Abstract

Αλλαγή στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο του παγκρέατος θα μπορούσε να αποδοθεί στη μεταβολή της ιστόνης μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις οδηγούν σε μετέπειτα αναδιαμόρφωση του εκμαγείου χρωματίνης κατά την διάρκεια της μεταγραφής. Ωστόσο, το διασυνδεδεμένο δίκτυο των μορίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση αυτών των διεργασιών παραμένει άπιαστο. hPaf1 /PD2, μία υπομονάδα του ανθρώπινου ΡΑΡ-συγκρότημα, που εμπλέκονται στη ρύθμιση της μεταγραφικής επιμήκυνσης έχει ογκογόνο δυναμικό. Η μελέτη μας διερευνά την πιθανότητα ότι η ρύθμιση των ιστονών μεθυλίωση από hPaf1 μπορεί να συμβάλει στην αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης από νουκλεοσώματος αναδιάταξη. Εδώ, δείχνουμε ότι knockdown του hPaf1 /PD2 οδηγεί σε μειωμένη δι- και τρι-μεθυλίωση στο ιστόνης Η3 λυσίνης 4 υπολείμματα σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, hPaf1 /PD2 συνεντοπίζεται με MLL1 (Μικτή Lineage Λευχαιμία 1), μια μεθυλοτρανσφεράση των ιστονών που μεθυλιώνει υπολείμματα H3K4. Επίσης, η μείωση του επιπέδου hPaf1 οδήγησε σε μειωμένη έκφραση MLL1 και μια αντίστοιχη μείωση του επιπέδου του CHD1 (Chromohelicase DNA-πρωτεΐνης δέσμευσης 1), μια ΑΤΡάση εξαρτώμενο χρωματίνης ένζυμο αναδιαμόρφωσης που δεσμεύεται ειδικά με H3K4 δι και τριμεθυλο σήματα. hPaf1 /PD2 βρέθηκε επίσης να αλληλεπιδρούν και να συνεντοπίζονται με CHD1 τόσο κυτταροπλασματικά και πυρηνικά εκχυλίσματα των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Περαιτέρω, μειωμένο επίπεδο CHD1 εντοπισμού στον πυρήνα σε κύτταρα hPaf1 /PD2 Knockdown μπορούσε να διασωθεί με έκτοπη έκφραση της hPaf1 /PD2. Μικροκοκκική πέψη με νουκλεάση έδειξε μια αλλαγμένη δομή χρωματίνης στα κύτταρα hPaf1 /PD2-KD. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι hPaf1 /PD2 σε συνδυασμό με MLL1 ρυθμίζει μεθυλίωση υπολειμμάτων H3K4, καθώς αλληλεπιδρά και ρυθμίζει την πυρηνική παλινδρόμηση των πρωτεϊνών χρωματίνης αναδιαμόρφωσης CHD1, διευκολύνοντας τη λειτουργία του σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Dey P, Ponnusamy MP, Deb S, Batra SK (2011) Human RNA πολυμεράσης ΙΙ-Association Factor 1 (hPaf1 /PD2) Ρυθμίζει ιστόνης μεθυλίωσης και αναδιαμόρφωσης χρωματίνης στον καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (10): e26926. doi: 10.1371 /journal.pone.0026926

Επιμέλεια: Μαίρη Bryk, Texas A & amp? Μ University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 του Σεπτεμβρίου, 2011? Αποδεκτές: 5 Οκτώβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 27 Οκτ, 2011

Copyright: © 2011 Dey et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς για το έργο αυτό υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (CA78590, CA111294, CA127297, CA133774 και CA131944) και το Υπουργείο άμυνας (BC073541). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των βασικών πρωτεϊνών ιστόνης, όπως φωσφορυλίωση, μεθυλίωση, ακετυλίωση, ubiquitylation ή τροποποίησή της με SUMO, παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Ένας τρόπος με τον οποίο η λειτουργία αυτών των τροποποιήσεων ιστονών είναι από την πρόσληψη των μεταγενέστερων εκτελεστικών πρωτεϊνών που εκτελούν συγκεκριμένες ανεξάρτητες λειτουργίες στο πρότυπο χρωματίνης. Αυτές περιλαμβάνουν την χρωματίνη αναδιαμόρφωση πρωτεΐνες που «διαβάζουν» τα τροποποιημένα σήματα των ιστονών και τη χρήση ενέργειας ATP για να αλλάξει τη θέση της νουκλεοσώματα στο DNA. Ως αποτέλεσμα, το πρότυπο χρωματίνης είτε μπλοκάρει ή να γίνει προσβάσιμο με τη μηχανή μεταγραφής, ως εκ τούτου, τη ρύθμιση προς τα κάτω της γονιδιακής έκφρασης. Ιστονών μεθυλίωσης, συγκεκριμένα η ιστόνης H3 λυσίνη 4 μονο- υπόλειμμα, δι- και trimethylation, ως επί το πλείστον συνδέονται με την 5 ‘περιοχές ενεργά μεταγράφονται τα γονίδια [1]. Ωστόσο, μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι στις περιοχές της βλάβης του DNA, η ING πρωτεΐνες προσλάβει συμπλέγματα HDAC να φιμώσει τη μεταγραφή των γονιδίων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσω της αναγνώρισης των τριμεθυλιωμένη υπολειμμάτων H3K4 από PHD τομείς τους [2]. Αυτή είναι η πρώτη έκθεση που συνδέει K4 trimethylation για την ενεργό καταπιεσμένη γονίδια, καθώς και.

Στα θηλαστικά, η μεθυλίωση στο υπόλειμμα H3K4 διενεργείται από την μεθυλοτρανσφεράση των ιστονών MLL1, μια περιοχή SET περιέχει πρωτεΐνη η οποία παραμένει σε συγκρότημα με άλλες πρωτεΐνες υπομονάδας WDR5, RbBP5 και ASH2 [3]. Το ομόλογο ζυμομύκητα του MLL1, Set1, είναι ένα μέρος ενός μακρομοριακού συμπλόκου που ονομάζεται COMPASS (συγκρότημα πρωτεϊνών που σχετίζονται με Set1) που αλληλεπιδρά με σύμπλεγμα PAF ζύμη για ιστόνης μεθυλίωση [4]. Έχει υποτεθεί ότι μερικά συντηρημένων γονιδίων, από Drosophila στους ανθρώπους, φέρει αποκλειστικά το σήμα αυτό για μεθυλίωση και η έκφραση αυτών των γονιδίων ρυθμίζεται από ροΙ II γενικούς παράγοντες επιμήκυνσης [1]. Τα σήματα μεθυλίωση H3K4 ιστόνης μπορεί να αναγνωριστεί περαιτέρω με ειδικές πρωτεΐνες, με αποτέλεσμα την πρόσληψη και την επακόλουθη ενζυμική ή φυσιολογική δραστηριότητα στο σημείο της πρόσληψης. CHD1 (Chromodomain ελικάσης DNA δεσμευτική πρωτεΐνη 1) είναι μια πρωτεΐνη που ανήκει στην οικογένεια των εξαρτώμενων ΑΤΡάσης χρωματίνης παράγοντες αναδιαμόρφωσης που συνδέουν ειδικά με διμεθυλιωμένα και τριμεθυλιωμένη H3K4 [5], [6]. Το ανθρώπινο CHD1 συνδέεται με το μεθυλιωμένο κατάλοιπο της ιστόνης H3K4 τόσο μέσω της tandem chromodomains της, ενώ η μαγιά Chd1 αποτυγχάνει να συνδεθεί μεθυλιωμένα υπολείμματα H3K4 [7].

ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου αποδίδεται στην απορυθμισμένη γονιδιακή έκφραση η οποία θα μπορούσε συχνά συσχετίζονται είτε ελαττωματικό επιγενετικές ενεργοποίηση ή αποσιώπηση γονιδίων [8]. Altered μοτίβα τροποποίηση ιστόνης προκαλέσει λανθασμένη στόχευση του αναδιαμόρφωσης χρωματίνης ενζύμων που μπορεί να οδηγήσει σε ανεξέλεγκτη έκφραση γονιδίων και ως εκ τούτου να προκαλέσουν τα φυσιολογικά κύτταρα να μετατραπούν σε καρκινικά κύτταρα. Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη κύρια αιτία του καρκίνου με πολύ κακή πρόγνωση ποσοστό επιβίωσης και πενταετούς λιγότερο από 5%. Όπως και άλλες μορφές κακοήθειας, καρκίνου του παγκρέατος, επίσης συσχετίζεται με επιγενετικές μεταβολές όπως μεθυλίωση του DNA και των ιστονών τροποποιήσεις, που οδηγεί σε ένα αλλαγμένο γονιδιακή έκφραση [9].

PD2 είναι το ανθρώπινο ομόλογο του RNA πολυμεράση ζύμης II- που συνδέονται παράγοντα 1 (yPaf1), η οποία αποτελεί τον πυρήνα υπομονάδα του συμπλόκου του ανθρώπου σε συνδυασμό παράγοντας RNA πολυμεράσης II (ΗΡΑΡ). Παρόμοια με τον ομόλογό μαγιά, το συγκρότημα ΗΡΑΡ αποτελείται από τέσσερις άλλες υπομονάδες, δηλαδή hLeo1, hCtr9, hSki8 και parafibromin [10] – [12]. Οι κύριες λειτουργίες του συγκροτήματος ΗΡΑΡ περιλαμβάνει μεταγραφική επιμήκυνση, την επεξεργασία και την ωρίμανση του mRNA, παρόμοια με εκείνη του συμπλόκου PAF ζύμη [12]. Χρωματίνης τροποποίηση και την αναδιαμόρφωση είναι επίσης μερικά από τα χαρακτηριστικά των παραγόντων μεταγραφής. Προφανώς, μια σειρά από τροποποιήσεις των ιστονών έχουν συνδεθεί με το PAF πολύπλοκες και μεταγραφή επιμήκυνση καθώς [4], [13]. Τόσο η ζύμη και το ανθρώπινο σύμπλοκο ΡΑΡ βρίσκονται να είναι αναγκαία για Rad6 /Bre1 εξαρτώμενη ubiquitylation ιστόνης Η2Β [14]. Η monoubiquitylation του Η2Β με ΗΡΑΡ αφαιρεί το νουκλεοσώματος φράγμα, το οποίο αποτελεί προϋπόθεση για την αποτελεσματική επιμήκυνση της μεταγραφής σε χρωματίνη από την RNA ροΙ II [14]. Η παρουσία του ubiquitylated Η2Β πυροδοτεί περαιτέρω H3K4 δι- και τρι-μεθυλίωση. Στη ζύμη, η λειτουργία Paf1C στο σχηματισμό H3K4-Me3 ανατίθεται από την υπομονάδα Rtf1 με την πρόσληψη το συγκρότημα SET1 ιστόνης μεθυλοτρανσφεράση [15], η οποία είναι ομόλογη με την ανθρώπινη MLL συγκρότημα [16]. Μελέτες Μαγιά δείχνουν επίσης ότι το συγκρότημα Paf1 απαιτείται για την πρόσληψη του συμπλόκου μεθυλτρανσφεράσης πυξίδα για την RNA πολυμεράση II μέσω της αλληλεπίδρασης υπομονάδας. Σε ανθρώπινα κύτταρα, hCdc73 φαίνεται ότι απαιτείται για την πλήρη επίπεδα H3K36-Me3 [17], αλλά όχι H3K4-Me3, ενώ σε ζύμη Cdc73 απαιτείται για τις δύο τροποποιήσεις [18]. Ως εκ τούτου, ο ρόλος του συμπλόκου PAF σε επιμήκυνση της μεταγραφής έχει συσχετίζεται στενά με τροποποιήσεις των ιστονών.

Εκτός από το ρόλο της στην ρύθμιση της μεταγραφής, τα ανθρώπινα PAF συγκρότημα υπομονάδων έχουν επίσης συνδεθεί με ένα κακοήθη φαινότυπο. Parafibromin (hCdc73) βρέθηκε να μεταλλαχθεί σε παραθυρεοειδούς όγκους και ενισχύθηκαν σε ήπατος και του μαστού καρκίνωμα. Leo1, παρόντες στη 15q21 τόπο, ενισχύεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου και κακοήθες ινώδες ιστιοκύττωμα του οστού, ενώ η

Ctr9

γονιδιακό τόπο βρεθεί να διαγραφεί σε καρκίνο του παγκρέατος. Η hPaf1 υπομονάδα του ανθρώπινου ΡΑΡ συγκρότημα, επίσης γνωστή ως PD2, ενισχύεται και υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παγκρέατος και ο ρόλος της στην ογκογένεση υποδεικνύεται από την επαγωγή ενός μετασχηματισμένου φαινοτύπου σε υπερέκφραση [19]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε προσδιορίσει ένα ρόλο hPaf1 /PD2 στη ρύθμιση ιστόνης μεθυλίωση στο υπόλειμμα H3K4 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μέσω αλληλεπίδρασης με ιστόνης μεθυλτρανσφεράση MLL1. Διαπιστώθηκε επίσης να ρυθμίζουν την έκφραση του παράγοντα χρωματίνης αναδιαμόρφωσης, CHD1 που δεσμεύεται ειδικά με δι και τριμεθυλιωμένη H3K4 και διευκολύνουν την πυρηνική εισαγωγή του, πιθανόν μέσω άμεσων αλληλεπιδράσεων. Περαιτέρω, δοκιμασίες πέψης μικροκοκκική νουκλεάσης δείχνουν ότι νοκ ντάουν της PD2 οδηγεί σε μεταβολή της νουκλεοσωμικών τοποθέτηση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές PANC1 και MIAPaCa ελήφθησαν από την ATCC. Τα κύτταρα καλλιέργειας σε ϋΜΕΜ μέσο (Sigma) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Sigma) και 1% πενικιλλίνη-streptamycin διάλυμα (Sigma). Το μέσο καλλιέργειας άλλαζε κάθε 2 ημέρες και κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν με επεξεργασία με θρυψίνη-ΕϋΤΑ.

Απομόνωση RNA και QRT-PCR

Ολικό κυτταρικό RNA εξήχθη από κύτταρα PANC1 χρησιμοποιώντας το κιτ RNAeasy (Qiagen) και υποβάλλονται σε επεξεργασία για την αντίστροφη μεταγραφή. Το αρχικό στάδιο ενεργοποίησης PCR ήταν στους 94 ° C για τέσσερα λεπτά, ακολουθούμενο από το στάδιο μετουσίωσης στους 94 ° C επί ένα λεπτό, βήμα αποδιάταξης εκκινητών στους 58 ° C για 30 δευτερόλεπτα, στάδιο επέκτασης στους 72 ° C για ένα λεπτό, και το τελικό στάδιο επέκτασης στους 72 ° C για δέκα λεπτά. προϊόντα αντίδρασης PCR στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας πηκτή αγαρόζης 2%. Οι πηκτές χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας 0,5 μg /ml βρωμιούχου αιθιδίου, φωτίστηκε με υπεριώδες φως. Σύνολο κύτταρο RNA μεταγράφηκε αντίστροφα και προσδιορίστηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας Πράσινο SYBR ενσωμάτωση. Η έκφραση όλων των γονιδίων ομαλοποιήθηκε με εκείνη του εσωτερικού ελέγχου β-ακτίνης και εκφράζεται σε σχέση με την αναφερόμενη δείγμα αναφοράς (μέσος όρος ± S.D. αντιδράσεων τριπλούν). Οι εκφράσεις του γράμμωσης ειδικά γονίδια συγκρίθηκαν μεταξύ των κωδικοποιημένα και κυττάρων PD2 knockdown PANC1 από t-test του two-tailed Student. Μια τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

παρεμβολή RNA

Η περιοχή της Paf1 /PD2 έγινε στόχος με συγκεκριμένα siRNA (αλληλουχία 5′-AACAGGUUCGUCCAGUACAAA-3). ». Συνθετικά νόημα και αντινόημα ολιγονουκλεοτίδια (Dharmacon, Lafayette, CO) ανοπτήθηκαν σε 100 mM οξικού καλίου, 30 mM ΗΕΡΕδ-ΚΟΗ (ρΗ 7.4), και 2 mM οξικό μαγνήσιο για ένα λεπτό στους 90 ° C και μία ώρα στους 37 ° C, και καταψύχθηκαν. Ολιγονουκλεοτίδια επιμολύνθηκαν σε κύτταρα με

Trans

IT-TKO (Mirus, Madison, WI) σύμφωνα με τις συστάσεις του προμηθευτή.

Ανοσοστύπωμα Δοκιμασία

PANC1 και MiaPaCa κυτταρικές σειρές ήταν επεξεργασία για εκχύλιση πρωτεΐνης και κηλίδωση Western με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό RIPA (100 mM Tris, 5 mM EDTA, 5% ΝΡ40? ΡΗ 8.0) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (1 mM φαινυλ-μεθυλ σουλφονυλ φθορίδιο, 1 μg /ml απρωτινίνη, 1 μg /ml λευπεπτίνη) και διατηρήθηκε στους 4 ° C και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. Είκοσι μγρ των προϊόντων λύσης πρωτείνης διαχωρίστηκε σε 10% SDS-PAGE. Αποφασισμένοι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν πάνω στο PVDF μεμβράνη. Μετά ταχεία πλύση σε PBST (Φωσφορικό αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα και 0.1% Tween 20), οι μεμβράνες αποκλείστηκαν σε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS για τουλάχιστον 2 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (αντι-Paf1 /PD2, αντι-Leo1, αντι-CDC, αντι-Ski8, αντι- Oct3 /4, αντι-SOX2, αντι-β-ακτίνης) (αραιωμένο εντός 3% BSA σε PBS) όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Η μεμβράνη στη συνέχεια πλύθηκε (3 χ 10 λεπτά) σε PBST σε θερμοκρασία δωματίου και ανιχνεύτηκαν με αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση 1:2000 αραιωμένο χρένο για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκε 5 × 10 λεπτά με PBST . Το σήμα ανιχνεύθηκε με ένα κιτ χημειοφωταύγειας ECL (Amersham Bioscience, UK). Όλες οι κηλίδες Western ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ChemiImager 4400. Τα γραφήματα που δημιουργούνται γραμμές δείχνουν λάθος που αντιπροσωπεύουν τα τυπικά σφάλματα, όπως υπολογίζεται από τρεις ανεξάρτητες πειραματικών αντιγράφων. Η διαφορά σε κάθε επίπεδο της πρωτεΐνης μεταξύ ομελέτα και τα κύτταρα νοκ ντάουν PD2 αναλύονται με Students t-test με τιμή p μικρότερη από 0,05 να θεωρείται στατιστικά σημαντική.

Ομοεστιακή Μικροσκοπίας

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επάνω σε αποστειρωμένα γύρος καλυπτρίδες (μάρκα CIR 18-1 Fisher 12-545-10) και αναπτύχθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων για 24 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένο μεθανόλη (προ-ψύχθηκαν στους -20 ° C) και διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 σε PBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και αποκλείστηκαν με χρήση 10% ορό κατσίκας για 30 λεπτά. Μετά τον αποκλεισμό, επωάστηκε με πρωτογενές (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού PD2, CHD1 κουνελιού πολυκλωνικών) αντισωμάτων για μία ώρα και φθορίζοντα δευτερεύοντα αντισώματα ετικέτα (FITC κατσίκας αντι-ποντικού, Texas Red-κατσίκας αντι-κουνελιού) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αντισώματα αραιώθηκαν σε 5% ορό κατσίκας. Τέλος, μετά από επώαση δευτερεύον αντίσωμα, τα κύτταρα πλύθηκαν με TBST τρεις φορές και καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν με vectashield περιείχε ϋΑΡΙ (VECTOR).

Απομόνωση των κυτταροπλασματικών και πυρηνικών εκχύλισμα

Το πρωτόκολλο για κυτταροπλασματική και η παρασκευή πυρηνικό εκχύλισμα προσαρμόστηκε από προηγουμένως δημοσιευμένες διαδικασίες. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δύο φορές σε παγωμένο PBS και επωάστηκαν σε πάγο για 30 λεπτά σε υποτονικό κυτταροπλασματική ρυθμιστικό εκχύλισης (10 mM Hepes, ρΗ 7.4, 10 mM KCl, 0,2% ΝΡ-40, 0,1 mM EDTA, 10% γλυκερόλη, 1.5 mM MgCl

2, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 5 mM Na

3νο

4, 5 mM NaF), συμπληρωμένο με πλήρη κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης [Roche]. Η κυτταρική διάσπαση επιτεύχθηκε με αρκετές διελεύσεις μέσω μιας βελόνας 25G. Πυρήνες συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση σε 16,000 g, και το υπερκείμενο περαιτέρω φυγοκεντρήθηκε σε 16,000 g για να δώσει το τελικό κυτταροπλασματικό εκχύλισμα. Πυρηνική σφαιρίδια πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS που ακολουθείται από επώαση σε υπέρτονο διάλυμα πυρηνικής εκχύλισης (20 mM Hepes, [ρΗ 7,6], 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% γλυκερόλη, 1.5 mM MgCl

2, 1 mM DTT , 1 mM PMSF, 5 mM Na

3νο

4, 5 mM NaF), συμπληρωμένο με πλήρη κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης [Roche]. Το διάλυμα περαιτέρω κατεργασία με υπερήχους σε πλάτος 60% δύο φορές για 10 δευτερόλεπτα το καθένα. Τα αδιάλυτα υλικά καταβυθίστηκαν με φυγοκέντρηση. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε ως πυρηνικό εκχύλισμα.

Ανοσοκαταβύθιση Ανάλυση

ίσες ποσότητες πρωτεΐνης Α + σφαιρίδια G-Sepharose (Oncogene Research, Boston, ΜΑ) επωάστηκαν για μια νύχτα με αντι-PD2 (κουνέλι πολύκλωνα) και αντισώματα σε μία 1 ml συνολικό όγκο αντι-CHD1 (κουνελιού πολυκλωνικό). Ακολούθως πλύθηκε δύο φορές για να απομακρυνθεί το μη δεσμευμένο αντίσωμα και 1,5 mg λύματος πρωτεΐνης προστέθηκε στο σφαιρίδιο-αντισώματος μίγμα και επωάζονται σε μια περιστρεφόμενη πλατφόρμα για 5 ώρες σε 4 ° C. Μετά την περίοδο επώασης, τα μίγματα πλύθηκαν πέντε φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Τα ανοσοϊζήματα ή ολική κυτταρολύματα ηλεκτροφορητικά διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE (10%). Αποφασισμένοι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν πάνω στο PVDF μεμβράνη. Μετά ταχεία πλύση σε PBST (Φωσφορικό αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα και 0.1% Tween 20), οι μεμβράνες αποκλείστηκαν σε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS για τουλάχιστον 2 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (αντι Paf1 /PD2, Oct3 /4 και RNA Pol II). Τα ανοσοαποτυπώματα πλύθηκαν πέντε φορές (5 χ 10 λεπτά), επωάστηκαν 1 ώρα με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας, πλένονται πέντε φορές (5 χ 10 λεπτά), αντιδρά με αντιδραστηρίου ενισχυμένης χημειοφωταύγειας ECL ανοσοανιχνεύσεως (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, UK), και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ για την ανίχνευση του σήματος.

μικρόκοκκη νουκλεάση δοκιμασία

Η δοκιμασία μικροκοκκική νουκλεάση διεξήχθη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [20] με κάποιες τροποποιήσεις. Πενήντα × 10

6 κύτταρα σφαιροποιήθηκαν στις 2000 RPM στους 4 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από πλύσιμο με 10 ml παγωμένο PBS και πάλι δισκιοποιούνται όπως προηγουμένως. Τα κύτταρα κατόπιν επαναιωρήθηκαν σε 5 ml παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ΝΡ-40 (10 mM Tris-HCl (ρΗ 7.4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl

2, 0,5% Nonidet Ρ-40, 0.15 mM σπερμίνη και 0,5 mM σπερμιδίνης), επωάστηκαν για 5 λεπτά σε πάγο και οι πυρήνες πελέτα. Οι πυρήνες πλύθηκε με 2.5 ml MNase ρυθμιστικού πέψης (10 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, 60 mM KCI, 0,15 mM σπερμίνη και 0,5 mM σπερμιδίνη) και μετά από φυγοκέντρηση περαιτέρω επαναιωρήθηκαν σε 1 ml του MNase ρυθμιστικού πέψης που περιέχει 2 mM ΟαΟ

2. Από τα αναδιαλυμένου διαλύματα, δείγματα 100 μΐ λήφθηκαν και επωάστηκαν με αυξανόμενες ποσότητες του μικρόκοκκη νουκλεάση ένζυμο (0, 80 και 100 μονάδες) για 5 και 10 λεπτά. Η αντίδραση σταμάτησε με προσθήκη 80 μΙ ρυθμιστικού πέψης MNase, 20 μΙ ρυθμιστικού διακοπής MNase (100 mM EDTA, 10 mM EGTA), 3 μΐ Proteinase Κ (25 mg /ml) και 10 μΐ 20% SDS και επωάστηκαν για μία νύχτα στους 37 ° C. Την επόμενη ημέρα, τα δείγματα εκχυλίζονται με 200 μl διαλύματος φαινόλης-χλωροφορμίου. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση και μια υδατική στιβάδα συλλέχθηκε. Δύο μΐ του RNAse Α (10 mg /ml) προστέθηκε στο διάλυμα και επωάστηκε στους 37 ° C για 2 ώρες και πάλι εκχύλιση με φαινόλη-χλωροφόρμιο διεξήχθη. Περαιτέρω, το DNA καταβυθίστηκε με την προσθήκη αιθανόλης 100% και μετά από φυγοκέντριση, το ίζημα DNA επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό ενυδάτωση DNA ή νερό. Πέντε μg του απομονωμένου DNA αναλύθηκε σε γέλη αγαρόζης 1,4% και οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου. λογισμικό ImagJ χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση πυκνότητας των προτύπων των ζωνών DNA σε έλεγχο, Κωδικοποιημένα και τα κύτταρα PD2 KD PC.

Αποτελέσματα

hPaf1 /PD2 επηρεάζει άλλες PAF συγκρότημα υπομονάδων σε PC κύτταρα

το ανθρώπινο συγκρότημα PAF αποτελείται από πέντε υπομονάδες, παρόμοια με τον ομόλογό της μαγιάς, δηλαδή hPaf1, parafibromin (hCdc73), hCtr9, hLeo1 και την υπομονάδα hSki8, το οποίο είναι επίσης ένα μέρος του συγκροτήματος του ανθρώπου σκι. Προηγούμενες εκθέσεις έχουν δείξει ότι οι υπομονάδες του ανθρωπίνου συμπλόκου ΡΑΡ καταδεικνύουν συντονισμένη έκφραση όπου knockdown είτε hCtr9 ή υπομονάδας hSki8 οδήγησε σε μείωση των επιπέδων των άλλων υπομονάδων όπως hPaf1 και hLeo1 [12]. Αυτό είναι συνεπές με την παρατήρηση σε ζυμομύκητες, όπου διαγραφή των επιμέρους υπομονάδων οδηγεί σε διάφορους βαθμούς μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης των άλλων υπομονάδων [21]. Είναι ενδιαφέρον ότι, πρόσφατα δεδομένα από το εργαστήριο μας έχει δείξει ότι, οι PAF συγκρότημα υπομονάδες λειτουργούν ανεξάρτητα σε βλαστικά κύτταρα ποντικού εμβρυϊκών, έτσι ώστε knockdown της υπομονάδας Paf1 δεν επηρεάζει το επίπεδο των άλλων υπομονάδων [22]. Για να αναλυθεί η λειτουργική σημασία της hPaf1, την κύρια υπομονάδα του συμπλόκου ΗΡΑΡ, σε καρκίνο του παγκρέατος, έχουμε παροδικά γκρέμισε hPaf1 /PD2 στις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές PANC1 και MiaPaCa. Σε επιβεβαίωση με προηγούμενες εκθέσεις, βρήκαμε ότι hPaf1 /PD2 έχει μία συντονισμένη έκφραση με τις άλλες υπομονάδες του συμπλόκου ΗΡΑΡ. Western Blot ανάλυση των hCdc73 (parafibromin), πρωτεΐνες hLeo1, hSki8 και hCtr9 και μετέπειτα ποσοτικοποίηση έδειξαν μειωμένα επίπεδα έκφρασης του hLeo1, hCdc73 και hCtr9 υπομονάδας στο hPaf1 knockdown PANC1 και MiaPaCa κύτταρα σε σύγκριση με τα κωδικοποιημένα siRNA κατεργασμένων κυττάρων (Εικ. 1) αν και δεν είναι στατιστικά σημαντική. (Ρ & gt? 0,05) Ωστόσο δεν υπήρξε καμία παρατηρήσιμη αλλαγή στο επίπεδο πρωτεΐνης hSki8 υπομονάδας κατά μειορύθμιση της υπομονάδας hPaf1. Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω τα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας μια διαφορετική ομάδα των siRNAs (Santa Cruz, CA) που στρέφονται κατά PD2 και παρατηρούνται παρόμοια αποτελέσματα (Εικ. S3). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι knockdown του μία υπομονάδα του συμπλόκου ΗΡΑΡ επηρεάζει την έκφραση των άλλων μελών, προκειμένου να διατηρηθεί μια γενική στοιχειομετρική αναλογία του συμπλόκου σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Περαιτέρω, τονίζεται επίσης η διαφορική έκφραση και η λειτουργία των επιμέρους υπομονάδων του συμπλέγματος ΡΑΡ σε διαφορετικά καρκινώματα.

PANC1 και MiaPaCa καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα επιμολύνθηκαν με περιπλεγμένο και PD2 ειδικών ολίγο siRNA και προϊόντα λύσης πρωτεΐνης συλλέχθηκαν στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η ανάλυση στυπώματος Western των προϊόντων λύσης κυττάρου χρησιμοποιώντας αντίστοιχα αντισώματα έδειξαν την έκφραση του hPaf1 /PD2 και άλλα πολύπλοκα μόρια ΡΑΡ (parafibromin, hLeo1, hSki8 και hCtr9) σε κωδικοποιημένα και Paf1 /PD2 RNAi κατεργασμένα κύτταρα PANC1 και MiaPaCa. Η έκφραση της ιστόνης 3 Λυσίνη 4 υπόλειμμα μονο, δι και τρι-μεθυλίωση σήματα έδειξαν μειωμένο επίπεδο σε hPaf1 /PD2 knockdown PANC1 και MiaPaCa κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα κωδικοποιημένα RNAi. Το συνολικό επίπεδο της ιστόνης Η3 είναι το ίδιο και στις δύο κωδικοποιημένα και PD2 γκρέμισε κύτταρα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Ποσοτικοποίηση των κηλίδων Western για κάθε κυτταρική γραμμή παρέχεται κάτω από τα στοιχεία ανοσοστύπωμα με αντίστοιχες ράβδους σφάλματος. * Αντιπροσωπεύει σημαντική μεταβολή (p & lt? 0,05) σε επίπεδο πρωτεΐνης μεταξύ ομελέτα και PD2 κύτταρα νοκ ντάουν

Η

hPaf1 /PD2 επηρεάζει ιστόνης μεθυλίωσης στο PC κύτταρα

Το συγκρότημα PAF μαγιά έχει καλά. καθιερωμένο ρόλο στην ιστόνης τροποποιήσεις όπως ubiquitylation και μεθυλίωση [4], [23] – [25]. Είναι γνωστό ότι προκαλεί την αλληλεπίδραση μεταξύ του συμπλέγματος Rad6-Bre1, πυξίδα ιστόνης μεθυλτρανσφεράση, και RNA ΡοΙ II, που οδηγεί στην ουβικιτινίωση ιστόνης Η2Β στη λυσίνη 123 κατάλοιπο, το οποίο είναι ένα μετέπειτα έναυσμα για μεθυλίωση στο υπόλειμμα λυσίνης 4 της ιστόνης Η3 [24]. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η RNAi έναντι hCtr9 ή hSki8 οδήγησε σε μείωση κυτταρικό επίπεδο της ιστόνης H3K4 μονο και trimethylation σημάτων, αλλά όχι διμεθυλίωση σήματα σε κύτταρα HeLa, υποδεικνύοντας ένα πιθανό ρόλο του ανθρώπινου συμπλόκου PAF σε ιστόνης μεθυλίωση καθώς [12 ]. Βρήκαμε ότι παροδική knockdown του hPaf1 /PD2 χρησιμοποιώντας ειδικά RNAi σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα επηρεάζει μεθυλίωση των ιστονών στο υπόλειμμα H3K4 (Εικ. 1). Western Blot ανάλυση των μονο, δι και trimethylation σήματα Η3 ιστόνης lysine4 υπόλειμμα έδειξαν σημαντική μείωση (* ρ & lt? 0,05) σε δι- και τριμεθυλιωμένη επίπεδα H3K4 σε PD2 knockdown PANC1 και MiaPaCa κύτταρα σε σύγκριση με κωδικοποιημένο κύτταρα κατεργασμένα RNAi. Ωστόσο, δεν υπήρχε μεγάλη διακύμανση στα επίπεδα H3K4 μονομεθυλίωσης λόγω της εξάντλησης PD2 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν με διαφορετική δεξαμενή PD2 ειδικών siRNAs σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. S3). Παρατηρήσαμε και πάλι προς τα κάτω ρύθμιση των ιστονών δι- και trimethylation σήματα όπως και πριν με ελάχιστη ή καμία μεταβολή στα επίπεδα των ιστονών μονομεθυλ.

hPaf1 /PD2 ρυθμίζει ιστόνης μεθυλοτρανσφεράση επίπεδο πρωτεΐνης MLL1

Με βάση την παρατήρηση ότι hPaf1 /PD2 ρυθμίζει ιστόνης δι και τρι-μεθυλίωση στο υπόλειμμα H3K4, θελήσαμε να διερευνήσουμε την επίδραση της hPaf1 νοκ ντάουν για μεθυλοτρανσφεράσες ιστόνης. Η πρωτεΐνη MLL1 που ανήκει στην οικογένεια των SET1 μεθυλτρανσφερασών λυσίνης είναι γνωστό ότι ρυθμίζει ειδικώς δι-και trimethylation στο ιστόνης Η3 λυσίνης 4 κατάλοιπα. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε την επίδραση της hPaf1 /PD2 knockdown επί έκφρασης πρωτεΐνης MLL1 χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά σύνολα PD2 siRNAs σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές PANC1 και MiaPaCa. Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι η μείωση του επιπέδου hPaf1 /PD2 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα οδηγεί σε μία σημαντική μείωση (* ρ & lt? 0,05) σε επίπεδο πρωτεΐνης MLL1 (Σχήμα 2Α, S3.). Οι γραφικές παραστάσεις που παρέχονται κάτω από τα αποτελέσματα ανοσοκηλιδώσεως αντιπροσωπεύουν ποσοτικοποίηση των κηλίδων Western για κάθε κυτταρική γραμμή. Εξετάσαμε περαιτέρω πρωτεΐνες PD2 και MLL1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με συνεστιακή μικροσκοπία και διαπίστωσε ότι οι δύο πρωτεΐνες συνεντοπίζονται στον πυρήνα, υποδεικνύοντας έτσι μία πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ τους (Σχ. 2Β). Ωστόσο, η ποσότητα των συνεντόπισης των δύο πρωτεϊνών ήταν σχετικά χαμηλή, γεγονός που δείχνει μια πιθανώς αδύναμη ή /και παροδικές αλληλεπίδραση. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σε επιβεβαίωση με προηγούμενες μελέτες οι οποίες έδειξαν ότι τόσο η ζύμη και την ανθρώπινη ΡΑΡ σύμπλοκα αλληλεπιδρούν με την αντίστοιχη ομόλογο του MLL ή Set1 πρωτεΐνη [4], [26], [27]. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι hPaf1 /PD2 ρυθμίζει, και πιθανώς αλληλεπιδρά με MLL1, για τον έλεγχο της H3K4 μεθυλίωσης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

(Α) και PANC1 MiaPaCa παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα επιμολύνθηκαν με περιπλεγμένο και PD2 RNAi ολίγο και προϊόντα λύσης συλλέχθηκαν στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. ανάλυση Western Blot χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα δεικνύει μία μείωση στην πρωτεϊνική έκφραση MLL1 ιστόνης μεθυλοτρανσφεράσης σε knockdown κυττάρων σε σύγκριση με κωδικοποιημένα κύτταρα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. δεδομένα Ποσοτικοποίηση της δυτικής κηλίδος παρέχεται κάτω από τα αντίστοιχα αποτελέσματα ανοσοαποτυπώματος για τις αντίστοιχες κυτταρικές σειρές. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν υποδεικνύεται τυπικό σφάλμα υπολογίζεται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Αντιπροσωπεύει σημαντική μεταβολή (p & lt? 0,05) σε επίπεδο πρωτεΐνης μεταξύ ομελέτα και PD2 νοκ ντάουν κύτταρα. εικόνες μικροσκοπίου (Β) Ομοεστιακή απεικονίζουν PD2 και MLL1 εντοπισμού στον πυρήνα των κυττάρων PANC1. MLL1 συνεντοπίζεται με PD2 σε διακριτές περιοχές εντός του πυρήνα (χρωματίστηκαν με DAPI) των κυττάρων PANC1. Το ένθετο αντιπροσωπεύει μια μεγεθυμένη εικόνα των κηλίδων συνεντόπισης της PD2 και MLL1.

Η

Νοκ ντάουν της hPaf1 /PD2 μειώνει το επίπεδο CHD1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Η ρύθμιση της ιστόνης μεθυλίωση από την hPaf1 /PD2 υπομονάδα του συμπλόκου ΗΡΑΡ αυξάνει την πιθανότητα ότι μπορεί να επηρεάσει διάφορες άλλες πρωτεΐνες, όπως οι παράγοντες αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης, τα οποία αλληλεπιδρούν με τροποποιημένες ιστόνες σε θέσεις της μεταγραφής. Μία υποτιθέμενη χρωματίνης σύμπλεγμα αναδιαμόρφωσης, CHD-1 (Chromodomain ελικάσης DNA-πρωτεΐνης δέσμευσης 1), ταυτοποιήθηκε τυχαία ως μία πρωτεΐνη θηλαστικού δέσμευσης DNA, το οποίο περιέχει τρία μοτίβα αλληλουχία υπογραφής: το chromodomain 52-αμινοξέων που βρίσκεται στην πρωτεΐνη ετεροχρωματίνης HP- 1 και η ομοιοτικών Polycomb καταστολέα, ο τομέας SnF2 /SWI2 ΑΤΡάσης, και χαρακτηριστικά μοτίβα του ελάσσονα αύλακα DNA δεσμευτικές πρωτεΐνες [28], [29]. Είναι ενδιαφέρον ότι η πρωτεΐνη χρωματίνης αναδιαμόρφωση CHD1 είναι γνωστό ότι συνδέεται ειδικά με το μεθυλιωμένο κατάλοιπο λυσίνης 4 της ιστόνης Η3, η οποία είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των ενεργών μεταγραφής. Θεωρείται ότι τα ανθρώπινα chromodomains CHD1 είναι υπεύθυνα για την αναγνώριση και την αλληλεπίδραση με τα σημάδια της ιστόνης μεθυλίωση [30]. Δεδομένου ότι hPaf1 /PD2 ρυθμίζεται ιστόνης μεθυλίωση στο υπόλειμμα H3K4, ερευνήσαμε ρύθμιση CHD1 από hPaf1 με παροδική knockdown του hPaf1 /PD2 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και αναλύθηκε η μεταβολή στα επίπεδα της πρωτεΐνης CHD1. Η ανάλυση στυπώματος Western μαζί με τα αντίστοιχα δεδομένα ποσοτικοποίηση παρέχονται παρακάτω τα στοιχεία ανοσοκηλιδώσεως (Εικ. 3Α) δείχνει ότι knockdown του hPaf1 /PD2 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα οδηγεί σε μείωση του επιπέδου CHD1 σε σύγκριση με τα κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου. Προς τα κάτω ρύθμιση του CHD1 ως αποτέλεσμα της PD2 knockdown επιβεβαιώθηκε περαιτέρω στις ίδιες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ένα διαφορετικό πισίνα siRNA κατά PD2 (Εικ. S3). Προκειμένου να επικυρώσει αυτό το αποτέλεσμα, χρησιμοποιήθηκε μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Σε συμφωνία με τα βιοχημικά δεδομένα, η ανάλυση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι το επίπεδο CHD1 μειώνεται σε hPaf1 /PD2 knockdown PANC1 και MiaPaCa κύτταρα σε σύγκριση με τα κωδικοποιημένα MiaPaCa ή PANC1 κύτταρα (Σχ. 3Β). Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR περαιτέρω δείχνει ότι μαζί με PD2 mRNA, υπάρχει επίσης μία μείωση στην στάθμη CHD1 mRNA σε PD2 siRNA επεξεργασμένα κύτταρα PANC1, υποδεικνύοντας ότι hPaf1 ρυθμίζει την έκφραση CHD1 τόσο στα επίπεδα μεταγραφής και μεταφράσεως (Εικ. S1 Α). Παράλληλα, η υπερέκφραση του PD2 σε ΗΡΑΡ /CD18 καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα απορυθμίζει επίσης έκφραση CHD1 (Σχ. S1B). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι hPaf1 /PD2 ρυθμίζει την έκφραση της πρωτεΐνης χρωματίνης αναδιαμόρφωσης CHD1, υποδηλώνοντας τον πιθανό ρόλο της στην αναδιάταξη της δομής της χρωματίνης κατά την διάρκεια επιμήκυνσης μεταγραφής σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western δείχνει μια μειωμένο επίπεδο της πρωτεΐνης CHD1 σε PC κύτταρα κατά RNAi που προκαλείται αναστολή hPaf1 /PD2. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Το γράφημα παρακάτω κάθε σχήμα κηλίδος western αντιπροσωπεύει τα αντίστοιχα αποτελέσματα ποσοτικού προσδιορισμού για ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές. (Β) ανάλυση ανοσοφθορισμού δείχνει μειωμένο επίπεδο hPaf1 /PD2 (πράσινο), μαζί με αντίστοιχη μείωση του επιπέδου CHD1 (κόκκινο) σε κύτταρα επεξεργασμένα PC PD2 siRNA σε σύγκριση με ομελέτα siRNA επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

hPaf1 /PD2 αλληλεπιδρά με CHD1 τόσο στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των κυττάρων καρκίνου του παγκρέατος

επαναμοντελοποίηση χρωματίνης πρωτεΐνης CHD1 είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρά με τους παράγοντες επιμήκυνσης μεταγραφής και εντοπίζονται σε ενεργά μεταγράφεται γονίδια [31]. Στη ζύμη, CHD1 λειτουργίες κατά τη διάρκεια της επιμήκυνσης της μεταγραφής μέσω αλληλεπιδράσεων με παράγοντες επιμήκυνσης, Spt4-Spt5 και Spt16-Pob3. Είναι ενδιαφέρον, CHD1 βρίσκεται επίσης να αλληλεπιδρά με το Rtf1 υπομονάδα του συμπλόκου PAF ζυμομύκητα που συσχετίζει με RNA πολυμεράση II και ρυθμίζει επιμήκυνσης μεταγραφής [31]. Αν και η Rtf1 είναι παρούσα στον άνθρωπο, δεν είναι ως μέρος του συγκροτήματος ΗΡΑΡ. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε την πιθανότητα ότι ο hPaf1 /PD2 υπομονάδας του ανθρώπινου συμπλόκου PAF αλληλεπιδρά με CHD1 χρησιμοποιώντας μελέτες συν-ανοσοκαταβύθισης. Η ανάλυση στυπώματος Western των συν-ανοσοκαταβυθίσματα δείχνει ότι PD2 αλληλεπιδρά με CHD1 τόσο κυτταρόπλασμα καθώς και πυρηνικά εκχυλίσματα από παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, PANC1 και MiaPaCa (Εικ. 4). Αναλύσαμε περαιτέρω την αλληλεπίδραση μεταξύ PD2 και CHD1 με μελέτες συν-εντοπισμό χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία (Εικ. 5Α). Η χρώση CHD1 (κόκκινο) βρέθηκε να επικαλύπτονται με τη χρώση PD2 (πράσινο), τόσο στο κυτταρόπλασμα όσο και στον πυρήνα των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων σε επιβεβαίωση με τα βιοχημικά δεδομένα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι PD2 και CHD1 αλληλεπιδρούν και περαιτέρω συμμετάσχουν στην δομή της χρωματίνης αναδιαμόρφωση σε καρκίνο του παγκρέατος.

(Α) Κυτταροπλασματικά και κλασματοποίηση πυρηνικό εκχύλισμα διεξήχθη σε PANC1 και MiaPaCa παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που ακολουθείται από την αμοιβαία συν-ανοσοκαταβύθιση των ενδογενών πρωτεΐνες στα κλάσματα κυττάρων. Η ανάλυση στυπώματος Western δείχνει ότι hPaf1 /PD2 αλληλεπιδρά με CHD1 στις δύο κυτταροπλασματικά και πυρηνικά εκχυλίσματα PANC1 και MiaPaCa καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα. Anti-PD2 ανοσοϊζήματα από εκχυλίσματα κυττάρων PANC1 και MiaPaCa ανοσοστυπώθηκαν με ένα αντι-CHD1 αντισώματος. Παρομοίως, αντι-CHD1 ιζήματα στυπώθηκαν με αντι-PD2 αντίσωμα. IgG Κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Η

(Α) και PANC1 MiaPaCa κύτταρα επιμολύνθηκαν με περιπλεγμένο και PD2 RNAi ολίγο και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση ανάλυση ανοσοφθορισμού διεξήχθη. Ομοεστιακή εικόνες δείχνουν ότι υπάρχει μειωμένη εντοπισμός του CHD1 στον πυρήνα (μπλε, χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ) του PD2 KD καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα (μεσαίο πλαίσιο) σε σύγκριση με τα κωδικοποιημένα κύτταρα (άνω πλαίσιο). Τα κύτταρα περαιτέρω επαναμολύνθηκαν με ρΒΑΒΕ-hygro PD2 κατασκεύασμα για έκτοπη έκφραση της PD2, 72 ώρες μετά την επιμόλυνση intital. Ομοεστιακή εικόνες απεικονίζουν προσθήκη εξωγενών PD2 reshuttles CHD1 πίσω στον πυρήνα (κάτω πίνακας). Το ένθετο αντιπροσωπεύει PD2 και CHD1 εντοπισμού στον πυρήνα (χρωματίστηκαν με DAPI).