Abstract

Αυξημένη γλουταθειόνη (GSH) και θειορεδοξίνη (Τγχ) μεταβολισμός είναι μηχανισμοί που είναι ευρέως εμπλέκεται στην αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία. Η τρέχουσα μελέτη προσδιορίζεται εάν ταυτόχρονη αναστολή της GSH και του μεταβολισμού Τγχ ενισχυμένη κυτταρική θανάτωση κυττάρων λαιμού ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (HNSCC) ανθρώπινο κεφάλι και μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει το οξειδωτικό στρες. Αναστολή της GSH και του μεταβολισμού Τγχ με μπουθειονίνης σουλφοξιμίνη (BSO) και αουρανοφίνη (AUR), αντίστοιχα, προκάλεσε σημαντικές μειώσεις στην κλωνογονική επιβίωση σε σύγκριση με κάθε φάρμακο μόνο σε FaDu, Cal-27 και SCC-25 HNSCC κύτταρα

in vitro

και

in vivo

στο Cal-27 ξενομοσχεύματα. BSO + AUR αυξηθεί σημαντικά η γλουταθειόνη και την οξείδωση θειορεδοξίνης και κατέστειλε peroxiredoxin δραστηριότητα

in vitro

. Προ-θεραπεία με Νακετυλοκυστεΐνη αντιστραφεί εντελώς BSO + AUR που προκαλείται θανάτωσης κυττάρων σε FaDu και Cal-27 κύτταρα, ενώ η καταλάση και τα συμπληρώματα σεληνίου μόνο ανέστειλε BSO + AUR που προκαλείται θανάτωση κυττάρων σε κύτταρα FaDu. BSO + AUR μειωμένη δραστηριότητα κασπάσης 3/7 σε κύτταρα HNSCC και μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα τόσο Βαχ /Bak διπλό knockout (ϋΚΟ) και ϋΚΟ-Βαχ ανασυσταθεί αιμοποιητικών κυττάρων υποδηλώνοντας ότι νέκρωση είχε εμπλακεί. BSO + AUR και ευαισθητοποιημένων σημαντικά FaDu, Cal-27, SCC-25 και κύτταρα SQ20B στην καταστροφή κυττάρων που προκαλείται από τον αναστολέα του EGFR Η erlotinib

in vitro

. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι η ταυτόχρονη αναστολή της γλουταθειόνης και το μεταβολισμό Trx οδούς προκαλεί το οξειδωτικό στρες και κλωνογονικού δολοφονία στο HNSCCs και αυτή η στρατηγική μπορεί να είναι χρήσιμη στην ευαισθητοποίηση HNSCCs με αναστολείς του EGFR

Παράθεση:. Sobhakumari Α, Αγάπη-Homan L , Fletcher EVM, Martin SM, Parsons μ.Χ., Spitz DR, et al. (2012) Ευαισθησία του Ανθρώπου καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κύτταρα σε συνδυασμένη αναστολή της γλουταθειόνης και θειορεδοξίνη του μεταβολισμού. PLoS ONE 7 (10): e48175. doi: 10.1371 /journal.pone.0048175

Επιμέλεια: Jinah Choi, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Merced, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 του Ιουνίου 2012? Αποδεκτές: 21 Σεπτέμβρη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 31 Οκτώβρη, 2012

Copyright: © 2012 Sobhakumari et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Επιχορηγήσεις K01CA134941 (ALS), R01CA133114 και P30CA086862 (DRS), καθώς και τα Τμήματα της Παθολογίας και της Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας στο Πανεπιστήμιο της Αϊόβα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η επίκτητη αντίσταση στη χημειοθεραπεία είναι ένα σημαντικό εμπόδιο για την επιτυχία της κεφαλής και του τραχήλου πλακώδες καρκίνωμα (HNSCC) θεραπεία. ασθενείς με πρώιμο στάδιο HNSCC έχουν υψηλό κίνδυνο να αναπτύξουν δευτερογενείς όγκους, ακόμη και μετά τοπικός έλεγχος επιτυγχάνεται [1] – [3]. Ως εκ τούτου, η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που σχετίζονται με την αντίσταση στην χημειοθεραπεία σε καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να οδηγήσει σε βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών

Αυξημένη γλουταθειόνη (GSH) και θειορεδοξίνη (Τγχ) μεταβολισμός είναι μηχανισμοί που έχουν ευρέως εμπλακεί σε αντίσταση χημειοθεραπεία [4] – [7] και τα δύο από αυτά τα μονοπάτια του μεταβολισμού παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) αποτοξίνωση [ ,,,0],8] – [11]. Το σύστημα λειτουργεί GSH μέσω της γλουταθειόνης υπεροξειδάσης (GPx) Τα ένζυμα, οι οποίες απενεργοποιούν H

2O

2 και άλλων υδροϋπεροξείδια (συμπεριλαμβανομένων αλκυλο και λιπιδικών υπεροξειδίων) με μετατροπή της GSH σε γλουταθειόνη δισουλφίδιο (GSSG), η οποία μετατρέπεται πίσω σε GSH με γλουταθειόνη αναγωγάση (GR) με χρήση NADPH ([12], Σχήμα 1Α). Το σύστημα Trx εμπλέκεται στην αποτοξίνωση H

2O

2 και υδροϋπεροξείδια μέσω της δράσης της peroxiredoxins (Prx). Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, οξειδωμένα Τγχ (Trx [S

2]) σχηματίζεται η οποία ανάγεται στη συνέχεια με θειορεντοξίνη αναγωγάση (TR) χρησιμοποιώντας επίσης αναγωγικά ισοδύναμα από NADPH (Σχήμα 1Α [13])

Α.: NADPH είναι μια πηγή αναγωγικών ισοδυνάμων για το σύστημα της γλουταθειόνης που αποτελείται από ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH), γλουταθειόνη δισουλφίδιο (GSSG), γλουταθειόνη υπεροξειδάσης (GPx), και αναγωγάση γλουταθειόνης (GR) και το σύστημα θειορεδοξίνης που αποτελείται από ελαττωμένη θειορεδοξίνης [Τγχ (SH)

2], θειορεδοξίνη δισουλφίδιο [Τγχ (S

2)], peroxiredoxin (Prx), και αναγωγάση της θειορεδοξίνης (TR). BSO αναστέλλει γ-glutamylcysteine ​​λιγάσης (GCL), το οποίο καταλύει την αντίδραση μεταξύ κυστεΐνης και L-γλουταμινικού για να σχηματίσει γ-γλουταμυλ-κυστεΐνη. συνθετάση της γλουταθειόνης (GS) μετατρέπει γ-GCS σε GSH. AUR αναστέλλει τη δράση της TR. FaDu, Cal-27 και SCC-25 κύτταρα κατεργάστηκαν με 0,5 μΜ AUR ή /και 1 mM BSO επί 24 ώρες και αναλύθηκαν για ολική GSH (Β) και δραστηριότητα TR (C). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) της Ν = 3 πειράματα *, p & lt?. 0,05 έναντι ελέγχου

Η

Πολυάριθμες μελέτες κατά τη διάρκεια των ετών έχουν διερευνηθεί στρατηγικές ατομικά αναστέλλοντας GSH ή ο μεταβολισμός Trx σε Εκτός από συμβατικούς παράγοντες χημειοθεραπείας, αλλά απέδωσαν ποικίλα αποτελέσματα [14] – [16] πιθανώς οφείλεται στις περιττές προστατευτικές λειτουργίες των συστημάτων αυτών [17] – [20]. Δεδομένου ότι και τα δύο συστήματα αποτοξινώσει H

2O

2 και χρησιμοποιούν NADPH ως αναγωγικά ισοδύναμα, είναι λογικό ότι και τα δύο συστήματα GSH και Trx έχουν επικαλύψεις και περιττές λειτουργίες στην αποτοξίνωση των ROS. Για να ξεπεραστεί η πλεονασμού σε αυτές τις πορείες που σχετίζονται με την αντίσταση σε θεραπεία σε HNSCC, η τρέχουσα μελέτη προσδιορίζεται η επίδραση του συγχρόνως αναστέλλουν τόσο την GSH και Τγχ μεταβολισμό χρησιμοποιώντας σουλφοξιμίνη μπουθειονίνης (BSO? Ένας αναστολέας της σύνθεσης GSH), και αουρανοφίνη (AUR? ένας αναστολέας της δραστικότητας TR

in vitro

και

in vivo

. η στρατηγική αυτή βρέθηκε να είναι πολύ αποτελεσματικό στην ενίσχυση της θανάτωσης οξειδωτικό στρες με τη μεσολάβηση των κυττάρων του όγκου και την ενίσχυση της ευαισθησίας στην erlotinib χημειοθεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

κύτταρα και συνθήκες καλλιέργειας

FaDu, κύτταρα Cal-27 και SCC-25 ανθρώπινα κεφαλής και λαιμού πλακώδους καρκινώματος (HNSCC) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA). κύτταρα SQ20B HNSCC [21] ήταν ένα δώρο από τον Δρ Anjali Gupta (Τμήμα Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας, Το Πανεπιστήμιο της Αϊόβα). Όλες οι HNSCC κυτταρικές σειρές ήταν p53 μεταλλαγμένα. κύτταρα HNEpC ελήφθησαν από Promocell (Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Όλες οι κυτταρικές σειρές επικυρώνονται από την ΑΤΟΟ για βιωσιμότητα (πριν από την κατάψυξη και μετά την απόψυξη), την ανάπτυξη, τη μορφολογία και isoenzymology. Τα κύτταρα αποθηκεύονται σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή και να χρησιμοποιηθεί σε μια πορεία που δεν υπερβαίνει τους 3 μήνες μετά την ανάνηψη των κατεψυγμένων δειγμάτων. Bax /Bak διπλό νοκ-άουτ (ϋΚΟ) και DKO-Bax ανασυσταθεί αιμοποιητικών κυττάρων ποντικού ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Δρ Craig Thompson (University of Pennsylvania, Philadelphia, PA). FaDu, Cal-27 και SQ20B κύτταρα διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) που περιέχει 4 mM L-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 1,5 g /L διττανθρακικό νάτριο και 4,5 g /L γλυκόζη με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS ? Hyclone, Logan, UT). SCC-25 κύτταρα διατηρήθηκαν σε ένα μίγμα 1:01 του Dulbecco τροποποιημένο μέσο του Eagle και μέσο Ham F12 που περιέχει 1.2 g όξινου ανθρακικού /L νάτριο, 2,5 mM L-γλουταμίνη, 15 mM HEPES, 0,5 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 4,5 g /L γλυκόζη, και 400 ng /mL υδροκορτιζόνη με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. ΫΚΟ και ϋΚΟ-Βαχ κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 U /mL πενικιλλίνη, 100 g /mL στρεπτομυκίνη και 50 μΜ 2-μερκαπτοαιθανόλη. κύτταρα HNEpC διατηρήθηκαν σε Airway Επιθηλιακά Μέσο Ανάπτυξης (Promocell) που περιέχει 4 μL /mL βόεια εκχύλισμα υπόφυσης, 10 ng /mL επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, 5 μg /mL ινσουλίνη, 0.5 μg /mL υδροκορτιζόνη, 0,5 μg /mL επινεφρίνης, 6,7 ng /mL τριϊωδο-L-θυρονίνη και 0,1 ng /mL ρετινοϊκό οξύ. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 και υγραίνεται σε ένα επωαστή 37 ° C.

Drug Θεραπεία

Pegylated καταλάσης (CAT), σταυροσπορίνη (STS), ιονομυκίνη (ΙΟΝ) και L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (BSO) ελήφθησαν από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ). Αουρανοφίνη (AUR) λήφθηκε από ICN Biochemicals (Aurora, ΟΗ). Erlotinib (ΕΡΠ) στην αγορά ως Tarceva και Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC) στην αγορά ως Acetadote (Cumberland Pharmaceuticals, Nashville TN), ελήφθησαν από την ενδονοσοκομειακή φαρμακείο στο Πανεπιστήμιο της Αϊόβα Νοσοκομεία και Κλινικές. Όλα τα φάρμακα χρησιμοποιήθηκαν χωρίς περαιτέρω καθαρισμό. Φάρμακα προστέθηκαν στα κύτταρα σε τελικές συγκεντρώσεις 1 mM BSO, 0.5 μΜ AUR, 20 mM NAC, 1000 U /mL CAT, 10 μΜ ERL, 10 μΜ STS και 100 μΜ ιόντων. BSO, CAT, και SEL διαλύθηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). AUR, STS, ΕΡΠ και ΙΟΝ διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). Ο απαιτούμενος όγκος του κάθε φαρμάκου προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας των κυττάρων σε κύτταρα για να επιτευχθούν οι επιθυμητές τελικές συγκεντρώσεις. έλεγχοι οχήματος είχαν περιληφθεί σε κάθε πείραμα.

δοκιμασία γλουταθειόνης

Η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH) και γλουταθειόνη δισουλφίδιο (GSSG) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας εμπορική γλουταθειόνης (Cayman Chemical, Αηη Arbor, ΜΙ) . Όλοι οι προσδιορισμοί γλουταθειόνη κανονικοποιήθηκαν προς την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του πλήρους ομογενοποιημάτων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford.

Δοκιμασία αναγωγάσης της θειορεδοξίνης

αναγωγάση της θειορεδοξίνης (TR) δραστηριότητα προσδιορίσθηκε φασματοφωτομετρικά χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ δοκιμασίας θειορεδοξίνης αναγωγάσης (Cayman Χημικός, Ann Arbor, MI). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με την μέθοδο Bradford.

Βιωσιμότητας Κυττάρων

Κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Prestoblue ™ την Κυτταρική Βιωσιμότητα (Invitrogen, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

κλωνογόνος πειράματα κυτταρικής επιβίωσης

κλωνογονιδιακή επιβίωση προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Ατομικές δοκιμασίες διεξήχθησαν με πολλαπλές αραιώσεις με τουλάχιστον τέσσερα κλωνοποίηση πιάτα ανά σημείο δεδομένων, επαναλαμβάνονται σε τουλάχιστον 3 ξεχωριστά πειράματα.

siRNA Επιμόλυνση

αναγωγάση της θειορεδοξίνης (TR) και ελέγχου siRNA αγοράστηκαν από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). κύτταρα HNSCC επιμολύνθηκαν με 20 ηΜ siRNA σε 80% συρροή σε αετού μειωμένο ορό Minimum Essential Medium (ΕΜΕΜ, Santa Cruz, CA) για 24 ώρες. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκε για επιμολύνσεις ακόλουθα πρωτόκολλα που παρέχονται από τον κατασκευαστή. Βιοχημικές αναλύσεις διεξήχθησαν 48-72 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Caspase 3/7 Δραστηριότητα

Caspase 3/7 δραστικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ApoTox-Glo ™ Triplex (Promega Corporation, Madison WI) .

Thioredoxin οξειδοαναγωγής κηλίδες Western

Thioredoxin στυπώματα Western διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [22] – [25]. Τα κύτταρα επωάστηκαν με είτε 2 mM dl-διθειοθρεϊτόλη (DTT) ή 2 mm H

2O

2 για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πριν από την επώαση με 50 mM ΙΑΑ που πρέπει να χρησιμοποιούνται ως μάρτυρες για να βοηθήσουν στην ταυτοποίηση των θειορεδοξίνης οξειδοαναγωγική κατάσταση ζώνες.

αναγωγάσης της γλουταθειόνης (GR) Δοκιμασία

δραστηριότητα GR μετρήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από Mavis και Stellwagen [26]. Δεδομένα ομαλοποιήθηκε ανά mg πρωτεΐνης, όπως καθορίστηκε με τον προσδιορισμό πρωτείνης Lowry.

υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPx) Δραστηριότητα

Σελήνιο εξαρτώμενη δραστικότητα GPx μετρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Δεδομένα ομαλοποιήθηκε ανά mg πρωτεΐνης, όπως καθορίστηκε με τον προσδιορισμό πρωτείνης Lowry.

Peroxiredoxin Δραστηριότητα Δοκιμασία

δραστηριότητα

2-Cys-Peroxiredoxin μετρήθηκε όπως περιγράφηκε [28]. Εν συντομία, ο αρχικός ρυθμός της οξείδωσης του NADPH παρακολουθήθηκε φασματοφωτομετρικά στα 340 nm στους 30 ° C σε ένα μίγμα αντίδρασης (150 μL) που περιείχε 50 mM Hepes-NaOH (ρΗ 7.0), 0.25 mM NADPH, 46 ηΜ TR, 2,4 mM Τγχ και 0.13 mm H

2O

2. Η αντίδραση άρχισε με την προσθήκη H

2O

2 και παρακολουθήθηκε για 10 λεπτά.

καταλάση Δοκιμασία Δραστηριότητα

δραστικότητα CAT μετρήθηκε σε ομογενοποιήματα κυττάρου με παρακολούθηση της εξαφάνισης του 10 mmol /LH

2O

2 σε 50 mmol /L φωσφορικού καλίου (ρΗ = 7,0) φασματοφωτομετρικά στα 240 nm. Δραστηριότητες εκφράστηκαν σε μονάδες mk /mg πρωτεΐνης, όπως περιγράφεται [29].

όγκου εμφύτευση κυττάρων

Γυναίκα ηλικίας 4-5 εβδομάδων αθυμικά-nu /nu γυμνά ποντίκια αγοράστηκαν από Harlan Laboratories (Indianapolis , ΣΕ). Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε ένα δωμάτιο φράγμα παθογόνο-ελεύθερο στην μονάδα φροντίδας ζώων του Πανεπιστημίου της Αϊόβα και ο χειρισμός χρησιμοποιώντας άσηπτες διαδικασίες. Όλες οι διαδικασίες εγκρίθηκαν από την επιτροπή IACUC του Πανεπιστημίου της Αϊόβα και σύμφωνη με τις κατευθυντήριες γραμμές που καθορίζονται από το NIH. Οι ποντικοί αφέθηκαν τουλάχιστον 3 ημέρες για να εγκλιματιστούν πριν από την έναρξη του πειραματισμού, και τροφή και νερό έγιναν ελεύθερα διαθέσιμα. Τα κύτταρα όγκου εμβολιάσθηκαν σε γυμνά ποντίκια με υποδόρια ένεση κλάσματα 0,1 mL φυσιολογικού ορού που περιέχει 4 × 10

6 Cal 27-κυττάρων στο δεξί πλευρό χρησιμοποιώντας βελόνες 26-gauge.

μετρήσεις του όγκου

στις

in vivo πειράματα

ποντικοί ξεκίνησαν θεραπεία απεξάρτησης 1 εβδομάδα μετά τον εμβολιασμό του όγκου με μέσο όγκο του όγκου με 0.025 εκατοστά

3. Τα ποντίκια αξιολογήθηκαν καθημερινά και οι μετρήσεις του όγκου λαμβάνεται τρεις φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας καλίμπρες Vernier. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο: όγκος όγκου = (μήκος Χ πλάτος

2) /2, όπου το μήκος ήταν η μακρύτερη διάσταση, και το πλάτος ήταν η διάσταση κάθετη προς το μήκος

in vivo.

χορήγηση φαρμάκων

τα ποντίκια χωρίστηκαν σε 4 ομάδες (n = 6-10 ποντικοί /ομάδα). BSO ομάδα: BSO διελύθη σε φυσιολογικό ορό και χορηγούνται 400 mg /kg ε.π. κάθε ημέρα για 2 εβδομάδες. ομάδα AUR: μητρικό διάλυμα AUR αραιώνεται με φυσιολογικό ορό και χορηγείται ε.π. 1 mg /kg κάθε ημέρα για 2 εβδομάδες. BSO + AUR ομάδα: ποντίκια χορηγήθηκαν 400 mg /kg BSO συν 1 mg /kg ε.π. AUR κάθε δεύτερη ημέρα για 2 εβδομάδες. ομάδα ελέγχου: ποντίκια χορηγήθηκε ένα αλατούχο διάλυμα κάθε μέρα ε.π. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία μέσω ασφυξίας με CO

2 αέριο ή θανατηφόρα δόση πεντοβαρβιτάλης νατρίου (100 mg /kg) όταν διάμετρος του όγκου υπερέβαινε 1,5 cm σε οποιαδήποτε διάσταση.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση ήταν γίνεται χρησιμοποιώντας GraphPad Prism version 5 για Windows (GraphPad Software, San Diego, CA). Οι διαφορές μεταξύ των 3 ή περισσότερα μέσα προσδιορίστηκαν με μονόδρομη ANOVA με Tukey μετα-τεστ. Γραμμικά μοντέλα παλινδρόμησης μικτά αποτελέσματα χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση και τη σύγκριση της ομάδας ειδικού αλλαγή στις καμπύλες ανάπτυξης των όγκων. Όλα στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε στο p & lt?. 0.05 επίπεδο σημαντικότητας

Αποτελέσματα

BSO και AUR μειωμένη σύνθεση και TR δραστηριότητα GSH

BSO και AUR είναι ευρέως γνωστοί αναστολείς της κυτταρική σύνθεση GSH και δραστικότητα TR αντίστοιχα όπως απεικονίζεται στο απλοποιημένο σχηματικό στο Σχήμα 1Α. Για την επιβεβαίωση αυτών των επιδράσεων της BSO και AUR σε κύτταρα HNSCC, εκθετικά αυξανόμενη FaDu, Cal-27 και SCC-25 κύτταρα κατεργάστηκαν με 1 mM BSO ή /και 0,5 μΜ AUR για 24 ώρες και στη συνέχεια αναλύονται για τα συνολικά επίπεδα GSH και δραστικότητα TR. παραγωγή GSH εξαντλήθηκε σημαντικά σε τόσο BSO και BSO + AUR επεξεργασμένα κύτταρα σε όλες τις κυτταρικές σειρές 3, γεγονός που υποδηλώνει ότι η BSO ήταν πράγματι ικανή να αναστέλλει τη σύνθεση GSH (Σχήμα 1Β). BSO επίσης αυξηθεί σημαντικά δραστικότητα TR σε FaDu και SCC-25 κύτταρα και έδειξε μια τάση προς αυξημένη δραστικότητα TR σε Cal-27 κύτταρα (Σχήμα 1 C). Επιπλέον, η δραστικότητα TR αναστάλθηκε σε AUR και BSO + AUR κατεργασμένα κύτταρα που επιβεβαιώνει το μηχανισμό της δράσης του AUR (Σχήμα 1 C). AUR αύξησε επίσης την παραγωγή GSH σε όλες τις 3 κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Β). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η BSO και AUR αναστέλλουν την παραγωγή της γλουταθειόνης και της δραστηριότητας TR θεραπεία αντίστοιχα μετά από 24 ώρες στα κύτταρα HNSCC

in vitro

.

BSO και AUR μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων και κλωνογονική επιβίωση

για τη διερεύνηση των κυτταροτοξικών επιδράσεων BSO και AUR σε κύτταρα HNSCC, η βιωσιμότητα των κυττάρων και κλωνογονική επιβίωση μετά ελέγχθηκαν BSO και θεραπεία AUR σε εκθετικά αυξανόμενη FaDu, Cal-27 και SCC-25 κύτταρα. BSO και AUR σαν απλούς παράγοντες δεν προκάλεσε καμία σημαντική μείωση στην μεταβολική κυτταρική βιωσιμότητα αν και η αύξηση της βιωσιμότητας παρατηρήθηκε με τη θεραπεία με BSO (σε Cal-27 και SCC-25 κύτταρα) και με θεραπεία AUR (σε κύτταρα FaDu, Σχήμα 2Α). Σε αντίθεση, ο συνδυασμός του BSO και AUR μείωσε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα σε όλες τις κυτταρικές σειρές 3 σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες αγωγής (Σχήμα 2Α). Παρομοίως, σημαντική κλωνογονικού θανάτωση των κυττάρων παρατηρήθηκε με το συνδυασμό του BSO και AUR σε όλες τις κυτταρικές σειρές 3 σε σύγκριση με οποιονδήποτε παράγοντα μεμονωμένα υποδηλώνοντας ότι BSO και AUR πρέπει να χρησιμοποιούνται ταυτόχρονα για να επάγει κυτταρική θανάτωση σε κύτταρα HNSCC (Σχήμα 2Β) . Όταν η βιωσιμότητα των κυττάρων σε απόκριση προς BSO + AUR ελέγχθηκε σε διάστημα 24 h, φαίνεται ότι σημαντικές μειώσεις στην βιωσιμότητα των κυττάρων δεν παρατηρήθηκαν μέχρι 16 ώρες (Cal-27 και SCC-25) και 24 ώρες (FaDu) μετά τη θεραπεία (Σχήμα 2C). Αντίθετα, σημαντική μείωση της κλωνογονική επιβίωση σε απόκριση σε BSO + AUR άρχισε να εμφανίζεται αμέσως μόλις 1 ώρα μετά τη θεραπεία σε SCC-25 κύτταρα και 4 ώρες μετά τη θεραπεία σε κύτταρα FaDu (Σχήμα 2D). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν σαφώς ότι οι αλλαγές παρακολούθηση της βιωσιμότητας των κυττάρων ως συνάρτηση του χρόνου δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα επαγόμενη από φάρμακα θανάτωση κυττάρων όπως μετράται από την ικανότητά σχηματισμού αποικίας. Εμείς επιπλέον παρατηρηθεί ότι BSO + AUR επαγόμενη κυτταροτοξικότητα μετρήθηκε με κλωνογόνο προσδιορισμό, ήταν σημαντικά μικρότερη σε κύτταρα HNSCC συρρέοντα όταν συγκρίνονται με εκθετικά αναπτυσσόμενα καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 3Α) υποδηλώνοντας ότι BSO + AUR ήταν πιο αποτελεσματική στην εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα. Επιπροσθέτως, τα κύτταρα FaDu ήταν σημαντικά πιο ευαίσθητα από τα φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα (HNEpCs) για να BSO + AUR μετά από 24 ώρες, γεγονός που υποδηλώνει ότι η BSO + AUR ήταν κατά προτίμηση τοξική για τα κύτταρα HNSCC σε σύγκριση με φυσιολογικά «μη μετασχηματισμένα« κύτταρα (Σχήμα 3Β). Συνολικά, τα αποτελέσματα τόσο στην βιωσιμότητα και κλωνογονικού πειράματα δείχνουν ότι η BSO + AUR φαίνεται να προκαλέσουν περισσότερο από προσθετικό θανάτωση των κυττάρων σε FaDu, Cal-27 και SCC-25 κύτταρα

in vitro

.

FaDu, Cal-27 και SCC-25 κύτταρα κατεργάστηκαν με 0,5 μΜ AUR ή /και 1 mM BSO επί 24 ώρες και αναλύθηκαν για τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Α) και κλωνογόνο επιβίωση κυττάρου (Β). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως αναφέρεται παραπάνω και η βιωσιμότητα (C) και την επιβίωση των κυττάρων κλωνογονικού (D) μετρήθηκαν επί μία περίοδο 8 h (κλωνογονική επιβίωση, [D]) ή 24 ώρες (βιωσιμότητα, [C]). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) Ν = 3 πειράματα. *, P & lt? 0,05 έναντι ελέγχου? ¥, σ & lt? 0,05 έναντι BSO ή AUR

Η

Α:. Εκθετική καλλιέργεια και συρροή FaDu, Cal-27 και SCC-25 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 0,5 μΜ AUR ή /και 1 mM BSO για 24 ώρες και αναλύθηκαν για κλωνογονική επιβίωση. δεδομένα κλωνογονιδιακή επιβίωση των κυττάρων κανονικοποιήθηκαν προς εκθετικά αυξανόμενη και κύτταρα ελέγχου συρρέοντα (δεν φαίνεται). Β: FaDu και HNEpC κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BSO + AUR και ο αριθμός των βιώσιμων συνδεδεμένων κυττάρων μετρήθηκε μετά από 24 ώρες. Αριθμοί βιώσιμων BSO + AUR-επεξεργασμένα κύτταρα κανονικοποιήθηκαν προς τις αντίστοιχες τους ελέγχους τους (CON). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) Ν = 3 πειράματα. *, P & lt? 0,05 έναντι ΛΗΞΗ? ¥, σ & lt?. 0,05 έναντι CON

Η

αναγωγάση της θειορεδοξίνης (TR) νοκ ντάουν ευαισθητοποιημένα κύτταρα FaDu να BSO

Για να επιβεβαιώσετε ότι AUR που προκαλείται από αλλαγές στην κυτταροτοξικότητα οφείλονταν στην καταστολή της δραστηριότητας TR , η έκφραση TR χτυπήθηκε κάτω με siRNA στοχεύουν TR σε κύτταρα FaDu και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς BSO επί 24 ώρες. TR knockdown είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική καταστολή της δραστηριότητας TR (Πίνακας 1) και ευαισθητοποιημένα κύτταρα FaDu να BSO όπως προσδιορίζεται με κλωνογόνο προσδιορισμό (Σχήμα 4). Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν περαιτέρω υποστήριξη για την υπόθεση ότι η αναστολή του μεταβολισμού Trx ευαισθητοποιεί τα κύτταρα HNSCC σε θανάτωση κυττάρων παρουσία αναστολέων του μεταβολισμού της γλουταθειόνης.

έκφραση TR χτυπήθηκε κάτω σε κύτταρα FaDu χρήση siRNA απευθύνονται σε TR και αναλύθηκαν για κλωνογονική επιβίωση με και χωρίς 1 mM θεραπεία BSO επί 24 ώρες. Κλωνογονικού στοιχεία επιβίωσης ομαλοποιήθηκε για τον έλεγχο (CON). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) Ν = 3 πειράματα. *, P & lt? 0,05 έναντι ελέγχου? ¥, σ & lt?. 0,05 έναντι BSO ή SITR

Η

BSO + AUR που προκαλείται από νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο

Η κυτταροτοξική ανταπόκριση των BSO + AUR θα μπορούσε να ανιχνευθεί μορφολογικά χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης . Cal-27 κύτταρα κατεργασμένα με BSO ή /και AUR μόνο για 6 ώρες συνελήφθησαν και αποκολλήθηκαν από τα τρυβλία καλλιέργειας ιστού σε σύγκριση με BSO ή AUR επεξεργασμένα κύτταρα που συνδέθηκαν και φαινόταν άθικτα (Σχήμα 5Α). Οι ίδιες παρατηρήσεις παρατηρήθηκαν σε FaDu και SCC-25 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να καθοριστεί εάν η απόπτωση ή νέκρωση είχε εμπλακεί σε BSO + AUR-κυτταρικό θάνατο που επάγεται, αναλύσαμε δραστικότητα κασπάσης 3/7 σε απόκριση προς BSO ή /και AUR για 24 ώρες σε FaDu και Cal-27 κύτταρα. Κύτταρα κατεργασμένα με σταυροσπορίνη (STS, 10 μΜ, 6 ώρες) και ιονομυκίνη (ΙΟΝ, 100 μΜ, 6 ώρες) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες για απόπτωση και νέκρωση αντίστοιχα. Βρήκαμε ότι AUR σημαντικά αυξημένη δραστηριότητα κασπάσης 3/7 σε σύγκριση με τον έλεγχο επεξεργασμένα κύτταρα σε μόνο Cal-27 κύτταρα (Σχήμα 5Β). Ωστόσο, BSO + AUR μειώθηκε σημαντικά δραστικότητα κασπάσης 3/7 σε FaDu και Cal-27 κύτταρα, τα οποία ήταν συγκρίσιμη με ιονομυκίνη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 5Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι νέκρωση και απόπτωση δεν εμπλέκονται στο μηχανισμό κυτταρικού θανάτου. Προς στήριξη αυτών των αποτελεσμάτων, έχουμε επιπλέον διερευνήθηκε η επίδραση της BSO + AUR για Bax

– /- Bak

– /- διπλό νοκ-άουτ αιμοποιητικών κυττάρων (ϋΚΟ) ποντίκι. Το αποπτωτικό μονοπάτι, καταργείται σε κύτταρα ϋΚΟ με γενετική διαγραφή των προ-αποπτωτικών παραγόντων, Βαχ και Bak καθιστώντας αυτά τα κύτταρα εξαρτώνται από την νέκρωση όταν εκτίθενται σε θανατηφόρες προσβολές [30]. Επίσης χρησιμοποιήσαμε κύτταρα ϋΚΟ που ανασυστάθηκαν με Βαχ (ϋΚΟ-Βαχ) με επιμόλυνση με φορέα που περιέχει Βαχ (pCDNA3 /Bax) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Ανασύσταση του Bax σε κύτταρα ϋΚΟ έχει δειχθεί να αποκαταστήσει την ευαισθησία τους σε αποπτωτικά ερεθίσματα [30], [31]. Παρατηρήσαμε ότι BSO μόνη της δεν επηρέασε την βιωσιμότητα του είτε ϋΚΟ ή κυττάρων ϋΚΟ-Βαχ (Εικόνα 5C). Ωστόσο, ϋΚΟ-Βαχ αλλά όχι τα κύτταρα ϋΚΟ ήταν ιδιαίτερα ευαίσθητα σε αγωγή AUR (Σχήμα 5C), το οποίο υποστηρίζει την προηγούμενη αναφορές ότι AUR επάγει μία αποπτωτική απόκριση [32]. Τόσο ϋΚΟ και ϋΚΟ-Βαχ κύτταρα ήταν πολύ ευαίσθητα σε BSO + AUR που υποδηλώνει ότι νέκρωση ήταν το μονοπάτι κυτταρικού θανάτου που εμπλέκονται στην απόκριση σε BSO + AUR (Σχήμα 5C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι BSO + AUR στις δόσεις και χρόνους επεξεργασίας που χρησιμοποιούνται σε αυτές τις μελέτες που επάγεται νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο

Α:. Εικόνες αντίθεσης φάσης του Cal-27 κύτταρα λήφθηκαν μετά από 6 ώρες θεραπείας με 0.5 μΜ AUR και ή /και 1 mM BSO. Β: FaDu και Cal-27 κύτταρα κατεργάστηκαν με 0,5 μΜ AUR ή /και 1 mM BSO επί 24 ώρες, στη συνέχεια αναλύθηκαν για κασπάσης 3/7 δραστηριότητα χρησιμοποιώντας δοκιμασία φωταύγειας. κατεργασία των κυττάρων με σταυροσπορίνη (STS) και ιονομυκίνη (ΙΟΝ) για 6 ώρες χρησιμοποιήθηκε ως θετικοί μάρτυρες για απόπτωση και νέκρωση αντίστοιχα. Όλες οι θεραπείες κανονικοποιήθηκαν για τον έλεγχο. *, P & lt? 0,05 έναντι ελέγχου? ¥, σ & lt? 0,05 έναντι BSO ή AUR. C: Βαχ /Bak διπλό knockout (ϋΚΟ) κύτταρα και κύτταρα ϋΚΟ με ανασυσταθεί Βαχ (ϋΚΟ-Βαχ) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,05 mM BSO και 2 μΜ AUR για 24 ώρες και στη συνέχεια αναλύθηκαν για τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) Ν = 3 πειράματα. *, P & lt? 0,05 έναντι ελέγχου? ¥, σ & lt? 0,05 έναντι BSO ή AUR? £, σ & lt?. 0,05 έναντι κυττάρων DKO

Η

BSO + AUR που προκαλείται από την οξείδωση της GSH και Trx

Επειδή μια αύξηση στην οξειδωμένη GSSG (% GSSG) πιστεύεται ότι σηματοδοτούν μια στροφή προς ένα πιό ιδιαίτερα οξειδωτικό ενδοκυτταρικό περιβάλλον ενδεικτικό του οξειδωτικού στρες [12], ερευνήσαμε αλλαγές σε% GSSG σε απόκριση σε BSO και AUR. BSO + AUR προκάλεσε μια σημαντική αύξηση σε% GSSG σε σύγκριση με BSO και AUR μόνη της σε κύτταρα FaDu, ενώ τόσο BSO και BSO + AUR αγωγή ομάδες προκάλεσε μια σημαντική αύξηση σε% GSSG σε σύγκριση με τον έλεγχο σε Cal-27 κύτταρα (Σχήμα 6Α). Ανάλυση της θειορεδοξίνης-1 (Τγχ-1) οξειδοαναγωγής πειράματα κηλίδος Western έδειξαν ότι η θεραπεία με BSO + AUR σε κύτταρα FaDu ως αποτέλεσμα μια αύξηση στην οξειδωμένη Τγχ-1 (Trx1 [S

2] και Trx1 [S

2 ]

2) έκφραση, όπως φαίνεται από την αυξημένη έκφραση των άνω 2 ζώνες στο Σχήμα 6Β σύγκριση με τις άλλες ομάδες θεραπείας. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε Cal-27 κύτταρα σε απόκριση στην θεραπεία BSO + AUR, αν και η συνολική ποσότητα του Τγχ (μειωμένη + οξειδώνεται) φάνηκε να είναι μικρότερη από τις άλλες ομάδες αγωγής (Σχήμα 6Β). Πριν αναφορές έχουν δείξει ότι η μείωση της συνολικής έκφρασης Τγχ μπορεί να οφείλεται στο σχηματισμό μεγάλων θειορεδοξίνης μικτών σύμπλοκα πρωτεΐνης δισουλφιδίου που αδυνατούν να εισέλθει στο πήκτωμα κατά την ηλεκτροφόρηση [23]. Επιβεβαιώσαμε αυτό με επώαση BSO + AUR επεξεργασμένα λύματα με DTT ώστε να μειωθούν τυχόν μικτά δισουλφίδια πρωτεΐνης πριν από την ανάλυση για τη μειωμένη και οξειδώνεται Trx1. Βρήκαμε ότι DTT ήταν επιτυχής στη μείωση της οξειδωμένης Trx1 σχηματίζεται από BSO + AUR και την αποκατάσταση των επιπέδων της μειωμένης Trx1 κοντά επίπεδα ελέγχου σε δύο FaDu και Cal-27 κύτταρα (Σχήμα 6Β), υποδεικνύοντας ότι οι μικτές δισουλφίδια πρωτεΐνης που σχηματίζεται σε απόκριση σε BSO + AUR. Τέλος, οι μεταβολές στην ενεργότητα άλλων ενζύμων που σχετίζονται με GSH και Τγχ όπως γλουταθειόνη αναγωγάση (GR), γλουταθειόνη υπεροξειδάσης (GPx) και peroxiredoxin (Prx) σε απόκριση προς BSO και AUR εξετάστηκαν σε FaDu και Cal-27 κύτταρα. Δεν υπήρξαν σημαντικές αλλαγές στις GR (Σχήμα 7Α) ή GPx (Σχήμα 7Β) σε απόκριση σε BSO + AUR σε δύο κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με το μάρτυρα. δραστηριότητα Prx ήταν σημαντικά αυξημένη σε BSO επεξεργασμένο Cal-27 κύτταρα αλλά ήταν σημαντικά καταστέλλεται σε AUR και BSO + AUR επεξεργασμένου FaDu και Cal-27 κύτταρα (Σχήμα 7C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι BSO + AUR που προκαλείται οξειδωτικό στρες μέσω της αυξημένης GSH και οξείδωση Τγχ σε κύτταρα HNSCC

Α, Β:. FaDu και Cal-27 κύτταρα κατεργάστηκαν με 0,5 μΜ AUR ή /και 1 mM BSO επί 24 h, στη συνέχεια αναλύθηκαν για ποσοστό γλουταθειόνη δισουλφίδιο (% GSSG, (Α)) και το καθεστώς θειορεδοξίνης οξειδοαναγωγής (Β). Dithiotrietol (DTT, 2 mM) ή 2 mm H

2O προστέθηκε

2 για 15 λεπτά για τον έλεγχο προϊόντων λύσης ως θετικοί μάρτυρες για ανηγμένη και οξειδωμένη θειορεδοξίνη αντίστοιχα (Β). *, P & lt? 0,05 έναντι ελέγχου (CON)? ¥, ρ & lt? 0,05 έναντι BSO ή AUR

Η

Α-Γ:. Κύτταρα FaDu και Cal-27 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,5 μΜ AUR ή /και 1 mM BSO επί 24 ώρες, στη συνέχεια αναλύθηκαν για αναγωγάσης γλουταθειόνης (GR) δραστηριότητα (Α), γλουταθειόνη υπεροξειδάσης (GPx) δραστηριότητα (Β), και peroxiredoxin δραστηριότητα (C). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) Ν = 3 πειράματα. *, P & lt?. 0,05 έναντι ελέγχου

Η

BSO + AUR-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα αναστέλλεται από αντιοξειδωτικά

Για να αναλυθεί περαιτέρω ο ρόλος του οξειδωτικού στρες σε BSO + AUR που προκαλείται από τη θανάτωση των κυττάρων, FaDu και Cal-27 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 20 mM NAC (α αντιοξειδωτικό θειόλης) για 1 ώρα πριν και κατά τη διάρκεια της θεραπείας BSO + AUR, στη συνέχεια αναλύθηκαν για κλωνογόνο επιβίωση. NAC ήταν σε θέση να αναστρέψει πλήρως την κυτταροτοξικότητα που επάγεται από BSO + AUR σε FaDu και Cal-27 κύτταρα υποδηλώνοντας ότι η αναστολή της BSO + AUR επάγει οξειδωτικό στρες μέσω διαταραχές στο μεταβολισμό θειόλη (Σχήμα 8Α). Για να επιβεβαιωθεί ότι H

2O

2 είχε εμπλακεί σε BSO + AUR επαγόμενη κυτταροτοξικότητα, FaDu και Cal-27 κύτταρα προκατεργάστηκαν για 1 ώρα με 1000 U /mL πεγκυλιωμένη καταλάσης (CAT) πριν από τη θεραπεία με BSO + AUR. CAT ανέστρεψε σημαντικά BSO + AUR επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα FaDu αλλά όχι Cal-27 κύτταρα (Σχήμα 8Α). Ανάλυση της δραστικότητας CAT σε BSO + AUR έναντι CAT + BSO + AUR-κατεργασμένων κυττάρων αποκάλυψε ότι η θεραπεία με CAT δεν αύξησε δραστικότητα CAT σε Cal 27-κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα FaDu (Σχήμα 8Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι η γάτα μπορεί να μην έχουν εισέλθει επαρκώς τα κύτταρα. Επιπλέον, Cal-27 κύτταρα κατείχαν σημαντικά υψηλότερο επίπεδο δραστηριότητας CAT σε σύγκριση με κύτταρα FaDu (Σχήμα 8Β). Συνολικά, τα αποτελέσματα στα σχήματα 6, 7 και 8 υποστηρίζουν την υπόθεση ότι H

2O

2 επαγόμενη disrutions στο μεταβολισμό θειόλης οδηγεί σε οξειδωτικό στρες εμπλέκονται στην θανάτωση κυττάρων που προκαλείται από BSO + AUR σε ανθρώπινα κύτταρα HNSCC.

Α: FaDu και Cal-27 κύτταρα κατεργάστηκαν με 20 mM NAC ή 1000 U /mL πεγκυλιωμένη καταλάσης (CAT) για 1 ώρα πριν από και κατά τη διάρκεια της θεραπείας 24 ώρες με 0,5 μΜ AUR ή /και 1 mM BSO. κύτταρα κατεργασμένα Drug μετρήθηκαν για τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Όλες οι θεραπείες κανονικοποιήθηκαν για τον έλεγχο. Β: BSO + AUR και CAT + BSO + AUR επεξεργασμένου FaDu και Cal-27 κύτταρα αναλύθηκαν για δραστικότητα CAT. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) Ν = 3 πειράματα. *, P & lt? 0,05 έναντι ελέγχου? ¥, σ & lt? 0,05 έναντι BSO + AUR? **, P & lt?. 0,05 έναντι αντίστοιχων θεραπεία σε κύτταρα FaDu

Η

BSO + AUR κατέστειλε Cal-27 όγκου ανάπτυξης

Το

in vivo

δραστηριότητα BSO και AUR σε Cal-27 που φέρουν όγκο αθυμικά γυμνά ποντίκια εξετάστηκε. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με 400 mg /kg BSO σε συνδυασμό με 1 mg /kg ε.π. AUR ημερησίως για 10 ημέρες, έδειξε μια καταστολή της ανάπτυξης του όγκου σε σύγκριση με τον έλεγχο και BSO αγωγή όγκων (Σχήμα 9Α) χωρίς αρνητικές επιπτώσεις στο σωματικό βάρος (Σχήμα 9Β) επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα που φαίνονται

in vitro

. Παρά το γεγονός ότι, BSO + AUR αγωγή όγκων έδειξαν μία τάση προς βραδύτερη ανάπτυξη σε σχέση με τους όγκους AUR αγωγή, αυτή η διαφορά δεν έφθασε σημασία (Σχήμα 9Α)

Α, Β:. Αθυμικών (ηυ /ηυ) ποντικούς που φέρουν Cal-27 όγκους ξενομοσχεύματος υποβλήθηκαν σε θεραπεία αρχίζει με μέσο όγκο του όγκου των 0,025 εκατοστά

3 με 450 mg /kg BSO ip και /ή 1 mg /kg ε.π. AUR ημερησίως για 10 ημέρες. Τα ποντίκια ελέγχου έλαβαν 10% αιθανόλη σε φυσιολογικό ορό ε.π. ημερησίως για 10 ημέρες. Ο όγκος του όγκου (Α) και το σωματικό βάρος (Β) μετρήθηκε κατά την ημέρα 1, 3, 5, 8, 10 και 12 της θεραπείας. Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν τις μέσες τιμές για 10 ποντικούς. Β: Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) Ν = 3 πειράματα. *, P & lt?. 0,05 έναντι CON

Η

BSO + AUR ευαισθητοποιημένα κύτταρα HNSCC στην erlotinib

Δεδομένου ότι η αντίσταση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, όπως οι αναστολείς του EGFR, είναι ένας σημαντικός περιορισμός στη θεραπεία HNSCC [33], θα καθορίζεται εάν BSO + AUR θα ευαισθητοποιήσει συρροή κύτταρα HNSCC με τον αναστολέα του EGFR η erlotinib. Βρήκαμε ότι BSO και AUR όταν χρησιμοποιούνται μόνα τους δεν ήταν σε θέση να ευαισθητοποιήσει κύτταρα στην erlotinib (10 μΜ, 24 ώρες (Σχήμα 10)). Ωστόσο, BSO + AUR ευαισθητοποιημένα σημαντικά όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν στην erlotinib (Σχήμα 10) υποδηλώνοντας ότι BSO + AUR πρέπει να χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με αναστολείς του EGFR να επιτευχθεί η μέγιστη χημειο-ευαισθητοποίηση.

Συρρέουσες FaDu, Cal-27, SCC-25 και SQ20B κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 mM BSO και ή 0,5 μΜ AUR σε συνδυασμό με 10 μΜ Η erlotinib (ΕΡΠ) για 24 ώρες. δεδομένα κλωνογονιδιακή επιβίωση των κυττάρων κανονικοποιήθηκαν με κύτταρα μάρτυρες (CON). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) Ν = 3 πειράματα. *, P & lt? 0,05 έναντι CON? ¥, σ & lt? 0,05 έναντι CON, BSO και AUR? £, σ & lt? 0,05 έναντι ΕΡΠ? §, σελ & lt?. 0,05 έναντι όλων των άλλων ομάδων αγωγής

Η

Συζήτηση

Αυξημένη GSH και του μεταβολισμού Τγχ έχουν γνωστό εδώ και χρόνια να συσχετίζεται με την υψηλή επιθετικότητα του όγκου και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία [4 ] – [7]. Ως αποτέλεσμα αυτής της γνώσης, η αναστολή της GSH ή Τγχ σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία έχει εκτεταμένα διερευνηθεί αλλά είναι εξαιρετικά κυτταρική γραμμή ειδική και απέδωσε απογοητευτικά αποτελέσματα τα οποία μπορεί να οφείλεται στις επικαλύψεις και περιττές λειτουργίες αντιοξειδωτικό του GSH και των συστημάτων Τγχ [17 ] – [20]. Στην πραγματικότητα, προηγούμενες μελέτες μας έχουν δείξει ότι η ικανότητα των BSO ή AUR να ευαισθητοποιήσει κύτταρα HNSCC σε αναστολείς Akt ήταν ιδιαίτερα κυτταρική γραμμή ειδική [16].