Abstract

Σε αυτή τη μελέτη, έξι 2-φαινυλοναφθαλένια με ομάδες υδροξυλίου συντέθηκαν σε υψηλές αποδόσεις από την απομεθυλίωση των αντίστοιχων μεθοξυ-2-φαινυλοναφθαλένια, και ένα 2-φαινυλοναφθαλένιο με μία αμινομάδα λήφθηκε με υδρογόνωση. Όλα τα παράγωγα της 2-φαινυλοναφθαλένιο αξιολογήθηκαν για κυτταροτοξικότητα, και η σχέση δομής-δραστικότητας (SAR) έναντι (MCF-7) ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού προσδιορίστηκε επίσης. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι SAR κυτταροτοξικότητα ήταν αξιοσημείωτα προωθείται από την ομάδα υδροξυλίου στη θέση C-7 του δακτυλίου ναφθαλίνης. Η εισαγωγή των ομάδων υδροξυλίου στη θέση C-6 του δακτυλίου ναφθαλινίου και το C-4 ‘θέση του δακτυλίου φαινυλίου αρκετά ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα, αλλά η εισαγωγή μιας ομάδας υδροξυλίου στο C-3′ θέση του δακτυλίου φαινυλίου μειώθηκε ελαφρά κυτταροτοξικότητα. Συνολικά, 6,7-διυδροξυ-2- (4’-υδροξυφαινυλο) ναφθαλένιο (PNAP-6Η) εμφάνισε το καλύτερο κυτταροτοξικότητα, με IC

50 τιμή του 4.8 μΜ κατά της κυτταρικής σειράς MCF-7, και έδειξε χαμηλή τοξικότητα προς τα κανονικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού (MCF-10Α). PNAP-6Η οδήγησε στη σύλληψη των κυττάρων στη φάση S, κατά πάσα πιθανότητα οφείλεται στην αύξηση των επιπέδων ρ21 και ρ27 και μειώνοντας τα επίπεδα της κυκλίνης D1, CDK4, κυκλίνη Ε, και CDK2. Επιπλέον, PNAP-6Η μειώθηκε CDK1 και έκφραση κυκλίνης Β1, πιθανότατα οδηγούν σε G

2 /M σύλληψης, και επαγόμενη από μορφολογικές αλλαγές, όπως η πυρηνική συρρίκνωση, πυρηνική κατάτμηση, και την πυρηνική hypercondensation, όπως παρατηρείται από την Hoechst χρώση 33.342. PNAP-6Η απόπτωση, πιθανότατα με την προώθηση της έκφρασης του Fas, αυξημένη δραστηριότητα PARP, κασπάσης-7, κασπάσης-8, και της έκφρασης της κασπάσης-9, ο Bax /Bcl-2 αναλογία, και η φωσφορυλίωση της ρ38, και μειώθηκε ο φωσφορυλίωση της ERK. Αυτή η μελέτη παρέχει την πρώτη απόδειξη του κυτταροτοξικότητα PNAPs εναντίον κυττάρων MCF-7 και διαφωτίζει τον μηχανισμό υποκείμενων PNAP επαγόμενη κυτταροτοξικότητα

Παράθεση:. Chang CF, Ke CY, Wu YC, Chuang Θ (2015) Δομή- Δραστηριότητα Σχέσεις Συνθετικής 2-φαινυλοναφθαλένια με ομάδες υδροξυλίου ότι αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και διεγείρουν απόπτωση του Καρκίνου MCF-7 κύτταρα. PLoS ONE 10 (10): e0141184. doi: 10.1371 /journal.pone.0141184

Επιμέλεια: Yi-Hsien Hsieh, Ινστιτούτο Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, ΤΑΪΒΑΝ

Ελήφθη: 13 του Ιούλη του 2015? Αποδεκτές: 6 Οκτώβρη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 22 Οκτώβρη του 2015

Copyright: © 2015 Chang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: Οι συγγραφείς θα ήθελα να ευχαριστήσω το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας, Ταϊβάν (MOST 103 με 2320-Β-039-027-? ΠΙΟ 103-2113-. M-039-003- και οι περισσότεροι 103 έως 2738-M-039-001-), η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου (CMU103-Ν-05), και εν μέρει, η επιχορήγηση από το Ερευνητικό Κέντρο Κινέζικη Ιατρική, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου (το Υπουργείο Παιδείας, ο στόχος για το σχέδιο Top Πανεπιστήμιο) για οικονομική υποστήριξη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου

του μαστού είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες? Ως εκ τούτου, η αναζήτηση για ένα νέο και αποτελεσματικό αντικαρκινικό παράγοντα είναι επιτακτική. παράγωγα ναφθαλίνης εμφανίζουν ισχυρή αντι-αρρυθμίας, αντι-όγκου, και αντιοξειδωτικές δραστηριότητες [1]. Φαρμακολογικώς, 2-φαινυλοναφθαλένια (PNAPs) έχουν παρόμοιες χωρικές και διαμορφωτική απαιτήσεις για γενιστεΐνη (μια ισοφλαβόνη) και παρουσιάζουν ένα μεγάλο αριθμό βιολογικών και βιοϊατρική [2] επιδράσεις. Χημικά, 1-υποκατεστημένες ναφθαλίνη, όχι 2-υποκατεστημένη ναφθαλίνη, λαμβάνεται με την ηλεκτρόφιλη αρωματική υποκατάσταση της ναφθαλίνης. Για το καλύτερο της γνώσης μας, μελέτες για τη σχέση μεταξύ της δομής και κυτταροτοξικότητα των πολυ-υποκατεστημένων PNAPs είναι σπάνιες. Σε αυτή τη μελέτη, συνθέσαμε μη υποκατεστημένο PNAP-1, επτά μεθοξυ-PNAPs (PNAP-2-PNAP-8), έξι αντίστοιχο υδροξυ-PNAPs (PNAP-2Η-PNAP-7Η), και μία αμινο-PNAP (PNAP-8η) και διερευνήθηκαν αντικαρκινικές σχέσεις και τους μηχανισμούς δράσης στην κυτταρική σειρά MCF-7 δομής-δραστικότητας τους.

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η genistein και οι ενώσεις με τον φαινυλ-1-βενζοπυραν-4-όνη ραχοκοκαλιά αναστέλλουν την ανάπτυξη των τα καρκινικά κύτταρα μέσω διακοπή του κυτταρικού κύκλου και επαγωγή απόπτωσης [3-5]. εξαρτώμενη κινάση (CDK) σύμπλοκα κυκλίνης-κυκλίνης είναι οι κύριοι ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου, η οποία είναι μια πολύ πολύπλοκη και αυστηρά ελεγχόμενη διαδικασία [6,7]. Το G

μετάπτωσης φάσης 1 /S ρυθμίζεται από ενεργοποίηση της κυκλίνης D1-CDK4 /6 πολύπλοκη και κυκλίνη E-CDK2 σύμπλεγμα [8,9], ενώ το G

2 /M μετάπτωσης φάσης ρυθμίζεται από ενεργοποίηση της κυκλίνης Β1-CDK1 συγκρότημα [10,11]. Η απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου προκαλεί έλλειψη διαφοροποίησης και ανώμαλης ανάπτυξης.

Η απόπτωση είναι μια εξελικτική διαδικασία που οδηγεί σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο [12]. Η διαδικασία της απόπτωσης περιλαμβάνει μορφολογικές αλλαγές (π.χ., συρρίκνωση κυττάρου, διόγκωση μεμβράνης, συμπύκνωση χρωματίνης, και η πυρηνική κατάτμηση) και βιοχημικές μεταβολές (π.χ., διάσπαση DNA, διάσπαση της πρωτεΐνης, και πρωτεΐνη εγκάρσια σύνδεση) [13,14]. Πολλοί αντικαρκινικοί παράγοντες επάγουν τον κυτταρικό θάνατο με την ενεργοποίηση κασπασών, οι οποίες αποτελούν μέρος μιας κοινής αποπτωτικής παθολογικής οδού [15,16]. έχουν εξωγενή και ενδογενή μονοπάτια που ρυθμίζουν κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση έχουν ταυτοποιηθεί [17]. Στην εξωγενή οδό, Fas, ένας υποδοχέας θανάτου, οδηγεί στο σχηματισμό ενός επάγει θάνατο FADD-κασπάσης-8 σύμπλεγμα σηματοδότησης [18]. Η ενδογενής οδός ελέγχεται από την Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών. Πρώτον, οι αναλογία Bax /Bcl-2 αυξάνει, και η αύξηση αυτή ακολουθείται από την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, οδηγώντας σε ενεργοποίηση της κασπάσης-9 και κασπάσης-3 [19]. Η οδός ΜΑΡΚ είναι γνωστή για ρύθμιση της κυτταρικής επιβίωσης και της απόπτωσης. Η οικογένεια ΜΑΡΚ αποτελείται από τρεις μεγάλες κινάσες: ERK, ρ38, και JNK [20]. ERK κατά προτίμηση ενεργοποιείται από παράγοντες ανάπτυξης, που οδηγεί στην κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση. ρ38 και JNK ενεργοποιούνται επιλεκτικά από τη διέγερση κυτοκίνης και το οξειδωτικό στρες, με αποτέλεσμα την κυτταρική διαφοροποίηση και την απόπτωση [21,22]. Δεν είναι σαφές εάν η ενδογενής /εξωγενής οδός ή η οδός ΜΑΡΚ ενεργοποιείται σε PNAP απόπτωση που διαμεσολαβείται. Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε την κυτταροτοξικότητα μιας σειράς PNAPs έναντι κυττάρων MCF-7 και διαλευκανθεί ο μηχανισμός στηρίζεται PNAP επαγόμενη κυτταροτοξικότητα.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημεία

Οι προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται για τη σύνθεση των παραγώγων δεκαπέντε PNAP φαίνεται στο Σχ 1. 2-φαινυλοναφθαλένιο (PNAP-1) και επτά μεθοξυ-PNAPs (PNAP-2-PNAP-8) συντέθηκαν από εμπορικώς διαθέσιμα φαινυλακετονιτρίλια και βενζαλδεΰδες σύμφωνα με προηγουμένως αναφερθείσες μεθόδους [23]. Έξι αντίστοιχο υδροξυ-PNAPs (PNAP-2Η-PNAP-7Η) ελήφθησαν με την απομεθυλίωση του PNAP-2-PNAP-7 σε εξαιρετικές αποδόσεις (91% έως 100%). Μία αμινο-PNAP (PNAP-8h) λήφθηκε με την υδρογόνωση του PNAP-8 σε απόδοση 86%. Το

1 και

13C NMR φάσματα PNAP-2h-PNAP-8h είναι διαθέσιμες στην Υποστήριξη Πληροφοριών (Σχήματα A-G στο S1 αρχείου). Όλα τα PNAPs διαλύθηκαν σε DMSO σε συγκέντρωση 50 mM για την παρασκευή διαλυμάτων αποθέματος, τα οποία φυλάχθηκαν στους -20 ° C.

Οι οκτώ 2-φαινυλοναφθαλένια (PNAP-1-PNAP-8) ήταν εύκολα που λαμβάνονται από φαινυλακετονιτρίλια και βενζαλδεϋδες μέσω έξι βήματα. Στη συνέχεια, η έξι υδροξυ-PNAPs (PNAP-2Η-PNAP-7Η) ελήφθησαν με απομεθυλίωση του αντίστοιχου μεθοξυ-PNAPs (PNAP-2-PNAP-7). Δυστυχώς, οι προσπάθειες στην απομεθυλίωση PNAP-8 κάτω από τις ίδιες συνθήκες οδήγησε σε σύνθετα μίγματα. Μια άλλη υδρόφιλες αμινο-PNAP (PNAP-8h) παρήχθη από τη μείωση της νιτρο-PNAP (PNAP-8).

Η

Γενική Διαδικασία για την Παρασκευή των υδροξυ-PNAPs.

BBR

3 σε CH

2Cl

2 σε συγκέντρωση 1 Μ (5 mL, 5 mmol) προστέθηκε αργά σε ένα διάλυμα μεθοξυ-PNAPs (PNAP-2-PNAP-7, 0,5 mmol) σε CH

2Cl

2 (20 mL) στους 0 ° C. Το μίγμα αφέθηκε να θερμανθεί σε θερμοκρασία δωματίου και αναδεύτηκε για 1 ώρα. Το προκύπτον διάλυμα χύθηκε εντός H

2O (50 mL). Η H

2O στιβάδα εκχυλίστηκε με EtOAc (3 χ 50 mL), και τα συνδυασμένα εκχυλίσματα πλύθηκαν με Η

2O (3 χ 50 mL), ξηραίνεται με άνυδρο θειικό μαγνήσιο

4, και διηθείται. Το διήθημα συμπυκνώθηκε, και το υπόλειμμα καθαρίστηκε με χρωματογραφία στήλης υπεράνω πυριτικής πηκτής και εκλούεται με EtOAc για να ληφθεί υδροξυ-PNAPs (PNAP-2Η-PNAP-7Η). Οι πλήρεις φασματικά δεδομένα αυτών των ενώσεων που περιγράφονται ως εξής

6-υδροξυ-2-φαινυλοναφθαλένιο (PNAP-2Η)

91% απόδοση..? λευκό στερεό, mp 176-177 ° C (βιβλ [24], σ.τ. 169-170 ° C).

1Η NMR (500 ΜΗζ,

3)

δ

5.12 (1Η, br s), 7,12 (1Η, dd,

J

= 8,8, 2,4 Hz), 7.17 (1Η, s), 7.36 (2Η, t,

J

= 7,4 Hz), 7,47 (1Η, t,

J

= 7.4 Hz), 7.69-7.71 (3Η, m ), 7,75 (1Η, d,

J

= 8,8 Hz), 7,80 (1Η, d,

J

= 8,8 Hz), 7,97 (1Η, s)?

13C NMR (125 ΜΗζ,

3)

δ

109.3, 118.2, 125.7, 126.3, 126.9, 127.1, 127.2 (2 χ C), 128,8 (2 χ C), 129,2, 130,2, 133,8, 136,4, 141,2, 153,5? IR (KBr) 3339, 3046, 1618, 1495, 1292, 1194 εκατοστά

-1? ESIMS

m /z

(σχετική ένταση) 219 (100, [Μ-Η]

-)? HRESIMS

m /z

υπολογίστηκε για C

16H

11ο: 219.08044? βρέθηκαν:.. 219.08036 [Μ-Η]

–

6,7-διϋδροξυ-2-φαινυλοναφθαλένιο (PNAP-3h)

Απόδοση 98%? λευκό στερεό, mp 205-207 ° C.

1Η NMR (500 MHz, DMSO-

d

6)

δ

7,12 (1Η, s), 7,20 (1Η, s), 7.32 (1Η, t,

J

= 7,5 Hz), 7,45 (2Η, t,

J

= 7.5 Hz), 7.50 (1Η, d,

J

= 8.4 Hz), 7.65 ( 1Η, d,

J

= 8,4 Hz), 7,72 (2Η, d,

J

= 7,5 Hz), 7,86 (1Η, s), 9,57 (2Η, br s)?

13C NMR (125 MHz, DMSO-

δ

6)

δ

109,5, 110,2, 112,2, 123,4, 126,4, 126,8 (2 × C), 127,0, 128,3 , 129,0 (2 χ C), 129,3, 134,7, 140,9, 147,3, 147,4? IR (KBr) 3495, 3395, 1628, 1528, 1119 εκατοστά

-1? ESIMS

m /z

(σχετική ένταση) 235 (100, [Μ-Η]

-)? HRESIMS

m /z

υπολογίστηκε για C

16H

11o

2: 235.0754? βρέθηκαν:.. 235.0755 [Μ-Η]

–

2- (4′-υδροξυφαινυλο) ναφθαλίνη (PNAP-4h)

Απόδοση 100%? λευκό στερεό, mp 166-167 ° C (βιβλ [25], σ.τ. 167-169 ° C).

1Η NMR (500 ΜΗζ,

3)

δ

4.89 (1Η, br s), 6.95 (2Η, d,

J

= 8.6 Hz), 7.44- 7.50 (2Η, m), 7,61 (2Η, d,

J

= 8,6 Hz), 7,70 (1Η, dd,

J

= 8,5, 1,7 Hz), 7.84-7.90 (3Η , m), 7,97 (1Η, s)?

13C NMR (125 ΜΗζ,

3)

δ

115,7 (2 χ C), 125,0, 125,4, 125,7, 126,2, 127,6, 128,0, 128,3, 128,7 (2 χ C), 132.3, 133.7, 133.9, 138.1, 155.1? IR (KBr) 3564, 3055, 1603, 1512, 1180 εκατοστά

-1? ESIMS

m /z

(σχετική ένταση) 219 (41, [Μ-Η]

-)? HRESIMS

m /z

υπολογίστηκε για C

16H

11ο: 219.08044? βρέθηκαν:.. 219.08043 [Μ-Η]

–

6-υδροξυ-2- (4′-υδροξυφαινυλο) ναφθαλίνη (PNAP-5η)

Απόδοση 93%? λευκό στερεό, mp 127-128 ° C (βιβλ [26], σ.τ. 258-262 ° C).

1Η NMR (500 MHz, DMSO-

δ

6)

δ

6,86 (2Η, d,

J

= 8,4 Hz), 7.01 ( 1Η, dd,

J

= 8,8, 2,0 Hz), 7,10 (1Η, s), 7,56 (2Η, d,

J

= 8,4 Hz), 7,63 (1Η, dd,

J

= 8,6, 1,6 Hz), 7,70 (1Η, d,

J

= 8,6 Hz), 7,78 (1Η, d,

J

= 8,8 Hz), 7,94 (1Η, s), 9.51 (1Η, br s), 9.70 (1Η, br s)?

13C NMR (125 MHz, DMSO-

δ

6)

δ

108.6, 115.9 (2 × C), 119,1, 124,1, 125,2, 126,7, 127,8 (2 × C), 128,3, 129,7, 131,2, 133,5, 134,6, 155,3, 157,0? IR (KBr) 3183, 3030, 1603, 1512, 1265, 1204 εκατοστά

-1? ESIMS

m /z

(σχετική ένταση) 235 (100, [Μ-Η]

-)? HRESIMS

m /z

υπολογίστηκε για C

16H

11o

2: 235.0754? βρέθηκαν:.. 235.0751 [Μ-Η]

–

6,7-διϋδροξυ-2- (4′-υδροξυφαινυλο) ναφθαλίνη (PNAP-6h)

Απόδοση 98%? λευκό στερεό, mp 280-282 ° C.

1Η NMR (500 MHz, DMSO-

δ

6)

δ

6,84 (2Η, d,

J

= 8,1 Hz), 7.08 ( 1Η, s), 7,13 (1Η, s), 7,42 (1Η, d,

J

= 8,4 Hz), 7,53 (2Η, d,

J

= 8,1 Hz), 7,58 ( 1Η, d,

J

= 8,4 Hz), 7,73 (1Η, s), 9.46 (3Η, br s)?

13C NMR (125 MHz, DMSO-

δ

6)

δ

109,5, 109,9, 115,8 (2 × C), 122,0, 122,2, 126,2, 127,7, 127,8 (2 χ C), 129,3, 131,6, 134,8, 146,8, 147,3, 156,8? IR (KBr) 3495, 3341, 1597, 1520, 1119 cm

-1? ESIMS

m /z

(σχετική ένταση) 251 (100, [Μ-Η]

-)? HRESIMS

m /z

υπολογίστηκε για C

16H

11o

3: 251.07027? βρέθηκαν:. 251.07032 [ΜΗ]

–

6,7-διυδροξυ-2- (3 ‘, 4’-διυδροξυφαινυλ) ναφθαλίνη (PNAP-7Η)

Απόδοση 100%. ? λευκό στερεό, mp 230 ° C (αποσύνθ.).

1Η NMR (500 MHz, DMSO-

δ

6)

δ

6,80 (1Η, d,

J

= 8,2 Hz), 6.98 ( 1Η, dd,

J

= 8,2, 2,0 Hz), 7,08 (1Η, s), 7,09 (1Η, d,

J

= 2,0 Hz), 7,13 (1Η, s), 7.37 (1Η, d,

J

= 8,4 Hz), 7,57 (1Η, d,

J

= 8,4 Hz), 7,68 (1Η, s), 8,94 (2Η, br s) , 9,46 (2Η, br s)?

13C NMR (125 MHz, DMSO-

δ

6)

δ

109,5, 110,0, 114,1, 116,2, 117,7, 122,0, 122,2, 126,2, 127,7, 129,3, 132,3, 135,1, 144,9, 145,7, 146,8, 147,3? IR (KBr) 3372, 3329, 1602, 1234, 1111 εκατοστά

-1? ESIMS

m /z

(σχετική ένταση) 267 (100, [Μ-Η]

-)? HRESIMS

m /z

υπολογίστηκε για C

16H

11o

4: 267.0652? βρέθηκαν:.. 267.0647 [ΜΗ]

–

2- (4′-αμινοφαινυλο) -6,7-διμεθοξυ (PNAP-8h)

PNAP-8 (77 mg, 0.25 mmol) υποβλήθηκε σε υδρογόνωση (50 psi) χρησιμοποιώντας 10% Pd /C ως καταλύτη σε τετραϋδροφουράνιο (THF, 10 mL) και EtOH (1 mL) σε θερμοκρασία δωματίου για 12 ώρες. Το μίγμα της αντίδρασης διηθήθηκε, και το διήθημα συμπυκνώθηκε. Το υπόλειμμα καθαρίστηκε με χρωματογραφία στήλης υπεράνω πυριτικής πηκτής και εκλούεται με EtOAc για να δώσει PNAP-8h. Απόδοση 86%? ωχρό κίτρινο στερεό, σ.τ. 190-191 ° C.

1Η NMR (500 ΜΗζ,

3)

δ

3.74 (2Η, br s), 4,01 (6Η, s), 6.79 (2Η, d,

J

= 8,1 Hz), 7,12 (1Η, s), 7,15 (1Η, s), 7,52 (2Η, d,

J

= 8,1 Hz), 7,56 (1Η, d,

J

= 8,4 Hz), 7,71 (1Η, d,

J

= 8,4 Hz), 7,82 (1Η, s)?

13C NMR (125 ΜΗζ,

3)

δ

55.9 (2 χ C), 106,1, 106,5, 115,5 (2 χ C), 123,2, 123,6, 126,7, 127,8, 128,1 ( 2 × C), 129.6, 131.8, 137.0, 145.6, 149.2, 149.7? IR (KBr) 3460, 3439, 3018, 2995, 1624, 1504, 1244, 1130 εκατοστά

-1? ESIMS

m /z

(σχετική ένταση) 280 (100, [Μ + Η]

+)? HRESIMS

m /z

υπολογίστηκε για C

18Η

17NO

2: 251.07027? βρέθηκε: 251.07032 [Μ + Η]

+

καλλιέργειας κυττάρων

MCF-7 κύτταρα ελήφθησαν από το εργαστήριο του Δρ Γιανγκ-Chang Wu (Τμήμα Φαρμακευτικής, Κίνα Ιατρική. Πανεπιστήμιο, Ταϊβάν), και MCF-10Α κύτταρα ελήφθησαν από το εργαστήριο του Δρ Wei-Chien Huang (Πανεπιστημιακό Ινστιτούτο Βιολογίας του Καρκίνου, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου, Ταϊβάν). Τα κύτταρα MCF-7 διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM /F12 που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. κύτταρα ΜΟΡ-10Α διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM /F12 που περιέχει 1,05 mM ΟαΟ

2, 100 mg /ml τοξίνης χολέρας, 5% ορό αλόγου, 10 μg /ml ινσουλίνη, 500 ng /ml υδροκορτιζόνη και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε θερμοκοιτίδες καλλιέργειας κυττάρων, τα οποία τέθηκαν σε θερμοκρασίες από 37 ° C και συμπληρώθηκε με 5% CO

2.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

κύτταρα MCF-7 απλώθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων, επωάστηκαν όλη τη νύκτα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, και 50 μΜ) δεκαπέντε PNAPs (PNAP-1-PNAP-8 και PNAP-2Η-PNAP-8Η). Επιπλέον, τα κύτταρα ΜΟΡ-10Α επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων, επωάστηκαν όλη τη νύκτα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, και 100 μΜ) τριών PNAPs (PNAP-3h, -6Η, και -7Η). Μετά από 48 ώρες θεραπείας, 10 μΐ διαλύματος ΜΤΤ (5 mg /ml σε PBS) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 4 ώρες στους 37 ° C. Το μέσο στη συνέχεια αφαιρεθεί εντελώς, και 50 μΙ DMSO προστέθηκε σε διαλυτοποίηση των ΜΤΤ κρύσταλλοι φορμαζάνης. Η απορρόφηση σε μήκος κύματος 550 nm μετρήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλάκας MQX200R (BioTek, VT, USA).

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

κύτταρα MCF-7 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 3 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων, επωάστηκαν όλη τη νύκτα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PNAP-1, -3Η, και -6Η σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις (5, 10, και 25 μΜ). Μετά από 48 ώρες αγωγής, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν μία φορά με PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη για 1 ώρα στους -20 ° C. Τα στερεωμένα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS, αιωρήθηκαν σε 0.5 ml PBS που περιέχει 0,2 mg /ml ΚΝάση και 0,1% Triton Χ-100 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο 20 μg /ml προπίδιο. Τα βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FACScan κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, CA, USA). Ο φθορισμός που εκπέμπεται από το σύμπλοκο ιωδιούχο προπίδιο-DNA εκτιμήθηκε από το ελάχιστο των 10.000 κύτταρα ανά δείγμα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Cell Quest Άλλως λογισμικού (BD Biosciences, USA).

Western ανάλυση κηλίδος

τα κύτταρα MCF-7 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 3 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων, επωάστηκαν όλη τη νύκτα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PNAP-1, -3Η, και -6Η σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις (5, 10 , και 25 μΜ) για 48 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα ΚΙΡΑ για 30 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε στις 15.000 rpm και 4 ° C για 30 λεπτά. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε μέσω ενός προσδιορισμού Bio-Rad χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλάκας MQX200R (BioTek, VT, USA). Τα κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά πάνω σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA). Μετά από αρκετές πλύσεις, οι μεμβράνες αποκλείσθηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε TBST (Τρις-ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0.1% Tween-20) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με διαφορετικές πρωτογενή αντισώματα εναντίον κυκλίνη D1, CDK4, κυκλίνη Ε, CDK2, ρ21, ρ27, κυκλίνη Β1, CDK1, διασπασμένη κασπάση-7, -8, -9, PARP, Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bid, Fas, ρ-ρ38, ρ38, ρ-ΙΝΚ , JNK, ρ-ΕΚΚ, ή ERK (αραίωση 1: 1000). Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με TBST και ανιχνεύθηκε με υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) δευτερογενές αντίσωμα (1: 2000) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από τρεις πλύσεις σε TBST, το δεσμευμένο αντίσωμα οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ECL Western Blotting (PerkinElmer, Boston, MA, USA), και η χημειοφωταύγεια ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας φιλμ Fuji Ιατρικές ακτίνων Χ (Tokyo, Japan).

μελέτες κυτταρικής μορφολογίας

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο, επωάστηκαν όλη τη νύκτα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με PNAP-1, -3Η, και -6Η σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις (5, 10, και 25 μΜ) για 48 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS, και ένα υποσύνολο των κυττάρων χρωματίστηκε με Hoechst 33342 (10 μg /ml για 15 λεπτά). Οι μορφολογικές αλλαγές μετά παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία φωτός στα 100 × μεγέθυνση και φθορισμού μικροσκοπία στα 200 × μεγέθυνση.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SEM από τρεις επαναληπτικές πειράματα . Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων συγκρίθηκαν με ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) και Tukey test-hoc υστέρων Ειλικρινά σημαντική διαφορά (HSD) χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS 12.0 για Windows (USA). Οι τιμές Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Επίδραση των PNAPs σε MCF-7 κυτταρική γραμμή η βιωσιμότητα και η μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας τους

Για να διερευνηθούν οι επιδράσεις των 2-φαινυλοναφθαλένια PNAP-1-PNAP-8, τα παράγωγα απομεθυλίωση τους PNAP-2Η-PNAP-7Η, και αμινο-PNAP (PNAP-8η) στην επιβίωση των κυττάρων, MCF-7 κύτταρα κατεργάστηκαν με διαφορετικές δόσεις κάθε ένωση (0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, και 50 μΜ) για 48 ώρες. Τα ποσοστά της βιωσιμότητας προσδιορίστηκαν μέσω της δοκιμασίας ΜΤΤ, και τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 1. Αρχικά, PNAP-1 δεν έδειξε σημαντική δραστικότητα σε κύτταρα MCF-7, και PNAP-2-PNAP-8, τα οποία περιέχουν μεθοξυ-ομάδες, που προκαλείται καθίζηση στα μέσα κυττάρων σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από 5 μΜ (Πίνακας 1). Ως εκ τούτου, τα περισσότερα παράγωγα υδρόφιλα PNAP PNAP-2Η-PNAP-8h σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν. Πράγματι, δεν παρατηρήθηκε καταβύθιση για PNAP-2Η-PNAP-8h, πιθανότατα λόγω του σχηματισμού διαμοριακών δεσμών υδρογόνου μεταξύ του νερού και του υδροξυλίου (ή αμινο) ομάδες επί των 2-φαινυλοναφθαλένια. Τρία από τα παράγωγα (PNAP-3h, -6Η, και -7Η) εμφάνισαν σημαντική τοξικότητα εξαρτάται από τη δόση εναντίον κυττάρων MCF-7, με IC

50 τιμές των 17.9, 4.8, και 31.8 μΜ, αντίστοιχα (Πίνακας 1), ενώ τα IC

50 τιμές που λαμβάνονται έναντι των κυττάρων MCF-10Α ήταν 71,0, 50,9 και 55,1 μΜ, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι PNAP-3h και -6Η διαθέτουν ενισχυμένη και εκλεκτική κυτταροτοξικότητα εναντίον κυττάρων MCF-7 και δείχνουν χαμηλή τοξικότητα έναντι κυττάρων MCF-10Α.

Η

Τα ανωτέρω περιγραφέντα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι PNAP-5Η, η οποία έχει ομάδες υδροξυλίου στη θέση C-6 του δακτυλίου ναφθαλινίου και στη θέση του C-4 ‘του δακτυλίου φαινυλίου, παρουσίασαν καλύτερη κυτταροτοξικότητα από PNAP-1, -2Η, και -4Η στις δοκιμές μας. Αυτό το φαινόμενο δείχνει ότι η εισαγωγή των ομάδων υδροξυλίου στη θέση C-6 του δακτυλίου ναφθαλινίου και η θέση της C-4 ‘του δακτυλίου φαινυλίου ενισχύει την κυτταροτοξικότητα. Περιέργως, οι δύο 2-φαινυλοναφθαλένια PNAP-3h και -6Η, τα οποία περιέχουν μία ομάδα υδροξυλίου στη θέση C-7 του δακτυλίου ναφθαλίνης, παρουσίασαν καλύτερη κυτταροτοξική δραστηριότητα ενάντια στην κυτταρική γραμμή MCF-7 (συγκρίνετε PNAP-3h να -2Η και συγκρίνετε PNAP-6h να 5Η). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η κυτταροτοξικότητα σημαντικά προωθείται από την παρουσία μιας ομάδας υδροξυλίου στη θέση C-7 του δακτυλίου ναφθαλίνης. Επιπλέον, θα πρέπει να σημειωθεί ότι PNAP-6Η εμφάνισε την καλύτερη δραστικότητα ενάντια στην κυτταρική γραμμή MCF-7 (IC

50 = 4.8 μΜ). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε επίσης ότι η εισαγωγή μιας ομάδας υδροξυλίου στην θέση C-4 ‘του δακτυλίου φαινυλίου θα ενισχύσει τις δραστηριότητες κατά της κυτταρικής σειράς MCF-7. Αντίθετα, η παρουσία μιας ομάδας υδροξυλίου στην θέση C-3 ‘του δακτυλίου φαινυλίου στη PNAP-7Η μπορεί σημαντικά να μειώσει την κυτταροτοξικότητα (σύγκρινε PNAP-6Η και -7Η). Επιπλέον, η σύγκριση των κυτταροτοξικών δραστηριότητες του PNAP-6Η και PNAP-8h δείχνει ότι η παρουσία μίας ομάδας υδροξυλίου, η οποία χρησιμεύει ως δότης Η-δεσμού, με το δαχτυλίδι ναφθαλίνη αποδίδει καλύτερα δραστηριότητες από την παρουσία μιας μεθοξυ ομάδας, το οποίο χρησιμεύει ως δέκτης η-δεσμού. Με βάση την βιωσιμότητα των κυττάρων και των αποτελεσμάτων SAR, ερευνήσαμε περαιτέρω τους πιθανούς λόγους για τη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων που προκαλείται από PNAP-3h και -6Η και διευκρινιστεί τον υποκείμενο μηχανισμό.

Επίδραση της PNAPs επί των μορφολογικών χαρακτηριστικών των MCF -7 κύτταρα

Κατ ‘αρχάς, η επίδραση της PNAP-1, -3Η και 6Η στην κυτταρική μορφολογία παρατηρήθηκε με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. MCF-7 κύτταρα σε αγωγή είτε με έκδοχο αναφοράς (0,05% DMSO) ή 5 έως 25 μΜ PNAP-1 έδειξε πυκνούς πληθυσμούς κυττάρων κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Σχ 2Α-2D). Τα κύτταρα MCF-7 ήταν κανονικό σχήμα και μέγεθος, με έκκεντρο πυρήνα και ένα σχετικά μικρό ποσό του κυτταροπλάσματος. Η κυτταρική πυκνότητα και τη δομή των κυττάρων που υποβάλλονται σε θεραπεία για 48 ώρες με 5 έως 25 μm PNAP-3h και -6Η έδειξαν προφανείς αλλαγές (Εικ 2Ε-2J). Τα κύτταρα έγιναν στρογγυλεμένες και συρρικνωμένο και έχασε την επαφή με γειτονικά κύτταρα. Επιπλέον, τα αποπτωτικά κύτταρα πια προσκολλημένο στο υπόστρωμα, προκαλώντας τους να αποκολληθούν από τις πλάκες καλλιέργειας και επιπλέουν στο μέσο καλλιέργειας. Έτσι, PNAP-3h και -6Η οδήγησε σε μείωση των αριθμού των βιώσιμων κυττάρων MCF-7 σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1.

MCF-7 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PNAP-1, -3Η, και -6Η σε τρεις συγκεντρώσεις (5, 10, και 25 μΜ) για 48 h, και στη συνέχεια, (Α-J), η μορφολογία παρατηρήθηκε με οπτικό μικροσκόπιο (100 Χ). Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33342, και στη συνέχεια, (Κ-Τ) η μορφολογία παρατηρήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού (200 Χ). (/Κ Α) ελέγχου? (B /L) 5 μΜ PNAP-1? (C /M) 10 μΜ PNAP-1? (D /N) 25 μΜ PNAP-1? (Ε /Ε) 5 μΜ PNAP-3h? (F /P) 10 μΜ PNAP-3h? (G /Q) 25 μΜ PNAP-3h? (Η /Κ) 5 μΜ PNAP-6Η? (Ι /S) 10 μΜ PNAP-6h? και (Ι /T) 25 μΜ PNAP-6Η.

Η

Παρατηρήσαμε επίσης το πυρηνικό μορφολογία των κυττάρων MCF-7 υποβλήθηκαν σε Hoechst 33342 φθορίζουσα χρώση μετά από θεραπεία για 48 ώρες με τρεις συγκεντρώσεις (5, 10 , και 25 μΜ) του PNAP-1, -3Η, και -6Η (Σχήμα 2L-2Τ). Οι πυρήνες των κυττάρων ελέγχου του οχήματος εμφανίζεται μια ανέπαφη ωοειδές σχήμα και εκτέθηκαν ένα αδύναμο μπλε φθορισμό (Σχ 2K). Ωστόσο, τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με PNAP-3h (25 μΜ) και PNAP-6Η (5, 10, και 25 μΜ) εμφάνισαν τυπικά χαρακτηριστικά αποπτωτικών, όπως η πυρηνική συρρίκνωση, πυρηνική κατάτμηση, και πυρηνικά hypercondensation (Σχ 2Q-2Τ). Με βάση αυτές τις μικροσκοπικές παρατηρήσεις, προτείνουμε ότι η παρατηρούμενη κυτταροτοξικότητα μπορεί να διαμεσολαβείται εν μέρει μέσω PNAP-3Η- και -6Η-επαγόμενη απόπτωση.

Επίδραση της PNAPs επί MCF-7 κυττάρων κύκλου

διανομή φάση

Επειδή κυτταρικού πολλαπλασιασμού ρυθμίζεται από τον κυτταρικό κύκλο, η επίδραση της PNAP-1, -3Η και -6Η στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου στην κυτταρική σειρά MCF-7 εξετάστηκε με κυτταρομετρία ροής και αναλύσεις western blot. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι η θεραπεία με PNAP-6Η για 48 ώρες αύξησε την υπο-G

1 πληθυσμού (Σχήμα 3Α). Η υπο-G

1 κορυφή, η οποία αποτελείτο από κύτταρα με μειωμένη περιεκτικότητα σε DNA, εκπροσώπησε την παρουσία αποπτωτικών κυττάρων [27,28]. Επιπλέον, η PNAP-6Η-προκαλούμενη κυτταρικής σύλληψης στο G

2 /M φάση που λαμβάνεται σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (5 και 10 μΜ) συνοδεύτηκε από μία μείωση του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται στο /G1 φάση Go. PNAP-5h και -6Η προκαλείται διακοπή φάσης S σε υψηλότερη συγκέντρωση (25 μΜ), οδήγησε σε μείωση του αριθμού των κυττάρων αντιγραφής και κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Ωστόσο, οι PNAP-1-επεξεργασμένα κύτταρα δεν έδειξαν σημαντική μεταβολή στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου του οχήματος.

κύτταρα MCF-7 υπέστησαν επεξεργασία με PNAP-1, -3Η, και -6Η σε τρεις συγκεντρώσεις (5, 10, και 25 μΜ) για 48 h, και στη συνέχεια, (Α), τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο για να αναλύσει το περιεχόμενο DNA με κυτταρομετρία ροής. (B, C) Cell κύκλος που σχετίζονται πρωτεΐνες (κυκλίνη D1, CDK4, κυκλίνη Ε, CDK2, ρ21, ρ27, κυκλίνη Β1, και CDK1) ανιχνεύθηκαν και αναλύθηκαν με western blot. Η έκφραση ήταν ποσοτικά με το μηχανογραφημένο σύστημα ανάλυσης αναλυτή εικόνας Gel-Pro. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SEM από τρεις ανεξάρτητες δοκιμασίες. * Ρ & lt? 0.05 και ** Ρ & lt? 0.01 είναι σημαντικά διαφορετικές από τον έλεγχο

Η

Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις της κατανομής του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων MCF-7, αναλύσαμε τις αλλαγές στην αφθονία του κυττάρου. ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κύκλου. σύμπλοκα κυκλίνης-ΟϋΚ είναι οι κύριοι ρυθμιστές της προόδου του κυτταρικού κύκλου [7], και η δραστικότητα της κυκλίνης /ΟϋΚ είναι αρνητικά ρυθμίζονται από αναστολείς CDK, όπως ρ21 και ρ27 [29]. PNAP-3h (σε 25 μΜ) και PNAP-6Η οδήγησε σε κύτταρο σύλληψης κατά τη φάση S, κατά πάσα πιθανότητα λόγω των αυξημένων επιπέδων των ρ21 και ρ27 και μειωμένα επίπεδα κυκλίνης D1, CDK4, κυκλίνη Ε, και CDK2, όπως προσδιορίζεται μέσω της ανάλυση κηλίδας Western (Σχ 3Β και 3C). Επιπλέον, PNAP-6Η προκάλεσε αναστολή της δραστηριότητας της κινάσης CDK1 και μια μείωση στην έκφραση κυκλίνης Β1, πιθανότατα οδηγούν σε G

2 /M σύλληψης. Κατά συνέπεια, προτείνουμε ότι η αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων από PNAP-3h και -6Η μπορεί να προκαλείται εν μέρει μέσω διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης.

PNAPs ενεργοποιούν την οδό της κασπάσης και να αυξήσει την έκφραση της σχετικής αποπτωτικών πρωτεϊνών

Με βάση τα ανωτέρω αποτελέσματα, βρήκαμε ότι PNAPs μπορεί να αποτρέψει τον πολλαπλασιασμό, διεγείρουν απόπτωση, και να μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων στην κυτταρική σειρά MCF-7. Είναι γνωστό ότι πολυάριθμες αντικαρκινικά φάρμακα διαμεσολαβούν την απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης των κασπασών [16]. Για να αποδειχθεί ότι ο PNAP επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα MCF-7 λαμβάνει χώρα μέσω ενεργοποίησης της κασπάσης, ερευνήσαμε την έκφραση των βασικών ρυθμιστικών πρωτεϊνών που συνδέονται με τις οδούς κασπάσης σε MCF-7 κύτταρα κατά την έκθεση σε 5 έως 25 μm PNAP-1, -3Η, και 6Η. Παρά την έλλειψη της κασπάσης-3 σε κύτταρα MCF-7, κασπάσης-7, ένα απόπτωση δήμιος, μπορεί να λειτουργήσει ως υποκατάστατο [30]. Η κασπάση-7 είναι σε θέση να διασπάσει ειδικά υποστρώματα τετραπεπτιδίου (π.χ., PARP), και διάσπαση PARP είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης [31]. Η έκθεση των κυττάρων MCF-7 σε τρεις συγκεντρώσεις (5, 10, και 25 μΜ) του PNAP-3h και -6Η για 48 ώρες αύξησε σημαντικά τα επίπεδα της διασπασμένης κασπάσης-7 και PARP και αύξησε τη δραστικότητα της διασπασμένης κασπάσης-7 και PARP με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, η απόπτωση μπορεί να τονωθεί μέσω της εξωγενή και ενδογενή μονοπάτια. Η κασπάση-8 θεωρείται γενικά ένας ενεργοποιητής της απόπτωσης στην εξωγενή οδό, και τη κασπάση-9 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ενδογενή οδό [32]. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η έκφραση της διασπασμένης κασπάσης-8 και κασπάσης-9 σε κύτταρα MCF-7 αυξήθηκε μετά την αγωγή με PNAP-3h και -6Η με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, διασπασμένη κασπάση-8 και κασπάσης-9 ανεστάλησαν εν μέρει από την κασπάση-8-ειδικός αναστολέας Ζ-IETD-FMK και κασπάσης-9-ειδικός αναστολέας Ζ-LEHD-FMK. Επιπλέον, οι δύο αναστολείς επίσης μερικώς ανέστειλε διάσπασης κασπάσης-7 σε PNAP παράγωγο επαγόμενη απόπτωση (Σχήμα 5Α και 5Β) και μερικώς ανέστρεψε την PNAP-6-επαγόμενη μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων, όπως παρατηρείται με μικροσκοπία και τη δοκιμασία ΜΤΤ (Σχ 5C) . Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι κασπάσης-7-, 8- κασπάσης-και κασπάση-9-διαμεσολαβούμενη οδοί μπορεί να συμμετέχουν εν μέρει στην ρύθμιση της PNAP απόπτωση.

(Α) κύτταρα MCF-7 υπέστησαν επεξεργασία με PNAP-1, -3Η, και -6Η σε τρεις συγκεντρώσεις (5, 10, και 25 μΜ) επί 48 ώρες, και η έκφραση του διασπασμένη κασπάση 7, -8, -9 και PARP προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. (C) κύτταρα MCF-7 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 25 μΜ PNAP-1, -3Η, και -6Η σε τρεις συγκεντρώσεις (5, 10, και 25 μΜ) επί 48 ώρες, και το Bcl-2, Bcl-XL, Bax, επίπεδα bax /Bcl-2, Bid, και Fas στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με western blot. (Β, D) Η έκφραση ήταν ποσοτικά με τη χρήση μηχανογραφημένου Gel-Pro σύστημα ανάλυσης αναλυτή εικόνας. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SEM από τρεις ανεξάρτητες δοκιμασίες. * Ρ & lt? 0.05 και ** Ρ & lt? 0.01 είναι σημαντικά διαφορετικές από τον έλεγχο

Η

MCF-7 κύτταρα επωάστηκαν με την παρουσία ή απουσία (Α) της κασπάσης-8 αναστολέα Ζ-IETD-. FMK ή (Β) ο κασπάσης-9 αναστολέας Ζ-LEHD-FMK για 1.5 ώρα πριν από την προσθήκη του PNAP-6Η. αναλύσεις κηλίδος Western διεξήχθησαν με αντισώματα προς κασπάση-7, -8, -9 και, και ακτίνη. (C) MCF-7 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με PNAP-6Η παρουσία ή απουσία κασπάσης-8 αναστολέα, ή κασπάσης-9 αναστολέα, και η μορφολογία στη συνέχεια παρατηρήθηκε με οπτικό μικροσκόπιο.

Η

Η ενεργοποίηση της κασπάσης-8 είναι το πρώτο βήμα στον καταρράκτη αποπτωτικών γεγονότων που προκαλούνται από Fas διέγερση [33], και η ενεργοποίηση της κασπάσης-9 ρυθμίζεται από Bcl-2 μελών της οικογένειας [34-36]. Ωστόσο, η επεξεργασία των κυττάρων MCF-7 με 25 μΜ παράγωγα PNAP ασκείται μέτρια επίδραση στην έκφραση της Bcl-XL, πρωτεΐνες Bax, και Bid σε τρία χρονικά σημεία (12, 24, και 48 ώρες) (Σχ 4C και 4D) .