Αφηρημένο

Ιστορικό

Το

την ανάπτυξη σύλληψη ειδικά μεταγραφή 5 γονίδιο

(

GAS5

) κωδικοποιεί ένα RNA μακρύ μη κωδικοποιητική (lncRNA) και φιλοξενεί μια σειρά από μικρά πυρηνισκικός RNAs (snoRNAs) που έχουν πρόσφατα εμπλακεί σε πολλαπλές κυτταρικές διεργασίες και τον καρκίνο. Εδώ, θα διερευνηθεί η σχέση μεταξύ της βλάβης του DNA, p53, και το

GAS5

snoRNAs να αποκτήσουν περαιτέρω γνώσεις σχετικά με την πιθανό ρόλο αυτού του τόπου στην επιβίωση των κυττάρων και την ογκογένεση τόσο

in vivo

και

in vitro

.

Μέθοδοι

Εμείς που χρησιμοποιούνται ποσοτικές τεχνικές για να αναλύσουν την επίδραση της βλάβης του DNA στο

GAS5

έκφραση snoRNA και να αξιολογήσει τη σχέση μεταξύ της p53 και η

GAS5

snoRNAs σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και σε φυσιολογικούς, προ-κακοήθη και κακοήθη ανθρώπινου ορθοκολικού ιστού και χρησιμοποιούνται βιολογικές τεχνικές να προτείνουν δυνητικούς ρόλους για τα εν λόγω snoRNAs στην απόκριση βλάβης DNA.

Αποτελέσματα

GAS5

προερχόμενο έκφραση snoRNA προκλήθηκε από βλάβη του DNA σε ένα ρ53-εξαρτώμενο τρόπο σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές και τα επίπεδά τους δεν επηρεάστηκαν από Dicer. Επιπλέον, τα επίπεδα p53 συσχετίζεται έντονα με το

GAS5

προερχόμενο έκφραση snoRNA σε ορθοκολικό ιστό.

Συμπεράσματα

Συνολικά, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι το

GAS5

προερχόμενο snoRNAs είναι υπό τον έλεγχο του p53 και ότι έχουν ένα σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση της απόκρισης της ρ53 σε βλάβη του DNA, η οποία δεν μπορεί να αφορά τη λειτουργία τους στο ριβόσωμα. Προτείνουμε ότι αυτές οι snoRNAs δεν υποβάλλονται σε επεξεργασία από Dicer για να σχηματίσουν μικρότερες snoRNA που προέρχονται από RNA με microRNA (miRNA) -όπως λειτουργίες, αλλά ο ακριβής ρόλος τους απαιτεί περαιτέρω αξιολόγηση. Επιπλέον, δεδομένου ότι οι GAS5 snoRNAs υποδοχής χρησιμοποιούνται συχνά ως ενδογενείς ελέγχους qPCR ποσοτικούς προσδιορισμούς που δείχνουν ότι η χρήση τους ως γονίδια καθαριότητας σε πειράματα βλάβες στο DNA μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα

Παράθεση:. Krell J, Frampton ΑΕ, Mirnezami R, Harding V, De Giorgio A, Roca Alonso L, et al. (2014)

Ανάπτυξη σύλληψης-Ειδικές Απομαγνητοφώνηση 5

Associated snoRNA επίπεδα είναι Σχετικά με το p53 Έκφρασης και βλάβη στο DNA του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (6): e98561. doi: 10.1371 /journal.pone.0098561

Συντάκτης: Raffaele Α Calogero, Πανεπιστήμιο του Τορίνο, Ιταλία

Ελήφθη: 28 Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 5 Μάη 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Krell et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Searle Memorial (2005) φιλανθρωπικό ίδρυμα, Μιχαήλ και Lottie Hunter, ο Πέτρος και ο Marilyn Cooper, ο Steve Mobbs και Pauline Τόμας, και την Denise και Edward Pincheson για τη γενναιόδωρη υποστήριξή τους. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

snoRNAs είναι ένα καλά χαρακτηρισμένο κατηγορία εκφράζεται παντού, μη-κωδικοποίησης RNAs (ncRNAs) που είναι 60-300 νουκλεοτιδίων σε μήκος [1]. Που βρίσκονται κυρίως στην πυρηνίσκου που κλασικά λειτουργούν ως RNAs οδηγός για τη μετα-μεταγραφική ωρίμανση και την τροποποίηση των ριβοσωμικών RNAs (rRNAs) και snRNAs εμπλέκονται στην σωμάτια συναρμογής. ακολουθίες οδηγός snoRNA υβριδοποιούνται ειδικά με αλληλουχία-στόχο rRNA τους, και, μέσω ενώσεων με πρωτεΐνες, σχηματίζουν μικρά συγκροτήματα πυρηνισκικός ριβονουκλεοπρωτεΐνης (snoRNPs) και να εκτελέσει συγκεκριμένες τροποποιήσεις rRNA [1]. Ως εκ τούτου, snoRNAs είναι ζωτικής σημασίας για τη λειτουργία του ριβοσώματος και την αποτελεσματική ρύθμιση της μετάφρασης και έτσι, όπως ήταν αναμενόμενο, είναι πολύ συντηρημένες σε όλη εξέλιξη [2]. Υπάρχουν δύο κύριες κατηγορίες snoRNAs, που ονομάζεται C /D κουτί snoRNAs και H /ACA κουτί snoRNAs, αντίστοιχα. Διαφέρουν από την άποψη της ακολουθίας τους και τη δομή, τους συνεργάτες τους δεσμευτικές και τη φύση των μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις που επάγουν [2], [3].

Στα ευκαρυωτικά γονιδιώματα, snoRNAs είναι κυρίως κωδικοποιούνται στα εσώνια πρωτεΐνης κωδικοποίησης γονιδίων του ξενιστή αλλά μερικά είναι υπό τον έλεγχο ανεξάρτητων προαγωγέων [4]. Στους ανθρώπους, οι περισσότεροι snoRNAs είναι ιντρονικές και συν-μεταγράφονται με γονίδιο υποδοχής μεταγραφές τους, και στη συνέχεια σε επεξεργασία από τα αποκοπέντων ιντρόνια [5]. Ωστόσο, η μεταγραφή μιας μειονότητας συμβαίνει μέσω ανεξάρτητων RNA πολυμεράση II ή III δραστηριότητα κατά παρόμοιο τρόπο με πολλούς miRNAs [5], [6]. συνδέονται στενά μέλη της οικογένειας snoRNA συνήθως κωδικοποιούνται σε διαφορετικά εσώνια του ίδιου γονιδίου ξενιστή, αλλά μερικά γονίδια ξενιστή κωδικοποιούν πολυάριθμες άσχετες snoRNAs. Παρά το γεγονός ότι ορισμένα γονίδια ξενιστή snoRNA φαίνεται να είναι κωδικοποίηση μη-πρωτεΐνης, πολλοί εμπλέκονται στη σύνθεση πυρηνίσκου λειτουργία και πρωτεϊνών, και ως τέτοια συχνά υπάρχει ένα στοιχείο συν-λειτουργούν [5], [7]. Το γεγονός ότι σε ανθρώπους, οι περισσότεροι snoRNAs κωδικοποιούνται στα εσώνια πρωτεΐνης-κωδικοποίησης και μη-κωδικοποίησης πρωτεΐνης γονιδίων οδήγησε στην υπόθεση ότι αυτά τα γονίδια ξενιστή δρουν αποκλειστικά ως κυτταρική οικονόμοι μέσω αλληλουχίες snoRNA κωδικοποιούν τους [8], [9 ]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν αμφισβητήσει αυτή την έννοια και έχουν ενοχοποιηθεί snoRNAs και τα γονίδιά τους υποδοχής στον έλεγχο της ογκογένεσης και της κυτταρικής τύχης [10], [11]. Η ύπαρξη ενός αριθμού των «ορφανών» snoRNAs χωρίς γνωστών στόχων rRNA, και η επίδειξη της παρουσίας τους στην υποκυτταρική περιοχές εκτός του nucleolus [12], υποστηρίζει την ιδέα ότι αυτή η ομάδα των μικρών μη-κωδικοποίησης RNAs μπορούν να ρυθμίζουν άλλα μόρια και έχουν πρόσθετες κυτταρικές λειτουργίες [13]. Επιπλέον, μια σειρά από μελέτες δείχνουν μια εξελικτική σχέση μεταξύ των miRNAs και snoRNAs [14] και άλλοι αναφέρουν ότι το ώριμο snoRNAs μπορούν να υποβληθούν σε περαιτέρω κυτταρική επεξεργασία για να σχηματίσουν μικρότερες snoRNA που προέρχονται RNAs (sdRNAs) με miRNA-όπως λειτουργίες [3], [14] – [17]. Επιπλέον, η έκφραση snoRNA έχει αποδειχθεί ότι είναι τόσο μεταβλητή ως έκφραση των miRNAs σε δείγματα ανθρώπινου όγκου και την ομαλοποίηση των miRNA αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) δεδομένα έκφρασης σε αυτούς τους snoRNAs εισήγαγε προκατάληψη σε συσχετίσεις μεταξύ miRNA και το αποτέλεσμα [18].

η

την ανάπτυξη σύλληψη ειδικά μεταγραφή 5

γονίδιο (

GAS5

), που βρίσκεται στο 1q25, είναι πολλαπλάσιο γονίδιο υποδοχής snoRNA μη-κωδικοποίησης πρωτεΐνης που αποτελείται από 12 εξώνια [19], [20] αρχικά ανακαλύφθηκε κατά τη διάρκεια ελέγχου για πιθανές ογκοκατασταλτικά γονίδια εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα κατά τη διάρκεια της διακοπής της ανάπτυξης. Στους ανθρώπους, το οποίο κωδικοποιεί δέκα εσονικές κουτί C /D snoRNAs και δύο ώριμες μεγάλες μη-κωδικοποίησης RNAs (lncRNAs) ισομορφών που προέρχονται από εναλλακτικά σημεία δότη 5′-ματίσματος στο εξώνιο 7 [20]. Το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης που κωδικοποιείται μέσα στο

GAS5

εξώνια είναι σύντομη και δεν θεωρείται ότι κωδικοποιεί μία λειτουργική πρωτεΐνη. Χαρτογράφηση του 5 * άκρο του αποδεικνύει ότι διαθέτει ένα χαρακτηριστικό ολιγοπυριμιδίνης οδό του 5 *-τερματικού ολιγοπυριμιδίνης (5 * TOP) κατηγορία γονιδίων που συσσωρεύονται κατά τη διάρκεια της διακοπή του κυτταρικού κύκλου, αλλά αποικοδομούνται ταχέως από ανοησίες μεσολάβηση αποσύνθεση κατά τη διάρκεια της κυτταρικής ανάπτυξης. Η κατάταξη των

GAS5

ως 5 * TOP γονίδιο προσφέρει μια εξήγηση ως προς το γιατί είναι μια σύλληψη της ανάπτυξης ειδικών μεταγραφή καθώς ενώ ο συγκολλημένα

GAS5

RNA είναι συνήθως συνδέονται με τα ριβοσώματα και αποικοδομείται ταχέως, κατά τη διάρκεια συνελήφθη κυτταρική ανάπτυξη συσσωρεύεται σε σωματίδια mRNP. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι μόνες περιοχές συντήρησης μεταξύ ποντικού και ανθρώπου

GAS5

γονίδια είναι snoRNAs τους και 5 * -Αποσπασμένοι αλληλουχιών [20] υποδηλώνοντας ότι αυτά είναι τα πιο σημαντικά λειτουργικά συστατικά. Αν και

GAS5

παίζει ένα ρόλο στην μετα-μεταγραφική τροποποίηση του ριβοσωμικού RNA μέσω snoRNAs του, ένας αριθμός πρόσφατες μελέτες έχουν εμπλέξει αυτό το γονίδιο σε άλλες σημαντικές κυτταρικές διαδικασίες [10], [18], [21], [ ,,,0],22]. Η GAS5 lncRNA δείχθηκε να αλληλεπιδρά με το πεδίο σύνδεσης ϋΝΑ του υποδοχέα γλυκοκορτικοειδούς όπου δρα ως ένα riborepressor, επηρεάζοντας την κυτταρική επιβίωση και μεταβολικές δραστηριότητες κατά ασιτία διαμορφώνοντας τη μεταγραφική δραστηριότητα αυτού του υποδοχέα [10]. Επιπλέον, η ίδια ομάδα έδειξε σε κυτταρικές σειρές του προστάτη, ότι GAS5 mRNA απομονώνει το σύμπλοκο υποδοχέα ανδρογόνων /ανδρογόνων και αποτρέπει τη δέσμευση του σε στόχο DNA αλληλουχίες [10], η οποία είναι πιθανό να παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των επιδράσεων των ανδρογόνων στον προστάτη . μεταγραφές GAS5 έχουν επίσης δειχθεί ότι είναι σημαντικοί ρυθμιστές της κυτταρικής επιβίωσης και απόπτωσης σε ανθρώπινα Τ-κύτταρα και κυτταρικές γραμμές καρκίνου του μαστού και του προστάτη [21] – [23], και η υπερέκφραση ευαισθητοποιημένα καρκινικές κυτταρικές γραμμές τους θηλαστικού σε επαγωγείς της απόπτωσης [21] . Επιπλέον, η μειωμένη έκφραση του GAS5 και /ή snoRNAs του έχει καταδειχθεί σε καρκίνωμα κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων [18], του καρκίνου του μαστού [18], [21] και πολύμορφο γλοιοβλάστωμα [24], ενώ η υπερ-έκφραση του U44, U76 και U78 έχει δειχθεί σε NSCLC [25]. Η παρεκκλίνουσα

GAS5

έκφραση αποδειχθεί σε μαστού και του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση [18].

Παρά τα στοιχεία αυτά, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τον ακριβή ρόλο των συγκεκριμένων GAS5 snoRNAs στην οι οδοί στις οποίες έχουν ενοχοποιηθεί, και ακόμα λιγότερο είναι αποδεκτή για τους μηχανισμούς που διέπουν αυτές. Με δεδομένη την περιγράφηκε προηγουμένως ρόλο του

GAS5

στη ρύθμιση της απόπτωσης και το καλά τεκμηριωμένο ρόλο για την ρ53 στην ίδια διαδικασία, με στόχο την περαιτέρω διερεύνηση της σχέσης μεταξύ της p53 και την GAS5 snoRNAs να αποκτήσουν περαιτέρω κατανόηση των δυνατοτήτων τους ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων και την ογκογένεση στον καρκίνο του παχέος εντέρου και

in vivo

και

in vitro

. Επιπλέον αποδείξαμε ότι τόσο U44 και U47 GAS5 προέρχονται snoRNAs, που είναι από τις συχνότερες snoRNAs χρησιμοποιηθούν ως γονίδια καθαριότητας για την εξομάλυνση σε συνδυασμό με την ανάλυση της έκφρασης TaqMan miRNA και θα πρέπει να αποφεύγεται σε πειράματα βλάβη του DNA.

Υλικά και Μέθοδοι

ηθική Δήλωση

η δεοντολογική έγκριση ελήφθη από την ηθική επιτροπή δεοντολογίας του Imperial College. Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με την Διακήρυξη του Ελσίνκι και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς πριν από τη λήψη δειγμάτων ιστού για το σκοπό της μελέτης.

Συλλογή, το χειρισμό και την εξαγωγή RNA από λέιζερ κατέλαβε μικρο-τεμαχίζεται (LCM) δείγματα όγκων

με την έγκριση της επιτροπή δεοντολογίας μας, δείγματα ιστών που να αντιπροσωπεύουν φυσιολογικό ιστό του παχέως εντέρου και του παχέος εντέρου αδενοκαρκίνωμα ελήφθησαν αμέσως μετά την επέμβαση, κομμένο σε τεμάχια, και στη συνέχεια φορμόλη σταθερών και ενσωματωμένα σε παραφίνη. λήφθηκε γραπτή συγκατάθεση. Πριν από την μικροδιατομής, κόπηκαν οκτώ 8-μm διαδοχικές τομές (-25 ° C) από το ίδιο μπλοκ ιστού και τοποθετήθηκαν επάνω σε πλάκες (1 mm), τα οποία στη συνέχεια αποπαραφινοποιήθηκαν χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Στη συνέχεια μικροτομή χρησιμοποιώντας το σύστημα PALM Laser MicroBeam (P.A.L.M. μικρολέιζερ Technologies GmbH, Bernried, Γερμανία). Μια συνολική έκταση 200.000 μm

2 μικρο-ανατομή από κάθε διαφάνεια. Το Σχήμα 1 δείχνει εικόνες από τα διάφορα στάδια της διαδικασίας μικροδιατομή. RNA στη συνέχεια εξάγεται από τα μικρο-ανατομή δειγμάτων ο RNeasy MinElute Απομόνωση RNA Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France).

Ν = φυσιολογικό κόλον, Τ = όγκος, Α = αδένωμα. 1: αιματοξυλίνη και χρώση ηωσίνης? 2: τομείς που πρέπει να μικροτομή έχουν σημανθεί? 3: slide παρακάτω μικροδιατομής των επισημαίνονται περιοχές? 4:. Μικροτομή ιστού μετά εκτοξεύοντας πάνω στο εσωτερικό των καλυμμάτων eppedORF

Η

Συλλογή, το χειρισμό και την εξαγωγή RNA από μακρο-τεμαχίζεται

ορθοκολικού ιστού

Θα ήθελε να ερευνήσει κατά πόσον υπήρχε σχέση μεταξύ δραστηριότητα ρ53 και η έκφραση του

GAS5

-snoRNAs σε ανθρώπινο ορθοκολικό ιστό, και ειδικότερα σε δείγματα ορθοκολικού καρκίνου. Συλλέξαμε ζευγαρωμένα δείγματα νωπών κατεψυγμένων ορθοκολικό ιστό του όγκου και αντίστοιχο φυσιολογικό ορθοκολικό ιστό από 20 μεμονωμένους ασθενείς και μέτρησε miR-34a και τα επίπεδα snoRNA και της έκφρασης p53 σε αυτά τα δείγματα. Δείγματα της κανονικής, αδενωματώδεις και κακοήθη ορθοκολικού ιστού ελήφθησαν από άτομα που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση του παχέος εντέρου ή κολονοσκόπηση μεταξύ του 2011 και του 2013 στο St Mary του Νοσοκομείου, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή. Τα δείγματα αμέσως macrodissected κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης, τοποθετείται απευθείας σε RNA

Αργότερα

διάλυμα σταθεροποίησης (Qiagen, Hilden, Germany), φυλάσσονται σε θερμοκρασία δωματίου για 2-3 ώρες, και στη συνέχεια καταψύχθηκαν στους -80 ° C. Η &? Χρώση Ε χρησιμοποιήθηκε για ιστολογική επιβεβαίωση του καρκίνου και για να προσδιοριστεί η κυτταροβρίθεια των αντιπροσωπευτικών τμημάτων. Ένας ειδικός παθολόγος του παχέος κριτική για τις διαφάνειες, και ιστού για την απομόνωση του RNA επιβεβαιώθηκε να περιέχει ≥60% των νεοπλασματικών κυττάρων. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς, και την ηθική έγκριση δόθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας στην έρευνα του νοσοκομείου. Φρέσκα ιστός αποθηκεύεται σε RNA

Αργότερα

(Qiagen) συνεθλίβη σε υγρό άζωτο και της επακόλουθης σκόνη λύθηκαν σε ΤπζοΙ (Invitrogen, Paisley, UK) αντιδραστήριο και RNA απομόνωση διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

κυτταρική καλλιέργεια και δοξορουβικίνη θεραπεία

ρ53 άγριου τύπου (WT) και τα νοκ άουτ (ΚΟ) κύτταρα HCT116 και Dicer WT και νοκ ντάουν (KD) κυτταρικές σειρές είχαν την καλοσύνη να παρέχονται από τον Dr. Bert Volgestein [26], [ ,,,0],27]. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 150 mm σε συρροή 50% και επωάστηκαν υπό στους 37 ° C σε ένα υγροποιημένο 5% CO2 επωαστή. Αυτά στη συνέχεια κατεργάστηκαν με δοξορουβικίνη σε μία συγκέντρωση 0.2 ug /ml ή ισοδύναμο όγκο οχήματος (DDH

20). Μετά από κάθε χρονικό σημείο θεραπείας, πιάτα τοποθετήθηκαν σε πάγο και το μέσο αναρροφήθηκε. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS, ξύνεται και φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στις 1300 rpm. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το κυτταρικό ίζημα σε επεξεργασία για RNA χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Paisley, UK) και /ή εκχύλιση πρωτεϊνών.

RNA ποσοτικοποίηση και RT-qPCR Ανάλυση

Ποσοτικοποίηση του εξορυσσόμενου RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το NanoDrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο (Thermo Scientific, USA) και την ποιότητα του αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το RNA 6.000 κιτ Pico LabChip και το 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ή μέσω μη αποδιατακτικό πήκτωμα αγαρόζης ηλεκτροφόρηση. Ολικό RNA (10 ng) μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας το TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) με τη χρήση ενός εκκινητή ειδικού για κάθε ώριμο miRNA, snoRNA ή snRNA.

U6

και

U19

(μικρό πυρηνισκικός RNA) χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχοι για την εξομάλυνση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. qRT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το TaqMan assaykit microRNA (Applied Biosystems). Το μίγμα της αντίδρασης αποτελούνταν από 10 μΐ TaqMan καθολικής 2χ κύριο μείγμα, 1 μΐ μείγματος TaqMan 20x, 1 ng του cDNA σε ένα τελικό όγκο 20 μΙ. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qPCR) εκτελέστηκε με ένα σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας ΑΒΙ Prism 7900HT (Applied Biosystems). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό qBasePlus (biogazelle). Επίπεδα παρουσιάζονται είναι μέσα από τρία ανεξάρτητα επαναλήψεις cDNA. Κανονικοποίηση διεξήχθη με τη χρήση της μεθόδου δέλτα Ct.

ηλεκτροφόρηση γέλης SDS-πολυακρυλαμιδίου και δυτική

κηλίδα

Οι σβώλοι κυττάρων ή δειγμάτων νωπού κατεψυγμένου ιστού λύθηκαν σε 30 έως 60 μΐ ΝΡ-40 ρυθμιστικό διάλυμα λύσης + αναστολέων πρωτεάσης διάλυμα κοκτέιλ (Roche) και η φάση πρωτεΐνη συνελέγη μετά από φυγοκέντρηση. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου Bradford (BioRad). μετρήσεις απορρόφησης μετρήθηκαν στα 595 nm χρησιμοποιώντας Beckman DU 530 Life Science UV /ορατού. Μετά τη συλλογή των δεδομένων, η συγκέντρωση των άγνωστων δειγμάτων προσδιορίστηκε με βάση την τυπική τιμή απορρόφησης. Τα δείγματα πρωτεΐνης στη συνέχεια εξετέθησαν σε ηλεκτροφόρηση πήγματος SDS-πολυακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκαν σε Hybond C σούπερ μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (GE Healthcare) και στη συνέχεια στυπώνονται για την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος. Οι μεμβράνες πλύθηκαν και ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (ECL) (GE Healthcare) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση. Το εκπεμπόμενο φθορισμός ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας Hyperfilm ECL (GE Healthcare) επί SRX-101A προγραμματιστή ακτίνων Χ.

Στατιστική Ανάλυση

Biostatistical αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism. Στατιστικές συγκρίσεις έγιναν με τη χρήση t-test ή Pearsons Συσχέτιση συντελεστών Student.

Αποτελέσματα

δοξορουβικίνη επαγόμενη DNA αυξήσεις βλάβη

GAS5

-deriveded έκφραση snoRNA κατά τρόπο που εξαρτάται από το ρ53 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου

Είμαστε επεξεργασία HCT116 p53

WT και HCT116 p53

κύτταρα KO με δοξορουβικίνη με σκοπό να προκαλέσει βλάβες στο DNA, και να χρησιμοποιηθεί RT-qPCR να μετρήσει τις αλλαγές που προκαλούνται στα επίπεδα έκφρασης της διάφορα μικρά RNAs, ιδιαίτερα το

GAS5

προερχόμενη snoRNAs U44 και U47. επεξεργασία δοξορουβικίνη σε HCT116 p53

κυτταρικές σειρές WT οδήγησε σε σημαντική επαγωγή στην έκφραση του

GAS5

προερχόμενη snoRNAs U44 (P & lt? 0,01) και U47 (P & lt? 0,01) σε σύγκριση με τη θεραπεία με το όχημα ελέγχου, αλλά δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή στα επίπεδα της μη

GAS5

-associated snoRNA U19 (Σχήμα 2) ή την U6 snRNA που δεν προέρχονται από τον τόπο GAS5 σε σύγκριση με την έκφραση GAPDH (τα δεδομένα δεν απεικονίζεται). επεξεργασία doxorubicin δεν αύξησε σημαντικά την

GAS5

προερχόμενο έκφραση snoRNA σε HCT116 p53

κύτταρα ΚΟ (Σχήμα 2), γεγονός που υποδηλώνει ότι η βλάβη του DNA που προκαλείται από την έκφραση του

GAS5

προερχόμενο snoRNAs στην ένα ρ53-εξαρτώμενο τρόπο. θεραπεία Doxorubicin του HCT116 ρ53

WT κύτταρα επίσης αύξησε σημαντικά την έκφραση του miR-34a (P≤0.006), χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος, αν και το μέγεθος της πτυχής αλλαγή ποικίλει ανάλογα με το ποια επιλέχθηκε μικρό RNA για να ομαλοποιήσει τα επίπεδα έκφρασης έως (Σχήμα 2 & amp? 3). Μετά από 24 ώρες κατεργασίας δοξορουβικίνη, η έκφραση του miR-34a αυξήθηκε σημαντικά κατά 2,8 φορές και 2,6 φορές (P≤0.006 για τα δύο) όταν τα επίπεδα κανονικοποιήθηκαν προς U6 και U19 αντίστοιχα. Ωστόσο, αν και ακόμα στατιστικά σημαντική, οι πολλαπλές μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης του miR-34a ήταν πολύ μικρότερο (1,9 φορές? P & lt? 0.01), όταν το

GAS5

προερχόμενη snoRNAs U44 και U47 χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση (Σχήμα 3). Παρόμοιες διαφορές παρατηρήθηκαν όταν ρ21 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ανάλυση των p53 αλληλούχισης χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (τσιπ seq) πειράματα που έγιναν σε κύτταρα HCT116 [29] δείχνει την παρουσία ενός σημαντικού κορυφής της αλληλεπίδρασης ρ53 σε δύο ανεξάρτητα πειράματα που περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση της ρ53 που επάγεται από Nutlin3 ή 5’fluorouracil (5FU)), κατά τη ίδια θέση, περίπου 800 bp μακριά από την περιοχή έναρξης της μεταγραφής GAS5 (TSS), υποδεικνύοντας ότι η ρ53 ελέγχει άμεσα τη μεταγραφή GAS5.

Σχετική επίπεδα (Α) miR-34a, (Β) U19 snoRNA, (C) U44 snoRNA και (Δ) U47 snoRNA μετρήθηκαν με RT-qPCR σε ρ53

κυτταρικές σειρές WT HCT116 και ρ53

κυτταρικές γραμμές ΚΟ HCT116 αγωγή είτε με δοξορουβικίνη (σε τελική συγκέντρωση 0,2 μg /ml) ή το όχημα για 24 ώρες. Επίπεδα κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα U6 snRNA και τα δεδομένα παρουσιάζονται σε σχέση με το όχημα επεξεργασμένα κύτταρα ± sem (το καθένα από αυτά πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν? T δοκιμή Student: * Ρ & lt? 0,01, ** P≤0.006).

Η

Σχετικά επίπεδα του miR-34a κανονικοποιημένη σε (Α) U6 snRNA, (Β) U47 snoRNA, (Γ) U44 snoRNA και (Δ) U19 snoRNA μετρήθηκαν με RT-qPCR σε ρ53

κυτταρικές σειρές και WT HCT116 p53

κυτταρικές γραμμές ΚΟ HCT116 αγωγή είτε με δοξορουβικίνη (σε τελική συγκέντρωση 0,2 μg /ml) ή όχημα για 24 ώρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται σε σχέση με τα κύτταρα που κατεργάστηκαν όχημα ± sem. (το καθένα από αυτά πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν? t δοκιμή Student: * Ρ & lt? 0,01, ** P≤0.006)

Η

GAS5

προερχόμενη έκφραση snoRNA ποικίλλει μεταξύ των φυσιολογικών και κακοήθων παχέος φρέσκο ​​μη μικροτομή ιστού σε p53-εξαρτώμενο τρόπο

Βρήκαμε σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης του

GAS5

προερχόμενο snoRNAs μεταξύ των αξιόπιστων δείγματα φρέσκου κατεψυγμένου φυσιολογικό ορθοκολικό ιστό και ορθοκολικού όγκου από τον ίδιο ασθενή (Ρ & lt? 0,01? Σχήμα 4). επίπεδα snoRNA ήταν σημαντικά υψηλότερα σε όγκους σε σύγκριση με το αντίστοιχο φυσιολογικό ορθοκολικό ιστό στο 85% των δειγμάτων των ασθενών, αλλά ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε 15%. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα επίπεδα U6 snRNA μεταξύ ζεύγη φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα miR-34a ήταν επίσης σημαντικά υψηλότερη σε δείγματα όγκων των ασθενών όταν συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα δείγματα φυσιολογικού ιστού του παχέως τους (P≤0.0006? Σχήμα 4). Στη συνέχεια μετρώνται τα επίπεδα έκφρασης ρ53 στα ζεύγη φυσιολογικό ορθοκολικό ιστό και τα δείγματα ορθοκολικού όγκου χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western (Σχήμα 5Α-C). επίπεδα ρ53 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε όγκους παχέος εντέρου σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κανονικά δείγματα ορθοκολικού ιστού τους (Ρ & lt? 0,01? Σχήμα 5D).

Ένα Θηκόγραμμα συγκρίνοντας τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του miR-34a, U44 snoRNA και U47 snoRNA μεταξύ ζευγαρωμένα ορθοκολικού όγκου (Τ) και φυσιολογικό ορθοκολικό (Ν) φρέσκα δείγματα κατεψυγμένου ιστού. (Του Student t test * P & lt? 0,01, *** P≤0.0006)

Η

(Α & amp? Β). Επίπεδα δείχνει p53 κηλίδα του Western στο πρώτο 10 κανονική του παχέος εντέρου (Α) και του παχέος όγκου ( δείγματα Β) ιστού. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) γράφημα στήλης που καταδεικνύουν τις φορές οι αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης p53 φαίνεται στις κηλίδες Western (amp A &? Β) ομαλοποιήθηκε ως προς GAPDH και υπολογίζεται χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. (Δ) Ένα οικόπεδο κουτί συγκρίνοντας τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του p53 μεταξύ όλων των 25 ζεύγη ορθοκολικού όγκου (Τ) και δείγματα ιστών κανονική του παχέος εντέρου (Ν) (του Student t test * P & lt? 0,01).

Η

Χρήση τα ίδια δείγματα, θα υπολογίζονται οι συντελεστές συσχέτισης του Pearson, συγκρίνοντας τα επίπεδα έκφρασης p53 με U44 και U47 επίπεδα snoRNA, για να καθοριστεί εάν υπήρχε κάποια σχέση μεταξύ των

GAS5

προερχόμενη επίπεδα snoRNA και p53

in vivo

στην άνθρωπο. Βρήκαμε μια ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης p53 και τα επίπεδα τόσο snoRNA U44 (Pearson Correlation = 0,64? R

2 γραμμική = 0,41? P = 0,02) και snoRNA U47 (Pearson Correlation = 0,69? R

2 γραμμική = 0,49? Ρ = 0.01) σε δείγματα ορθοκολικού όγκου (Σχήμα 6Α). Υπολογίσαμε επίσης οι συντελεστές συσχέτισης Pearson για να συγκρίνουν τα επίπεδα έκφρασης του miR-34a με U44 και U47 επίπεδα snoRNA, για να καθοριστεί εάν υπήρχε οποιαδήποτε σχέση μεταξύ των επιπέδων

GAS5

προερχόμενο snoRNAs και p53-ρυθμίζονται miRNAs στον άνθρωπο. Αυτό πραγματοποιήθηκε επίσης να προσκομίσει αποδεικτικά στοιχεία για την υποστήριξη της χρήσης του miR-34a ως υποκατάστατος δείκτης για την p53 σε αυτό το πλαίσιο για επιπλέον πειράματα χρησιμοποιώντας RNA που προέρχεται από μικροτομή δείγματα FFPE ιστού όπου τα επίπεδα του p53 δεν ήταν μετρήσιμες με κηλίδωση Western. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε μια ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του miR-34a και τα επίπεδα τόσο snoRNA U44 (Pearson Correlation = 0,73? R

2 γραμμική = 0,53? P = 0.001) και snoRNA U47 (Pearson Correlation = 0,66? R

2 γραμμική = 0,43?. Ρ = 0,02) σε δείγματα ορθοκολικού καρκίνου (Σχήμα 6Β)

Γραφήματα δείχνει Pearson συσχέτιση αναλύσεις της σχέσης μεταξύ των () επίπεδα p53 Α ή (Β) επίπεδα miR-34a και η U44 snoRNAs και U47 σε δείγματα ιστού ορθοκολικού καρκίνου (amp A &? Β).

η

GAS5

προερχόμενο έκφραση snoRNA ποικίλλει μεταξύ των κανονικών, προ-κακοήθη και κακοήθη μικροτομή FFPE ορθοκολικό ιστό και τα επίπεδα συσχετίζονται με την έκφραση του miR-34a

υπάρχει μεγάλη συζήτηση ως προς την ακρίβεια των μελετών RNA και γονιδιακή έκφραση που χρησιμοποιούν δείγματα μη μικροτομή όγκου, λόγω των πιθανών επιπτώσεων ότι τα κυτταρικά συστατικά του γύρω στρώμα μπορεί έχουν σχετικά με τα επίπεδα του μετρούμενου μορίου. Ως εκ τούτου, με στόχο να εκτελέσει περαιτέρω πειράματα σε δείγματα ιστών μικροδιατομή για την υποστήριξη των ανωτέρω αποτελέσματα. Συλλέξαμε 60 αταίριαστα δείγματα ορθοκολικού ιστού FFPE που αποτελείται από 20 φυσιολογικού βλεννογόνου, 20 αδενώματα και 20 δείγματα όγκων. Εμείς μικροδιατομή τα απαιτούμενα τμήματα μετά Η &? Χρώση Ε, εκτελείται εκχύλιση RNA και μετρήθηκαν μικρά επίπεδα έκφρασης του RNA με RT-qPCR (Σχήμα 1). Βρήκαμε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα του miR-34a (P≤0.006), snoRNA U44 (P≤0.0005) και snoRNA U47 (P≤0.0005) σε δείγματα αδένωμα, σε σύγκριση με φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνο (Εικόνα 7Α). Επιπλέον, η έκφραση όλων των 3 μικρών RNAs ήταν σημαντικά υψηλότερη σε δείγματα όγκων συγκριτικά με αδενώματος ή φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνου (Σχήμα 7Α). Επιπλέον, τα επίπεδα ρ53 μετρήθηκε με ανοσοϊστοχημεία και δίδεται ως αποτέλεσμα ρ53 του 0-3, ήταν υψηλότερα σε δείγματα όγκων (80% = σκορ 3, 20% = βαθμολογία 2) και τα δείγματα αδένωμα (50% = σκορ 3, βαθμολογία 30% της 2, όρος 20% του 1) από το φυσιολογικό ιστό (100% = σκορ 0).

Α, RT-qPCR χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθούν τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του miR-34a, snoRNA U44 και snoRNA U47 σε μικροδιατομή δείγματα ανθρώπινου ιστού που αντιστοιχεί στην κανονική ορθοκολικό ιστό (Ν), ορθοκολικού αδενώματος (Α) και του παχέος όγκων (Τ) (του Student t test * Ρ & lt? 0,05, ** P≤0.006, *** P≤0.0005) . Β, ανάλυση συσχέτισης Α του Pearson έγινε για να καθορίσουν τη σχέση μεταξύ των επιπέδων του miR-34a και της U44 snoRNAs και U47 σε δείγματα ιστών FFPE όγκου μικροτομή παχέος εντέρου.

Η

Χρησιμοποιώντας τα ίδια δείγματα, θα υπολογίζεται στη συνέχεια συσχέτισης του Pearson συντελεστές να συγκρίνουν τα επίπεδα έκφρασης του miR-34a και τα επίπεδα U44 και U47 snoRNA για να καθορίσει εάν η σχέση αποδειχθεί σε μη-μικροτομή δειγμάτων μεταξύ

GAS5

προερχόμενη επίπεδα snoRNA και p53 (miR-34a που χρησιμοποιούνται εδώ ως υποκατάστατο δείκτη για p53) παρατηρήθηκε επίσης σε μικροτομή όγκους του παχέος εντέρου. Βρήκαμε μια ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του miR-34a και τα επίπεδα τόσο snoRNA U44 (Pearson Correlation = 0,69? R

2 γραμμική = 0,47) και snoRNA U47 (Pearson Correlation = 0,67? R

2 γραμμική = 0.45) σε δείγματα ορθοκολικού καρκίνου (Σχήμα 7Β).

Η έκφραση του

GAS5

προερχόμενη snoRNAs δεν επηρεάζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές στις οποίες Dicer έχει χτυπηθεί κάτω και ως εκ τούτου δεν φαίνεται να υποβληθούν σε επεξεργασία από Dicer

με βάση τα πορίσματα που περιγράφηκαν σε προηγούμενες μελέτες, οι οποίες έδειξαν ότι snoRNAs μπορεί να μετατραπεί από Dicer να sdRNAs με miRNA-όπως λειτουργίες είναι πιθανό ότι miRNA-όπως τα μόρια που παράγονται από GAS5 προέρχεται snoRNAs εμπλέκονται στην απόκριση βλάβης DNA [3]. Προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή εμπλοκή του Dicer σε αυτή τη διαδικασία θα αξιολογηθεί η επίδραση του Dicer knock-down για την έκφραση

GAS5

προερχόμενο snoRNAs μετά από βλάβη του DNA. Για να το πετύχουμε αυτό χρησιμοποιείται RT-qPCR να συγκρίνουν τις αλλαγές στην έκφραση της U44 snoRNAs και U47 μετά από δοξορουβικίνη μεταχείριση στον καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές DLD1 και RKO σε άγριου τύπου τους (WT) μορφή και σε μια μορφή στην οποία Dicer είχε σταθερά γκρέμισε (KD). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι αν και Dicer knock-down οδήγησε σε στατιστικά σημαντική μείωση των επιπέδων του miR-34a (P≤0.006) και στις δύο κυτταρικές σειρές DLD1 και RKO, όπως αναμενόταν, δεν υπήρξε καμία επίδραση στα επίπεδα της snoRNA U44 ή U47 snoRNA (Σχήμα 8), γεγονός που υποδηλώνει ότι η λειτουργία του

GAS5

προερχόμενο snoRNAs στο p53-ρυθμίζεται απόκριση σε βλάβη του DNA δεν συνεπάγεται τη μετατροπή τους σε sdRNAs με λειτουργία miRNA-όπως.

Σχετική επίπεδα U44 snoRNA (κόκκινο), U47 snoRNA (μπλε) και miR-34a (μωβ) μετρήθηκαν με RT-qPCR στο DLD1 Dicer

κυτταρικές σειρές WT, DLD1 Dicer

κυτταρικές σειρές KD, RKO Dicer

κυτταρικές γραμμές WT, RKO Dicer

KD κυτταρικές σειρές αγωγή είτε με δοξορουβικίνη (σε τελική συγκέντρωση 0,2 μg /ml) ή όχημα για 24 ώρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται σε σχέση με το όχημα αγωγή αντίστοιχο κυτταρικές γραμμές (διακεκομμένη γραμμή) ± SEM (το καθένα από αυτά πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν? t δοκιμή Student: * Ρ & lt? 0,01, ** P≤0.006).

Η

συζήτηση

τα ευρήματά μας έδειξαν μια σχέση μεταξύ της δραστηριότητας p53 και την έκφραση του

GAS5

προερχόμενο snoRNAs στον καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές και τα ανθρώπινα ορθοκολικό ιστό. Επιπλέον, πρότειναν ότι η μεταγραφή του

GAS5

γονίδιο άμεσα ρυθμίζεται από ρ53, αν και χρωματίνης μελέτες ανοσοκαταβύθισης θα απαιτούνταν για να το επιβεβαιώσει. Αν και δεν υπάρχουν λειτουργικές μελέτες έχουν διεξαχθεί, τα ευρήματα αυτά έδειξαν ένα σημαντικό ρόλο για τους

GAS5

προερχόμενο snoRNAs στην ρ53-ρυθμιζόμενη κυτταρική απόκριση σε βλάβη του DNA και σε μονοπάτια σηματοδότησης ρ53 συνδέονται σε ανθρώπινο ορθοκολικό ιστό και του παχέος εντέρου .

Μέχρι Chang

et al.

(2002) [30] περιγράφηκε για πρώτη φορά τον πιθανό ρόλο των snoRNAs στην ογκογένεση, υπήρξε μικρή αιτιολόγηση για τη συστηματική αξιολόγηση του ρόλου των snoRNAs σε αυτό ή οποιαδήποτε άλλη παθολογική κατάσταση. Ωστόσο τα δεδομένα που προκύπτουν στο σύνδεσμο μια απορρύθμισης στην έκφραση διαφόρων snoRNAs στην ανάπτυξη ενός αριθμού κακοηθειών [11], [25], [31], [32]. Καθώς το

GAS5

γονίδιο φιλοξενεί δέκα ιντρονική snoRNAs και ένα lncRNA και έχει εμπλακεί σε ογκογένεση και τη ρύθμιση της επιβίωσης κυττάρου και απόπτωσης [21] – [23], και με δεδομένη την καλά τεκμηριωμένη ρόλος για το ρ53 με τον ίδιο διαδικασίες, έχουμε ως στόχο την περαιτέρω διερεύνηση της σχέσης μεταξύ της p53 και την GAS5 snoRNAs να αποκτήσουν περαιτέρω γνώσεις σε πιθανό ρόλο τους στην ογκογένεση. Βρήκαμε ότι, σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, η

GAS5

προερχόμενο snoRNAs προκλήθηκαν σε p53-εξαρτώμενο τρόπο μετά από DOX διεγείρονται βλάβη στο DNA, αλλά ότι αυτό δεν επηρεάζουν χάθηκε όταν Dicer ήταν λειτουργικά γκρέμισε. Αυτό προτείνει ότι αυτές οι snoRNAs δεν είχαν μεταποιηθεί σε sdRNAs με λειτουργία miRNA-όπως, και ότι ο ρόλος τους στην αντιμετώπιση βλαβών του DNA δεν απαιτείται να υποβληθούν σε περαιτέρω επεξεργασία με αυτόν τον τρόπο. Αυτό υποδεικνύει ότι αυτά τα snoRNAs μπορεί να εμπλέκεται στον συντονισμό της ρ53 απόκριση με διαμεσολάβηση μέσω του ρόλου τους στη ρύθμιση της ριβόσωμα. snoRNAs είναι ζωτικής σημασίας για τη λειτουργία του ριβοσώματος και την αποτελεσματική ρύθμιση της μετάφρασης [2] και p53 αποτελεί βασικό μεσολαβητή των ριβοσωμάτων βιογένεση, ιδίως σε απάντηση στα λεγόμενα πυρηνισκικός στρες [33]. Επιπλέον, ρ53 έχει δειχθεί ότι μεσολαβεί στη σύνδεση σηματοδότηση μεταξύ ριβοσωμάτων βιογένεση και του κυτταρικού κύκλου [34]. Φαίνεται λογικό, επομένως, ότι το

GAS5

προερχόμενο snoRNAs θα μπορούσε να προκληθεί άμεσα από τη μεσολάβηση του ρ53 μεταγραφής μετά από βλάβη του DNA, προκειμένου να «εξορθολογισμό» της μετα-μεταγραφική ωρίμανση και την τροποποίηση των rRNAs και να εξασφαλιστεί μια πιο αποτελεσματική μετάφραση των γονιδίων που απαιτούνται για να συντονίζει την απάντηση σε ένα τέτοιο άγχος. Αυτή η θεωρία σαφώς απαιτεί περαιτέρω πειραματική αξιολόγηση δεν τουλάχιστον αποδεικνύοντας ότι υπάρχει μία αύξηση στον εντοπισμό αυτών των snoRNAs στο ριβόσωμα παρά μια εναλλακτική λύση κυτταρικό διαμέρισμα μετά από βλάβη του DNA. Είναι πιθανό ότι αυτά τα snoRNAs ενεργούν σε μια θέση διαφορετική από το ριβόσωμα και ότι μπορεί να έχουν sdRNA λειτουργία τύπου, αλλά δεν απαιτούν την επεξεργασία Dicer για να ενεργοποιήσετε αυτό. Είτε αυτά βλάβες στο DNA που προκαλούνται

GAS5

προερχόμενο snoRNAs λειτουργούν απλά για να φιλοξενήσει μια αύξηση γονίδιο μετάφρασης στο ριβόσωμα ή αν είναι όντως σε επεξεργασία για να sdRNAs και έχουν επιπλέον, ανεξάρτητη λειτουργία, θα μπορούσε να αξιολογηθεί η επίδρασή τους στην έκφραση γονιδίων μέσω της υπερ-έκφραση πειράματα που ακολουθείται από πειράματα γονιδιακής προφίλ.