Αφηρημένο

ανθρώπινων καρκίνων που υπερεκφράζουν

mdm2

, μέσω ενός Τ στη διακύμανση G σε ένα μόνο νουκλεοτίδιο πολυμορφισμού στη θέση 309 (

mdm2

SNP309), έχουν λειτουργικά αδρανοποιημένο p53 που δεν αποικοδομείται αποτελεσματικά. Έχουν επίσης υψηλή έκφραση του εναλλακτικά ματισμένων μεταγραφής,

MDM2-C

. Εναλλακτικά ματισμένες

Οι mdm2

μεταγραφές εκφράζονται σε πολλές μορφές καρκίνου στον άνθρωπο και όταν είναι εξωγενώς εκφράζονται μετατρέπουν ανθρώπινα κύτταρα. Ωστόσο, καμία μελέτη μέχρι σήμερα δεν έχει ανιχνευθεί ενδογενής ισομορφές της πρωτεΐνης MDM2. Οι μελέτες με εξωγενή έκφραση των παραλλαγών ματίσματος πραγματοποιήθηκε με

MDM2-A

και

MDM2-Β

, αλλά το

MDM2-C

ισομορφή έχει παραμείνει σχεδόν ανεξερεύνητη. Εμείς απευθύνεται η κυτταρική επίδραση της εξωγενώς εξέφρασε MDM2-C, και με ρώτησε αν ενδογενής πρωτεΐνη MDM2-C ήταν παρούσα σε ανθρώπινους καρκίνους. Για την ανίχνευση της ενδογενούς πρωτεΐνης MDM2-C, δημιουργήσαμε ένα ανθρώπινο αντίσωμα MDM2-C στη διασταύρωση επιτόπου ματίσματος του εξώνια τέσσερις και δέκα (MDM2 C410) και επικύρωσε το αντίσωμα με το

in vitro

μεταφραστεί πλήρους μήκους MDM2 σε σύγκριση με MDM2 -ΝΤΟ. Είναι ενδιαφέρον, ανακαλύψαμε ότι MDM2-C συν-μεταναστεύει με MDM2-FL σε περίπου 98 kDa. Χρησιμοποιώντας την επικυρωμένη αντίσωμα C410, ανιχνεύσαμε υψηλή έκφραση του ενδογενούς MDM2-C σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και τους ανθρώπινους ιστούς καρκίνου. Στην υποδοχέα οιστρογόνου θετικό (ER +)

mdm2

G /G SNP309 καρκίνου του μαστού κυτταρική γραμμή, T47D, παρατηρήσαμε μια αύξηση στην ενδογενή πρωτεΐνη MDM2-C με τη θεραπεία με οιστρογόνα. MDM2-C εντοπισμένη στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα. Εξετάσαμε την βιολογική δραστικότητα της MDM2-C με εξωγενώς εκφράζουν την πρωτεΐνη και παρατήρησε ότι MDM2-C δεν στοχεύουν αποτελεσματικά ρ53 για την αποικοδόμηση ή την μείωση της δραστηριότητας της μεταγραφικής ρ53. Η εξωγενής έκφραση MDM2-C σε

ρ53

-null ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα αυξημένο σχηματισμό αποικιών, υποδεικνύοντας ρ53-ανεξάρτητη ογκογονικές ιδιότητες. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ένα ρόλο για MDM2-C που δεν απαιτεί την αναστολή της p53 για την αύξηση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση

Παράθεση:. Οκόρο DR, Arva Ν, Gao C, Polotskaia Α, Puente C, M Rosso , et al. (2013) ενδογενούς ανθρώπινου MDM2-C εκφράζεται εντόνως σε καρκίνους του ανθρώπου και λειτουργεί ως ρ53-ανεξάρτητη Activator Ανάπτυξης. PLoS ONE 8 (10): e77643. doi: 10.1371 /journal.pone.0077643

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 του Νοεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 12 Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 11, Οκτωβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Οκόρο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (MCB- 0744316), επιχορήγηση από το στήθος Ίδρυμα Έρευνας για τον Καρκίνο, και επιχορήγηση από την Κλινική Μεταγραφική Science Center (CTSC) TR000457 του Εθνικού Κέντρου για την Προώθηση της Tranlsational Επιστημών του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας να J. Bargonetti. Είναι επίσης δυνατή εν μέρει από ένα βραβείο υποδομή για να Hunter College, αριθμός επιχορήγηση MD007599 από το Εθνικό Ινστιτούτο για Μειονότητας υγείας και της υγείας ανισότητες, ένα συστατικό των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (NIH). Το περιεχόμενό του είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις της NIMHD ή ΝΙΗ. ΚΆΝΩ. υποστηρίχθηκε εν μέρει από ένα βραβείο CUNY μαγνήτη και Μ.Κ. υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα εκθέσεις MBR-RISE να Hunter College 3R25-GM060665. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ογκογόνο δραστικότητα της MDM2 συνδέεται με υπερ-έκφραση της πρωτεΐνης MDM2 σε ανθρώπινους καρκίνους [1-3]. Ενώ ορισμένες ισομορφές ΜΌΜ2 μπορούν να σχηματίσουν μια άμεση φυσική σύνδεση με p53 άλλοι δεν το κάνουν [3,4]. MDM2 ρυθμίζει την πρωτεΐνη p53 μέσω του πρωτεασώματος με τη μεσολάβηση της υποβάθμισης [5-10] και μεταγραφική καταστολή [5,11-14]. Αυτό το p53-μεσολάβηση ογκογόνο δράση του MDM2 καλύτερα αναφέρεται ως MDM2 κανονικές λειτουργίες. Ωστόσο, MDM2 είναι επίσης γνωστό ότι κατέχουν ρ53-ανεξάρτητη λειτουργίες [15-19] που είναι οι πλέον αναφέρονται ως MDM2 μη κανονικά λειτουργίες.

Η υπερ-έκφραση της MDM2 οφείλεται σε ένα μόνο νουκλεοτίδιο πολυμορφισμός θυμίνης σε γουανίνη (Τ έως G) στη θέση 309 από το

MDM2

γονίδιο (

mdm2

SNP309) σχετίζεται με αυξημένη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου και επιθετικότητα [20-23]. Αυτό το

MDM2

αλλαγή SNP309 νουκλεοτιδίων αυξάνει τη συγγένεια δέσμευσης για την συστατική παράγοντα μεταγραφής, Sp1 [21]. Κύτταρα ομόζυγα για το G /G

mdm2

SNP309 έχουν ενισχυθεί

επίπεδα mdm2

μεταγραφής και πρωτεϊνών υψηλής MDM2. MDM2 υπερ-έκφραση σε καρκίνους συχνά συνοδεύεται με την υπερ-έκφραση του εναλλακτικού ματίσματος

mdm2

μεταγραφές [3,24-28]. Πάνω από 40 εναλλακτικά και έκτροπα συγκολλημένα ανθρώπινη

mdm2

μεταγραφές έχουν αναφερθεί, δεν είναι όμως όλοι είναι το οστό fide αποτέλεσμα των εναλλακτικών γεγονότων ματίσματος [29]. Δεν αντέχουν, το

mdm2

παραλλαγές ματίσματος αντιπροσωπεύουν το δυναμικό ποικιλομορφίας που συμφωνεί με τα πορίσματα της Encyclopedia of DNA Elements (ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ) του έργου Κοινοπραξία. ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ αναδεικνύει προηγουμένως μη αναγνωρισμένα ρυθμιστικά στοιχεία υποψήφιος, και κωδικοποιημένα μηνύματα, στο ανθρώπινο γονιδίωμα [30]. Η ποικιλομορφία των

mdm2

ματιστεί μηνύματα που κωδικοποιούνται από δύο ανεξάρτητα υποκινητές έχει την ικανότητα να αυξήσει την ανθρώπινο καρκίνο πρωτεώματος [31]. Επομένως, δεν είναι έκπληξη το γεγονός ότι

mdm2

κύτταρα SNP309 εμφανίζουν αυξημένη ποικιλομορφία στο εναλλακτικό μάτισμα

mdm2

μεταγραφές τους με ουσιαστική έκφραση του

MDM2-C

μεταγραφής [32].

Παρά το γεγονός ότι πάνω από το 40

mdm2

εναλλακτικό μάτισμα μεταγραφές έχουν εντοπιστεί [29], μόνο πέντε, (

MDM2-Α

μέσω

MDM2-E

) έχουν δειχθεί ότι εκφράζουν πρωτεΐνη

in vitro

[3]. Η έκφραση αυτών των πέντε

mdm2

μεταγραφές προκαλεί τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 να σχηματίσουν σχετίζονται με όγκους εστιών [3]. Ωστόσο, μόνο δύο ισομορφές πρωτεΐνης, MDM2-Α και Β, έχουν μελετηθεί εκτενώς για τις βιολογικές τους λειτουργίες. Η εξωγενής έκφραση του ΜΌΜ2-A [33,34], ή MDM2-Β σε ποντικούς [35], αυξάνει το σχηματισμό όγκου σε ένα

p53

-null, ή p53-παραβιαστεί φόντο προκαλώντας μια αλλαγμένη φάσματος όγκων. Ωστόσο, η βιολογική λειτουργία της MDM2-C παραμένει απροσδιόριστο.

Ρωτήσαμε αν τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα του

MDM2-C

mRNA εκφράζεται ενδογενής πρωτεΐνη MDM2-C. Υποθέσαμε ότι οι υψηλές

MDM2-C

επίπεδα μεταγραφής που κωδικοποιείται από το αλληλόμορφο G

mdm2

SNP309 σε ανθρώπινους καρκίνους θα μπορούσε να οδηγήσει σε υψηλά επίπεδα της ενδογενούς πρωτεΐνης MDM2-C και θα προσέδιδε ογκογόνο λειτουργίες. Κύτταρα με MDM2 υπερ-έκφραση μέσω του G /G

mdm2

SNP309 έχουν σταθερή πρωτεΐνη ρ53, η οποία είναι συν-εντοπισμένα με p53 στην χρωματίνη [14]. Έτσι, υποθέσαμε ότι MDM2 υπερ-έκφραση μέσω του G /G SNP309 μπορεί να παράγει μια πρωτεΐνη ισομορφή MDM2-C που δεν θα υποβαθμίσει p53. Ως εκ τούτου, στόχος μας ήταν να προσδιοριστεί η κυτταρική λειτουργία των εξωγενώς εκφράζονται MDM2-C. Ζητήσαμε, επίσης, εάν τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα του

MDM2-C

mRNA, εξέφρασε επίσης την ενδογενή πρωτεΐνη MDM2-C.

Η ενδογενής έκφραση πρωτεΐνης MDM2-C δεν έχει ποτέ ανιχνευθεί λόγω της απουσίας αντισωμάτων που ανιχνεύουν ειδικά τις ισομορφές MDM2 που κατασκευάστηκαν από τα mRNA εναλλακτικής συρραφής. Η

MDM2-C

μεταγραφής δεν περιέχει εξόνια 5 έως 9, το οποίο κωδικοποιεί ένα τμήμα της περιοχής ρ53 δέσμευσης. Δημιουργήσαμε ένα ειδικό αντίσωμα σχεδιασμένο να ανιχνεύει τα αμινοξέα που κωδικοποιούνται από παράπλευρες MDM2-C εξόνια 4 και 10, οι οποίες ονομάσαμε C410. Χρησιμοποιώντας αυτό το MDM2 αντίσωμα παρατηρήσαμε υψηλά βασικά επίπεδα του ενδογενούς πρωτεΐνης MDM2-C σε διάφορα MDM2 υπερεκφράζουν κυτταρικές γραμμές καρκίνου και ιστών. Παρατηρήσαμε επίσης ότι, με την παρουσία ή απουσία ρ53, εξωγενώς εκφράζεται MDM2-C προάγει αυξημένο σχηματισμό αποικιών. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ενδογενής MDM2-C εκφράζεται σε καρκίνους και ότι λειτουργίες MDM2-C ανεξάρτητα από ρ53 για την προώθηση της ογκογένεσης.

Αποτελέσματα

MDM2 υπερ-κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα των μεταγραφών mdm2-C

Πολλές ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές υπερεκφράζουν πρωτεΐνη MDM2 και έχουν χρησιμοποιηθεί για προηγούμενες μελέτες MDM2 [14,21,32,36,37]. Χρησιμοποιήσαμε αυτές τις κυτταρικές γραμμές να εξετάσει την αναλογία του

MDM2-C

μεταγραφές πλήρους μήκους

mdm2

μεταγραφές. Οι κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν περιλαμβάνουν δύο υψηλής εκφραστές MDM2: SJSA-1 κυττάρων με άγριου τύπου

p53

και υπερέκφραση του MDM2 λόγω

ενίσχυση MDM2

γονιδίου (και το

mdm2

SNP309 T /T αλληλόμορφα) και τα κύτταρα MANCA με άγριου τύπου

p53

και υπερ-έκφραση MDM2 από το

mdm2

SNP309 G /G αλληλόμορφα. Περιλαμβάνουν, επίσης, δύο χαμηλά εκφραστές MDM2: το κυτταρική σειρά Κ562 που είναι

p53

-null και έχει ένα

mdm2

SNP309 T /G αλληλόμορφα και τα κύτταρα ML-1 με άγριου τύπου ρ53 και η

mdm2

SNP309 T /T αλληλόμορφα.

Η μεταγραφή του

MDM2-C

αξιολογήθηκε με ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (qRT-PCR) και ανάλυση κηλίδος Northern (βλέπε Εικόνα 1 και Εικόνα S1). Η ποσοτικοποίηση της συνολικής

mdm2

μεταγραφές, με ανάλυση κηλίδος Northern, κατέδειξε το υψηλότερο επίπεδο

mdm2

μεταγραφές σε SJSA-1 κύτταρα, τα οποία περιέχουν 25 αντίγραφα του

mdm2

γονίδιο [37]. Ένα υψηλό επίπεδο

mdm2

μεταγραφής παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα MANCA. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό ειδικά μεταγραφές που περιέχουν εξόνια 6 και 7, διενεργήσαμε qRT-PCR με ποσοτικό καθετήρα στη διασταύρωση εξόνιο 6-7 (Εικόνα 1Β βλέπε ανιχνευτή σε πράσινο και το Σχήμα 1C μαύρες μπάρες). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό ειδικά

MDM2-C

μεταγραφές, χρησιμοποιήσαμε ένα έναυσμα PCR σχεδιαστεί για να αναγνωρίσει το εξώνιο 4 και εξόνιο 10, διασταύρωση (που ονομάζεται 4:10) και ένα αντίστροφο εκκινητή για εξώνιο 12 (Σχήμα 1Β, βλέπε εκκινητές σε κόκκινο, και το Σχήμα 1C γκρι μπάρες). Σε κύτταρα MANCA, ανιχνεύσαμε την έκφραση χαμηλού επιπέδου του

mdm2

μεταγραφή που περιέχει εξώνια 6 και 7, από εδώ και πέρα ​​αναφέρεται ως

mdm2

πλήρους μήκους μεταγραφή (Σχήμα 1C). Σημαντικά, τα κύτταρα MANCA είχε έκφραση υψηλού επιπέδου του

MDM2-C

μεταγραφή με αποτέλεσμα χαμηλότερη αναλογία πλήρους μήκους για

MDM2-C

μεταγραφή (Σχήμα 1C, MANCA συγκρίνετε μαύρο σε γκρι μπαρ). Αυτό ήταν σε αντίθεση με

mdm2

μεταγραφή σε SJSA-1 κύτταρα, τα οποία παράγουν παρόμοια επίπεδα του

MDM2-C

και

mdm2

μεταγραφές πλήρους μήκους (Σχήμα 1C, SJSA -1 συγκρίνετε μαύρο σε γκρι μπάρες). Χαμηλά επίπεδα

mdm2

μεταγραφές παρήχθησαν σε κύτταρα Κ562 και επομένως αυτά τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως normalizer κυτταρική γραμμή. κύτταρα ML-1 έδειξαν παρόμοια

mdm2

επίπεδα μεταγραφής σε Κ562. Αυτό έδειξε ότι η υπερ-έκφραση της MDM2 πρωτεΐνης σε SJSA-1 κύτταρα και τα κύτταρα MANCA συσχετίζεται με υψηλά επίπεδα του

MDM2-C

μεταγραφής. Επιπλέον, τα κύτταρα MANCA είχε την υψηλότερη αναλογία

MDM2-C

σε πλήρους μήκους μεταγραφή. Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να οφείλεται στο

mdm2

SNP309 G /G γονότυπο που οδηγεί μεταγραφή από το διεγέρσιμο Ρ2 προαγωγό

.

Η

Α. Η ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας Image J μετά από ανάλυση κηλίδος Northern του RNA από δείγματα χωρίς θεραπεία MANCA, SJSA-1, ML-1 και Κ562 κυττάρων. Ένα

mdm2

ανιχνευτή DNA στο εξώνιο 12 PCR που δημιουργούνται και ραδιοσημασμένο με α

32Ρ dCTP. επίπεδα Απομαγνητοφώνηση συγκρίθηκαν με Κ562 για τη βασική έκφραση και κανονικοποιημένα για τα επίπεδα του RNA να

GAPDH

. Ένας μέσος όρος τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν το τυπικό σφάλμα.

Β. Σχηματική

mdm2

μηνύματα ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή Taqman για εξώνια 6 και 7 (6-7 καθετήρα) ή προς τα εμπρός έναυσμα για 4:10 και αντίστροφο εκκινητή για 12 (4: 10-12 αστάρι) για

MDM2-C

.

Γ. qRT-PCR με 4:10 προς τα εμπρός και το εξώνιο 12 αντίστροφης εναντίον καθετήρας Taqman στο εξώνιο 6 και 7 του

mdm2

διεξήχθησαν για την ανίχνευση

MDM2-C

και

mdm2

(με εξώνια 6 και 7) μεταγραφές. Η

MDM2-C

μεταγραφές ανιχνεύτηκαν μέσω Syber Πράσινο και

mdm2

(με εξώνια 6 και 7) μεταγραφές ανιχνεύτηκαν μέσω της τεχνολογίας Taqman. επίπεδα Απομαγνητοφώνηση συγκρίθηκαν με Κ562 για τη βασική έκφραση και κανονικοποιημένα για τα επίπεδα του RNA να

GAPDH

. Ένας μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν το τυπικό σφάλμα.

Δ. qRT-PCR του RNA χρησιμοποιώντας Taqman τεχνολογία από γονίδια στόχους ρ53,

ρ21

και

πούμα

μετά τη θεραπεία της βλάβης του DNA με 8μΜ ετοποσίδη επί 3 ώρες. Τα δεδομένα από κάθε κυτταρική γραμμή παρουσιάζεται ως κανονικοποιείται στη δική μη επεξεργασμένο δείγμα ελέγχου για πλάσια ενεργοποίηση και κανονικοποιημένα για τα επίπεδα του RNA να

GAPDH

. Ένας μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν το τυπικό σφάλμα.

Η

Για να δούμε αν το

mdm2

πλήρους μήκους για

mdm2 C-

αναλογία μεταγραφή επηρέασε την ανταπόκριση p53, συγκρίναμε η ενεργοποίηση των δύο γονιδίων στόχων p53,

p21

και

puma

. Εμείς αντιμετωπίζονται Κ562, ML-1, SJSA-1 και MANCA κυττάρων με ετοποσίδη να ξεκινήσει μια απάντηση βλάβες στο DNA, και να παρακολουθείται

p21

και

puma

ενεργοποίηση από qRT-PCR (Σχήμα 1D). Όπως ήταν αναμενόμενο, η

p21

και

puma

γονίδια δεν ενεργοποιούνται σε

p53

-null Κ562 κύτταρα. Στα SJSA-1 και MANCA κύτταρα, τα οποία έχουν άγριου-τύπου ρ53 και υψηλή MDM2, το

ρ21

και

πούμα

γονιδίων απέδειξαν ενεργοποίηση διακυβεύεται γονίδιο σε σύγκριση με την ενεργοποίηση ανιχνεύθηκε σε ML-1 κύτταρα , με κύτταρα MANCA αποδεικνύοντας την δραστικότητα τουλάχιστον ρ53 (Σχήμα 1 D).

Mdm2

εναλλακτικά συγκολλημένα προϊόντα, όπως

MDM2-Β

αυξάνουν μετά από βλάβη του DNA [38-40]. Για να προσδιορίσετε αν το

MDM2-C

μεταγραφή προκλήθηκε από p53, τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ετοποσίδη αναλύθηκαν από qRT-PCR για

MDM2-C

. Τα κύτταρα ML-1 ανταποκρίθηκαν στην ετοποσίδη θεραπεία με μια ισχυρή αύξηση του

MDM2-C

επίπεδα μεταγραφής (Εικόνα S2, κόκκινη γραμμή). Παραβιασμένος ρ53-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της

MDM2-C

παρατηρήθηκε στις SJSA-1 και MANCA κύτταρα παρόμοια με κίνδυνο ενεργοποίησης που παρατηρείται για

Puma

(Εικόνα S2 και σχήμα 1Δ). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η ρ53 μεταγραφική δραστηριότητα επηρεάστηκε σε υπερ-εκφράζοντα κύτταρα MDM2 και τα υψηλά επίπεδα της βασικής τους

MDM2-C

(ειδικά σε κύτταρα MANCA) ήταν ρ53-ανεξάρτητη.

Επικύρωση MDM2-C Ειδικό Αντίσωμα

Για να προσδιορίσετε αν το υψηλό επίπεδο των

MDM2-C

μεταγραφές στο MDM2 υπερ-κυττάρων που εκφράζουν μεταφράστηκε σε πρωτεΐνη, δημιουργήσαμε ένα MDM2-C ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα. Εμείς ανοσοποιημένα κουνέλια με μια πεπτιδική αλληλουχία που περιέχει την αλληλουχία αμινοξέων της ανθρώπινης εξονίου 4 προς διασταύρωση ματίσματος 10 (Εικόνα 2Α). Το πεπτίδιο ήταν εξαιρετικά ανοσογόνος και το αντίσωμα ελέγχθηκε ως προς την ειδικότητα χρησιμοποιώντας το

in vitro

μεταφραστεί πρωτεΐνες MDM2 σε εκχύλισμα φύτρου σιταριού. Τόσο MDM2-C, και MDM2-FL, μπορεί να μεταφραστεί

in vitro

σε πρωτεΐνη [3,41]. Η προσθήκη του

35S μεθειονίνη στο σύστημα μας επέτρεψε να ανιχνεύσουν ταχέως τα ειδικά σημασμένων πρωτεϊνών MDM2 χρησιμοποιώντας αυτοραδιογραφία (Σχήμα 2Β). Το

35S μεθειονίνη επισημασμένο MDM2-C και πρωτεΐνες MDM2-FL μετανάστευσαν σε SDS-PAGE σε μεγέθη προσδιορίζονται προηγουμένως (περιγράφεται ως υψηλότερη της προβλεπόμενης μεγέθη των 36 kDa και 55 kDa, αντίστοιχα) [41,42]. Η βραδύτερη κινητικότητα του MDM2 σε SDS-PAGE έχει προηγουμένως αποδοθεί στη μεγάλη όξινη περιοχή της πρωτεΐνης [42].

Α. Σχηματική πλήρους μήκους MDM2 (MDM2-FL) και MDM2-C. Οι βιοχημικές λειτουργικές περιοχές των πρωτεϊνών διατηρείται «παρουσιάζεται ως χρωματικούς κώδικες. Η πεπτιδική αλληλουχία που χρησιμοποιείται ως ένα ανοσογόνο που περιέχει το διασταύρωση ματίσματος του ανθρώπινου MDM2-C φαίνεται. Γλυκίνη (G) και κυστεΐνη (C) υπολείμματα προστέθηκαν στο Ν-τελικό άκρο του πεπτιδίου για να διευκολύνει σύζευξη προς ένα ανοσοαντιδραστική πρωτεΐνη, αιμοκυανίνη πεταλίδας (KLH).

Β.

35S μεθειονίνη χρησιμοποιήθηκε ως πηγή ραδιενέργειας στην ετικέτα

στο

vitro

μεταφραστεί πρωτεΐνες.

Σε

vitro

μεταφράσεις pcDNA3-MDM2-FL και pcDNA3-P2mdm2-C, χρησιμοποιώντας το ΤΝΤ συζευγμένο σύστημα εκχυλίσματος φύτρου σιταριού. Τα προκύπτοντα MDM2-FL και MDM2-C πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκαν σε Α10% SDS-PAGE σε μία αναλογία 5: 1: 1. Η πηκτή μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και εκτέθηκαν σε φιλμ για σημαντικές MDM2-C ανίχνευση πρωτεϊνικό προϊόν. Φύτρο σιταριού λύμα χωρίς DNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας.

Γ. Ανοσοκαταβύθιση

35S μεθειονίνη ραδιενεργά σημασμένο

στο

vitro

μεταφραστεί MDM2-FL και MDM2-C πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας MDM2 C410 και προ-ανοσοποιητικό πολύκλωνα αντισώματα στον ορό. αναλογίες πρωτεΐνης όπως δείχνεται στο Β χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση καθέλκυσης. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 10% πήκτωμα SDS-PAGE μεταφέρθηκε σε μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και εκτέθηκαν σε φιλμ για την ανίχνευση των πρωτεϊνών. Αυτό είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Δ.

Σε

vitro

μεταφραστεί πρωτεΐνη που παράγεται στο λύμα δικτυοερυθροκυττάρων κουνελιού (RRL λωρίδες 1 και 2) σε σύγκριση με την πρωτεΐνη που μεταφράζεται σε εκχύλισμα φύτρου σιταριού (WGE λωρίδες 3 και 4). Αυτές οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με είτε 4B11 αντίσωμα (άνω πάνελ) ή 2A9 (κάτω πίνακας). HRP-συζευγμένο αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα.

Η

Για την επικύρωση περαιτέρω η εξειδίκευση του αντισώματος MDM2-C, θα πραγματοποιηθεί ένα πείραμα ανοσοκατακρήμνισης του εκχυλίσματος φύτρου σίτου em

in vitro

μεταφραστεί

35S ραδιοσημασμένου MDM2-C και MDM2-FL προϊόντα πρωτεΐνης. Το πολυκλωνικό αντίσωμα MDM2 C410 τραβηχτεί προς τα κάτω MDM2-C (Σχήμα 2C, συγκρίνετε διαδρομές 3 και 8), αλλά όχι MDM2-FL (Σχήμα 2C, συγκρίνετε διαδρομές 4 και 9). Επιπλέον, MDM2-C και MDM2-FL

in vitro

μεταφράζονται πρωτεΐνες ανοσοκαταβυθίστηκαν με χρήση του πολυκλωνικού αντισώματος MDM2 C410 και αναλύθηκαν με western blot με MDM2 μείγμα μονοκλωνικό αντίσωμα. Μόνο η πρωτεΐνη MDM2-C ανιχνεύθηκε (Σχήμα S3, συγκρίνετε λωρίδες 2 και 3).

Για να αντιμετωπιστούν πιο διεξοδικά τη διαφορική μετακίνηση του MDM2-C και MDM2-FL, συγκρίναμε την ανοσο-αντιδραστικότητα του

in vitro

μεταφραστεί πρωτεΐνες γίνονται τόσο δικτυοερυθροκυττάρων κουνελιού λύμα (RRL) και το εκχύλισμα φύτρου σιταριού (WGE) συστήματα. Όταν οι πρωτεΐνες μεταφράζονται

in vitro

, είναι μετα-μεταφραστικά τροποποιημένο από τους παράγοντες που εκπροσωπούνται στο σύστημα κυτταρικό εκχύλισμα. Όπως είχε προβλεφθεί, το C-τερματικό μονοκλωνικό αντίσωμα 4B11 ανιχνεύεται MDM2-C και ισομορφές MDM2-FL ενώ το αντίσωμα 2A9, με στόχο την κεντρική περιοχή, ανιχνεύθηκε μόνο MDM2-FL (Εικόνα 2D, συγκρίνετε κορυφής και πυθμένα πάνελ για λωρίδες 1 και 3 έναντι λωρίδες 2 και 4). Είναι ενδιαφέρον ότι η MDM2-C που παράγεται στο σύστημα RRL θηλαστικών οδήγησε σε υψηλή έκφραση τρία διαφορικά μεταναστεύουν είδη σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE με μια μορφή συν-μεταναστεύει με MDM2-FL σε περίπου 98 kDa (Εικόνα 2D, συγκρίνετε λωρίδα 1 έως λωρίδα 2 ). Εξετάσαμε περαιτέρω τις δυνητικές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις του MDM2-C σε ανθρώπινα κύτταρα (και τη μετανάστευση των MDM2-C σε περίπου 98 kDa) με τη χρησιμοποίηση ενός HeLa

in vitro σύστημα μετάφρασης

από την Pierce (Σχήμα 3Α και 3Β ). Είναι σημαντικό ότι, σε αυτό το σύστημα, ανιχνεύσαμε επίσης μια μορφή MDM2-C σε περίπου 98 kDa. Τα δεδομένα μας δείχνουν σαφώς ότι ορισμένες της πρωτεΐνης ισομορφή MDM2-C που παράγεται σε αυτόν τον ανθρώπινο σύστημα συν-μεταναστεύει με MDM2-FL. Παρέχοντας έτσι αποδείξεις ότι η ανίχνευση του MDM2 από αντισώματα που μπορεί να αλληλεπιδράσει με το πλήρους μήκους και ματισμένες ισομορφές παραλλαγή θα έχει ως αποτέλεσμα τουλάχιστον μερικά συν-μεταναστεύουν πολυπεπτίδια σε μια κηλίδα western. Είναι ενδιαφέρον ότι, χρησιμοποιώντας το σύστημα HeLa, εμείς για πρώτη φορά, να ανιχνεύεται κάποια πρωτεΐνη MDM2-C στην προβλεπόμενο μοριακό βάρος 36 kDa (Σχήμα 3Β λωρίδα 1).

Ανοσοκαθίζηση χρησιμοποιώντας MDM2 C410 και προ-ανοσοποιητικό πολύκλωνα αντισώματα ορού με HeLa

στο

vitro

μεταφραστεί MDM2-C εκχυλίσματα χρήση προ άνοσοι οροί, MDM2 C410 και Ν-20 πολυκλωνικών αντισώματα. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση επάνω σε ένα 10% πήκτωμα SDS-PAGE εις διπλούν. A. Το ένα ήμισυ χρωματίστηκε με Coomassie blue για την ανίχνευση πρωτεΐνης. B. Τα δείγματα από το ήμισυ του πηκτώματος μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και MDM2 ανιχνεύθηκε με το μονοκλωνικό αντίσωμα 4B11. HRP-συζευγμένο αντι-ποντικού χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα. Τα βέλη απεικονίζουν πρωτεΐνη MDM2-C.

Η

MDM2-C πρωτεΐνη εκφράζεται ενδογενώς

Αν και εναλλακτικό μάτισμα

mdm2

μηνύματα έχουν ανιχνευθεί σε καρκίνους, δεν υπάρχει τεκμηρίωση για ενδογενώς παραγόμενα πολυπεπτίδια από τέτοια μηνύματα . Συγκρίναμε την συν-μεταναστεύουν φύση του MDM2-C και MDM2-FL χρησιμοποιώντας τη μεταβλητή ανοσοαντιδραστικότητα των εκχυλισμάτων ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων ανιχνεύθηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα MDM2 C410 (για την ανίχνευση του MDM2-C) με τα ίδια εκχυλίσματα ανιχνεύθηκαν με το MDM2 παν-αντιδραστικό ποντικού μονοκλωνικό αντίσωμα 4B11 (για την ανίχνευση του MDM2-C και MDM2-FL). Υψηλά επίπεδα έκφρασης MDM2 παρατηρήθηκαν σε MANCA και εκχυλίσματα SJSA-1 κυττάρου με 4B11 αντίσωμα (Σχήμα 4Α, λωρίδες 9 και 10). κύτταρα MANCA παρήγαγε την υψηλότερη έκφραση MDM2-C όταν ανιχνεύεται με C410 (Σχήμα 4Α, λωρίδα 1). Το πολυκλωνικό αντίσωμα MDM2 C410 μόλις ανιχνευθεί MDM2-C σε ML-1 κύτταρα (Σχήμα 4Α, λωρίδα 3). Ωστόσο, αναγνωρίζεται πρωτεΐνη MDM2-C στα κυτταρικά εκχυλίσματα από κύτταρα Κ562, τα οποία είναι κύτταρα γονότυπο G /T, καθώς και σε SJSA-1 κύτταρα που έχουν γονιδιακή ενίσχυση (Σχήμα 4Α, λωρίδες 2 και 4). Η έκφραση του MDM2-C σε ML-1 κύτταρα και τα κύτταρα MANCA συσχετίζεται με την βασική μεταγραφή του

MDM2

πλήρους μήκους και

MDM2-C

(σύγκρινε Σχήμα 1Γ Σχήμα 4Α). Για λόγους που παραμένουν ασαφείς, μια συγκεκριμένη συσχέτιση μεταξύ των

mdm2

μεταγραφές και ισομορφές της πρωτεΐνης MDM2 δεν ήταν εμφανής για SJSA-1 κύτταρα και κύτταρα Κ562. Αυτό μπορεί να οφείλεται στην αναλογία του MDM2-FL πρωτεΐνης στον ματισμένη παραλλαγή, και την επακόλουθη Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης μεσολάβηση αποικοδόμηση των πρωτεϊνών που MDM2 μειωμένη σταθερότητα της πρωτεΐνης.

A. Ανάλυση κηλίδας Western ολόκληρων κυτταρικών εκχυλισμάτων από: MANCA, SJSA-1, ML-1 και Κ562 κύτταρα. επίπεδα πρωτεΐνης MDM2-C αναλύθηκαν μέσω MDM2 C410 πολυκλωνικά αντισώματα ορού (C410, λωρίδες 1-4) και η συνολική MDM2 ανιχνεύθηκε με το μονοκλωνικό 4B11 (διαδρομές 9-12 και μακρά έκθεση για λωρίδα 12). Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Προ άνοσο πολυκλωνικός ορός χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. HRP-συζευγμένο αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα. Αυτό είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Bi. κύτταρα MANCA λύθηκαν είτε ως εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων (ΔΚΕ) ή σε κυτταρικό compartments- του κυτταροπλάσματος (CYTO) και χρωματίνης (CHR). Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν όπως στο επίπεδα πρωτεΐνης Α MDM2-C αναλύθηκαν μέσω αντισωμάτων MDM2 C410 πολυκλωνικό ορό (C410, λωρίδες 1-3) και η συνολική MDM2 ανιχνεύθηκε με το μονοκλωνικό 4B11 (λωρίδες 1-9 και μακρά έκθεση για λωρίδα 9).

BII. Τουμπουλίνης και Fibrillarin χρησιμοποιήθηκαν για να δείξουν την αποτελεσματική κυτταρική κλασμάτωση του εκχυλίσματος.

Γ. Κλωστήρια δίσκο ομοεστιακό μικροσκόπιο των κυττάρων MANCA. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, κατέστησαν διαπερατά και επωάστηκαν με p53, MDM2 C410 και προ-άνοσο πολυκλωνικά αντισώματα ορού. Τα πλακίδια επωάστηκαν με δευτερεύον Alexa-συζευγμένο γίδινο αντι-κουνελιού και συζευγμένη με FITC κατσίκας αντι-ποντικού. DAPI χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των κυτταρικών πυρήνων. Εικόνες ελήφθησαν σε 60X μεγέθυνση. Τα βέλη υποδεικνύουν περιοχές της Mdm2-C πρωτεΐνη πυρηνικού εντοπισμού.

Η

Η υψηλή έκφραση του ΜΌΜ2-C σε κύτταρα MANCA πρότεινε ότι η πρωτεΐνη θα είναι σαφώς ανιχνεύσιμη στα κυτταρικά διαμερίσματα. Εξετάσαμε τον εντοπισμό της ενδογενούς MDM2-C χρησιμοποιώντας μεθόδους κυτταρικής κλασμάτωσης (Σχήμα 4Β) και περιστρεφόμενο δίσκο συνεστιακή μικροσκοπία (Σχήμα 4C). Χρησιμοποιώντας μεθόδους χρωματίνη κλασματοποίησης, ανιχνεύσαμε MDM2-C στο κυτταρόπλασμα και στο χρωματίνης (Εικ. 4Bi, λωρίδες 1-3) και η πλειοψηφία των ισομορφών MDM2 ανιχνεύονται με 4B11 ήταν στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 4Bi, λωρίδες 7-9 ). Εξωγενώς εκφράζεται ισομορφές MDM2-Α και MDM2-Β έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι εμφανίζουν πυρηνικό εντοπισμό [43], παρά το γεγονός ότι οι περιοχές που κωδικοποιούν τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού και εξαγωγής MDM2 συγκολλημένα έξω. Παρομοίως, MDM2-C, η οποία έχει επίσης αυτές οι περιφέρειες συγκολλημένα έξω, εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα αυτών των αιμοποιητικών κυττάρων (σύγκρινε DAPI και χρωματίστηκαν περιοχή αντισώματος στο Σχ. 4Ci-ΙΙΙ ανιχνεύθηκαν με C410 και το Σχήμα 4Cvi-VIII ανιχνεύθηκαν με προ-άνοσο ορό κουνελιού). κύτταρα MANCA εκφράζουν υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης ρ53 άγριου τύπου [14], και παρατηρήσαμε κάποια συν-εντοπισμό των πρωτεϊνών ρ53 και ΜΌΜ2-C στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα, όπως υποδεικνύεται από το κίτρινο χρώμα συγχώνευση (Εικ. 4CV). Ενώ η σημασία της συν-εντοπισμό δεν είναι άμεσα κατανοητός, πιστεύουμε ότι είναι μια σημαντική παρατήρηση. Τα κόκκινα βέλη δείχνουν την ισχυρή χρώση του αντισώματος που αντιπροσωπεύει μια συνεπή παρακολούθηση της πρωτεΐνης εντοπίζεται στην διακριτική πυρηνική περιοχές (Εικ. 4Ciii και 4CV). Από MANCA αιμοποιητικά κύτταρα είναι μικρά και δεν έχουν πολύ κυτταρόπλασμα, ήταν δυνατό ότι αυτό που εμφανίστηκε κυτταροπλασματική ήταν στην περιφέρεια του πυρήνα. Επομένως, εξετάσαμε εντοπισμός MDM2-C σε επιθηλιακά κύτταρα του καρκίνου του μαστού και παρατηρήθηκε επίσης πυρηνικά και κυτταροπλασματικά MDM2-C εντοπισμού (Σχήμα 5C).

A. MCF-7 και T47D κύτταρα αναπτύχθηκαν και κατεργάστηκαν με 10ηΜ οιστρογόνου (Ε2) για πέντε ημέρες. Τα κύτταρα λύθηκαν και οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν μέσω Western blot. MDM2 C410 αντίσωμα αντι-κουνελιού πολυκλωνικό ορό χρησιμοποιήθηκε για ανίχνευση της πρωτεΐνης. Προ-ανοσο πολύκλωνο ορό χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση σήματος υποβάθρου. HRP-συζευγμένο αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Αυτό είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Bi. MCF-7 και T47D κύτταρα λύθηκαν για ολόκληρο κύτταρο ή χρωματίνη εκχυλίσματα κλασμάτωση. 50μg των δειγμάτων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας 10% SDS-PAGE και MDM2 C410 πολυκλωνικών ορών (λωρίδες 1 – 6), και το μονοκλωνικό αντίσωμα MDM2, 4B11 (διαδρομές 13 – 18) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της πρωτεΐνης. Προ άνοσο χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση σήματος υποβάθρου (λωρίδες 7 – 12). Δευτερογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ίδια όπως στο Α

BII. Τουμπουλίνης και Fibrillarin χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η καθαρότητα κλασμάτωση.

Γ. Spinning μικροσκοπία δίσκος των MCF-7 και T47D κύτταρα. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 ηΜ Ε2 για πέντε ημέρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και επωάστηκαν με αντίσωμα ρ53 και πολυκλωνικό αντίσωμα Mdm2 C410 για ανίχνευση πρωτεΐνης. Προ-άνοσος ορός χρησιμοποιήθηκε ως ένας αρνητικός έλεγχος για χρώση. Τα πλακίδια επωάστηκαν με δευτερεύον Alexa-συζευγμένο γίδινο αντι-κουνελιού και συζευγμένη με FITC κατσίκας αντι-ποντικού. DAPI χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων. Τα κύτταρα έγιναν ορατά σε 60X μεγέθυνση. Τα βέλη απεικονίζουν MDM2-C περιοχές εντοπισμού.

Η

MDM2-C αυξάνει με την θεραπεία με οιστρογόνα και εντοπίζεται σε διαφορετικές εστίες στικτή στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα του καρκίνου του μαστού ER + κυττάρων

MDM2 είναι αυξημένα μετά από αγωγή με οιστρογόνα του υποδοχέα οιστρογόνου θετικό (ER + ) κύτταρα καρκίνου του μαστού [36]. Επιπλέον,

mdm2

knockdown σε θεραπεία οιστρογόνου κύτταρα καρκίνου του μαστού ως αποτέλεσμα μια μείωση στον πολλαπλασιασμό, παρέχοντας έτσι αποδείξεις για τη σημασία της MDM2 σε αύξηση καρκινικού κυττάρου μαστού. Η υπερ-έκφραση της MDM2 σχετίζεται με αυξημένη

mdm2

ματισμένη παραλλαγή μεταγραφές [3,24-28]. Επομένως, εξετάσαμε την έκφραση πρωτεΐνης MDM2-C σε δύο κυτταρικές γραμμές καρκίνου του μαστού ER +, MCF-7 και T47D, που διαθέτουν διαφορετικούς γονότυπους για

mdm2

SNP30

9

(T /G έναντι G /G αντίστοιχα) και

ρ53

(άγριου-τύπου έναντι μεταλλαγμένης αντίστοιχα). Παρατηρήσαμε μια ελαφρά αύξηση στην πρωτεΐνη MDM2-C μετά τη θεραπεία με οιστρογόνα από MCF-7 και T47D κύτταρα (διαδρομές Σχήμα 5Α 2 και 4). Ο λόγος για τη διαφορά στο μοριακό βάρος των ισομορφών MDM2-C μπορεί να οφείλεται σε διαφορές σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις σε λύματα ολόκληρων κυττάρων. Η προ ανοσοορού πολυκλωνικό αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος υπόβαθρο για το αντίσωμα MDM2 C410 και οδήγησε σε σχεδόν καμία ανίχνευση πρωτεΐνης (Εικόνα 5Α διαδρομές 5-8). Επιπλέον, σε κύτταρα Τ47ϋ, το

MDM2-C

μήνυμα αυξήθηκε δύο φορές μετά τη θεραπεία με οιστρογόνα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εμείς κλασματώθηκαν τα κύτταρα και εξετάστηκαν κυτταροπλασματική και χρωματίνη κλάσματα για πρωτεΐνη MDM2-C (Σχ. 5Bi για C410, προ του ανοσοποιητικού και του ποντικού μονοκλωνικού 4B11 αντιδραστικότητα κουνέλι και το Σχ. 5Bii για δείκτες καθαρότητας κλάσμα). Η κυτταροπλασματική κλάσμα δεν περιείχε χρωματίνης όπως είναι εμφανές από την απουσία χρώσης fibrillarin και κάθε κλάσμα έδειξε κάποια MDM2-C αντιδρώσα πρωτεΐνη (Εικ. 5Bi λωρίδες 2 και 5). Είναι ενδιαφέρον ότι, το κλάσμα χρωματίνη από κύτταρα MCF-7 έδειξαν μια ισχυρή MDM2-C αντιδραστικά είδη και λιγότερο 4B11 αντιδρώσα πρωτεΐνη (Εικ. 5Bi, συγκρίνετε διαδρομές 3 και 15).

Για να καθοριστεί εάν οιστρογόνα θεραπεία επηρέασε τον εντοπισμό του MDM2-C σε MCF-7 και T47D κύτταρα, διενεργήσαμε immunoflouresence. Η MDM2-C σε MCF-7 ανιχνεύθηκε σε ένα πρότυπο διάχυτης και στικτή κυτταροπλασματική και πυρηνική εντόπιση πριν και μετά τη θεραπεία με οιστρογόνα (Σχ. 5Cii και 5Cvii). Παρά πολύ μικρή ανιχνεύσιμη ρ53 στα κύτταρα MCF-7 (Σχ. 5Civ και 5Cix), η κυτταροπλασματική p53 εμφανίστηκε να συν-εντοπίζεται με την MDM2-C, ως συν-χρώση ανιχνεύθηκε ως κίτρινο σήμα συγχώνευσης (Σχ. 5CV και 5Cx ).

Η οπτικοποίηση του MDM2-C με immunoflouresence στα κύτταρα T47D, πριν και μετά τη θεραπεία με οιστρογόνα, εμφανίζεται παρόμοια χρώση για κύτταρα MCF-7 (Σχ. 5Cxii και 5Cxvii). Ωστόσο, τα κύτταρα T47D δεν έδειξε συν-εντοπισμό των μεταλλαγμένων ρ53 και ΜΌΜ2-C (Σχ. 5Cxv και 5Cxx). Ο λόγος για αυτή τη διαφορά στην συν-εντοπισμό για MCF-7 κύτταρα και τα κύτταρα T47D μπορεί να ενυπάρχει στο γεγονός ότι αυτές οι κυτταρικές γραμμές έχουν άγριου-τύπου έναντι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες ρ53 αντίστοιχα. Πολλοί εξωγενώς εκφράζεται MDM2 ματισμένες ισομορφές δεν αλληλεπιδρούν με ρ53 [43,44] και είναι γνωστό ότι splice έξω την πλειοψηφία της περιοχής ρ53 δέσμευσης [29]. Παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα T47D εκφράζεται κυρίως πυρηνική μεταλλαγμένη ρ53 (Σχ. 5Cxiv και 5Cxix) ενώ τα κύτταρα MCF-7 εκφράζουν χαμηλά επίπεδα κυτταροπλασματικής και πυρηνικής ρ53 άγριου τύπου [45].

MDM2-C εκφράζεται εντόνως σε λιποσάρκωμα και καρκίνωμα του μαστού ιστούς

έκφραση υψηλού MDM2 παρατηρείται συχνά σε λιποσαρκώματα και χρησιμοποιείται σήμερα ως ένα διαγνωστικό βιοδείκτη καρκίνο [46-49]. Ήμασταν ενδιαφέρονται για την εξέταση αν το αντίσωμα C410 θα ήταν χρήσιμο να εξεταστεί MDM2-C ως βιοδείκτη λιποσάρκωμα σε δείγματα ασθενών. Χρησιμοποιήσαμε ανοσοϊστοχημεία (IHC) για τη δοκιμή για έκφραση MDM2-C σε ανθρώπινο λιποσάρκωμα ιστού από δείγματα ασθενή άνθρωπο. Για αναλύθηκαν δύο από τα τρία σύνολα δειγμάτων, θετική χρώση για MDM2-C παρατηρήθηκε (αντιπροσωπευτική εικόνα που φαίνεται στο Σχήμα 6Α). Η προ ανοσοποιητικό ορό ανιχνεύεται χαμηλή χρώση υπόβαθρο και όταν εξετάσαμε ιστούς λίπωμα, ανιχνεύθηκε μόνο χαμηλά χρώση θετική MDM2-C. Έχουμε αρχίσει παρόμοιες μελέτες χρησιμοποιώντας τον καρκίνο του μαστού ιστό μικρο-συστοιχίες και έχουν εντοπιστεί MDM2-C στην επεμβατική πορογενές καρκίνωμα (Εικόνα 6Β). Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία, παρατηρήθηκε ένα παρόμοιο μοτίβο χρώσης των θετικών ιστών με MDM2 C410 και MDM2 4B11 αντίσωμα (Σχ. 6Bii και 6Bii), ενώ IgG ποντικού δεν οδηγεί σε χρώση ιστού (Σχ. 6Biii).

A. Ανοσοϊστοχημεία των λίπωμα και το λιποσάρκωμα ιστούς χρησιμοποιώντας MDM2 C410 και προ-ανοσοποιητικό πολύκλωνα αντισώματα στον ορό. Βιοτινυλιωμένο δευτερογενές αντίσωμα, το αντιδραστήριο ABC και DAB από Vector Labs χρησιμοποιήθηκαν. Εικόνες ελήφθησαν σε 20Χ και μεγέθυνση 40x. H & amp? Ε αναφέρεται σε αιματοξυλίνη και ηωσίνη αντιχρωματισμός.