Αφηρημένο

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι μια στρωματικών κυττάρων που προέρχονται από παράγοντα-1 (SDF-1? CXCL12) σύστημα /CXCR4 εμπλέκεται στην εγκατάσταση της μετάστασης του καρκίνου του στόματος. Πρόσφατα, μικρά μη κωδικοποίησης RNAs, microRNAs (miRNAs) έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται στη μεταστατική διαδικασία αρκετών τύπων καρκίνου. Ωστόσο, τα miRNAs που συμβάλλουν στην μεταστάσεις που προκαλείται από το σύστημα SDF-1 /CXCR4 στον καρκίνο του στόματος είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την miRNAs μετάστασης που σχετίζονται προκαλείται από το σύστημα SDF-1 /CXCR4 χρησιμοποιώντας B88-SDF-1 από το στόμα των καρκινικών κυττάρων, τα οποία εμφανίζουν λειτουργική CXCR4 και μακρινό μεταστατικό δυναμικό

in vivo

. Μέσω της ανάλυσης μικροσυστοιχιών miRNA, προσδιορίσαμε την ρύθμιση προς τα άνω του miR-518c-5P στο B88-SDF-1 κύτταρα, και επιβεβαίωσε την επαγωγή με πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση. Παρά το γεγονός ότι ένας αναστολέας miR-518c-5P LNA-based δεν επηρέασε την κυτταρική ανάπτυξη των κυττάρων B88-SDF-1, αυτή ανέστειλε σημαντικά την μετανάστευση των κυττάρων. Στη συνέχεια, επιμολυσμένα φορέα έκφρασης miR-518c σε γονικά κύτταρα B88 και CAL27 καρκίνο του στόματος κύτταρα και απομονωμένα σταθερή μορφομετατροπείς, B88-518c και CAL27-518c κύτταρα, αντίστοιχα. Η αγκύρωση-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από την ανάπτυξη των επιμολύνσεων miR-518c ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με την αύξηση του mock κυττάρων. Επιπλέον, ανιχνεύσαμε την ενισχυμένη μετανάστευση αυτών των κυττάρων. Ο αναστολέας miR-518c-5P LNA-based απομειωθεί σημαντικά την αυξημένη κυτταρική ανάπτυξη και μετανάστευση των επιμολύνσεων miR-518c, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα φαινόμενα εξαρτώνται κυρίως από την έκφραση του miR-518c-5P. Στη συνέχεια, εξετάσαμε τη λειτουργία των miR-518c-5P

in vivo

. επιμολύνσεων miR-518c ή ψευδο μορφομετατροπείς εμβολιάστηκαν στον μυ μασητήρων ή τα αιμοφόρα αγγεία γυμνών ποντικών. Ο όγκος του όγκου, μετάσταση στους λεμφαδένες και μετάσταση πνεύμονα ήταν σημαντικά αυξημένες στα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με τα προϊόντα επιμόλυνσης miR-518c. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-518c-5P ρυθμίζει την ανάπτυξη και μετάσταση του καρκίνου του στόματος ως κατάντη στόχου του SDF-1 /CXCR4 σύστημα

Παράθεση:. Kinouchi Μ, Uchida D, Kuribayashi Ν, Tamatani Τ, Nagai Η Miyamoto Υ (2014) Συμμετοχή του miR-518c-5P για την ανάπτυξη και μετάσταση σε καρκίνο του στόματος. PLoS ONE 9 (12): e115936. doi: 10.1371 /journal.pone.0115936

Επιμέλεια: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 του Αυγ 2014? Αποδεκτές: 2 του Δεκέμβρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 23 του Δεκ, 2014

Copyright: © 2014 Kinouchi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: Το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση-in-Ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (Β? 25293411 και Γ? 26.463.046? Http:. //Www. jsps.go.jp/english/e-grants/grants01.html). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

προηγουμένως αποδειχθεί ότι B88 κύτταρα, τα οποία είναι από του στόματος καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν τον υποδοχέα χημειοκινών CXCR4, μετάσταση ειδικά σε τραχηλικούς λεμφαδένες μέσω στρωματικών κυττάρων προερχόμενο παράγοντα (SDF) -1 κλίση που παράγεται από το λεμφικό στρώμα [ ,,,0],1] – [3]. Η αναγκαστική έκφραση του SDF-1 σε B88 κύτταρα (ονομάζονται κύτταρα 1 B88-SDF-) ανατίθενται αυξημένη κινητικότητα κυττάρων και τη μετάσταση του πνεύμονα μετά από ενδοφλέβια εμβολιασμό [4]. Πρόσφατα, αποδείξαμε επίσης ότι η έκφραση CXCR4 συμβάλλει στην μεταστατικό δυναμικό των σιελογόνων αδένων καρκίνων [5]. Επιπλέον, έχουμε επίσης καταδείξει ότι δέσμευση CXCR4 με 1,1 ‘- [1,4-φαινυλενοδισ (μεθυλενο)] δις-1,4,8,11-τετρα octahydrochloride (AMD3100), ένας ανταγωνιστής CXCR4, μπορεί να είναι ένα ισχυρό αντι -metastatic θεραπεία για καρκίνο κεφαλής και τραχήλου CXCR4 που σχετίζονται με [5], [6].

Αν και το σύστημα SDF-1 /CXCR4 κυρίως λειτουργεί ως χημειοτακτικός παράγοντας σε καρκινικά κύτταρα με τους σπόρους μεταστατικές θέσεις, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι το σύστημα αυτό ρυθμίζει επίσης την ανάπτυξη του όγκου, η αλληλεπίδραση μικροπεριβάλλον των καρκινικών κυττάρων του όγκου και την αγγειογένεση [7] – [10]. Στην πραγματικότητα, για τον καθορισμό των μεταστάσεων, πολλές σημαντικές διαδικασίες, όπως η εισβολή, ενδαγγείωση, εξαγγείωση και έκτοπη δυναμικό ανάπτυξης, είναι απαραίτητη. Έτσι, είναι ζωτικής σημασίας να διερευνηθεί η λειτουργία του κατάντη στόχου (ες), υπεύθυνο για τη διαδικασία της μετάστασης στο σύστημα SDF-1 /CXCR4. microRNAs (miRNAs) είναι μικρά ρυθμιστικά μη-κωδικοποίησης RNAs που δεσμεύονται με ειδικά mRNA στόχου, οδηγώντας σε μεταγραφική καταστολή [11]. Τα miRNAs εμπλέκονται στη ρύθμιση των βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης και απόπτωσης, τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες και κατά τη διάρκεια ασθενειών, όπως ο καρκίνος [11]. Πρόσφατα στοιχεία έδειξαν ότι miRNAs παίζουν κρίσιμο ρόλο στη μεταστατική διαδικασία διάφορους τύπους καρκίνων [11]. Ωστόσο, τα miRNAs που συμβάλλουν στην μεταστάσεις που προκαλείται από το σύστημα SDF-1 /CXCR4 στον καρκίνο του στόματος είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Έτσι, στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε miRNAs στόχο ρυθμίζεται από το σύστημα SDF-1 /CXCR4 σε B88-SDF-1 κύτταρα χρησιμοποιώντας miRNA microarrays και διερευνήθηκαν λειτουργικό ρόλο τους στη μετάσταση του καρκίνου του στόματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

τα ποντίκια αντιμετωπίζονται σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την επιτροπή των ζώων Ερευνών, Πανεπιστήμιο Τοκουσίμα (Αριθμός Άδειας: 11111). Εν συντομία, όλοι οι ποντικοί στεγάστηκαν κάτω από ελεύθερες παθογόνων συνθήκες, έλαβαν τροφή και νερό κατά βούληση, και διατηρήθηκαν σε ένα κύκλο φωτός /σκότους 12 h φως σε έναν κατάλληλο ελεγχόμενης θερμοκρασίας δωματίου. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις και η ευθανασία διεξήχθησαν υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. κύτταρα B88 [1], [12] είχαν αρχικά καθοριστεί από έναν ασθενή με καρκίνο της γλώσσας το 1988. Η επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Τοκουσίμα παραιτηθεί από την ανάγκη για συναίνεση σχετικά με τη χρήση αυτής της κυτταρικής σειράς (Αριθμός Άδειας: 453).

miRNA ανάλυση μικροσυστοιχιών

Μικρές RNA για ανάλυση μικροσυστοιχιών miRNA εξήχθη από B88-mock κύτταρα στερούνται ορού και τα κύτταρα B88-SDF-1. Μια μικροσυστοιχία miRNA διεξήχθη και αναλύθηκε σε TORAY (Tokyo, Japan) χρησιμοποιώντας μια ανθρώπινη Array 3D-Gene (V16.1.0.0). Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα μικροσυστοιχιών κατατέθηκαν στη γονιδιακή έκφραση Omnibus (GEO, http: //www.ncbi.nlm.nih.-gov/geo) σύμφωνα με τις ελάχιστες πληροφορίες σχετικά με το πείραμα μικροσυστοιχιών (MIAME) κατευθυντήριες γραμμές. Ο αριθμός ένταξη είναι GSE59323.

Κύτταρα και κυτταρική καλλιέργεια

Στοματική καρκινικά κύτταρα θεωρείται απαλλαγμένη από μυκόπλασμα και βακτηριακά μολυσματικά. κύτταρα CAL27 είναι από του στόματος τα καρκινικά κύτταρα που ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD). κύτταρα B88 ιδιαίτερα μεταστάσεις σε τραχηλικούς λεμφαδένες, όταν τα κύτταρα εμβολιάστηκαν στο μασητήρας μυς γυμνών ποντικών, αλλά σπάνια κάνει μετάσταση στους πνεύμονες μέσω της ενδοφλέβιας εμβολιασμό [1], [4]. Σε αντίθεση, τα κύτταρα CAL27 σπάνια μεταστάσεις σε τραχηλικούς λεμφαδένες ή τους πνεύμονες, όταν τα κύτταρα εμβολιάστηκαν εντός του μυ ή μασητήρας φλέβα ουράς γυμνών ποντικών, αντίστοιχα (αδημοσίευτη παρατήρηση). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε Μέσο Eagle Τροποποιημένο Μέσο (DMEM? Sigma, St. Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS), 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, και 100 U /mL πενικιλίνη σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO2 στους 37 ° C.

ποντίκια και

in vivo μελέτη

BALB /c γυμνά ποντίκια αγοράστηκαν από CLEA Japan (Osaka, Japan). Τα ποντίκια διατηρήθηκαν κάτω από συνθήκες χωρίς παθογόνα. Τα πειράματα ξεκίνησαν όταν τα ποντίκια ήταν ηλικίας 8 εβδομάδων και πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [1], [4]. Εν συντομία, τα κύτταρα ορθοτοπικά εμβολιάστηκαν εντός του μασητήρας μυς γυμνών ποντικών (2 × 10

6) ή εμβολιάστηκαν μέσα στα αιμοφόρα αγγεία γυμνών ποντικών (1 × 10

6)? εκείνοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν κατά την ημέρα 35. Το μέγεθος του όγκου υπολογίστηκε με τη μέτρηση του μεγέθους του όγκου και με τον ακόλουθο τύπο: όγκος όγκου = 1/2 × L × W

2, όπου L και W αντιπροσωπεύουν τη μεγαλύτερη διάμετρο και το μικρότερο διάμετρο, αντίστοιχα. Η παρουσία ή η απουσία του λεμφαδένα και απομακρυσμένων μεταστάσεων επιβεβαιώθηκε με χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης.

Η επιμόλυνση

Κύτταρα (5 × 10

5 κύτταρα /δίσκο) σπάρθηκαν σε καλλιέργεια 100 mm πιάτα (Falcon? Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FCS. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 5 μg του φορέα έκφρασης HSA-miR-518c ή τον φορέα ελέγχου (ΟηΟεηε, Rockville, MD), με χρήση Lipofectamine LTX (Life Technologies, Carlsbad, CA) στην τελική συγκέντρωση του 50 ρΜ. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FCS (ν /ν) και στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη και σπέρνονται (1:05 ​​αναλογία) σε 100 πιάτα mm καλλιέργεια σε μέσο DMEM που περιέχει 10% FCS (ν /ν). Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ένα επιλεκτικό μέσο που περιέχει Geneticin (700 μg /ml G418? Life Technologies). Μετά την επιλογή με G418 για 2 εβδομάδες, όλες οι αποικίες συλλέχθηκαν και τα ακόλουθα σταθερά προϊόντα επιμόλυνσης απομονώθηκαν: B88-518c, B88-mock2, CAL27-518c, και CAL27-mock κύτταρα

Ποσοτική RT-PCR.

Μετά από 24 ώρες, το RNA απομονώθηκε από λογαριθμικά αναπτυσσόμενα κύτταρα με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Life Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το TaqMan microRNA RT Kit (Life Technologies) ή miScript II RT Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Στην ποσοτική PCR, miR-518c-5P και miRNAs RNU6B ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το TaqMan Gene Expression Assay (Life Technologies) ή στη δοκιμασία miScript Primer (Qiagen). Gene-ειδικά προϊόντα μετρήθηκαν συνεχώς από ΑΒΙ StepOnePlus Real-Time PCR Σύστημα κατά 40 κύκλους PCR. Σε μερικά πειράματα, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ή χωρίς 50 ηΜ αναστολέα miRCURY LNA microRNA (Exiqon, Vedbaek, Denmark) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMax (Life Technologies).

ΜΤΤ δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα 96-φρεατίων (Falcon? Becton Dickinson Labware) στους 5 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FCS. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ή χωρίς 50 ηΜ LNA miRCURY microRNA αναστολέα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMax. Μετά από 24 ή 48 ώρες, ο αριθμός των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με μια δοκιμασία που χρησιμοποιεί ΜΤΤ [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου? Sigma].

In vitro

μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Το

in vitro

μετανάστευση των κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας transwells (Corning Corning, Νέα Υόρκη) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [1]. Τα κύτταρα συνδεδεμένο στον πόρο ή κύτταρα προσκολλώνται στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μετρήθηκαν σε 10 πεδία σε υψηλή άποψη ισχύος (Χ 400) από τρίτο πρόσωπο τυφλωμένο σε συνθήκες θεραπείας. Σε μερικά πειράματα, 50 ηΜ LNA miRCURY microRNA αναστολέα επιμολύνθηκε πριν τα κύτταρα σπάρθηκαν επί του άνω θαλάμου.

Wound δοκιμασία

24 ώρες μετά την σπορά των κυττάρων, μια γραμμική πληγή δημιουργήθηκε στις οι συρρέουσες μονοστοιβάδες με απόξεση με ρύγχος πιπέτας. Τα μη συνδεδεμένα κύτταρα ξεπλένονται με ανάδευση. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν στο ίδιο σημείο σε ένα πλέγμα 48 ώρες αργότερα. Κάθε γραμμή κυττάρων απλώθηκε και τραυματίστηκε στο τριπλούν

σφαιροειδές δοκιμασία σχηματισμού

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων (NanoCulture πλάκα? SCIVAX Επιστήμες της Ζωής, Woburn, ΜΑ). Σε 1 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% θερμοαπενεργοποιημένο FCS. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, ο φαινότυπος των κυττάρων παρατηρήθηκε με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (χ 300).

Στατιστική ανάλυση

Σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων για τις διάφορες ομάδες αξιολογήθηκαν με StatView 4.5 (Abacus Concepts, Berkeley, CA) με τη χρήση μονόδρομης ANOVA με τη σημασία που σ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Απομόνωση του miR-518c-5P, η οποία προκαλείται από την SDF- 1 /σύστημα CXCR4

Ερευνήσαμε miRNA κατάντη του συστήματος SDF-1 /CXCR4 χρησιμοποιώντας την προφορική κυτταρική σειρά καρκίνου, B88-SDF-1, που έχουν αυτοκρινούς /σύστημα SDF-1 CXCR4 και εμφανίζουν μακρινή μεταστατικό δυναμικό

in vivo

[4]. ανάλυση μικροσυστοιχιών απεκάλυψε ότι αρκετοί miRNAs ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω ή προς τα κάτω σε B88-SDF-1 κύτταρα σε σύγκριση με ψευδο κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα της ανάλυσης των μικροσυστοιχιών, η έκφραση miRNA επιβεβαιώθηκε με ποσοτική RT-PCR. Παρόμοια με τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών, miR-518c-5P (που ονομαζόταν παλαιότερα miR-518c *) έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά σε B88-SDF-1 κύτταρα σε σύγκριση με ψευδο κύτταρα (Σχ. 1Α). Επιπλέον, αυτή η προς τα πάνω ρύθμιση πλήρως καταργείται από την επιμόλυνση ενός αναστολέα miR-518c-5P LNA (Εικ. 1Α). Λάβαμε επίσης παρόμοια αποτελέσματα στα μητρικά κύτταρα B88 διεγείρονται με SDF-1 (Εικ. 1Β).

(Α) Η έκφραση του miR-518c-5P επιβεβαιώθηκε σε B88-παρωδία και B88-SDF-1 κύτταρα με PCR πραγματικού χρόνου. Η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-518c-5P στο B88-SDF-1 κυττάρων μετά από θεραπεία με έναν αναστολέα LNA miR-518c-5P Επιβεβαιώθηκε επίσης. Μ.π. .: δεν είναι ανιχνεύσιμη. (Β) Η έκφραση του miR-518c-5P επιβεβαιώθηκε σε γονικά κύτταρα B88 μετά τη θεραπεία με ή χωρίς SDF-1 με PCR πραγματικού χρόνου.

Η

Επίδραση της αναστολής miR-518c-5P στο κελί ανάπτυξη και SDF-1 /CXCR4-εξαρτώμενη κυτταρική μετανάστευση

Προηγουμένως, βρήκαμε ότι ούτε η παρακρινή ούτε το αυτοκρινές σύστημα /CXCR4 SDF-1 επηρέασε την αύξηση εξαρτώμενη από προσκόλληση των κυττάρων B88 [1], [4] . Εξετάσαμε την επίδραση του miR-518c-5P για την ανάπτυξη των κυττάρων με τη χρήση ενός ειδικού αναστολέα LNA miR-518c-5P. Ο αναστολέας δεν επηρέασε την ανάπτυξη του είτε B88-mock ή κύτταρα B88-SDF-1 (Σχ. 2Α). Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση του miR-518c-5P στο SDF-1 /CXCR4-εξαρτώμενη μετανάστευση των κυττάρων. δοκιμασίες θάλαμο μετανάστευσης αποκάλυψε ότι η αυξημένη κινητικότητα των B88-SDF-1 κύτταρα ήταν σημαντικά μειωμένη μετά τη θεραπεία με έναν αναστολέα miR-518c-5P LNA (Εικ. 2Β).

(Α) Η ανάπτυξη των B88-παρωδία κύτταρα (αριστερή πλευρά) και τα κύτταρα B88-SDF-1 (δεξιά πλευρά) με την παρουσία είτε ενός αναστολέα LNA ελέγχου ή έναν αναστολέα LNA miR-518c-5P εξετάστηκε χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό ΜΤΤ. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των τριών ομάδων με μονόδρομη ANOVA. (Β) Η κινητικότητα των κυττάρων B88-SDF-1 παρουσία είτε ενός αναστολέα LNA ελέγχου ή έναν αναστολέα LNA miR-518c-5P εξετάστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία μετανάστευσης Transwell. Ένα σύνολο 2 × 10

4 κύτταρα επιμολύνθηκαν πριν σπάρθηκαν στο θάλαμο. **?

σ

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με μη επεξεργασμένο έλεγχο ή LNA ελέγχου κύτταρα αναστολέα αντιμετωπίζονται από μονόδρομη ANOVA

Η

Επίδραση του miR-518c-5P υπερέκφραση για την ανάπτυξη των κυττάρων

στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε ένα κέρδος ανιχνεύσεως λειτουργία υπερεκφράζουν miR-518c-5P σε γονικά κύτταρα B88 και επίσης σε γονικά κύτταρα CAL27 στα οποία η έκφραση του CXCR4 και miR-518c-5P δεν ήταν ανιχνεύσιμη. Μετά την επιμόλυνση του κενού φορέα ή φορέα έκφρασης miR-518c, συλλέξαμε όλα τα ανθεκτικών κλώνων G418 για να αποφευχθεί η κλωνική ετερογένεια των κυττάρων και καθορίστηκαν οι ακόλουθες επιμολύνσεις, B88-mock2, B88-518c, CAL27-παρωδία και CAL27-518c. Θα μπορούσαμε να ανιχνεύσει την προς τα πάνω ρύθμιση του miR-518c-5P στα επιμολυσμένα miR-518c σε σύγκριση με mock κύτταρα, τα οποία ανεστάλη πλήρως με κατεργασία με τον αναστολέα miR-518c-5P LNA (Σχ. 3Α, Β). Η αγκύρωση που εξαρτάται από το αναπτυξιακό δυναμικό και των δύο κυττάρων B88-518c και CAL27-518c ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με εκείνη των ψευδο κύτταρα (Σχ. 3C, D), η οποία ήταν σημαντικά αναστέλλεται από τη θεραπεία με τον αναστολέα LNA miR-518c-5P (Σχ. 3Ε, F). Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της miR-518c υπερέκφραση για την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων. B88-mock2 κύτταρα σχηματίζονται στρογγυλά και σφιχτό σφαιροειδή προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου (Εικ. 3G), ενώ B88-518c κύτταρα σχηματίζονται αμπέλι-όπως σφαιροειδή (Σχ. 3Η). Αντίθετα, και τα δύο προϊόντα επιμόλυνσης CAL27 σχηματίζεται γύρο σφαιροειδή (Σχ. 3I, J), αλλά μεγαλύτερες σφαιροειδή παρατηρήθηκαν σε κύτταρα CAL27-518c (Σχ. 3J).

B88 κύτταρα και κύτταρα CAL27 διαμολύνθηκαν σταθερά με έναν έλεγχο φορέας ή ένας φορέας έκφρασης miR-518c, και B88-mock2 ή B88-518c κύτταρα και CAL27-mock ή CAL27-518c κύτταρα απομονώθηκαν, αντίστοιχα. (Α, Β) Η έκφραση του miR-518c-5P στις B88-επιμολύνσεις (Α) και CAL27-επιμολύνσεις (Β) αξιολογήθηκαν με PCR πραγματικού χρόνου. Η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-518c-5P στα κύτταρα B88-518c ή κύτταρα CAL27-518c μετά τη θεραπεία με έναν αναστολέα LNA miR-518c-5P Επιβεβαιώθηκε επίσης. (C, D) Anchorage-εξαρτώμενη ανάπτυξη των B88-μορφομετατροπείς (C) και CAL27-μορφομετατροπείς (D) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ. *?

σ

& lt? 0,05, **?

ρ

& lt? 0,01, σε σύγκριση με mock κύτταρα με μονόδρομη ANOVA. (Ε, F) Η ανάπτυξη των B88-μορφομετατροπείς (Ε) και CAL27-μορφομετατροπείς (F) υπό την παρουσία είτε ενός αναστολέα LNA ελέγχου ή έναν αναστολέα LNA miR-518c-5P εξετάστηκε χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό ΜΤΤ. *?

σ

& lt? 0,05, **?

ρ

& lt? 0,01 σε σύγκριση με μη επεξεργασμένο έλεγχο ή LNA κύτταρα ελέγχου αναστολέα επεξεργασμένα με μονόδρομη ANOVA. (GJ) Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη των B88-mock2 (G), B88-518c (H), CAL27-παρωδία (Ι) ή CAL27-518c (J) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πιάτο νανο-πολιτισμού.

Η

Επίδραση του miR-518c-5P υπερέκφραση για τη μετανάστευση των κυττάρων

B88-518c κύτταρα αποκτήσει σημαντική χημειοκινητικές ανταπόκριση (Σχ. 4Α) και την ενισχυμένη κινητικότητα του κυττάρου (Εικ. 4Β). Διαπιστώσαμε επίσης μία ενισχυμένη μετανάστευση στα κύτταρα CAL27-518c (Εικ. 4C). Η ενισχυμένη κυτταρική κινητικότητα των B88-518c κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη μετά την επεξεργασία με τον αναστολέα miR-518c-5P LNA (Εικ. 4D).

(Α) B88-mock2 ή B88-518c κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε συμβολή. Μια δοκιμασία επούλωσης της πληγής έγινε. *?

ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με mock κύτταρα με μονόδρομη ANOVA. (B, C) Η κινητικότητα των B88-518c κυττάρων (Β) ή κύτταρα CAL27-518c (C) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία μετανάστευσης Transwell. Κάθε μορφομετατροπέα σπάρθηκε σε πυκνότητα 1 × 10

4. **?

ρ

& lt? 0,01, σε σύγκριση με mock κύτταρα με μονόδρομη ANOVA. (Δ) Η κινητικότητα των B88-επιμόλυνσης με την παρουσία είτε ενός αναστολέα LNA ελέγχου ή έναν αναστολέα LNA miR-518c-5P εξετάστηκε επίσης χρησιμοποιώντας δοκιμασία μετανάστευσης Transwell. **?

ρ

& lt? 0,01 σε σύγκριση με μη επεξεργασμένο έλεγχο ή LNA κύτταρα ελέγχου αναστολέα επεξεργασμένα με μονόδρομη ANOVA

Η

Ο ρόλος του miR-518c-5P για την ανάπτυξη και την μετάσταση.

in vivo

η

στη συνέχεια εκτιμήσαμε την επίδραση του miR-518c-5P για την ανάπτυξη και μετάσταση in vivo. B88 και CAL27 επιμολύνσεις ορθοτοπικώς εμβολιάστηκαν εντός του μασητήρας μυς των άτριχων ποντικών [1]. Το μέγεθος του πρωτογενούς όγκου από B88-518c κύτταρα (Σχ. 5Α) και CAL27-518c κύτταρα (Σχ. 5Β) ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με όγκους από mock κύτταρα. Αν και οι δύο mock και miR-518c μορφομετατροπέων ιστοπαθολογικά μεταστάσεις στους τραχηλικούς λεμφαδένες, το βάρος των λεμφαδένων που περιέχουν επιμολυντές miR-518c ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη των λεμφαδένων που περιέχουν mock κύτταρα (Σχ. 5C-Ε). Είμαστε δίπλα πραγματοποιηθεί ενδοφλέβια εμβολιασμό χρήση αυτών των επιμολύνσεων. Πολυάριθμες και μεγάλες μεταστατικών οζιδίων ανιχνεύθηκαν στους πνεύμονες σε όλα τα ποντίκια που εμβολιάσθηκαν με B88-518c κύτταρα (Σχ. 6Α). Ο αριθμός των οζιδίων από ποντίκια που εμβολιάστηκαν με B88-518c κύτταρα ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τον αριθμό από ψευδο κύτταρα (Σχ. 6Β).

(Α, Β) B88-μορφομετατροπείς (Α) και CAL27-μορφομετατροπείς ( Β) ορθοτοπικά εμβολιάστηκαν εντός του μασητήρας μυς γυμνών ποντικών που θυσιάστηκαν την ημέρα 35. το μέγεθος των πρωτοπαθών όγκων μετρήθηκε μία φορά την εβδομάδα. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD. *? ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με mock κύτταρα με μονόδρομη ANOVA. (C) Αντιπροσωπευτική Η &? Ε χρώση των μεταστατικών λεμφαδένων από τα άτριχα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με B88-mock2 κύτταρα (αριστερά) και B88-518c κύτταρα (δεξιά). (D, Ε) Το βάρος των υπογνάθιους λεμφαδένες μετρήθηκε στα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με B88-μορφομετατροπείς (D) και CAL27-μορφομετατροπείς (Ε). *? ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με mock κύτταρα με μονόδρομη ANOVA

Η

Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε αιμοφόρα αγγεία των γυμνών ποντικών, τα οποία θυσιάστηκαν την ημέρα 35. (Α) Αντιπροσωπευτική Η &?. Ε χρώση οι πνεύμονες από τα άτριχα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με B88-mock2 κύτταρα (αριστερά) και B88-518c κύτταρα (δεξιά). (Β) Τα μεταστατικά οζίδια μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. **, Ρ & lt?. 0.01 όταν συγκρίνεται με mock κύτταρα με μονόδρομη ANOVA

Η

Συζήτηση

miRNAs είναι μικρά, ενδογενή, εξελικτικά συντηρημένη μη κωδικοποιητικού RNA που ρυθμίζουν περίπου 60% των γονιδίων θηλαστικών με ρύθμιση των επιπέδων μεταγραφής τους. Τα miRNAs εμπλέκονται σε πολλές μοριακές οδοί και στις πιλοτικές βιολογικές διεργασίες συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης, την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό και θάνατο των κυττάρων [11]. Πρόσφατη απόδειξη έχει καταδείξει το ρόλο των miRNAs στη ρύθμιση της μεταστατικής διαδικασίας στα πλαίσια των στερεών όγκων, και οι εν λόγω miRNAs ονομαστεί metastamir [13]. Πολυάριθμες metastamirs έχουν ταυτοποιηθεί και έχουν προ- και αντι-μεταστατικά αποτελέσματα [11]. Ωστόσο, είναι πιθανό ότι υπάρχουν πολλοί miRNAs που είναι metastamir με άγνωστες λειτουργίες, επειδή το 3% του ανθρώπινου γονιδιώματος εκτιμάται ότι κωδικοποιούν για miRNA ακολουθίες [14]. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι το miR-518c-5P μπορεί να είναι μια νέα μετάσταση-προώθηση metastamir. miR-518c-5P ταυτοποιήθηκε αρχικά στα 250 μικρών βιβλιοθηκών RNA από 26 διαφορετικά συστήματα οργάνων και κυτταρικών τύπων ανθρώπινων και τρωκτικά, εμπλουτισμένο σε νευρωνική καθώς και κανονική και κακοηθών αιμοποιητικών κυττάρων και ιστών [15]. Αν και η λειτουργία των miR-518c-5P δεν έχει οριστεί με σαφήνεια σε καρκίνους, Dyrskjøt και οι συνεργάτες του απέδειξαν ότι το miR-518c-5P ήταν σημαντικά σχετίζεται με την εξέλιξη της νόσου κατά τη διόρθωση για το στάδιο της νόσου και του βαθμού χρησιμοποιώντας μια πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox [16]. Επιπλέον, πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι το miR-518c-5P παρουσίασαν σημαντική αυξητική ρύθμιση σε ρετινοβλάστωμα σε μια ανάλυση miRNA μικροσυστοιχιών [17]. Σε συνδυασμό με τα παρόντα αποτελέσματα μας, miR-518c-5P μπορεί να λειτουργήσει ως oncomiR στα καρκινικά κύτταρα.

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι το miR-518c-5P απορυθμίζεται από τον-1 SDF /συστήματος CXCR4 σε ένα παρακρινή ή autocine τρόπο. Rhodes και οι συνεργάτες της μελέτησαν miRNA έκφραση που προκαλείται από το σύστημα SDF-1 /CXCR4 σε υποδοχείς οιστρογόνων άλφα-θετικά κύτταρα καρκίνου του μαστού [18]. Ωστόσο, ούτε miR-518c-5P ούτε άλλη miRNA ανιχνεύθηκε σε ανάλυση miRNA μας ήταν παρόντες στα αποτελέσματα τους. Επιπλέον, αν και αναλύσαμε επίσης την ανάλυση miRNA μικροσυστοιχιών στα CXCR4-θετικά σιελογόνων αδένων καρκινικά κύτταρα, ACC-M [19], μετά από διέγερση με SDF-1, δεν υπήρχαν κοινά miRNAs μεταξύ των τριών miRNA αναλύσεις μικροσυστοιχιών παρά τη χρήση του το σύστημα SDF-1 /CXCR4 σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Αυτό το εύρημα μπορεί να οφείλεται στις διαφορετικές πειραματικές συνθήκες των κυττάρων? Ωστόσο, αυτό μπορεί να οφείλεται στο διαφορετικό site-specific μεταστατικό πρότυπο αυτών των καρκινικών κυττάρων. Για παράδειγμα, ο καρκίνος του μαστού χάρες μετάσταση στο οστό, σιελογόνων αδένων καρκίνο στον πνεύμονα, και καρκίνο του στόματος στον λεμφαδένα. Έτσι, miRNAs που είναι απαραίτητες για επανακάμπτοντας στο συγκεκριμένο όργανο-στόχο θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί με CXCR4 κατά την πρόσδεση του συνδέτη, SDF-1 σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα.

Ο μηχανισμός της miR-518c-5P αυξορρύθμιση από τον SDF σύστημα -1 /CXCR4 στην προφορική καρκινικά κύτταρα δεν διευκρινίστηκε στην παρούσα μελέτη. miR-518c-5P ανήκει στην οικογένεια miR-515 σε ένα σύμπλεγμα χρωμόσωμα 19 miRNA, που ονομάζεται έτσι C19MC [20]. C19MC είναι το μεγαλύτερο σύμπλεγμα, συντηρημένη μόνο στα πρωτεύοντα θηλαστικά, το οποίο κωδικοποιεί 59 ώριμη miRNAs και εμφανίζοντας μια πολύ χαμηλή έκφραση στους περισσότερους ανθρώπινους ιστούς λόγω επιγενετικών ελέγχου [20]. Επειδή το σύστημα SDF-1 /CXCR4 μπορεί αυξορρυθμίζουν DNMT1 /έκφραση DNMT3ß [21] ή ANP32A /Lanp, ένα συστατικό του αναστολέα της ιστόνης ακετυλο τρανσφεράσης [22], miR-518c-5P αυξητική ρύθμιση μπορεί να εξαρτάται από το αποτέλεσμα της απομεθυλίωση C19MC. Εναλλακτικά, πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι ορισμένα από τα μέλη miRNA σε C19MC ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα που χαρακτηρίζεται από ανώμαλη IGF, φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) -Akt-mTOR ή ενεργοποίηση ρ53 μονοπάτι [23], [24]. Το σύστημα /CXCR4 SDF-1 θα μπορούσε επίσης να ενεργοποιήσετε τις PI3K-Akt περιόδων B88 κύτταρα [1], και αυτά τα μονοπάτια μπορεί να εμπλέκεται στην ρύθμιση προς τα άνω του miR-518c-5P. Εξετάσαμε περαιτέρω έκφραση miR-518c-5P χρησιμοποιώντας στοματικό κυτταρική σειρά καρκίνου, HNT, στην οποία η έκφραση του CXCR4 ήταν 7.5 φορές χαμηλότερη από ότι σε κύτταρα B88 [1], [3]. HNT-SDF-1 κύτταρα επέδειξαν μικρή αλλά όχι σημαντική, φαινοτυπικές αλλαγές

in vitro

και

in vivo

, στην οποία η ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ-Akt με SDF-1 δεν ήταν ανιχνεύσιμη [ ,,,0],4]. Επιπλέον, η επαγωγή miR-518c-5P σε κύτταρα HNT-SDF-1 ήταν ανιχνεύσιμη μόνο σε οριακό επίπεδο, πιθανότατα λόγω της μειωμένης έκφρασης του CXCR4, σε σύγκριση με εκείνη του B88 κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, το επίπεδο έκφρασης CXCR4 και ισχυρή κατάντη σηματοδότησης, όπως PI3K-Akt, θα μπορούσε επίσης να είναι κρίσιμη για την ενεργοποίηση της έκφρασης miR-518c-5P, ως εκ τούτου, περαιτέρω μελέτες θα χρειαστούν για να διευκρινιστεί αυτό το μηχανισμό.

στην παρούσα μελέτη, miR-518c-5P που προκαλείται από το σύστημα SDF-1 /CXCR4 δεν διέγειρε την κυτταρική ανάπτυξη αλλά δεν ενισχύσει μετανάστευση κυττάρων χρησιμοποιώντας έναν αναστολέα LNA. Αντίθετα, θα μπορούσε να ανιχνεύσει τόσο την διέγερση της ανάπτυξης και την ενίσχυση της μετανάστευσης μετά την επιμόλυνση ενός φορέα έκφρασης miR-518c,

in vitro

και

in vivo

. Αν και ο λόγος δεν είναι σαφής, το εύρημα μπορεί να οφείλεται στην επίδραση του miR-518c-3ρ που παράγεται από τον φορέα έκφρασης miR-518c. Ωστόσο, δεν μπορέσαμε να βρούμε προηγούμενες εκθέσεις σχετικά με miR-518c-3ρ στα καρκινικά κύτταρα και την ανάπτυξη των κυττάρων, και ενός αναστολέα LNA κατά miR-518c-5P θα μπορούσε να καταστείλει την ενίσχυση της ανάπτυξης, τόσο σε B88-518c και CAL27-518c κύτταρα (Εικ. 3Ε ,ΦΆ). Έτσι, πιστεύουμε ότι η επίδραση του miR-518c-3ρ για την ανάπτυξη των κυττάρων θα μπορούσε να αγνοηθεί εν μέρει. Η δεύτερη δυνατότητα μπορεί να οφείλεται στην αρνητική ρύθμιση των μη φυσιολογικές ή ψευδείς mRNAs στόχο που μοιράζονται μια παρόμοια ακολουθία σπόρο από την υπερέκφραση του miR-518c-5P. Ωστόσο, η υπερέκφραση του miR-518c-5p από το ολιγονουκλεοτίδιο ανέστειλε αντιστρόφως την ανάπτυξη και τη μετανάστευση των κυττάρων και τα κύτταρα B88 CAL27, πιθανότατα λόγω της προς τα κάτω ρύθμιση του mRNA ψευδών στόχου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η έκφραση του miR-518c χρησιμοποιώντας τη μέθοδο φορέα που προκαλείται από μια φυσιολογική και μη-τοξική κατάσταση σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα από το στόμα. Έτσι, πιστεύουμε ότι η μέτρια επαγωγή του miR-518c-5P μπορεί να είναι επαρκής για τη μετανάστευση των κυττάρων, αλλά μπορεί να χρειαστούν ισχυρή επαγωγή του miR-518c-5P για την επαγωγή της κυτταρικής ανάπτυξης. Επειδή το

in silico

στόχους mRNA του miR-518c-5P περιλαμβάνουν διάφορους τύπους γονιδίων που ρυθμίζουν την ανάπτυξη και μετάσταση (S1 πίνακα), διατριβές γονίδια στόχους μπορεί να ελέγχει τη διαφορετική επίδραση του miR-518c-5P.

C19MC, συμπεριλαμβανομένων των miR-518c-5P, χάρτες για να 19q13.4 χρωμοσωμική ζώνη [20]. Kasamatsu και συνεργάτες απέδειξαν ότι ο τόπος 19q13.4 ενισχύεται σε σιελογόνων αδένων αδενοκυστικό καρκίνωμα, μια ιδιαίτερα μεταστατική τύπο του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. [25] Επιπλέον, η ενίσχυση αυτού του τόπου είναι συχνά ανιχνεύεται σε ependymoblastoma και εμβρύου όγκους με άφθονη νευροπιλήματος και αληθινή ρόδακες, πολύ επιθετική εμβρυονικό νεοπλάσματα, σε ποσοστό 93% [26]. Το σύστημα /CXCR4 SDF-1 παίζει σημαντικούς ρόλους στη διατήρηση της αρχιτεκτονικής του κόγχες για αιμοποιητικών και άλλα βλαστικά κύτταρα ιστού όπως γεννητικών κυττάρων και θυλακιώδη, εντερική, και νευρικών βλαστικών κυττάρων [27], [28]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα περισσότερα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) εκφράζουν CXCR4 και να απαντήσετε σε μια χημειοτακτική βαθμίδα του SDF-1, γεγονός που υποδηλώνει ότι ΚΕΠ πιθανότατα αντιπροσωπεύουν ένα υποπληθυσμό την ικανότητα έναρξης μετάσταση [29]. Επιπλέον, αρκετές ομάδες έχουν συνδεθεί πρόσφατα την έκφραση των μελών της C19MC με τη χαρακτηριστική υπογραφή miRNA για ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα [20]. Στο σύνολό τους, C19MC, συμπεριλαμβανομένων των miR-518c-5P, θα μπορούσε να εκφραστεί σε ΚΕΠ που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και μετάσταση.

Συμπεράσματα και συστάσεις

Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ρυθμίζει miR-518c-5P η ανάπτυξη και η μετάσταση του καρκίνου του στόματος ως κατάντη στόχου του συστήματος SDF-1 /CXCR4. Στο μέλλον, θα είναι κρίσιμη για να εξετάσει τη σχέση μεταξύ CXCR4 και την έκφραση του miR-518c-5P στο κλινικό υλικό. Αν και ο μοριακός μηχανισμός του miR-518c-5P έναντι μετάστασης καρκίνου θα μπορούσε να διασαφηνιστεί περαιτέρω, η καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και μετανάστευση από έναν αναστολέα miR-518c-5P μπορεί να χρησιμεύσει ως βάση για την ανάπτυξη θεραπειών κατά της μετάστασης.

Υποστήριξη Πληροφορίες

πίνακα S1.

miRNA στοχεύει miR-518c-5P αναλύεται με τη χρήση του προγράμματος microRNA.org (https://www.microrna.org/microrna/getMirnaForm.do), και η τιμή αποκοπής προσαρμόζεται κάτω από -1.5 της βαθμολογίας miRSVR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115936.s001

(DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Koh-ichi Nakashiro (Τμήμα Στοματικής και Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής, Πανεπιστήμιο Ehime Graduate School of Medicine) για την παροχή τεχνικής βοήθειας.