Αφηρημένο

Η mesothelin (

MSLN

) γονίδιο κωδικοποιεί μια 71 kilodalton (kDa) πρωτεΐνη πρόδρομο που υποβάλλονται σε επεξεργασία σε μεγακαρυοκυτταρική παράγοντας δυναμικοποίησης (MPF), μια πρωτεΐνη 31 kDa που εκκρίνεται από το κύτταρο, και ώριμα mesothelin (mMSLN), μια 40 kDa πρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας. Η mMSLN δεσμεύεται με CA125, μια αλληλεπίδραση που έχει ενοχοποιηθεί για την ενδο-σπηλαιώδη εξάπλωση του μεσοθηλιώματος και του καρκίνου των ωοθηκών. Για τον καλύτερο καθορισμό του ρόλου της MPF και mMSLN, την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα Α549 κυτταρική σειρά αξιολογήθηκε σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια με αδρανοποίηση του

Msln

γονίδιο. Παρατηρήσαμε ότι

Msln

– /- ποντίκια ξενο-μεταμόσχευσις ενδοπεριτοναϊκή όγκους Α549 επιβιώνουν σημαντικά καιρό από ό, τι φέρουν όγκο

Msln + /+

ποντίκια. Όταν φέρουν όγκο

Msln

– /-

ποντίκια

συμπληρώνονται με ανασυνδυασμένο MPF (και σε μικρότερο βαθμό mMSLN), το μεγαλύτερο μέρος αυτής πλεονέκτημα επιβίωσης χάνεται. Αυτές οι μελέτες καταδεικνύουν ότι MPF και mMSLN έχουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων

σε

vivo

και εγείρουν την πιθανότητα ότι η αδρανοποίηση του MPF μπορεί να είναι μια χρήσιμη θεραπεία για πνεύμονα και άλλων MSLN καρκίνων που εκφράζουν

Παράθεση:. Zhang J, Bera TK, Liu W, Du X, Alewine C, Χασάν R, et al. (2014) μεγακαρυοκυτικών ενισχυτικά Factor και Ώριμη Mesothelin διεγείρει την ανάπτυξη μιας γραμμής καρκίνο του πνεύμονα στην περιτοναϊκή κοιλότητα των ποντικών. PLoS ONE 9 (8): e104388. doi: 10.1371 /journal.pone.0104388

Επιμέλεια: Prasad Σ Adusumilli, Memorial Sloan-Kettering,, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Απριλίου, 2014? Αποδεκτές: 12, Ιουλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Αυγούστου του 2014

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η mesothelin

(MSLN)

γονίδιο κωδικοποιεί μια περιορισμένη καταγωγή αντιγόνο όγκου που εκφράζεται σε φυσιολογικά mesothelial επιθηλιακά κύτταρα του υπεζωκότα, του περιτοναίου και του περικαρδίου. Είναι επίσης εξαιρετικά εκφράζεται σε μεσοθηλιώματα epitheliod, τα οποία προέρχονται από φυσιολογικά μεσοθηλιακών κυττάρων, και παρεκκλίνοντα σε πολλές άλλες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών, του παγκρέατος, του πνεύμονα, του στομάχου, χολαγγειοκαρκίνωμα και τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού [1] – [4]. Η

MSLN

γονίδιο κωδικοποιεί μια 71 kDa πρόδρομη πρωτεΐνη που υποβάλλονται σε επεξεργασία σε δύο ώριμες πρωτεΐνες: μεγακαρυοκυτικών ενισχυτική Factor (MPF) και ωριμάζουν MSLN (mMSLN). MPF είναι μια kDa γλυκοπρωτεΐνη 31 που εκκρίνεται από το κύτταρο στο αίμα. Το mMSLN είναι ένα 40 kDa γλυκοπρωτεΐνη πρωτεΐνη που παραμένει δεσμευμένο στην κυτταρική μεμβράνη με φωσφατιδυλινοσιτόλη [5], [6], αλλά ρίχνει από την κυτταρική επιφάνεια την πάροδο του χρόνου μέσω της δράσης του ΤΝΡ-α μετατρεπτικού ενζύμου (Εικ. 1) [7 ]. Η mMSLN έχει αποδειχθεί ότι δεσμεύονται σε MUC 16 (CA125)? αυτή η αλληλεπίδραση έχει ενοχοποιηθεί για την ενδο-σπηλαιώδη εξάπλωση του μεσοθηλιώματος και του καρκίνου των ωοθηκών [8]. Μελέτες

Msln

γονιδίου νοκ άουτ (- /-) ποντίκια δείχνουν ότι το γονίδιο δεν είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική ανάπτυξη και την αναπαραγωγή, αλλά αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν εγείρει την πιθανότητα ότι

MSLN

μπορεί να ρυθμίσει τον καρκίνο κυτταρική ανάπτυξη [9] – [12]. Σε αρουραίους Eker, η ανάπτυξη της οζώδη σκλήρυνση-2 επαγόμενη από νεφρικό καρκίνωμα ήταν σημαντικά μειωμένη σε απουσία ενός ομολόγου του

MSLN

γονίδιο [13], [14]. Σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, υπερέκφραση του

MSLN

έχει εμπλακεί στην σημαντική ενίσχυση της ανάπτυξης του όγκου των κυττάρων και μετανάστευση

στο

vitro

[11]. Πρόσφατα το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης MSLN συσχετίστηκε με την επιθετικότητα του όγκου, καθώς και μειωμένη συνολική επιβίωση των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα πρώιμου σταδίου [15], αλλά ο μοριακός μηχανισμός που συμβάλλει στην εν λόγω φαινοτύπους δεν είναι καλά κατανοητοί. CA125, μια που συνδέεται μεμβράνη αντιγόνο του καρκίνου των ωοθηκών, έχει αναφερθεί ότι αλληλεπιδρά με MSLN, και έχει προταθεί ότι αυτή η αλληλεπίδραση μπορεί να διευκολύνει τη μετάσταση του καρκίνου των ωοθηκών. Αν και σύνδεση του MSLN κυττάρων που εκφράζουν προς CA125 έχει αποδειχθεί σε κυτταρική καλλιέργεια [8], [16], δεν υπάρχουν τα πειράματα σε ζώα δείχνουν ότι αυτή η αλληλεπίδραση είναι σημαντική σε ποντίκια που φέρουν όγκο.

GPI, γλυκοσυλφωσφατιδυλινοσιτόλης.

Έχουμε παράγονται αθυμικά γυμνά ποντίκια στα οποία το

Msln

γονίδιο απενεργοποιείται, εμποδίζει την παραγωγή mMsln και Mpf πρωτεΐνη. Αυτοί οι ποντικοί πολλαπλασιάζεται κανονικά και δεν υπάρχουν ανωμαλίες στην ανάπτυξή τους ή άλλες ιδιότητες έχουν παρατηρηθεί. Επειδή αυτά τα ποντίκια δεν κάνουν Mpf και δεν έχουν Msln στα κύτταρα που ευθυγραμμίζουν την περιτοναϊκή κοιλότητα, έχουμε τους χρησιμοποιήθηκε για να διερευνηθεί κατά πόσο η απουσία Msln επηρεάζει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα εμβολιάστηκαν εντός της περιτοναϊκής κοιλότητας αυτών των ποντικών.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και Ανοσοϊστοχημεία

Ο καρκίνος του πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή ελήφθη από τον Dr. Hisataka Kobayashi (National Cancer Institute, ΝΙΗ, Bethesda, USA) και η ταυτότητά του επιβεβαιώθηκε με τη λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA χρησιμοποιώντας Σύντομη δοκιμασία διαδοχικές επαναλήψεις. Το ανθρώπινου επιδερμοειδούς Α431 κυτταρική γραμμή καρκινώματος αγοράστηκε από την ATCC (Mananasas, VA) και διατηρήθηκαν στο εργαστήριο, όπως συνιστάται. Η ανοσοϊστοχημική χρώση για MSLN και CA125 διεξήχθη με Histoserv, Inc (Germantown, MD) χρησιμοποιώντας αντι-MSLN ποντικού 5Β2 (Novocastra Αντιδραστήρια από την Leica Bioystems, Buffalo Grove, IL) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], και αντι-CA125 ποντικού OC125 (Zymed Laboratories) σε αραίωση 1:50.

Πειράματα σε ζώα

Οι προτάσεις Μελέτη των ζώων (LMB-053 και LMB-014) εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης ΝΙΗ των ζώων. Όλα τα πειράματα σε ζώα συμπεριλαμβανομένης της θεραπείας και της θυσίας διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες του ιδρύματός του ΝΙΗ. Αθυμικά γυμνά ποντίκια (NCr-ηυ /ηυ) και Nude /

Msln

– /- ποντίκια ελήφθησαν από το NCI-Frederick στεγάστηκαν σε κλουβιά μικρο-απομονωτή καθ ‘όλη τη διάρκεια του πειράματος. Όλα τα ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα ήταν θηλυκά, βάρους (15-20 g) και ηλικίας (7-10 εβδομάδες) συμφωνημένα. Όλες οι ενέσεις ήταν ενδοπεριτοναϊκή (ΙΡ) εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Α549 και Α431 IP ξενομοσχεύματα καθορίστηκαν με ενοφθαλμισμό 2 χ 10

6 κύτταρα σε 200 μΐ κυτταρικού αιωρήματος σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Για την υποδόρια μοντέλο, 2 × 10

κύτταρα Α549 6 εγχύθηκαν εντός του δεξιού μηρού. Όλες οι θεραπείες ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη διεξήχθησαν με ΙΡ ένεση πρωτεΐνης μελέτη 25 μg σε 200 μΙ PBS, τρεις φορές την εβδομάδα για ένα σύνολο τριών εβδομάδων. Για μελέτες επιβίωσης, τα ποντίκια παρακολουθούνται καθημερινά και θυσιάστηκαν με CO

2 εισπνοή όταν ετοιμοθάνατα

Δημιουργία

Msln

-. /- Αθυμικά γυμνά ποντίκια

Άνδρας

Msln

null ποντίκια σε C57 /BL6 γενετικό υπόβαθρο (

Msln

– /-) [9] χρησιμοποιήθηκαν για την πίσω σταυρό με θηλυκό BALB /c αγρίου τύπου (WT) ποντίκια και νεογνά εξετάστηκαν για

Msln

ετερόζυγο αλληλόμορφο. Αρσενικά ποντίκια ετεροζυγώτες από κάθε γενιά χρησιμοποιήθηκαν στην πλάτη σταυρό με θηλυκά WT BALB /c και πίσω διάβαση έγινε για περισσότερο από δέκα γενιές. Τα αρσενικά ετερόζυγο για

Msln

σε BALB /c γενετικό υπόβαθρο διασταυρώθηκαν με αθυμικά γυμνά (Fox Ν) θηλυκά να δημιουργήσει Fox Ν null /

Msln

– /- ποντίκια. Από το Fox Ν null /

Msln

– /- θηλυκά ποντίκια δεν είναι καλοί κτηνοτρόφοι, χρησιμοποιήσαμε

Msln

– /- /Fox Ν Het γυναίκες και οι εταίροι αναπαραγωγής για Fox Ν null /em

Msln

– /- άνδρες για να διατηρήσει και να δημιουργήσει Fox Ν null /

Msln

– /-. γυναίκες για τα πειράματά μας

Δημιουργία MPF-Rabbit (r) Fc, mMSLN- RFC και CD22-RFC πρωτεϊνών σύντηξης σε κύτταρα θηλαστικών

Για την παραγωγή ανασυνδυασμένης εκδόσεις mMSLN και MPF, mMSLN-RFC και MPF-RFC εκφράστηκαν ως πρωτεΐνες σύντηξης με IgG κουνελιού (RFC) σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ και καθαρίστηκε όπως προηγουμένως περιγράφεται [18]. πρωτεΐνη σύντηξης CD22-RFC παρασκευάστηκε για χρήση σαν ένας έλεγχος.

Κυτταρομετρία Ροής

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό FACS (PBS με 5% FBS και 0.1 % αζίδιο του νατρίου), στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-mesothelin αντίσωμα, ΜΝ (Rockland Immunochemicals Inc., Gilbertsville, ΡΑ) ή Morab-009 (Morphotek Inc, Exton, ΡΑ) ή αντι-MUC 16 αντίσωμα, το OC125 (Abcam, Cambridge, ΜΑ) σε συγκέντρωση 5 μg /ml. αντίσωμα ισοτόπων ταιριαστό χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η σύνδεση των πρωτογενών αντισωμάτων σε καρκινικά κύτταρα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας είτε αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού συζευγμένο με R-φυκοερυθρίνη (R-ΡΕ) (Invitrogen) ή με αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού συζευγμένο με FITC (Biosource). Ο φθορισμός που συνδέεται με τα ζωντανά κύτταρα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα FACS Calibur (BD Biosicences). Γεωμετρική μέσα εκφράστηκαν ως μέση ένταση φθορισμού (MFI). Η MFI των κυττάρων συγκρίθηκε με το MFI από μία πρότυπη καμπύλη του R-ΡΕ-συζευγμένα σφαιρίδια βαθμονόμησης (BD QuantiBRITETM ΡΕ κιτ επιμέτρησης, BD Biosciences) και τον αριθμό των τόπων mMSLN ανά εκτιμήθηκε κύτταρο. Τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια με ΜΝ (n = 2 πειράματα) ή Morab-009 (η = 3 πειράματα).

MPF Ποσοτικοποίηση

Α549 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με είτε φορέα ελέγχου (Α549 /pcDNA) ή MPF φορέα έκφρασης (Α549 /MPF) απλώθηκαν σε πιάτα που περιέχουν ίση ποσότητα πλήρους μέσου και επωάστηκαν για 48 ώρες. Ο συνολικός πληθυσμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν μετρητή κυττάρου Cellometer Vision (Nexcelom, St. Lawrence, ΜΑ) Ένα κλάσμα ίσων όγκων ρυθμισμένο μέσο απομακρύνθηκε από κάθε δίσκο και η συγκέντρωση του MPF στο διάλυμα ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας ένα ιδιόκτητο ανθρώπινο ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική MPF κιτ δοκιμασίας (Morphotek, Easton, ΡΑ).

Soft δοκιμασία άγαρ

Α549 /pcDNA ή Α549 /MPF σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 0,35% άγαρ, απλώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων (2 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο), και επωάστηκαν για 15-21 ημέρες στους 37 ° C. Μετά χρώση κρυσταλλικού ιώδους Τα τρυβλία πλύθηκαν για 1 ώρα και στη συνέχεια σαρώνονται για την παραγωγή ψηφιακών εικόνων. Οι αποικίες μετρήθηκαν εντός ενός προκαθορισμένου, κεντρικά τοποθετημένο τετράγωνο πεδίο με μήκος πλευρά ίσο με το ένα τρίτο της διαμέτρου καλά. Πολλαπλές φρεάτια (ιδ) μετρήθηκαν για κάθε ένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Ο μέσος αριθμός αποικιών για κάθε πείραμα αναφέρονται με τυπική απόκλιση (SD). ΚΒ κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για το σχηματισμό αποικιών.

Στατιστική Ανάλυση

Για μελέτες επιβίωσης, οι καμπύλες Kaplan-Meier παραστάθηκαν γραφικώς και συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας το τεστ log-rank. Μια δοκιμασία Mann-Whitney χρησιμοποιήθηκε για στατιστική σύγκριση των δεδομένων επιβίωσης. Ρ & lt? 0,05 χρησιμοποιήθηκε ως το όριο για στατιστική σημαντικότητα. Όλα στατιστική ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας Prism (έκδοση 5) για Mac (λογισμικό GraphPad).

Αποτελέσματα

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι mMSLN αλληλεπιδρά με το CA125 αντιγόνο ωοθηκικού όγκου του καρκίνου και ότι αυτή η αλληλεπίδραση μπορεί να είναι σημαντική στην μεταστατική εξάπλωση του καρκίνου των ωοθηκών, μέσω της περιτοναϊκής κοιλότητας [8], [16], [19]. Να αξιολογήσει τον αντίκτυπο των MSLN στην ανάπτυξη IP των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων, δημιουργήσαμε Fox Ν null /

Msln

– /- ποντίκια. Για να εξασφαλιστεί ότι η

Msln

γονιδίου ήταν απενεργοποιημένο και ότι τα ποντίκια δεν κάνουν Msln μας επιβεβαίωσε για πρώτη φορά την διαγραφή χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για τη διαλογή των διαγράφεται αλληλόμορφα των

Msln

γονίδιο (τα δεδομένα δεν απεικονίζεται). Η έλλειψη έκφρασης πρωτεΐνης mMsln επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημική ανάλυση ιστών ποντικού χρησιμοποιώντας αντι-Msln αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό που ακολουθείται από ανίχνευση χρώματος όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9] (Σχ. 2). Η ανοσοκαταστολή που προκαλείται από την διαγραφή FoxN επιτρέπει πείραμα ξενομοσχεύματος με ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Χρησιμοποιήσαμε το καρκίνο του πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή, η οποία έχει πολύ χαμηλή έκφραση του MSLN (μέσος όρος 3,5 × 10

3 θέσεις πρόσδεσης mMSLN /κύτταρο) αλλά ισχυρή έκφραση του CA125 (Εικ. 3). Εμείς ένεση δύο εκατομμύρια κύτταρα Α549 μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα του

Msln

– /- και

Msln + /+

γυμνά ποντίκια, τότε παρακολουθείται η επιβίωση των ζώων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, υπήρξε μια στατιστικά σημαντική διαφορά στην επιβίωση μεταξύ των δύο ομάδων ποντικών. Η μέση επιβίωση των

Msln + /+

ποντίκια ήταν 31 ημέρες, αλλά αυξήθηκαν σε 46 ημέρες στο

Msln

– /- ποντίκια (p & lt? 0,0001). Σχεδόν το 25% των

Msln

– /- ποντίκια επέζησαν πάνω από τέσσερις μήνες (Πίνακας 1), ενώ το σύνολο των

Msln + /+

ποντίκια πέθαναν μέσα σε 50 ημέρες (Εικ. 4Α). Δεν παρόμοιο πλεονέκτημα επιβίωσης φάνηκε όταν ο καρκίνος Α431 επιδερμικού κύτταρα (Εικ. 4Β), τα οποία εκφράζουν ούτε MSLN ούτε CA125, εμβολιάστηκαν ενδοπεριτοναϊκά. Η ανάπτυξη του όγκου αξιολογήθηκε επίσης όταν τα καρκινικά κύτταρα Α549 πνεύμονα εμβολιάστηκαν υποδορίως. Σε αυτό το μοντέλο, οι όγκοι σε

Msln

–

/

– και

Msln + /+

ποντίκια αυξήθηκαν με τον ίδιο ρυθμό (Εικ. 4C), καταδεικνύοντας ότι

Msln

έκφραση δεν έχει καμία επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου σε αυτό το διαμέρισμα.

Ένα τμήμα ιστούς των πνευμόνων μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη ενσωματωμένο σε παραφίνη και τομές 5 έως 6 μm σε πάχος, στη συνέχεια χρωματίζονται για MSLN. Α-Γ: πνεύμονα μορφή ιστό

FoxN null /Msln

(+ /+) βάφονται με αντι-Msln αντισώματος (Α: 100Χ? Β: μεγέθυνση 200Χ)? ή δευτερογενές αντίσωμα μόνο (C: μεγέθυνση 100Χ) ως αρνητικός έλεγχος. D-F: Lung μορφή ιστού

FoxN null /Msln

(- /-) χρωματίστηκαν με αντι-αντίσωμα Msln (D: 100Χ? Ε: μεγέθυνση 200Χ)? ή μόνο δευτερογενές αντίσωμα (F: μεγέθυνση 100Χ) ως αρνητικός έλεγχος. Όπως αναμενόταν ισχυρή έκφραση mesothelin ανιχνεύτηκε στο κύτταρο επένδυσης του πνεύμονα μεσοθηλιακών από

FoxN null /Msln

(+ /+) ποντικοί, αλλά καμία έκφραση στον πνεύμονα από

FoxN null /Msln

(- /-.) ποντικούς

Η

τα κύτταρα επωάστηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα ή αντισώματα ελέγχου ισότοπο, και κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα (γίδινο αντι-ποντικού IgG, Κ-ΡΕ ή κατσίκας αντι-ποντικού, FITC). Τα αποτελέσματα δείχνονται ως γραφικές παραστάσεις ιστόγραμμα για δέσμευση του πρωτογενούς αντισώματος (μαύρο ίχνος) ή ισοτυπικού ελέγχου (γκρι ίχνος). κύτταρα Α431 είναι αρνητική τόσο για MSLN και CA125. κύτταρα Α549 δείχνουν χαμηλή έκφραση mesothelin (3.5 × 10

3 θέσεις /κύτταρο), αλλά εξαιρετικά ρητή CA125

Η

(Α) Οικόπεδο που δείχνει την επιβίωση των ποντικών μετά τη λήψη ΙΡ ένεση των κυττάρων Α549.? διάμεση επιβίωση

Msln

– /- ποντίκια είναι 46 ημέρες και των

Msln (+ /+)

ποντίκια είναι 31 ημέρες (

σ

& lt? 0,0001). (Β) Οικόπεδο που δείχνει την επιβίωση του

Msln

(-

/

-) ή

Msln

(+ /+) ποντίκια μετά από ένεση ΙΡ των κυττάρων Α431. (Γ) γραφική παράσταση που δείχνει την επιβίωση του

Msln

(-

/

-) ή

Msln (+ /+) ποντικοί

μετά από υποδόρια ένεση των κυττάρων Α549 (D) Επιβίωση Α549 ξενομόσχευμα φέρουν

Msln

(- /-). ποντικιών μετά τη λήψη πρωτεϊνών MPF-RFC ή mMSLN-RFC ή CD22-RFC

η

στο ενδοπεριτοναϊκή μοντέλο, τις κοιλίες του Α549 ποντικούς που φέρουν όγκο έγινε διογκώθηκε λίγο πριν το θάνατο. Κατά την νεκροψία, οι μάζες όγκου αυξάνεται στο περιτοναϊκό τοίχωμα, στο επίπλουν, και στη μεγάλη και το λεπτό έντερο. IHC καταδεικνύει ότι αυτοί οι όγκοι Α549 κάνει καμία ανιχνεύσιμη MSLN (Εικ. 5Α), αλλά κάνουν CA125 (Εικ. 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι MPF, mMSLN ή και τα δύο μπορεί να ενισχύσει την επιθετικότητα των όγκων Α549 μέσα στην κοιλιακή κοιλότητα.

Μια αθυμικούς γυμνούς ποντικός θυσιάστηκε 26 ημέρες μετά τον εμβολιασμό IP με κύτταρα Α549. Οι όγκοι ανοσοχρώση με (Α) αντι-MSLN και (Β) αντι-ΟΑ125 μονοκλωνικά αντισώματα. Αυτοί οι όγκοι ήταν αρνητικά για MSLN αλλά θετικά για έκφραση CA125 όπως φαίνεται από καφέ χρώση των καρκινικών κυττάρων.

Η

Υποθέσαμε ότι, εάν η απώλεια του

Msln

ήταν υπεύθυνα για την επιβραδυνόμενη πρόοδο του όγκου σε η

Msln

– /- ποντίκια, τότε εξωγενής αντικατάσταση των πρωτεϊνών των προϊόντων της, MPF ή mMSLN, θα μπορούσε να αποκαταστήσει την πιο επιθετική πορεία της νόσου παρατηρήθηκε στις

Msln

(+ /+) ποντίκια. Ως εκ τούτου, συνθέσαμε ανασυνδυασμένη MPF-RFC, mMSLN-RFC, και ένα στοιχείο ελέγχου CD22-RFC πρωτεΐνη. Η στρατηγική προσθήκη του Fc τμήμα κουνέλι αυξάνει σημαντικά την ημιζωή αυτών των μορίων, αλλά δεν αναμένεται να επηρεάσει την λειτουργία. κύτταρα Α549 ενέθηκαν στις περιτοναϊκές κοιλότητες του

Msln

– /- ποντίκια, όπως και πριν, τότε, ξεκινώντας από την ημέρα της εμφύτευσης, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με μία από τις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες Fc κάθε δεύτερη ημέρα για συνολικά έξι δόσεις. Όπως συνοψίζεται στον Πίνακα 1 και φαίνεται στο Σχήμα 4D, το μέση επιβίωση

Msln

– /- ποντικών που υπέστησαν αγωγή με το πεπτίδιο ελέγχου CD22-RFC παρέμεινε 46 ημέρες. Ωστόσο, η διάμεση επιβίωση των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με MPF-RFC μειώθηκε σε 31 ημέρες, παρόμοια με την επιβίωση του

Msln

(+ /+) ποντικούς που έλαβαν ένεση με κύτταρα Α549 (Σχ. 4Α). Ένεση mMSLN-RFC παρήγαγε επίσης μια στατιστικά σημαντική μείωση στην μέση επιβίωση, αν και η επίδραση ήταν λιγότερο έντονη (42 ημέρες, ρ & lt? 0.016). Τα αποτελέσματα αυτού του πειράματος δείχνουν ότι η απώλεια των ΜΡί και όχι mMsln είναι κυρίως υπεύθυνη για την παρατεταμένη επιβίωση του

Msln

– /-. Ποντικών που φέρουν ξενομοσχεύτηκε κύτταρα Α549

Για να προσδιορίσετε αν MPF δρα άμεσα στο τα κύτταρα Α549 για την ενίσχυση της ανάπτυξης ή την επιθετικότητα τους, είμαστε σταθερά επιμολυσμένα του

MPF

cDNA σε κύτταρα Α549. MPF έκφραση αξιολογήθηκε με τροποποιημένη δοκιμασία ELISA ρυθμισμένου μέσου και την ποσότητα που παράγεται από 1 × 10

6 κύτταρα υπολογίστηκε με βάση μια πρότυπη καμπύλη ανασυνδυασμένου MPF. Ενώ Α549 /MPF κλώνοι παρήγαγαν περίπου 400 ng του MPF σε 48 ώρες, δεν MPF ανιχνεύθηκε στο μέσο όρο των κυττάρων Α549 επιμολύνονται με φορέα ελέγχου (Α549 /pcDNA). Σημειώσαμε καμία εμφανής διαφορά στον ρυθμό ανάπτυξης ή της μορφολογίας του

MPF

επιμολυσμένα κύτταρα Α549 όταν συγκρίνονται με τον έλεγχο φορέα-επιμολυσμένα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη αυτών των κυττάρων σε μαλακό άγαρ αξιολογήθηκε επίσης. Όπως φαίνεται στον πίνακα 2, δεν υπάρχει στατιστική διαφορά στο σχηματισμό αποικιών μεταξύ

MPF

επιμολυσμένα κύτταρα Α549 και της γραμμής ελέγχου φορέα-επιμολυσμένα. Αυτά τα πειράματα δείχνουν ότι MPF δεν προωθούν άμεσα την ανάπτυξη των κυττάρων Α549.

Η

Συζήτηση

Για τη μελέτη μας, δημιουργήσαμε ένα μοντέλο ποντικού που στερείται το

Msln

γονιδίου και είναι ανεκτική στην ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων. Η καρκινική κυτταρική γραμμή Α549 του πνεύμονα χρησιμοποιούνται για να σχηματίσουν όγκους IP στα πειράματά μας κάνει μόνο ελάχιστες ποσότητες mMSLN, έτσι ώστε όλες MPF και mMSLN πρέπει να παρέχεται εξωγενώς. Παρατηρήσαμε μια στατιστικώς σημαντική 15 ημέρες διαφορά στην επιβίωση μεταξύ των

Msln + /+

και

Msln

– /- ποντίκια που φέρουν ενδοπεριτοναϊκή όγκους Α549. Αυτό το εύρημα ήταν κυτταρική γραμμή ειδική και, κατά τρόπο ενδιαφέροντα, δεν παρατηρήθηκαν σε ένα υποδόριο μοντέλο. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ένα προϊόν το

Msln

γονίδιο παίζει σημαντικό ρόλο στην προώθηση της

στο

vivo

την ανάπτυξη του όγκου και την πρόοδο για ορισμένους τύπους καρκινικών κυττάρων αυξάνεται εντός της περιτοναϊκής κοιλότητα.

MPF και mMSLN είναι και οι δύο πρωτεΐνες προϊόντα που κατασκευάζονται από την έκφραση του

MSLN

γονίδιο. Αμφότερες οι πρωτεΐνες είναι εντόνως εκφράζεται από ένα αριθμό στερεών κακοηθειών όγκου συμπεριλαμβανομένων μεσοθηλίωμα, του παγκρέατος και των ωοθηκών [1], [4]. Αρκετές μελέτες έχουν διερευνήσει πώς οι αλλαγές στην έκφραση του

MSLN

γονίδιο μπορεί να μεταβάλλει την ανάπτυξη του όγκου, πρόοδο ή διεισδυτικότητα για να παράγει μια πιο επιθετική φαινότυπο όγκου. Η υπερέκφραση του

MSLN

γονίδιο δείχθηκε να ενισχύσει ιντερλευκίνη (IL) -6 σηματοδότηση [11], και για να προσδώσει αντίσταση σε παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF) -α απόπτωση σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [20]. Η έκτοπη έκφραση του

MSLN

γονιδίου σε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού που προωθούνται επιβίωση των κυττάρων και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη

σε

vitro

[10]. Άλλες μελέτες έχουν καταδείξει έναν ζωτικής σημασίας ρόλο για το

MSLN

γονίδιο στη ρύθμιση της ανάπτυξης και την απόπτωση μέσω και των δύο ρ53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη πορείες σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [12]. Σε όλες αυτές τις

στο

vitro

μελέτες, οι προ-ογκογόνο δράση του

MSLN

γονίδιο χειρισμός ήταν τεκμαίρεται ότι προκαλείται από αλλαγές στην έκφραση του mMSLN, αν και η γενετική χειρισμούς στα πειράματα θα πρέπει να παράγουν παρόμοιες μεταβολές των επιπέδων MPF

για να διαχωρίσετε συνεισφορές από MPF ή mMSLN στον φαινότυπο που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας, παρέχονται εξωγενή ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη για να το

Msln

. – /- ποντίκια. Βρήκαμε ότι MPF συμπλήρωση μειωμένη επιβίωση των ζώων 15 ημέρες σε σύγκριση με τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με μια πρωτεΐνη ελέγχου. Ενώ η συμπλήρωση με mMSLN έκανε μειώνουν την επιβίωση σε μια στατιστικά σημαντική 4 ημέρες, είναι σαφές ότι MPF είναι ο πιο ισχυρός παράγοντας στο μοντέλο μας.

MPF ταυτοποιήθηκε αρχικά ως αυξητικός παράγοντας που θα μπορούσε να προωθήσει το σχηματισμό αποικιών μεγακαρυοκυττάρων όταν δίνεται σε συνδυασμό με IL-3 [5]. Μέχρι σήμερα, κανένα MPF υποδοχέας έχει ταυτοποιηθεί επί μεγακαρυοκυττάρων ή οποιαδήποτε άλλα κύτταρα. Ούτε οι θεωρίες έχουν προταθεί για να εξηγήσουν γιατί μια πρωτεΐνη που κανονικά εκφράζεται αποκλειστικά από mesothelial κύτταρα θα πρέπει να έχει μια πρωταρχική λειτουργία ως παράγοντα διέγερσης μεγακαρυοκυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε πειράματα μας, ενώ MPF αυξημένη επιθετικότητα του όγκου

στο

vivo

, ανάγκασε υπερέκφραση του MPF παράγεται κανένα πλεονέκτημα ανάπτυξης

στο

vitro.

Αυτό υποδηλώνει ότι η επίδραση του MPF επί επιθετικότητας του όγκου δεν διαμεσολαβείται από μια άμεση δράση του MPF επί του όγκου, αλλά ίσως δουλεύοντας έμμεσα επί άλλων κυττάρων. Αν και θα μπορούσε να είναι δελεαστικό να θεωρηθεί ότι MPF μπορεί να έχει μια ανοσολογική λειτουργία τελεστή, τα πειράματα μας διεξήχθησαν σε λεμφοκύτταρα ανεπαρκή ποντίκια, υποδηλώνοντας ότι ένας άλλος μηχανισμός είναι πιο πιθανό να είναι υπεύθυνος. Αναγνώριση του τύπου (ες) των κυττάρων υπεύθυνη για τη διαμεσολάβηση αυτή την επίδραση της MPF είναι πέρα ​​από το πεδίο εφαρμογής της παρούσας μελέτης.

Παρά το γεγονός ότι οι παρατηρήσεις μας έγιναν με τη χρήση ενός μόνο τύπου κυττάρου, το αποτέλεσμα που παρατηρήθηκε στην επιβίωση ήταν βαθιά και υψηλή επαναληψιμότητα. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι MPF θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής της επιθετικότητας του όγκου στην περιτοναϊκή κοιλότητα, και ότι η αναστολή ή απομόνωση του MPF μπορεί να είναι κλινικά χρήσιμη στην επιβράδυνση της ανάπτυξης ορισμένων μορφών καρκίνου που αναπτύσσονται στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Οι μελέτες για τη δοκιμή αυτή η υπόθεση έχει ξεκινήσει.