Αφηρημένο

συναρμολόγηση Focal πρόσφυση και αποσυναρμολόγηση είναι απαραίτητα για τη μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή του καρκίνου, αλλά οι λεπτομερείς μοριακοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν αυτές τις διαδικασίες μένει να διευκρινιστεί. Φωσφατιδυλινοσιτόλης φωσφορικής κινάσης τύπου ΙΓ (PIPKIγ) δεσμεύεται Talin και απαιτείται για τον σχηματισμό εστιακών προσκόλληση σε κύτταρα EGF-διεγερμένα, αλλά ο ρόλος του στη ρύθμιση εστιακού δυναμική προσκόλληση και εισβολή καρκίνου του είναι ελάχιστα κατανοητή. Δείχνουμε εδώ ότι η υπερέκφραση της PIPKIγ προώθησε το σχηματισμό εστιακό πρόσφυση, ενώ τα κύτταρα που εκφράζουν είτε PIPKIγ

K188,200R ή PIPKIγ

D316K, δύο μεταλλάξεις της κινάσης-νεκρό, είχε πολύ λιγότερες εστιακό συμφύσεις από εκείνους που εκφράζουν WT PIPKIγ σε CHO-K1 κύτταρα και HCT116 καρκινικών κυττάρων κόλου. Επιπλέον, η υπερέκφραση του PIPKIγ, αλλά όχι PIPKIγ

K188,200R, οδήγησε σε αύξηση και στις δύο εστιακά ποσοστά συναρμολόγηση προσκόλληση και αποσυναρμολόγηση. Εξάντληση των PIPKIγ με τη χρήση shRNA έντονα ανέστειλε το σχηματισμό των συμφύσεων στα κύτταρα HCT116. Η υπερέκφραση του PIPKIγ

K188,200R ή εξάντληση των PIPKIγ μείωσε την αντοχή της κυτταρικής πρόσφυσης HCT116 να φιμπρονεκτίνης και ανέστειλε τις επεμβατικές ικανότητες των κυττάρων HCT116. εξάντληση PIPKIγ μειωμένη PIP

2 επίπεδα σε ~ 40% του ελέγχου και της PIP

3 σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα, και ανέστειλε βινκουλίνης εντόπιση σε εστιακές συμφύσεις. Στο σύνολό τους, PIPKIγ ρυθμίζει θετικά εστιακό δυναμική προσκόλληση και την εισβολή του καρκίνου, πιθανότατα μέσω της PIP

2-μεσολαβητική ενεργοποίηση βινκουλίνης

Παράθεση:. Wu Z, Λι Χ, Sunkara Μ, Spearman Η, Morris AJ, Χουάνγκ C (2011) PIPKIγ Ρυθμίζει Focal πρόσφυση Dynamics και του παχέος εντέρου κυττάρων εισβολή. PLoS ONE 6 (9): e24775. doi: 10.1371 /journal.pone.0024775

Επιμέλεια: Maddy Parsons, Kings College London, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 11 Ιούλ 2011? Αποδεκτές: 17, Αυγούστου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 12 Σεπτεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από Markey Cancer Center Start-up ταμείο (Πανεπιστήμιο του Κεντάκι) (για να Cai Huang), και εν μέρει από τη μετανάστευση Κοινοπραξία επιχορήγησης (ΝΙΗ GM64346) (στον Ken Jacobson, του Πανεπιστημίου της Βόρειας Καρολίνας στο Τσάπελ Χιλ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Focal συμφύσεις (FAS, που ονομάζεται επίσης συμφύσεις μήτρας-κυττάρων) είναι ειδικές τύπους μεγάλων μακρομοριακών συγκροτήματα σε κοιλιακή επιφάνεια των κυττάρων, που λειτουργούν ως δύο μηχανικά μηχανήματα και ρυθμιστικών κόμβους σηματοδότησης [1], [2]. Χρονική και χωρική ρύθμιση της εστιακής προσκόλλησης συναρμολόγηση /αποσυναρμολόγηση απαιτείται για την κυτταρική μετανάστευση [3]. Κατά τη μετανάστευση των κυττάρων, τα εν τω γεννάσθαι εστιακές συμφύσεις (ονομάζεται επίσης εστιακή σύμπλοκα) που σχηματίζεται για να σταθεροποιήσει ελασματοπόδια στο μπροστινό μέρος των κυττάρων, ενώ οι εστιακές συμφύσεις διαλύονται στα οπίσθια άκρα των κυττάρων [4], [5].

Focal προσκόλληση συναρμολόγηση και αποσυναρμολόγηση εμπλέκονται επίσης σε εισβολή καρκίνου, απαραίτητη προϋπόθεση για την μετάσταση. ΜΚΚ (κάτω-ρυθμίζονται σε καρκίνωμα νεφρών) συνδέεται με ακτίνη και μικροσωληνίσκους και διεγείρει γλοιώματος εισβολή, με την προώθηση εστιακό αποσυναρμολόγηση πρόσφυση [6]. Η ακτίνη εγκάρσιας σύνδεσης πρωτείνης filamin Α καταστέλλει εστιακό εισβολή αποσυναρμολόγηση πρόσφυση και κυττάρων καρκίνου του μαστού [7]. Rho /Ροκ σηματοδότηση προάγει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή ρυθμίζοντας εστιακό δυναμική προσκόλληση μέσω caveolin-1 φωσφορυλίωσης [8]. ΡΑΚ προωθεί επίσης εστιακό αποσυναρμολόγηση προσκόλληση και την εισβολή του καρκίνου [9], [10], [11]. Focal δυναμική προσκόλληση και τα μονοπάτια σηματοδότησης που ρυθμίζουν αυτή η διαδικασία θα μπορούσε να είναι ως εκ τούτου ένας ελκυστικός στόχος για θεραπεία του καρκίνου.

Πολλά μόρια έχουν δειχθεί ότι ρυθμίζουν εστιακή δυναμική προσκόλληση. FAK ρυθμίζει εστιακό κύκλου εργασιών συγκόλλησης [9], [12], πιθανώς μέσω ενός dynamin και μικροσωληνίσκων εξαρτώμενη οδό [13]. Παξιλλίνη, ένα κομβικό προσαρμογέα πρόσφυση, ρυθμίζει επίσης εστιακό δυναμική πρόσφυση από JNK και φωσφορυλίωση PAK-μεσολάβηση [14], [15]. Ταλίν ενεργοποιεί ιντεγκρίνες και ξεκινά εστιακό σχηματισμό σύμφυσης [16], [17], [18], ενώ η διάσπαση του Ταλίν από την καλπαΐνη μεσολαβεί εστιακό αποσυναρμολόγηση πρόσφυση [19]. Η καλπαΐνη επίσης διασπά FAK και παξιλλίνη να διαμορφώνει εστιακό δυναμική πρόσφυση [20], [21]. Δείξαμε ότι Smurf1 μεσολάβηση ουβικουϊτινίωση του τομέα κεφαλής ταλίνη, ένα από τα δύο προϊόντα διάσπασης, παίζει σημαντικό ρόλο στην εστιακή αποσυναρμολόγηση προσκόλληση και μετανάστευση κυττάρων [22]. ACF7, ένα μικροσωληνίσκων και νηματοειδή πρωτεΐνη που δεσμεύεται με ακτίνη, ρυθμίζει την εστιακή πρόσφυση συναρμολόγησης /αποσυναρμολόγησης μέσω της δραστηριότητάς της ΑΤΡ [23]. Πάντως, οι μοριακοί μηχανισμοί που ελέγχουν την εστιακή προσκόλληση συναρμολόγηση /αποσυναρμολόγηση δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

Τύπος φωσφατιδυλινοσιτόλης φωσφορικής κινάσης Ι γ (PIPKIγ) είναι ένα ένζυμο που καταλύει ΑΤΡ-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση της φωσφατιδυλινοσιτόλης 4-φωσφορικής (ΡΙ (4 ) P) για να δημιουργηθεί PI (4,5) Ρ

2, η οποία ρυθμίζει μία ποικιλία βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένου του σχηματισμού εστιακή προσκόλληση [24]. PIPKIγ έχει ένα καλά συντηρημένη καταλυτική περιοχή της κινάσης στην κεντρική περιοχή [25]. Μέσα στην καταλυτική περιοχή, υπάρχει ένα υποτομέα που ονομάζεται βρόχο ενεργοποίησης, το οποίο καθορίζει θέση φωσφορυλίωσης επί του δακτυλίου ινοσιτόλης του υποστρώματος. PIPKIγ αλληλεπιδρά έντονα με Talin και ανταγωνίζεται για δέσμευση με την ουρά β ιντεγκρίνης [26] ταλίνη, [27]. Είναι εντοπισμένη στις ενώσεις προσφύσεως στα επιθηλιακά κύτταρα [28], [29]. Έχει αναφερθεί ότι PIPKIγ απαιτείται για τον σχηματισμό εστιακών προσκόλληση σε μεταναστευτικά κύτταρα [30]. Ωστόσο, οι ακριβείς ρόλοι των δραστηριοτήτων των λιπιδίων κινάσης της PIPKIγ σε εστιακό δυναμική πρόσφυση δεν ορίζεται.

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η απαίτηση για τη δραστηριότητα των λιπιδίων κινάσης της PIPKIγ σε εστιακό δυναμική προσκόλληση και εισβολή καρκίνου του παχέος εντέρου . Τα αποτελέσματά μας προσδιορίσει ουσιαστικό ρόλο της PIPKIγ σε εστιακό συναρμολόγηση πρόσφυση /αποσυναρμολόγηση και τον καρκίνο εισβολή.

Αποτελέσματα

PIPKIγ προωθεί το σχηματισμό εστιακή πρόσφυση

Για να εξεταστεί ένα πιθανό ρόλο για PIPKIγ στην σχηματισμός εστιακών προσκόλληση, τα κύτταρα CHO-K1 επιμολύνθηκαν με ΕΟΡΡ-PIPKIγ ή φορέα EGFP, αντιστοίχως. Τα κύτταρα επανα-επιστρώθηκαν επί φιβρονεκτίνης, σταθεροποιήθηκαν με παραφορμαλδεΰδη, επωάστηκαν με ένα αντι-παξιλλίνη μονοκλωνικό αντίσωμα, και στη συνέχεια χρωματίζονται με Dylight 549 συζευγμένο γίδινο αντι-ποντικού IgG. Εστιακή συμφύσεις είχαν παραταχθεί γύρω από τις άκρες των κυττάρων φορέα-επιμολυσμένα EGFP, με ορισμένα βασικά συμφύσεις στα κέντρα των κυττάρων, ενώ η έκφραση PIPKIγ διεγείρεται δραματικά σχηματισμό εστιών προσκόλλησης στα κέντρα των κυττάρων (Εικ. 1Α). Υπερ-έκφραση του PIPKIγ διεγείρει μία αύξηση στην εστιακή αριθμούς πρόσφυσης (Σχήμα 1Β). Ενώ η αύξηση ήταν συνέβαλε κυρίως από μικρές εστιακές συμφύσεις (& lt? 3 μm

2) (Εικ. 1 C). Η διέγερση του σχηματισμού εστιακής προσκόλλησης με PIPKIγ στηρίζεται στην αλληλεπίδρασή της με ταλίνη, επειδή PIPKIγ

W647F, ένα μεταλλαγμένο που είναι ανεπαρκής στην αλληλεπίδραση με ταλίνη, δεν ήταν σε θέση να προωθήσει εστιακή σχηματισμός σύμφυσης (Σχήμα 1Α, Β, & amp.? C).

(Α) TIRF εικόνες από κύτταρα CHO-K1 που εκφράζουν EGFP, EGFP-PIPKIγ WT ή EGFP-PIPKIγ

W647F. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με pEGFP-φορέα, -PIPKIγ WT ή -PIPKIγ

W647F, και στη συνέχεια χρωματίζονται για παξιλλίνη. μπαρ κλίμακα, 20 μm. (Β) Έκφραση της PIPKIγ αλλά δεν PIPKIγ

W647F προκάλεσε αύξηση εστιακό αριθμό πρόσφυσης (n = 15, μπαρ σφάλμα = μέση τιμή ± SEM? Vector

vs

WT, P & lt? 0.001? WT

vs

W647F, P & lt? 0.001? Vector

vs

W647F, P & gt? 0,05). (C) κατανομή Περιοχή συμφύσεων σε κύτταρα που εκφράζουν EGFP, EGFP-PIPKIγ WT ή EGFP-PIPKIγ

W647F.

Η

δραστηριότητα κινάσης PIPKIγ απαιτείται για τη διέγερση του σχηματισμού εστιακού πρόσφυσης

PI (4,5) P

2 δεσμεύει Ταλίν και ενισχύει την αλληλεπίδραση μεταξύ Ταλίν και της ιντεγκρίνης β ουρά, την τόνωση της ιντεγκρίνης clustering [31]. PI (4,5) P

2 δεσμεύεται επίσης βινκουλίνης και αποκαλύπτει τις θέσεις πρόσδεσης ακτίνης και Ταλίν στις βινκουλίνης, την προώθηση της εστίασης σχηματισμό σύμφυσης [32]. Ως εκ τούτου, PIPKIγ διεγερμένα PI (4,5) P

2 της σύνθεσης μπορεί να είναι απαραίτητη για την προώθηση του σχηματισμού εστιακή πρόσφυση. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε μεταλλαχθεί δύο υπολείμματα λυσίνης, K188 και K200, σε αργινίνη κατάλοιπα εντός της θέσης σύνδεσης ΑΤΡ της PIPKIγ. Το μεταλλαγμένο PIPKIγ

K188,200R και το WT καθαρίστηκαν από κύτταρα ΟΗΟ-Κ1 και εξετάσθηκαν οι δραστηριότητες κινάσης

in vitro

χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας για την ποσοτικοποίηση της παραγωγής του ΡΙ (4,5) Ρ

2 από ΡΙ (4) Ρ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, η μετάλλαξη σε K188 και K200 μειωμένη δραστηριότητα κινάσης κατά 95%. EGFP-tagged μεταλλαγμένο PIPKIγ

K188,200R και WT PIPKIγ ήταν σταθερά εκφράζεται σε κύτταρα CHO-K1, και τις επιπτώσεις τους στη διαμόρφωση των εστιακών πρόσφυση εξετάστηκαν μετά από χρώση παξιλλίνη. Τα κύτταρα που εκφράζουν σταθερά WT PIPKIγ σχηματίζεται εστιακές συμφύσεις γύρω από τις άκρες και στα κέντρα των κυττάρων, ενώ τα κύτταρα που εκφράζουν PIPKIγ

K188,200R, παρόμοια με τα γονικά κύτταρα, κατείχαν μικρό εστιακό συμφύσεις, οι περισσότερες από τις οποίες ήταν γύρω από τις άκρες του κύτταρα, και είχε ένα ελάττωμα στην εξάπλωση (Εικ. 2Β). Ποσοτική ανάλυση έδειξε ότι PIPKIγ αυξημένο εστιακό συμφύσεις κατά περισσότερο από 2 φορές, ενώ PIPKIγ

K188,200R δεν προώθησε σημαντικά το σχηματισμό εστιακό πρόσφυσης (Εικ 2C & amp?. Δ). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η δραστηριότητα PIPKIγ είναι απαραίτητη για το σχηματισμό εστιακή προσκόλληση σε κύτταρα CHO-K1.

(Α) Ανάλυση των δραστηριοτήτων της PIPKIγ και PIPKIγ

K188,200R. (Β) εικόνες TIRF των κυττάρων CHO-K1 που εκφράζουν PIPKIγ ή PIPKIγ

K188,200R και τα γονικά κύτταρα ΟΗΟ-Κ1. Τα γονικά κύτταρα και κύτταρα που εκφράζουν EGFP-PIPKIγ WT ή -PIPKIγ

K188, 200R βάφτηκαν για παξιλλίνη. μπαρ κλίμακα, 20 μm. (C) Ποσοτική ανάλυση της εστιακής αριθμούς πρόσφυσης (ανά κύτταρο) στα μητρικά κύτταρα και τα κύτταρα που εκφράζουν PIPKIγ ή PIPKIγ

K188,200R (n = 30, μπαρ σφάλμα = μέση τιμή ± SEM? Γονική vs PIPKIγ, P & lt? 0.001? γονική vs PIPKIγ

K188,200R, P & gt? 0,05). (D) κατανομή Περιοχή συμφύσεων στα γονικά κύτταρα και κύτταρα που εκφράζουν PIPKIγ και PIPKIγ

K188,200R.

Η

Για να επαληθεύσετε περαιτέρω την απαίτηση της δραστηριότητας PIPKIγ για το σχηματισμό εστιακό πρόσφυση, ελέγξαμε το ικανότητας ενός άλλου νεκρού μεταλλαγμένο κινάσης, PIPKIγ

D316K [33], για την προώθηση του σχηματισμού εστιακή πρόσφυση, όπως περιγράφεται παραπάνω. Όπως φαίνεται στο Σχ. S1, ο μέσος αριθμός εστιακής προσκόλλησης (ανά κύτταρο) σε κύτταρα που εκφράζουν PIPKIγ

D316K ήταν περίπου 45, η οποία είναι περίπου η ίδια με εκείνη σε κύτταρα που εκφράζουν EGFP φορέα (Σχ. 1). Οι εστιακές συμφύσεις σε κύτταρα που εκφράζουν PIPKIγ D316K

συσσωρευτεί στις άκρες των κυττάρων, με πολύ λίγες εστιακές συμφύσεις στο κέντρο των κυττάρων. Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώνει τον ουσιαστικό ρόλο της δραστηριότητας PIPKIγ στο σχηματισμό εστιακή πρόσφυση.

Η δραστηριότητα των PIPKIγ είναι απαραίτητη για την προώθηση της δυναμικής εστίασης πρόσφυση

Για να εξεταστεί αν PIPKIγ δραστηριότητα των λιπιδίων κινάσης απαιτείται για την εστιακή πρόσφυση δυναμική, CHO-K1 κύτταρα τα οποία εκφράζουν σταθερά ΕΟΡΡ-PIPKIγ ή -PIPKIγ

K188,200R επιμολύνθηκαν με mDsRed-παξιλλίνη και μετά απλώθηκαν σε πιάτα MatTek (με γυάλινη καλυπτρίδα στο κάτω μέρος) προεπικαλυμμένα με ινονεκτίνη (5 μg /ml ) και αναπτύχθηκαν για 3 ώρες. εικόνες TIRF του mDsRed-παξιλλίνη ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Nikon TIRF και η θερμοκρασία διατηρήθηκε στους 37 ° C χρησιμοποιώντας ένα σύστημα επώασης μικροσκόπιο INU-TIZ-F1 (Tokai Αποτέλεσμα). Οι εικόνες καταγράφηκαν σε διαστήματα 1 λεπτού για μία περίοδο 120 λεπτών. Focal συναρμολόγηση και η αποσυναρμολόγηση προσκόλληση ρυθμό σταθερές υπολογίστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [22]. Το συγκρότημα FA και οι σταθερές ρυθμού αποσυναρμολόγηση σε κύτταρα που εκφράζουν PIPKIγ

K188,200R ήταν 0,083 ± 0,014 και 0,072 ± 0,010 min

-1, αντίστοιχα, οι οποίες είναι παρόμοιες με εκείνες στα φυσιολογικά κύτταρα CHO-K1 που αναφέραμε προηγουμένως [ ,,,0],22], ενώ η συναρμολόγηση FA και σταθερές αποσυναρμολόγηση ποσοστό ήταν 0,190 ± 0,019 και 0,136 ± 0,014 min

-1, αντίστοιχα, σε κύτταρα που εκφράζουν WT PIPKIγ (Εικ. 3). Αυτό το αποτέλεσμα υποδεικνύει ότι η δράση κινάσης λιπιδίων ινοσιτόλης του PIPKIγ απαιτείται για διέγερση της εστιακής συναρμολόγησης πρόσφυση και αποσυναρμολόγηση.

(Α) κύτταρα ΟΗΟ-Κ1 που εκφράζουν σταθερώς PIPKIγ ή PIPKIγ

K188,200R επιμολύνθηκαν παροδικά με mDsRed-παξιλλίνη. Τα κύτταρα απλώθηκαν σε ινονεκτίνη και η δυναμική της παξιλλίνης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας time-lapse μικροσκοπία TIRF. Αιχμές βελών δείχνουν τη δυναμική (άνω πάνελ) και σταθερές (κάτω πάνελ) εστιακές συμφύσεις. (Β) η υπέρθεση των 0 και 24 λεπτά σε «Α». (Γ) Ποσοτικοποίηση των εστιακών συναρμολόγησης πρόσφυση και το ρυθμό αποσυναρμολόγηση σταθερές στα κύτταρα που εκφράζουν PIPKIγ ή PIPKIγ

K188,200R. Οι ποσοτικοποιήσεις εκφράζονται ως μέση ± s.e.m. 50 συμφύσεων από 10 κύτταρα. Συνέλευση, WT vs K188,200R, P & lt? 0,00005? αποσυναρμολόγηση, σ & lt?. 0.005

Η

Ένα ουσιαστικό ρόλο για PIPKIγ στο σχηματισμό εστιακή προσκόλληση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

εστιακών συμφύσεων έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση της εισβολής του καρκίνου, ενώ ο ρόλος των εστιακών συμφύσεων σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου δεν έχει σαφώς καθορισμένες. Για να καθοριστεί εάν η δραστηριότητα της PIPKIγ επηρεάζει τον σχηματισμό εστιακή προσκόλληση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου, τα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά EGFP-PIPKIγ ή -PIPKIγ

K188,200R απλώθηκαν σε φιμπρονεκτίνη και χρωματίστηκαν για παξιλλίνη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, οι περισσότερες από τις εστιακές συμφύσεις βρίσκονταν προς την περιφερειακή περιοχή, και τα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν PIPKIγ

K188,200R είχε πολύ λιγότερες εστιακές συμφύσεις από εκείνα που εκφράζουν το ένζυμο WT. Ο μέσος αριθμός εστιακή προσκόλληση σε κύτταρα που εκφράζουν WT PIPKIγ ήταν 22,5 /κύτταρο, ενώ ότι σε κύτταρα που εκφράζουν PIPKIγ

K188,200R ήταν 11,5 /κύτταρο, αμφότερα από τα οποία ήταν λιγότερες από εκείνες που παρατηρούνται σε κύτταρα ΟΗΟ-Κ1 (Εικ. 4Β) . Επιπλέον, PIPKIγ

K188,200R είχε μεγαλύτερη επίδραση στις μικρότερες συμφύσεις εστιακό από τα μεγαλύτερα (Εικ. 4C).

(Α) TIRF εικόνες από κύτταρα CHO-K1 που εκφράζουν PIPKIγ ή PIPKIγ

K188,200R. Τα κύτταρα που εκφράζουν σταθερά EGFP-PIPKIγ WT ή -PIPKIγ

K188, 200R βάφτηκαν για παξιλλίνη. μπαρ κλίμακα, 20 μm. (Β) PIPKIγ

K188, 200R απέτυχε να διεγείρει την αύξηση της εστιακής αριθμό πρόσφυσης (n = 10, μπαρ σφάλμα = μέση τιμή ± s.e.m? Paired t-test, P & lt? 0.005). διανομής (C) Τομέας συμφύσεων σε κύτταρα που εκφράζουν PIPKIγ και PIPKIγ

K188,200R.

Η

Για να ελέγξετε αν PIPKIγ είναι απαραίτητη για το σχηματισμό εστιακή προσκόλληση στα κύτταρα HCT116, τα κύτταρα HCT116 μολύνθηκαν με ανασυνδυασμένη φακοϊούς που εκφράζουν PIPKIγ shRNA ή shRNA ελέγχου και επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, η έκφραση του PIPKIγ shRNA οδήγησε σε δραματική μείωση στο ενδογενές επίπεδο PIPKIγ των κυττάρων HCT116. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιστρώθηκαν σε ινονεκτίνη και χρωματίστηκαν για παξιλλίνη. Παραδόξως, PIPKIγ νοκ ντάουν σχεδόν καταργηθεί σχηματισμό εστιακό προσκόλληση στα κύτταρα HCT116 (Εικ. 5Β). εξάντληση PIPKIγ μειωμένη εστιακό αριθμό πρόσφυση κατά περίπου 74% (Σχ. 5C). Διαφορετικό από PIPKIγ

K188,200R, PIPKIγ shRNA είχε μεγαλύτερη επίδραση στις μεγαλύτερες συμφύσεις εστιακό από τα μικρότερα (Εικ. 5D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ουσιαστικό ρόλο του PIPKIγ στο σχηματισμό εστιακών προσκόλληση σε HCT116 κύτταρα καρκίνου κόλου. Αυτή η δραματική επίδραση του PIPKIγ knockdown δεν συμβαίνουν σε MDA-MB-231 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού, όπου knockdown μόνο μερικώς ανέστειλε το σχηματισμό εστιακών προσκόλληση PIPKIγ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Εκφραση σε κύτταρα PIPKIγ σταθερώς εκφράζοντας τον έλεγχο shRNA και PIPKIγ shRNA. εικόνων (Β) TIRF των HCT116 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά τον έλεγχο και PIPKIγ shRNA. Τα κύτταρα μολύνθηκαν με λεντοϊού σωματίδια που μεταφέρουν τον έλεγχο ή PIPKIγ shRNA, επιλεγμένα με πουρομυκίνη, και χρωματίστηκαν για παξιλλίνη. μπαρ κλίμακα, 20 μm. (C) PIPKIγ εξάντληση ανέστειλε εστιακό σχηματισμό προσκόλλησης στα κύτταρα HCT116. (N = 10, μπαρ σφάλμα = μέση τιμή ± SEM? Paired t-test, P & lt? 0,0001). (D) κατανομή Περιοχή συμφύσεων στα κύτταρα που εκφράζουν τον έλεγχο και PIPKIγ shRNA

Η

PIPKIγ ρυθμίζει θετικά την πρόσφυση αντοχή του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων στην φιμπρονεκτίνη

για να εξεταστεί αν η δραστηριότητα της PIPKIγ ρυθμίζει τη δύναμη προσκόλλησης κυττάρων σε ινονεκτίνη, HCT116 κύτταρα που σταθερά εκφράζουν EGFP-PIPKIγ ή -PIPKIγ

K188,200R βάφτηκαν με καλσεΐνη-ΑΜ και σπάρθηκαν σε πλάκα 96-φρεατίων που είχε προ-επικαλυφθεί με διαφορετικές συγκεντρώσεις της φιμπρονεκτίνης. Ο φθορισμός αναγνώσθηκε καλσεϊνη, και στη συνέχεια η πλάκα αναστρέφεται και φυγοκεντρήθηκε στα 150 χ g για 5 λεπτά. Ο φθορισμός καλσεϊνη διαβάσετε ξανά. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, η διαφορά δύναμη προσκόλλησης κυττάρων μεταξύ των κυττάρων που εκφράζουν PIPKIγ

K188,200R και το WT δεν ήταν σημαντική σε υψηλές συγκεντρώσεις φιμπρονεκτίνης. Ωστόσο, σε χαμηλές συγκεντρώσεις ινονηκτίνης, τα κύτταρα που εκφράζουν PIPKIγ

K188,200R είχαν σημαντικά μικρότερη αντοχή προσκόλλησης σε σύγκριση με εκείνα που εκφράζουν το WT. PIPKIγ knockdown προκάλεσε επίσης σημαντική μείωση στην δύναμη προσκόλλησης κυττάρου σε HCT116 κύτταρα (Σχ. 6Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η δραστικότητα PIPKIγ ρυθμίζει δύναμη προσκόλλησης κυττάρου σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

(Α) Εκφραση PIPKIγ

K188,200R ανέστειλε κύτταρα HCT116 προσκόλληση σε χαμηλές συγκεντρώσεις της ινονηκτίνης. Τα κύτταρα που εκφράζουν σταθερά PIPKIγ ή PIPKIγ

K188,200R επωάστηκαν με Calcein-ΑΜ και επιστρώθηκαν σε μία πλάκα 96 φρεατίων επικαλυμμένες με ινονηκτίνη για δοκιμασίες φυγοκέντρηση. (Β) Μείωση του PIPKIγ ανέστειλε κύτταρα HCT116 τήρηση φιμπρονεκτίνη. Τα κύτταρα τα οποία εκφράζουν σταθερά τον έλεγχο και PIPKIγ shRNA επωάστηκαν με Calcein-ΑΜ και επιστρώθηκαν σε μία πλάκα 96 φρεατίων επικαλυμμένες με ινονηκτίνη για δοκιμασίες φυγοκέντρηση. F

α /F

0 = (φθορισμός μετά από φυγοκέντρηση) ÷ (φθορισμός πριν τη φυγοκέντρηση).

Η

PIPKIγ είναι απαραίτητη για την εισβολή, αλλά όχι η μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου

έχει αναφερθεί ότι PIPKIγ παίζει ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση. Για να ελεγχθεί αν PIPKIγ ρυθμίζει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου HCT116, χρησιμοποιήσαμε δοκιμασίες επούλωση της πληγής χρόνου καταπίπτουν να εξετάσει την μετανάστευση των κυττάρων HCT116 που εκφράζουν EGFP-PIPKIγ και -PIPKIγ

K188,200R, αντίστοιχα, με την παρουσία του HGF . Όπως φαίνεται στο Σχ. S2 A & amp? Β, κύτταρα που εκφράζουν PIPKIγ

K188,200R μετανάστευσαν ελαφρώς ταχύτερα από ό, τι εκείνοι που εκφράζουν το ένζυμο WT όπως μετρήθηκαν με τη δοκιμασία επούλωση της πληγής time-lapse. Επίσης, η εξάντληση των PIPKIγ δεν είχε σημαντική επίδραση στη μετανάστευση των κυττάρων HCT116 στην επικοινωνούντα δοκιμασίες (Σχ S2 C & amp?. Δ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η δραστηριότητα PIPKIγ δεν είναι απαραίτητα για τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου HCT116.

Για να δοκιμαστεί το ρόλο της PIPKIγ σε εισβολή καρκίνου, την εισβολή των κυττάρων HCT116 που εκφράζουν σταθερά PIPKIγ shRNA ή ένα στοιχείο ελέγχου shRNA στην απουσία και παρουσία της HGF εξετάστηκε με τη χρησιμοποίηση προσδιορισμών εισβολή Matrigel. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7 (amp A &? Β), PIPKIγ knockdown είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση στην εισβολή των κυττάρων HCT116 είτε απουσία ή παρουσία του HGF. Η βασική και HGF-διεγερμένα επεμβατική ικανότητες των κυττάρων HCT116 που εκφράζουν σταθερά PIPKIγ

K188,200R είναι επίσης σημαντικά χαμηλότερες από εκείνες των κυττάρων που εκφράζουν το ένζυμο WT (Εικ 7C & amp?. D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι PIPKIγ ρυθμίζει θετικά την εισβολή του καρκίνου του παχέος εντέρου HCT116 κύτταρα.

(Α) Μείωση των PIPKIγ με τη χρήση shRNA ανέστειλε την εισβολή των κυττάρων HCT116. Οι επεμβατική ικανότητες των κυττάρων που εκφράζουν σταθερά τον έλεγχο shRNA ή PIPKIγ shRNA εξετάστηκαν εν απουσία και παρουσία του HGF (50 ng /ml) με δοκιμασίες εισβολή Matrigel που βασίζεται. (Β) Ποσοτικοποίηση της εισβολής των HCT116 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά τον έλεγχο shRNA ή PIPKIγ shRNA. n = 5, μπαρ σφάλμα = μέση τιμή ± s.e.m? ctrl vs PIPKIγ, σ & lt? 0,01? ctrl HGF vs PIPKIγ HGF, σ & lt? 0,01. (Γ) έκφραση των PIPKIγ

K188,200R ανέστειλε την εισβολή των κυττάρων HCT116. Τα κύτταρα που εκφράζουν σταθερά ΕΟΡΡ-PIPKIγ ή -PIPKIγ

K188,200R ελέγχθηκαν για επεμβατική ικανότητες απουσία και παρουσία του HGF. (Δ) Ποσοτικοποίηση της εισβολής των κυττάρων HCT116 που εκφράζουν σταθερά EGFP-PIPKIγ ή -PIPKIγ

K188,200R. n = 3, μπαρ σφάλμα = μέση τιμή ± s.e.m? WT vs K188,200R, P & lt? 0,01? WT HGF vs K188,200R HGF, P ​​& lt?. 0.005

Η

PIPKIγ ρυθμίζει το σχηματισμό εστιακή πρόσφυση μέσω ενεργοποίησης βινκουλίνης με PI (4,5) P

2

Για να αναλύσουμε την μηχανισμός με τον οποίο PIPKIγ ρυθμίζει το σχηματισμό εστιακή πρόσφυση, στόχος μας ήταν να αναλύσει τα επίπεδα polyphosphoinositides σε HCT116 κύτταρα που εκφράζουν PIPKIγ shRNA ή ελέγχου shRNA χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας. Εξάντληση των PIPKIγ στα κύτταρα HCT116 δεν είχε σημαντική επίδραση στο επίπεδο της PIP, αλλά προκάλεσε σημαντική μείωση της PIP

2 επιπέδων (σημειώστε ότι αυτές οι μέθοδοι δεν μπορούν να διακρίνουν θέσης εναντιομερή αυτών των λιπιδίων, έτσι είναι πιθανό ότι PI (3,4) Ρ

2 μπορεί να συμβάλει σημαντικά στην υπολειμματική επίπεδα ΡΙΡ

2 σε αυτά τα κύτταρα). Είναι ενδιαφέρον, για την υποστήριξη αυτής της ιδέας νοκ ντάουν της PIPKIγ μειωμένη PIP

3 επίπεδα κάτω από το όριο ανίχνευσης της ανάλυσης μας (Εικ. 8). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι PIPKIγ είναι ένα βασικό ένζυμο που είναι υπεύθυνο για την παραγωγή του PI (4,5) P

2 και PI (3,4,5) P

3 σε κύτταρα HCT116.

Polyphosphoinositides από κύτταρα που εκφράζουν σταθερά τον έλεγχο shRNA ή PIPKIγ shRNA εκχυλίστηκαν και παραγοντοποιείται χρησιμοποιώντας τριμεθυλσιλυλ διαζομεθάνιο, και στη συνέχεια μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας. Ν = 4, μπαρ σφάλμα = μέση τιμή ± s.e.m? PIP, η P & gt? 0,05? PIP2, P = 0,0034? ΡΙΡ3, P = 0,001.

Η

Για να δούμε αν PI (3,4,5) P είναι απαραίτητη για το σχηματισμό εστιακή προσκόλληση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

3, τα κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LY294002, ένας ειδικός αναστολέας της κινάσης φωσφατιδυλινοσιτόλης-3, και ο σχηματισμός εστιακών προσκόλληση σε αυτά τα κύτταρα εξετάστηκε μετά από χρώση παξιλλίνη. LY294002 (20 μΜ) δεν είχε σημαντική επίδραση στο σχηματισμό εστιακών προσκόλλησης (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Σε συνδυασμό με τα παραπάνω παρατηρήσεις, το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι PI (4,5) P

2, αλλά δεν PI (3,4,5) P

3, απαιτείται για το σχηματισμό εστιακή πρόσφυση.

PI (4,5) P

2 προσδένεται και ενεργοποιεί βινκουλίνης και εμπλέκεται στη ρύθμιση της εστίασης σχηματισμό σύμφυσης [32]. Αν PIPKIγ μεσολάβηση της παραγωγής των PI (4,5) P

2 είναι απαραίτητη για το σχηματισμό εστιακή προσκόλληση στα κύτταρα HCT116, εξάντληση των PIPKIγ θα μειώσει PI (4,5) P

2 επίπεδα και να αποτρέψει βινκουλίνης από τον εντοπισμό σε εστιακό συμφύσεις. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, κύτταρα ενδογενή PIPKIγ εξαντλημένο μολύνθηκαν με ρετροϊούς που εκφράζουν ένα κωδικόνιο-τροποποιημένη PIPKIγ (διάσωσης) (Εικ. 9Α), και τα κύτταρα χρωματίστηκαν για βινκουλίνης. Βινκουλίνης σπάνια εντοπισμένη σε εστιακές συμφύσεις σε PIPKIγ εξαντλημένο κύτταρα HCT116, ενώ εκ νέου έκφραση του PIPKIγ σε PIPKIγ εξαντλημένο κύτταρα οδήγησε σε μια δραματική αύξηση της εστιακής προσκόλλησης-εντοπισμένη βινκουλίνης (Σχ. 9Β). Ποσοτική ανάλυση έδειξε ότι PIPKIγ διάσωσης αποκατασταθεί σχηματισμός εστιακών προσκόλληση σε PIPKIγ-εξαντλημένο κύτταρα (Σχ 9Γ & amp?. Δ), σε σύγκριση με τα δεδομένα στο Σχ. 5. Τα στοιχεία αυτά υποδηλώνουν ότι PIPKIγ μπορούν να ρυθμίζουν το σχηματισμό εστιακή πρόσφυση μέσω PI (4,5) P

2-μεσολαβητική ενεργοποίηση βινκουλίνης.

(Α) Re-έκφραση της διάσωσης ΖΖ-tagged PIPKIγ σε κύτταρα που PIPKIγ έχει χτυπηθεί κάτω (KD) με τα οποία εκφράζουν σταθερά PIPKIγ shRNA. Τα κύτταρα PIPKIγ-KD μολύνθηκαν με σωματίδια ρετροϊού που φέρει διάσωση ΖΖ-tagged PIPKIγ επιλέγονται με νεομυκίνη. ΖΖ-PIPKI ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-PIPKIγ. εικόνες (Β) TIRF κυττάρων PIPKIγ-KD και η Kd κύτταρα που εκφράζουν διάσωση PIPKIγ Κύτταρα απλώθηκαν σε πιάτα γυαλί πυθμένα προ-επικαλυμμένη με ινονεκτίνη (5 μg /ml), σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν χρώση για βινκουλίνης. μπαρ κλίμακα, 20 μm. (C) PIPKIγ διάσωσης αποκατασταθεί σχηματισμό εστιακή προσκόλληση στα κύτταρα PIPKIγ-KD. (N = 11, μπαρ σφάλμα = μέση τιμή ± SEM? Paired t-test, P & lt? 0,0001). (D) κατανομή Περιοχή συμφύσεων στα κύτταρα PIPKIγ-KD και τα κύτταρα KD εκφράζουν PIPKIγ διάσωσης

Η

Συζήτηση

Εκτός από υπηρετούν ως πρόδρομος των άλλων δεύτερων αγγελιοφόρων, PI (4,5) P

2 ίδια συνδέει πολλές πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού και εστιακή πρόσφυση και πιστεύεται ότι είναι ένας βασικός ρυθμιστής της εστίασης δυναμικής πρόσφυσης [ ,,,0],34]. PI (4,5) P

2 προσδένεται βινκουλίνης να ξεσκεπάσουν τις θέσεις Ταλίν-δεσμευτική για βινκουλίνης [32]? δεσμεύει επίσης ταλίνη σταθεροποιώντας έτσι ταλίνη-ιντεγκρίνης αλληλεπιδράσεις [35]. PIPKIγ πιστεύεται ότι είναι το ένζυμο που παράγει PI (4,5) P

2 χωρικά και χρονικά για το σχηματισμό εστιακών πρόσφυση κατά τη διάρκεια της κυτταρικής μετανάστευσης [27], [34]. Από την άλλη πλευρά, ΡΙ (4,5) Ρ

2 δεν έχει ανιχνευθεί σε εστιακές συμφύσεις και ο ρόλος του στη ρύθμιση PIPKIγ εστιακό δυναμική προσκόλληση είναι αμφιλεγόμενη [36]. PIPKIγ έχει αποδειχθεί ότι απαιτείται για το σχηματισμό εστιακή πρόσφυση κατά τη διάρκεια της EGF-διεγείρεται η κυτταρική μετανάστευση [30], ενώ έχει επίσης αναφερθεί ότι η έκφραση της PIPKIγ προκαλείται κυτταρική στρογγυλοποίηση και το εστιακό αποσυναρμολόγηση πρόσφυση [26].

Δείχνουμε εδώ ότι η έκφραση της PIPKIγ σε χαμηλά επίπεδα σε κύτταρα CHO-K1 διεγείρεται σχηματισμός εστιακών πρόσφυσης (Εικ. 1), ενώ μεταλλάξεις της κινάσης-νεκρό, PIPKIγ

K188,200R και PIPKIγ

D316K απέτυχε να προωθήσει το σχηματισμό εστιακής προσκόλλησης (Εικ . 2, Σχ. 4 και Σχ. S1). Επιπλέον, PIPKIγ κατήργησε σχεδόν εντελώς knockdown σχηματισμός εστιακών προσκόλληση σε HCT116 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου (Εικ. 5). Επιπλέον, η έκφραση της PIPKIγ προωθείται εστίασης συνέλευση πρόσφυση και αποσυναρμολόγηση ρυθμούς, ενώ PIPKIγ

K188,200R δεν ήταν σε θέση να το πράξει (Εικ. 3). Τα αποτελέσματα αυτά προσδιορίζουν ουσιαστικό ρόλο της PIPKIγ στη ρύθμιση εστίασης δυναμική πρόσφυση.

Αν και άμεσες αποδείξεις είναι ανύπαρκτη, PI (4,5) P

2 έχει επίσης εμπλακεί στη ρύθμιση της ενεργοποίησης ιντεγκρίνης. PI (4,5) P

2 δεσμεύει Ταλίν και μπλοκ αυτο-αναστολή (αλληλεπίδραση κεφάλι-ουρά) της προωθώντας έτσι την αλληλεπίδρασή του με την ιντεγκρίνης β ουρά [35]. Τονώνει επίσης ιντεγκρίνης clustering [31]. Η αύξηση τόσο Ταλίν-ιντεγκρίνης αλληλεπίδρασης και ιντεγκρίνης ομαδοποίηση θα πρέπει να τονώσει την ενεργοποίηση ιντεγκρίνης. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν PIPKIγ

K188,200R έχουν σημαντικά μικρότερη αντοχή προσκόλλησης σε σύγκριση με εκείνα που εκφράζουν την WT, και η εξάντληση των PIPKIγ με shRNA προκάλεσε επίσης σημαντική μείωση της αντοχής προσκόλλησης κυττάρων σε κύτταρα HCT116 (Εικ. 6), υποδηλώνοντας ότι PIPKIγ μπορεί να ρυθμίζουν την ενεργοποίηση ιντεγρίνης σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

έχει αναφερθεί ότι PIPKIγ απαιτείται για EGF-διεγερμένα μετανάστευση του MDA ΜΒ-231 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού και HeLa ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [30] , [37]. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας δείχνουν εδώ ότι ούτε εκφράζουν PIPKIγ

K188,200R, μία μεταλλαγμένη κινάση-νεκρή, ούτε η εξάντληση των PIPKIγ αναστέλλουν τη μετανάστευση των κυττάρων HCT116 (Εικ. S2). Τα κύτταρα MDA-MB-231 και HeLa μεταναστεύουν πολύ πιο γρήγορα από ό, τι τα κύτταρα HCT116, υποδηλώνοντας ότι PIPKIγ είναι απαραίτητη για τη γρήγορη κίνηση κύτταρα, αλλά όχι για βραδέως μεταναστεύοντα κύτταρα όπως τα κύτταρα HCT116. Αυτό υποστηρίζεται από αδημοσίευτες αποτέλεσμα μας ότι PIPKIγ

K188,200R αναστέλλει δραματικά τη μετανάστευση των κυττάρων Clone A, μια γρήγορη κίνηση καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή.

Από την άλλη πλευρά, PIPKIγ φαίνεται να απαιτείται για την η εισβολή των δύο ταχείας δράσης (όπως MDA-MB-231) και βραδείας εισβολής (όπως HCT116) καρκινικά κύτταρα. Η εξάντληση των PIPKIγ έχει δειχθεί ότι αναστέλλει EGF που διεγείρεται εισβολή των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα [37], και είτε εκφράζουν PIPKIγ

K188,200R ή την εξάντληση των PIPKIγ αναστέλλει την εισβολή των κυττάρων HCT116 (Εικ. 7). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ουσιαστικό ρόλο του PIPKIγ στον έλεγχο εισβολή καρκίνου.

Προηγούμενες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στο ρόλο της εστιακής προσκόλλησης αποσυναρμολόγησης στη ρύθμιση εισβολή καρκίνου. ΜΚΚ προωθεί γλοίωμα εισβολή με την προώθηση της εστιακής προσκόλλησης αποσυναρμολόγηση [6]. Filamin Α καταστέλλει τον καρκίνο του μαστού εισβολή κυττάρων με αναστολή εστιακή προσκόλληση αποσυναρμολόγηση [7]. ΡΑΚ προωθεί επίσης εστιακό αποσυναρμολόγηση προσκόλληση και την εισβολή του καρκίνου [9]. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τόσο η έκφραση της PIPKIγ

K188,200R, η κινάση-νεκρή μεταλλαγμένα, και η εξάντληση των PIPKIγ να εμποδίσουν το σχηματισμό εστιακή πρόσφυση, που συνοδεύει την αναστολή της εισβολής των HCT116 (Εικ. 4, 5 και 7). Επιπλέον, PIPKIγ διεγείρει τόσο την εστιακή συναρμολόγηση και αποσυναρμολόγηση προσκόλλησης (Εικ. 3), γεγονός που υποδηλώνει ότι ο κύκλος εργασιών εστιακή προσκόλληση, η οποία απαιτεί τη συναρμολόγηση εστιακή προσκόλληση και αποσυναρμολόγηση χωρικά και προσωρινά, ρυθμίζει την εισβολή των καρκινικών κυττάρων.

PIPKIγ είναι ένα κύριο ένζυμο που ελέγχει polyphosphoinositide μεταβολισμό στα κύτταρα HCT116. PIPKIγ νοκ ντάουν ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του επιπέδου των PI (4,5) P

2 και μειώνει PI (3,4,5) P

3 επίπεδα, ακόμη πιο σημαντικά (Εικ. 8). ΡΙ (3,4,5) Ρ

3 παίζει έναν σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση και τη μετάσταση του καρκίνου. Ωστόσο, PIPKIγ knockdown δεν επηρεάζει την ενεργοποίηση του Akt, ένας κύριος στόχος της ΡΙ (3,4,5) Ρ

3, σε κύτταρα HCT116 (τα δεδομένα δεν φαίνονται), πιθανώς επειδή Akt μπορεί να ενεργοποιηθεί με ΡΙ (3, 4) P

2, η οποία δεν επηρεάζεται άμεσα από PIPKIγ.

Αναστολή της ΡΙ 3-κινάσης χρησιμοποιώντας LY294002 δεν επηρεάζει τον σχηματισμό εστιακή προσκόλληση στα κύτταρα HCT116, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ΡΙ (4,5) P

2 αντί του PI (3,4,5) P

3 είναι υπεύθυνη για PIPKIγ μεσολάβηση σχηματισμό εστιακό πρόσφυση. ΡΙ (4,5) Ρ

2 προάγει σύνδεση προς Talin και ακτίνη βινκουλίνης και έχει αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητη για το σχηματισμό εστιακών προσκόλληση [32]. Το αποτέλεσμά μας δείχνει ότι PIPKIγ ρυθμίζει βινκουλίνης εντοπισμού σε εστιακό συμφύσεις στα κύτταρα HCT116 (Εικ. 9). Στο σύνολό τους, είναι πιο πιθανό ότι PIPKIγ ρυθμίζει το σχηματισμό εστιακή πρόσφυση μέσω PI (4,5) P

2-μεσολαβητική ενεργοποίηση βινκουλίνης.

εισβολή Ο καρκίνος είναι μια περίπλοκη διαδικασία, που απαιτεί χωρική και προσωρινή ρύθμιση της κυτταρικής -matrix συμφύσεις, οι προεξοχές των κυττάρων και μήτρα υποβάθμιση [38]. PI (4,5) P

2 που παράγονται από PIPKIγ ρυθμίζει την εισβολή του καρκίνου μέσω της διαμόρφωσης δυναμική κυτταρική προσκόλληση. Αν και PI (3,4,5) P

3 δεν είναι απαραίτητη για το σχηματισμό εστιακή πρόσφυση, μπορεί επίσης να διαδραματίσει έναν ρόλο σε άλλες πτυχές της εισβολής καρκίνου, πιθανότατα μέσω ενεργοποίησης Rac [39].

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Anti-παξιλλίνης αντίσωμα (κλώνος 5H11) ήταν από την Millipore? Anti-PIPKIγ πολύκλωνο αντίσωμα ήταν από τη Cell Signaling Technology? Αντι-τουμπουλίνης και pLKO1 φακοϊού PIPKIγ shRNA (ακολουθία: CCG GGC AGT ΚΔ ACA GGT TCA TCA ACT CGA GTT GAT GAA ΚΔ GTA GGA CTG CTT ΤΤΤ G) ήταν από Sigma? DyLight 549 συζευγμένου αντισώματος κατσίκας αντι-ποντικού IgG (H + L) ήταν από την Thermo Scientific? Ινονεκτίνη και ανασυνδυασμένου HGF ήταν από Akron Biotech? παράγοντα ανάπτυξης μειώνεται Matrigel ήταν από BD Bioscience? Το πλασμίδιο pEGFP-PIPKIγ ήταν ένα δώρο από τον Δρ Μαρκ Ginsberg (Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας-Σαν Ντιέγκο)? Pfu Ultra ήταν από την Agilent Technologies? εκκινητών DNA συντέθηκαν από το Ολοκληρωμένο DNA Technologies.

πλασμίδιο κατασκευή

Το πλασμίδιο pEGFP-PIPKIγ

W647F δημιουργήθηκε από pfu Ultra-based PCR χρησιμοποιώντας pEGFP-PIPKIγ ως πρότυπο και 5′ GAT GAG ΑΓΓ AGC ΤΤΤ GTG TAC TCC CCG CTC-3/5-GAG CGG GGA GTA CAC ΑΑΑ GCT ΚΔ CTC ATC-3 ‘ως εκκινητές. pEGFP-PIPKIγ

K188,200R και ΡΖΖ-PIPKIγ

K188,200R δημιουργήθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας pEGFP-PIPKIγ και ΡΖΖ-PIPKIγ [40] ως πρότυπα, αντίστοιχα, και διαδοχικά 5′-GAC GAG ΤΤΟ ATC ATC ΑΓΓ ACC GTC ATG CAC-3/5-ΟΤΟ CAT GAC GGT ΚΔ GAT GAT GAA CTC GTC-3 ‘και 5’-GTT ΚΔ GCA GAG GCT GCT CCC ΤΟΟ CTA C-3/5-GTA GCC AGG GAG CAG ΚΔ CTG CAG GAA C-3 ‘ως εκκινητές.