννητικά κύτταρα (στρογγυλά, επιμηκύνοντας και επιμήκη σπερματίδια) (Σχ. 4α, e, i), ενώ Tubb παρατηρήθηκε στην απέναντι πλευρά της χρώσης PRAMEL1 στα επιμήκυνσης και επιμήκη σπερματίδες (Εικ. 4Ε, i), υποδεικνύοντας ότι η πρωτεΐνη PRAMEL1 βρισκόταν στο πρόσθιο πλευρά (

δηλαδή

ακροσωματίου) της πυρηνικής περιοχής σε σπερματίδες ποντίκι. Μια πιο προσεκτική εξέταση των ανοσοφθορισμό-τομές των όρχεων σε μεγαλύτερη μεγέθυνση (× 1000) έδειξε ότι η πρωτεΐνη PRAMEL1 παρατηρήθηκε για πρώτη φορά το γύρο σπερματίδες, όπου συνδέθηκε στενά με μια δομή καπάκι-όπως στην πυρηνική επιφάνεια (Εικ. 5α, β ). Σε σύγκριση με το τμήμα όρχεων, η πατημένη παρασκευή του γύρου σπερματιδίων προσφέρονται περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με το πρότυπο χρώσης, όπου PRAMEL1 παρατηρήθηκε κυρίως στο κυστίδιο ακροσωμιακή, με μικρή ή καθόλου χρώση στην περιοχή ακροσωμιακή κόκκου (Σχ. 5β). Αυτό το μοτίβο συνέπεσε με το σχηματισμό του κυστιδίου ακροσωμιακή που απλώνεται σε ένα λεπτό στρώμα πάνω από τον πόλο του πυρήνα για να σχηματίσει το πώμα ακροσωμιακή. Σε αυτό το στάδιο, δεν παρατηρήθηκε χρώση για Tubb επειδή το μαστίγιο δεν είχε ακόμα σχηματιστεί (Σχήμα 4α-ά?. Το Σχ. 5a, b). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η εξέλιξη του PRAMEL1 εντοπισμού αλλάζει σύμφωνα με μορφολογικές αλλοιώσεις συμβαίνουν σε ακροσωματίου και πυρήνα κατά την διάρκεια σπερμιογένεσης (Σχήμα 4α, e, i?. Το Σχ. 5a-g). Όταν τα στρογγυλά σπερματίδια αρχίζουν να επιμηκύνονται και το μαστίγιο αρχίζει να αναπτύσσει, Tubb παρατηρήθηκε στην απέναντι πλευρά της χρώσης PRAMEL1 στην περιπυρηνική περιοχή, που σηματοδοτεί την θέση της ανάπτυξης μούφα και σχηματισμού μαστιγίου (Σχήμα 4e, θ?. Σχ. 5c- σολ). Με την πρόοδο της σπερματοζωιδίου μορφογένεση, η χρώση πρωτεΐνης PRAMEL1 επεκταθεί σε διάστημα περίπου 1/3 της πυρηνικής επιφάνειας, μιμούμενη ακροσωματίου ανάπτυξη (Σχ. 5a-g). Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας δείχνουν σαφώς ότι η πρωτεΐνη PRAMEL1 συνδέεται με την ακροσώματος στην σπερματίδες. Ως αρνητικοί έλεγχοι, οι τομές χρωματίστηκαν είτε με το πρωτογενές αντίσωμα προ-απορροφάται με το αντίστοιχο πεπτίδιο ή μόνο με το δευτερογενές αντίσωμα. Δεν υπάρχει σήμα φθορισμού ανιχνεύθηκε στα τμήματα ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι η μη ειδική χρώση ήταν ελάχιστη. (Εικ 4m-p?. Εικ. 5h)

Διατομές από ενήλικα (≥ 2 μηνών) όρχεις ποντικού ήταν διπλή-βάφονται με το PRAMEL1 ποντικιού (πράσινο) και TUBA (κόκκινο) αντισώματα. Η χρώση PRAMEL1 παρατηρήθηκε σε γύρο (α), επιμήκυνση (ε) και επιμήκη (i) κατά τη διάρκεια της σπερματίδες σπερμιογένεσης. Η χρώση TUBA παρατηρήθηκε σε επιμήκυνση (στ) και επιμήκεις (ι) σπερματίδια, αλλά όχι στο γύρο σπερματίδια (β). Όλες οι τομές επιχρωματίστηκαν με DAPI (Πάνελ c, g, k και ιε) να απεικονίσει πυρήνες. Πάνελ d, h, l και σ συγχωνεύονται εικόνες για PRAMEL1, τούμπα και χρώση DAPI. Τα βέλη δείχνουν προς μια περιοχή με περιγράφεται σήματα. Τα ένθετα σε d, h, και l διευρυμένη εικόνα για τις περιοχές βέλος σήμανση (βλέπε επίσης Εικ. 5α, γ, ε και ζ). Πάνελ m και η είναι δευτεροβάθμιων ελέγχων αντισώματος για ΡΙΤΟ-επισημασμένο γαϊδάρου IgG αντι-κατσίκας και TRITC-επισημασμένο γαϊδάρου αντι-ποντικού IgG, αντίστοιχα. Η μεγέθυνση είναι × 400. Κλίμακα ράβδου = 20 μm.

Η

τμήματα όρχεων (a, c, e και g) και παρασκευάσματα σκουός του σπερματικών σωληναρίων (b, d, f και h) βάφτηκαν με αντι-PRAMEL1 (πράσινο) , αντι-Tubb (κόκκινο) και DAPI (μπλε). Συγχωνευμένη εικόνων για την τριπλή χρώση σε στρογγυλά σπερματίδες (α και β), επιμηκύνοντας σπερματίδια (c, d, e και f) και επιμήκη σπερματίδια (ζ) δείχνονται. Η χρώση PRAMEL1 παρατηρήθηκε στην φλύκταινα περιοχή ακροσωμιακή όλων των αναπτυσσόμενων σπερματίδες και το λέκιασμα Tubb παρατηρήθηκε στην μούφα επιμηκύνεται και επιμήκη σπερματίδια. Ως δευτερεύον αντίσωμα ελέγχου παρασκευή όρχεις σκουός (h) χρωματίστηκε με FITC-επισημασμένο γαϊδάρου IgG αντι-κατσίκας και TRITC-επισημασμένο γαϊδάρου αντι-ποντικού IgG. Η μεγέθυνση είναι × 1000. μπαρ κλίμακας = 10 μm.

Η

Εντοπισμός PRAMEL1 στο όρχεων και της επιδιδυμίδας τα σπερματοζωάρια

Ερευνήσαμε περαιτέρω την υποκυτταρική κατανομή των PRAMEL1 στο όρχεων /επιδιδυμίδας τα σπερματοζωάρια με την εκτέλεση έμμεση χρώση ανοσοφθορισμού, χρησιμοποιώντας το PRAMEL1- και α-τουμπουλίνης (TUBA) -εξειδικευμένης αντισώματα. Τα σπερματοζωάρια συλλέχθηκαν από στριμωγμένος σπερματικών σωληναρίων των όρχεων ώριμη, και caput, corpus και cauda περιοχές της επιδιδυμίδας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, παρόμοια με χρώση σε σπερματίδια, PRAMEL1 εντοπίζεται κυρίως στην πρόσθια περιοχή ακροσωματίου των σπερματοζωαρίων (Εικόνα 6a, b, d, e?. Πίνακας 2). Όπως παρατηρήθηκαν διαφορετικά μοτίβα χρώσης μεταξύ των όρχεων και της επιδιδυμίδας τα σπερματοζωάρια, πάνω από 200 σπερματοζωάρια από κάθε ομάδα (Πίνακας 2) εξετάστηκαν για να μελετηθεί η λεπτομερής εντόπιση της πρωτεΐνης PRAMEL1 στα κύτταρα σπέρματος. Βρήκαμε ότι όλοι όρχεων σπερματοζωάρια (100%) έδειξαν ακροσωμιακή εντοπισμός του PRAMEL1, ενώ μόνο το 86,5% των σπερματοζωαρίων επιδιδυμίδας ήταν θετικά για PRAMEL1 στην περιοχή ακροσωμιακή (Πίνακας 2). Επιπλέον, PRAMEL1 παρατηρήθηκε στον κύριο κομμάτι του μαστιγίου (41%) σε όρχεων σπερματοζωάρια (Σχ. 6α, Πίνακας 2), ενώ παρατηρήθηκε στο συνδετικό τεμάχιο (96%) και μεσαίο κομμάτι (87,9%) σε επιδιδυμίδας τα σπερματοζωάρια (caput, corpus, και cauda) (Σχ 6a, b, d, e?. Πίνακας 2). χρώση PRAMEL1 παρατηρήθηκε επίσης σε κυτταροπλασματικά σταγονίδια επιδιδυμίδας τα σπερματοζωάρια (Εικ. 6d). Βρήκαμε ότι το 55% των σπερματοζωαρίων επιδιδυμίδας είχε κυτταροπλασματική σταγονίδια που βρίσκεται στο περιφερικό άκρο του μεσαίου τμήματος. Περίπου 73% εκείνης της κυτταροπλασματικής σταγονιδίων που φέρουν σπερματοζωάρια έδειξε το σήμα PRAMEL1 στην κυτταροπλασματική σταγονιδίων (Εικ 6δ?. Πίνακας 2). Παρατηρήσαμε επίσης ότι το ποσοστό των κυτταροπλασματικής σταγονιδίων που φέρουν σπερματοζωαρίων ποικίλει μεταξύ των τριών ποντικών που μελετήθηκαν. Και για τα δύο όρχεων και της επιδιδυμίδας τα σπερματοζωάρια, δεν χρώση PRAMEL1 παρατηρήθηκε στην περιοχή δακτυλίου του μαστιγίου. TUBA εντοπίστηκε στην πρόσθια περιοχή ακροσωμιακή των κεφαλών των σπερματοζωαρίων, και το μεσαίο κομμάτι και κύριο κομμάτι των σπερματοζωαρίων μαστίγιο της επιδιδυμίδας σπερματοζωαρίων (Εικ. 6α, β, δ, και ε). Δεν παρατηρήθηκε σήμα όταν πρωτογενή αντισώματα είχαν παραλειφθεί κατά τη διάρκεια της χρώσης, υποδηλώνοντας ελάχιστη μη ειδική σύνδεση του με φθορισμό σημασμένο δευτερεύοντα αντισώματα (Εικ. 6c, f).

σπερματοζωάρια ποντικού που συλλέχθηκε από παρασκευάσματα σκουός του σπερματικών σωληναρίων (α , β και γ) και επιδιδυμίδα (d, e και f) βάφτηκαν με το PRAMEL1 (πράσινο), τούμπα (κόκκινο) αντισώματα και DAPI (μπλε). Η χρώση PRAMEL1 παρατηρήθηκε στην περιοχή της ακροσωματίου όρχεων και της επιδιδυμίδας τα σπερματοζωάρια (a, b, d και e). Σε όρχεων σπερματοζωάρια (α) PRAMEL1 ανιχνεύθηκε επίσης στο κύριο κομμάτι του μαστιγίου του σπέρματος, ενώ σε επιδιδυμίδας τα σπερματοζωάρια (δ και ε) παρατηρήθηκε κυρίως η χρώση PRAMEL1 στο συνδετικό κομμάτι, μεσαίο κομμάτι και κυτταροπλασματική σταγονιδίων. Ως δευτερεύον αντίσωμα ελέγχου ο όρχεων (c) και της επιδιδυμίδας (στ) σπερματοζωάρια βάφτηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένο γαϊδάρου IgG αντι-κατσίκας και TRITC-επισημασμένο γαϊδάρου αντι-ποντικού IgG. Μεγέθυνση × 1000. μπαρ κλίμακας = 10 μm.

Η

Συζήτηση

Αν και PRAME έχει μελετηθεί εκτενώς στην ογκογένεση και τη βιολογία του καρκίνου, και χρησιμοποιείται ως βιολογικός δείκτης για τη διάγνωση του καρκίνου και αντιγόνου ειδική ανοσοθεραπεία του καρκίνου [28] – [32], [34], η λειτουργία της οικογένειας γονιδίων PRAME σε γαμετογένεσης και την αναπαραγωγή δεν έχει χαρακτηριστεί. Στην παρούσα μελέτη, χαρακτήρισε την έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης του ποντικιού

Pramel1

γονίδιο, ένα μέλος της

PRAME

οικογένεια γονιδίων, κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των όρχεων και τη σπερματογένεση. Τα αποτελέσματά μας έδειξε σαφώς ότι PRAMEL1 εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα των σπερματοκυττάρων και ακροσωματίου και μαστιγίου των σπερματιδίων και σπερματοζωαρίων, τα οποία παρέχουν την πρώτη εικόνα του δυναμικού λειτουργίας του

PRAME

γονίδιο οικογένεια στην σπερματογένεση. Για να κατανοήσουμε τη βιολογική ρόλο (ες) όλης αυτής της γονιδιακής οικογένειας και η σχέση μεταξύ του

Pramel1

και άλλα μέλη της οικογένειας, θα ανακτηθεί εκφραστική δεδομένα για ένα σύνολο 10

PRAME

παράλογα από ο Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/geo) (Πίνακας 3) [35] – [40]. Σε συνδυασμό με τα δεδομένα RT-PCR που λαμβάνονται από αυτό το έργο, ήμασταν σε θέση να συγκεντρωθούν αυτά τα παράλογα σε τρεις μεγάλες ομάδες με βάση τα προφίλ έκφρασης χωρική και χρονική τους: ομάδα Ι, εκφράζεται μόνο στα αρσενικά γονάδων και των γεννητικών κυττάρων (

PRAME

και

Pramel1

)? ομάδα ΙΙ, εκφράζονται μόνο σε γυναίκες γονάδων και των γεννητικών κυττάρων (

Oog1-3

)? και η ομάδα ΙΙΙ, εκφράζεται κυρίως σε δύο αρσενικά και θηλυκά γονάδες (

Pramel, Praeml3, Pramef8, Pramef12,

και

Oog4

) (Πίνακας 3). Συλλογικά, οι αποκλίνουσες μορφές έκφρασης του

PRAME

παράλογα κατά τη διάρκεια της γαμετογένεσης και στα δύο αρσενικά και θηλυκά δείχνουν ότι διάφορα μέλη του

PRAME

γονίδιο της οικογένειας μπορούν να συμμετέχουν σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια της γαμετογένεσης και εμβρυογένεσης.

Η

έχει αναφερθεί σε προηγούμενες μελέτες που έχουν διαφορετικές CTAs εμπλέκονται σε διάφορα στάδια της σπερματογένεσης. Μερικά από τα οποία εκφράζονται αποκλειστικά σε ένα στάδιο, όπως SYCP1 (

synaptonemal σύμπλοκο πρωτεΐνης 1

, επίσης γνωστή ως HOM-TES-14), το οποίο περιορίζεται σε μειωτική prophase σπερματοκυττάρων, και SP17 (

πρωτεΐνη σπέρμα 17

), η οποία εκφράζεται στην ώριμα σπερματοζωάρια μόνον [41], [42]. Άλλες CTAs όπως CTAG1 (

καρκίνο του /των όρχεων αντιγόνο 1

, επίσης γνωστή ως NY-ESO-1) και TRO (

trophinin

, επίσης γνωστή ως

magphinin

ή MAGE -θ3), εκφράζονται σε διάφορα στάδια της σπερματογένεσης. CTAG1 εκφράζεται σε σπερματογόνια μέσω σπερματοκύτταρα παχυτενίου [43], [44], ενώ TRO εκφράζεται σε σχεδόν όλους τους τύπους των γεννητικών κυττάρων από σπερμογονίων προς ώριμα σπερματοζωάρια [45]. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι, όπως και το

Tro

γονίδιο, το ποντίκι

Pramel1

εκφράζεται ευρέως σε διαφορετικούς τύπους βλαστικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης. Η πρωτεΐνη PRAMEL1 εντοπίστηκε για πρώτη φορά, αν και σε σχετικά χαμηλό επίπεδο, στους όρχεις νεογέννητων με κηλίδωση Western, υποδεικνύοντας την έκφραση του PRAMEL1 σε σπερμογονίων. Μία βαθμιαία αύξηση του επιπέδου της PRAMEL1 ανιχνεύθηκε στους όρχεις σε 1-, 2-, 3-εβδομάδων και διατηρείται στο υψηλότερο επίπεδο στις ώριμες όρχεις. Αυτή η αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης συμπίπτει με την αύξηση στην έκφραση RNA από νεογέννητα έως 1 εβδομάδων όρχεις, και θα μπορούσε να εξηγηθεί από την προς τα πάνω ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, ή εναλλακτικά, με την αύξηση του αριθμού των γεννητικών κυττάρων ως εκεί είναι δραματική πολλαπλασιασμός των γεννητικών κυττάρων πριν από το πρώτο κύμα της σπερματογένεσης.

σε αντίθεση με τα καρκινικά κύτταρα στα οποία η πρωτεΐνη PRAME εντοπίστηκε στον πυρήνα, ο PRAMEL1 ποντίκι παρατηρήθηκε για πρώτη φορά στο κυτταρόπλασμα των σπερματοκυττάρων σε 2-εβδομάδων όρχεις σε αυτή τη μελέτη. Μια κυρίαρχη έκφραση της πρωτεΐνης PRAMEL1 στη συνέχεια παρατηρήθηκε στην πρόσθια περιοχή του (γύρο, επιμηκύνοντας και επιμήκη) σπερματίδες, σε συντονισμό με τις μορφολογικές αλλοιώσεις του ακρόσωμα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η

Pramel1

παίζει ρόλο στην ανάπτυξη ακρόσωμα . Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι PRAMEL1 ήταν διαφορικά κατανεμημένη κατά μήκος διαφορετικών τμημάτων του μαστιγίου σπερματοζωαρίων μεταξύ των όρχεων και της επιδιδυμίδας τα σπερματοζωάρια. Δεδομένου ότι η κινητικότητα κέρδος σπερματοζωάρια κατά τη μετάβαση από όρχεις έως το ουραίο περιοχή του επιδιδυμίδας, η διαφορική εντοπισμός του PRAMEL1 κατά μήκος διαφορετικών τμημάτων του μαστιγίου κατά τη μετάβαση του σπέρματος μπορεί να είναι μια ένδειξη ότι PRAMEL1 εμπλέκεται στην ωρίμανση σπέρματος και κινητικότητα (βλέπε συζήτηση κατωτέρω ).

Προγενέστερες μελέτες σε καρκινικά κύτταρα έδειξαν ότι λειτουργεί PRAME είτε ως καταστολέας της μεταγραφής της RA σηματοδότησης [27], ή σαν ένας ενεργοποιητής της μεταγραφής σε περιοχές προαγωγού δεσμεύεται από NFY [29], [32]. Ωστόσο, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι

Pramel1

δεν μπορούν να συμμετέχουν στη ρύθμιση της μεταγραφής μέσω ΚΑ και NFY μεσολάβηση μηχανισμών, επειδή (1) PRAMEL1 εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των γεννητικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης, και (2) το πιο σημαντικό, η μεταγραφή έχει κλείσει κατά τη διάρκεια τα μέσα σπερματογένεση [27], [29], [31] και τα σπερματοζωάρια είναι τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα ουσιαστικά στερούνται μεταγραφικής και μεταφραστικής δραστηριότητας [46].

αξίζει να σημειωθεί ότι δύο LRR- που περιέχουν, έχουν όρχεις-εκφρασμένων πρωτεϊνών έχουν εμπλακεί στην σπερματογένεση, δηλαδή LRRC67 (

πλούσιες σε λευκίνη επανάληψης που περιέχουν 67

, επίσης γνωστή ως όρχεις LRR ή TLRR) και PPP1R7 (

πρωτεϊνική φωσφατάση 1, ρυθμιστικά (αναστολέας) υπομονάδα 7

, επίσης γνωστή ως Sds22) [47], [48]. Αμφότερες οι πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με ένα κεντρικό φωσφατάση,

πρωτεϊνική φωσφατάση 1

(ΡΡ1), το οποίο χρησιμεύει ως γονίδιο πλήμνη σε διάφορες κανονιστικές διαδικασίες [46] – [48]. Η πρωτεΐνη LRRC67 αλληλεπιδρά με την ΡΡ1 να σχηματίσει ένα σύμπλοκο που συμμετέχουν στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού σε αρσενικούς γεννητικά κύτταρα [49]. Η πρωτεΐνη LRRC67 αλληλεπιδρά επίσης με κινησίνη που σχετίζονται με το μοριακό μοτέρ, KIFC1 (

κινεσίνη μέλος της οικογένειας C1

), για τη μεταφορά των μορίων κατά μήκος των μικροσωληνίσκων στη μούφα [33], [50]. Παρομοίως, η αλληλεπίδραση των ΡΡ1 και PPP1R7 έχει επίσης εμπλακεί στην ανάπτυξη του σπέρματος. Ο διμερισμός των PPP1R7 και PP1γ2 οδηγεί σε μείωση της δραστηριότητας φωσφατάσης της PP1γ2 και στη συνέχεια επάγει την κινητικότητα των σπερματοζωαρίων ουραίου [51], [52]. Λόγω παρόμοιες δομικές και έκφραση μοτίβα, προβλέπουμε ότι PRAMEL1 μπορούν να αλληλεπιδράσουν με PP1γ2 για τη μεταφορά των μορίων κατά μήκος των μικροσωληνίσκων στο μαστίγιο του σπέρματος. Μένει να εξακριβωθεί αν PRAMEL1 εκτελεί τη λειτουργία όμοια με ακρόσωμα σχηματισμό και κινητικότητας του σπέρματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα

C57BL /6J ποντίκια που εκτράφηκαν σε αποικία μας η εγκατάσταση του ποντικιού το Pennsylvania State University, και συνολικά έξι ζευγάρια των κτηνοτρόφων στήθηκαν. Όρχεις απομακρύνθηκαν από ποντικούς στους 0 ημέρα (νεογέννητα), 1 εβδομάδα, 2 εβδομάδες, 3 εβδομάδες, 4 εβδομάδες και 8 εβδομάδες της ηλικίας. Τουλάχιστον τρία ζώα (βιολογική επαναλήψεις) χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ηλικία. Όρχεις, την επιδιδυμίδα και σε άλλους ιστούς από τα ενήλικα αρσενικά αναπαραγωγής και τις ωοθήκες από τα γυναικεία κτηνοτρόφους συλλέχθηκαν μετά την περίοδο αναπαραγωγής. Όλες οι διαδικασίες ζώων είχαν εγκριθεί από το Θεσμικό Animal Care and Use Επιτροπή το Pennsylvania State University (IACUC).

Προετοιμασία των όρχεων ιστών

Για όρχεις ιστολογία, ολόκληρη όρχεις αποκόπηκαν από ενήλικα ποντίκια και σταθερό με επώαση όλη τη νύκτα σε διάλυμα Bouin (Sigma-Adrich, St. Louis, ΜΟ) στους 4 ° C. Οι ιστοί στη συνέχεια πλύθηκαν σε 70% αιθανόλη, αφυδατώθηκαν, και ενσωματώθηκαν σε μπλοκ παραφίνης. Οι ιστοί εγκλεισμένοι σε παραφίνη κόπηκαν σε τομές των 4 μm χρησιμοποιώντας μια μικροτόμο και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες.

στριμωγμένος δείγματα όρχεων παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [53]. Εν συντομία, τα ενήλικα όρχεις αποκόπηκαν και μεταφέρθηκαν σε ένα γυάλινο τρυβλίο Petri που περιέχει παγωμένο PBS (140 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 6,4 mM Να

2HPO

4, και 1,4 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4, ρΗ 7.4). Μετά την απομάκρυνση του ινώδη χιτώνα, σπερματικά σωληνάρια μεταφέρθηκαν σε ένα νέο τρυβλίο Petri που περιέχει PBS. Χρησιμοποιώντας λεπτές λαβίδες, τα σωληνάρια ήπια τραβιέται χώρια και κόψτε ένα μικρό κομμάτι του ενιαίου σωληνάριο. Το κομμάτι του σπερματικών σωληναρίων μεταφέρθηκε σε ένα νέο τρυβλίο Petri και προστέθηκαν 15-30 μΙ διαλύματος 0.1 Μ σακχαρόζης που παρασκευάζεται σε PBS. Τα κύτταρα απελευθερώνονται από το σωληνάριο με tweezing χώρια το σωληνάριο και εκ νέου εναιώρηση στο διάλυμα σακχαρόζης με σιφωνισμό πάνω και κάτω.