Αφηρημένο

Οι περισσότεροι ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με αναστολείς της κινάσης του EGFR-τυροσίνης (EGFR-TKIs) τελικά αναπτύξει επίκτητη αντοχή. Απώλεια της έκφρασης του αυξητικού παράγοντα που μοιάζει με ινσουλίνη (IGF) -σύνδεση πρωτεΐνη-3 (IGFBP-3) έχει προταθεί ως πιθανός μηχανισμός της αντοχής σε EGFR-TKIs στο Α431 και κυτταρικές σειρές HN11. Εδώ, ερευνήσαμε IGFBP-3 έκφραση σε δύο EGFR μεταλλαγμένο καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών με αντίσταση σε EGFR-ΤΚΙδ και εξέτασε την αξία του επιπέδου IGFBP-3 στον ορό ως δείκτη αντίστασης. Το αποτέλεσμα της επαγωγής ή καταστολής της IGFBP-3 έκφραση σε αντίσταση αξιολογήθηκε επίσης. ιδρύθηκαν HCC827 sublines με αντοχή στο gefitinib (HCC827 /GR) και erlotinib (HCC827 /ER). Απώλεια IGFBP-3 έκφραση ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western και στις δύο κυτταρικές σειρές χωρίς αλλαγές στην μεταγραφική δραστικότητα, και ELISA έδειξαν σημαντικά χαμηλότερες ποσότητες εκκρίνονται IGFBP-3 στο μέσο καλλιέργειας των μεταλλαγμένων κυτταρικών σειρών από ό, τι εκείνη του πατρική γραμμή. Παρά την απώλεια του IGFBP-3 έκφραση, η δραστικότητα σηματοδότησης IGFR παρέμεινε αμετάβλητη. Εξαναγκασμένη έκφραση του IGFBP-3 από τον αδενοϊό διαμόλυνση με μεσολάβηση ή ανασυνδυασμένο IGFBP-3 αυξήθηκαν ελαφρά τις ανασταλτικές της ανάπτυξης και αποπτωτικά αποτελέσματα του EGFR-ΤΚΙδ, ενώ η καταστολή της IGFBP-3 δεν επηρέασε την ευαισθησία στην EGFR-ΤΚΙ. Ορός IGFBP-3 επίπεδα μετρήθηκαν με ELISA πριν και μετά την ανάπτυξη της αντοχής του EGFR ΤΚΙ σε 20 ασθενείς δεν έδειξαν σημαντικές μεταβολές (1815.3 ± 94.6 ng /mL πριν από τη θεραπεία έναντι 1778,9 ± 87,8 ng /mL μετά αντίσταση EGFR-ΤΚΙ). Εν περιλήψει, αν και IGFBP-3 προς τα κάτω ρύθμιση συνδέεται με την απόκτηση αντοχής σε EGFR-TKIs ανεξάρτητα από το μηχανισμό, το αποτέλεσμά της επί αντίσταση δεν ήταν σημαντική, υποδεικνύοντας ότι η IGFBP-3 δεν μπορεί να παίξει ένα σημαντικό ρόλο στην αντίσταση σε EGFR-TKIs και επιπέδου IGFBP-3 ορού δεν αποτελεί αξιόπιστο δείκτη της αντίστασης

Παράθεση:. Choi YJ, Πάρκο GM, Rho JK, Kim SY, λοιπόν GS, Kim HR, et al. (2013) Ο ρόλος του IGF-Binding Protein 3 στο αντίσταση των κυττάρων EGFR Mutant Καρκίνο του Πνεύμονα σε αναστολείς EGFR-κινάσης τυροσίνης. PLoS ONE 8 (12): e81393. doi: 10.1371 /journal.pone.0081393

Επιμέλεια: Giuseppe Viglietto, Πανεπιστήμιο Magna Graecia, Ιταλία

Ελήφθη: May 13, 2013? Αποδεκτές: 14 Οκτ 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Δεκ, 2013

Copyright: © 2013 Choi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση (2011-467) από Ασάν Ινστιτούτο Life Science, Σεούλ, Κορέα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

EGFR είναι ένας υποδοχέας διαμεμβράνης που ανήκει σε μια οικογένεια τεσσάρων σχετικών πρωτεϊνών, EGFR (ErbB-1), HER2 /neu (ErbB-2), HER3 (ErbB-3) και HER4 (ErbB-4) [1]. Μετά τη σύνδεση συνδετήρα, μορφές EGFR ομο- ή ετεροδιμερή με άλλους υποδοχείς ErbB που οδηγεί στην ενεργοποίηση της ενδοκυτταρικής καταρρακτών σηματοδότησης. Οι δύο κύριες ενδοκυτταρικές οδοί ενεργοποιούνται από EGFR είναι τα RAS-RAF-ΜΕΚ-ΜΑΡΚ μονοπάτι, η οποία ελέγχει τη μεταγραφή γονιδίων, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό πολλαπλασιασμό, και ο ΡΙ3Κ-Akt μονοπάτι, το οποίο ενεργοποιεί έναν καταρράκτη των αντι-αποπτωτικών και prosurvival σήματα [2].

μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLCs) που φιλοξενούν την ενεργοποίηση μεταλλάξεις ή /και ενίσχυση της θέσεως EGFR είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε αναστολείς κινάσης EGFR-τυροσίνη (ΤΚΙδ) όπως gefitinib (Iressa? AstraZeneca International) και erlotinib (Tarceva? OSI Pharmaceuticals) [3] – [9]. Περίπου 70-80% των NSCLCs φιλοξενούν ένα σωματική μετάλλαξη στην περιοχή κινάσης της τυροσίνης του γονιδίου EGFR ανταποκρίνονται στο gefitinib /erlotinib [3], [4], [10]. Ωστόσο, επίκτητη αντοχή σε θεραπεία EGFR-ΤΚΙ σχεδόν πάντα αναπτύσσεται μετά από ένα μέσο όρο περίπου 10 μήνες από την έναρξη της θεραπείας, ακόμη και σε ασθενείς οι οποίοι εμφανίζουν μια αρχική δραματική απόκριση σε αυτούς τους παράγοντες. Επίκτητη αντοχή έχει συσχετιστεί με μια δευτερεύουσα μετάλλαξη στο γονίδιο EGFR, Τ790Μ [11], [12], η οποία έχει ανιχνευθεί σε περίπου 50% των καρκίνων με επίκτητη ανθεκτικότητα σε EGFR-TKIs [13], [14]. Επιπλέον, η ενίσχυση του ογκογονιδίου ΜΕΤ ταυτοποιήθηκε ως ένα άλλο μηχανισμό της επίκτητης αντοχής διαμεσολαβείται από την φωσφορυλίωση του ErbB-3 και την επακόλουθη ενεργοποίηση των ΡΙ3Κ [15], [16]. Παρομοίως, υπερέκφραση της κινάσης AXL έχει συσχετιστεί με αντίσταση σε EGFR-TKIs [17].

Σε μια πρόσφατη μελέτη, η απώλεια της έκφρασης του αυξητικού παράγοντα που μοιάζει με ινσουλίνη (IGF) -σύνδεση πρωτεΐνη 3 (IGFBP- 3) προτάθηκε ως πιθανός μηχανισμός ανθεκτικότητας στον κυτταρικές σειρές HN11 Α431 και [18]. Στη μελέτη αυτή, επίκτητη ανθεκτικότητα σε EGFR-TKIs μοντελοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το καρκίνο πλακωδών κυττάρων γραμμή Α431, που φιλοξενεί ενίσχυση γονιδίου EGFR φυσικού τύπου. Η Α431 κυτταρική γραμμή gefitinib ανθεκτική Α431 GR διατήρησε σηματοδότηση ΡΙ3Κ παρουσία gefitinib με την ενεργοποίηση του μονοπατιού ΙΟΡ1 υποδοχέα (IGF1R). Η αναστολή της σηματοδότησης IGF1R αποκατέστησε την ικανότητα του gefitinib να ρυθμίζουν προς τα κάτω ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότηση και αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων Α431 ΓΡ. Οι αναλύσεις έκφρασης γονιδίων έδειξαν σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση της IGFBP-3 έκφραση σε κύτταρα Α431 GR, και η προσθήκη ανασυνδυασμένης IGFBP-3 αποκατέστησε την ικανότητα του gefitinib να ρυθμίζουν προς τα κάτω ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότησης και να αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων. Σε ένα διαφορετικό υπόδειγμα της επίκτητης αντοχής gefitinib εγκατεστημένος στο gefitinib ευαίσθητη φυσικού τύπου EGFR εκφράζουν HN11 καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κυτταρική γραμμή, η φωσφορυλίωση της Akt διατηρήθηκε με την παρουσία του gefitinib, και αντίσταση ξεπεραστεί από συνδυάστηκαν EGFR και αναστολή IGF1R. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι η απώλεια της έκφρασης του IGFBPs σε καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με EGFR-ΤΚΙδ σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της σηματοδότησης IGF1R, η οποία με τη σειρά της προκαλεί αντίσταση σε ανταγωνιστές EGFR. Ως εκ τούτου, συνδυασμένη θεραπευτική αναστολή του EGFR και IGF1R μπορεί να καταργήσει αυτή απέκτησε μηχανισμός αντοχής φαρμάκου. Ωστόσο, ένα μοντέλο της επίκτητης αντίστασης σε gefitinib δεν έχει αναπτυχθεί σε EGFR μεταλλαγμένο κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, η οποία είναι κλινικής σημασίας.

Οι περισσότερες από τις κυκλοφορούντος IGF-1 συνδέεται με την κύρια πρωτεΐνη IGF-δέσμευσης, IGFBP- 3 [19]. Οι συγκεντρώσεις στον ορό IGF-1 και IGFBP-3 μπορεί να μετρηθεί εύκολα και θα μπορούσαν να έχουν αξία ως δείκτες του κινδύνου καρκίνου. Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η υψηλή IGF-1 και τα χαμηλά επίπεδα IGFBP-3 είναι ανεξάρτητα συνδέεται με υψηλό κίνδυνο συνηθισμένων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [20]. IGFBP-3 έχει προταθεί ως πιθανός στόχος για θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα, όπως αδενοϊό μεσολάβηση υπερέκφραση της IGFBP-3 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC in vitro και in vivo με επαγωγή απόπτωσης μέσω της αναστολής της ΡΙ3Κ /Akt /ΡΚΒ και ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης [21].

στην παρούσα μελέτη, η έκφραση IGFBP-3 εξετάστηκε σε EGFR κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα μεταλλαγμένο με επίκτητη ανθεκτικότητα σε EGFR-ΤΚΙδ, και η τιμή του επιπέδου IGFBP-3 ορού αξιολογήθηκε ως δείκτη αντίστασης. Η επίδραση της επαγόμενης IGFBP-3 για την υπέρβαση αντίσταση αξιολογήθηκε επίσης.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και αντιδραστήρια

Η HCC827 κυτταρική σειρά αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC: Rockville, MD, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 2 mM L-γλουταμίνη και 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη, και διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο που περιέχει 5% CO

2. Gefitinib και erlotinib ήταν η αγορά από Σέλεκ Χημικών Προϊόντων (Houston, TX, USA). Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IGFBP-3 (rh IGFBP-3) αγοράσθηκε από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Ο αδενοϊικός φορέας που εκφράζει ανθρώπινο IGFBP-3 (Ad /IGFBP3) παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Ho-Young Lee (Το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο) [21].

Ίδρυση του Gefitinib- και Erlotinib ανθεκτικών κυτταρικών γραμμών

gefitinib και παραλλαγές ερλοτινίμπη ανθεκτικές του HCC827 απομονώθηκαν με σταδιακή έκθεση σε αυξανόμενες δόσεις gefitinib και erlotinib. HCC827 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ gefitinib και erlotinib για 72 ώρες. Τα κύτταρα εκτίθενται συνεχώς σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις φαρμάκου μέχρι 1 μΜ πάνω από 8 μηνών. EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικές αποικίες επελέγησαν σε συγκεντρώσεις έκθεσης 5 μΜ και των δύο απομονωμένων κλώνων χαρακτηρίστηκαν ως HCC827 /GR και HCC827 /ER, αντίστοιχα. Δημιουργία κυτταρικής γραμμής HCC827 /ER έχει περιγραφεί προηγουμένως [17]. Ανθεκτικά κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για τουλάχιστον 2 εβδομάδες πριν από τα πειράματα για την εξάλειψη των επιδράσεων των φαρμάκων.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την ΜΤΤ δοκιμασία και trypan καταμέτρηση μπλε κυττάρων. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 96 φρεατίων στείρες πλαστικές πλάκες και εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις φαρμάκων σε μέσο που περιείχε 1% FBS. Μετά από 72 ώρες, 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) προστέθηκε και κρυσταλλική φορμαζάνη διαλυτοποιήθηκαν με διάλυμα δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS).

τα αποτελέσματα συνδυασμό αξιολογήθηκαν με την trypan καταμέτρηση μπλε κυττάρων. HCC827 /GR και HCC827 /ER κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 60 mm και κατεργάζεται με EGFR-ΤΚΙδ και Ad /μόλυνση IGFBP-3 ή rh IGFBP-3 για 72 ώρες σε μέσο που περιείχε 1% FBS. Οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν με μια ADAM-MC αυτόματο απαριθμητή κυττάρων (NanoEnTek, Σεούλ, Κορέα), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και οι ράβδοι σφάλματος σημαίνουν τυπικές αποκλίσεις (SDS).

Western Blot

Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές, και ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε Immobilon-P μεμβράνες (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA). Αντισώματα ειδικά για ρ-EGFR, EGFR, ΚΟΑ, Her2, Her3, IGF1R, π-Ακί, Akt, π-ΕΚΚ, ΕΚΚ, ο Axl, IGFBP-3 και ακτίνης λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), και εκείνα για τα ρ-HER2, ρ-ErbB3, ρ-ΜΕΤ και ρ-IGF1R (Tyr1131 και Tyr1135 /1136) από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια κηλίδωση Western kit (Amersham Biosciences, NJ, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ημι-ποσοτική Reverse Transcription Chain-αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Σύνολο απομόνωση RNA και σύνθεση cDNA εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο RNA mini-kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) και αντιδραστήριο μίγμα Accupower RT, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Bioneer Corp., Σεούλ, Κορέα). Οι αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων για ενίσχυση ήταν ως ακολούθως: πρόσθιος εκκινητής, 5′-ATATGGTCCCTGCCGTAGA-3 ‘, και αντίστροφο εκκινητή, 5′-AAATCGAGGCTGTAGCCAG-3′, για IGFBP-3? πρόσθιο εκκινητή, 5’-GCGAGAAGATGACCCAGATC-3 ‘και αντίστροφος εκκινητής, 5′-CCAGTGGTACGGCCAGAGG-3’, για την β-ακτίνη.

Η επιμόλυνση των μικρό παρεμβαλλόμενο RNA

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA ) ολιγονουκλεοτίδια ειδικά σε IGFBP-3 ελήφθησαν από την Thermo (Thermo Electron Corp., Waltham, ΜΑ? IGFBP-3 siRNA-1) και Qiagen (IGFBP-3 siRNA-2). Η επιμόλυνση του siRNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. έκφραση του γονιδίου-στόχου μετρήθηκε 24 ώρες αργότερα με τη χρήση ανάλυσης στυπώματος Western. Για τη δοκιμασία ΜΤΤ, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων μετά μορφομετατροπή siRNA, έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες φάρμακα για 72 ώρες.

ELISA για Serum IGFBP-3 ELISA

Υπολειμματική ορό μετά ρουτίνα δοκιμή χημεία συλλέχθηκαν από 20 ασθενείς πριν από τη θεραπεία με EGFR ΤΚΙ και μετά την εξαγορά της αντίστασης EGFR-TKIs με τη γραπτή συγκατάθεση. Είναι αποθηκεύθηκε στους -80 ° C μέχρι τον προσδιορισμό. IGFBP-3 Οι συγκεντρώσεις στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας και ορό μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μια ανθρώπινη IGFBP-3 κιτ ELISA (R &? D Systems, ΜΜ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα ορού αραιώθηκαν σε 1:100 σε ρυθμιστικό αραιωτικό περιλαμβάνεται στο κιτ και αναλύθηκαν εις διπλούν. Αυτή η δοκιμασία διεξήχθη σε ένα ερευνητικό εργαστήριο του Ασάν Ιατρικό Κέντρο και το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Ασάν Ιατρικό Κέντρο (IRB Όχι? 2010 – 0267)

Στατιστική Ανάλυση

. Εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά, όλες οι τιμές δίνονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση για τις συνεχείς μεταβλητές ή συχνότητες και τοις εκατό για κατηγορικές μεταβλητές. Οι συνεχείς μεταβλητές συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το Mann-Whitney U. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS (έκδοση 12.0, IBM-SPSS, Armonk, NY).

Αποτελέσματα

Δημιουργία και Χαρακτηρισμός των Gefitinib και Erlotinib ανθεκτικά HCC827 κύτταρα με διαγραφή Μετάλλαξη Εξόνιο 19 του EGFR Gene

Δύο EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτική υποσειρές, HCC827 /GR και HCC827 /ER, καθιερώθηκαν από τη γονική HCC827 κύτταρα με συνεχή έκθεση στο gefitinib και erlotinib σε μια περίοδο οκτώ μηνών. Οι επιδράσεις της erlotinib στη βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκαν με την δοκιμασία ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, το IC

50 τιμές για gefitinib και erlotinib ήταν 1000 φορές υψηλότερη στον HCC827 /γραμμές GR και HCC827 κύτταρο /ER ό, τι σε γονικά κύτταρα HCC827, και οι EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτική υποσειρές εμφάνισαν διασταυρούμενη αντίσταση σε κάθε αναστολέα. Η έκφραση και η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών σηματοδότησης που συνδέονται με EGFR που εμπλέκονται στην ευαισθησία σε EGFR-TKIs εκτιμήθηκαν με κηλίδωση Western. MET έκφραση και ενεργοποίηση αυξήθηκαν σε HCC827 /κύτταρα GR (Σχήμα 2Α) που φιλοξενούν γονιδιακή ενίσχυση ΚΟΑ (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι το ΚΟΑ ενίσχυση συμβάλλει στην ανθεκτικότητα σε κύτταρα HCC827 /GR. Αυτό υποστηρίχθηκε από θεραπεία συνδυασμού με EGFR-ΤΚΙ και PHA665752, έναν αναστολέα ΜΕΤ, το οποίο κατέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη των κυττάρων HCC827 /GR (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε HCC827 κύτταρα /ER, συνολική και ενεργοποιημένα EGFR ρυθμίστηκαν προς τα κάτω, και τα επίπεδα Her2, Her3 και ΜΕΤ ήταν σημαντικά χαμηλότερες από εκείνες των μητρικών κυττάρων (Σχήμα 2Α). Ωστόσο, η έκφραση της κινάσης Axl ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα HCC827 /ER σε σχέση με την γονική γραμμή, όπως αναφέρθηκε στην προηγούμενη μελέτη μας (17). Η δευτερεύουσα μετάλλαξη Τ790Μ δεν ανιχνεύθηκε στα /γραμμές HCC827 GR και HCC827 κυττάρου /ER με ανάλυση αλληλουχίας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για την αξιολόγηση των ανασταλτικών αποτελεσμάτων των EGFR-TKIs σχετικά με το ΚΟΑ περαιτέρω, EGFR και κατάντη σήματα τους, HCC827, HCC827 /GR και κυττάρων HCC827 /ER υποβλήθηκαν σε θεραπεία με gefitinib και erlotinib για 72 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β και C, το EGFR-TKIs ανέστειλε φωσφορυλίωση EGFR σε γονέα και ανθεκτικά κύτταρα, αλλά δεν καταστέλλει την ενεργοποίηση ΜΕΤ σε HCC827 /GR, το οποίο διέφερε από τις άλλες κυτταρικές γραμμές? σηματοδότησης κατάντη Akt ήταν επίμονα δραστηριοποιείται στους ανθεκτικά sublines HCC827 /GR και HCC827 /ER.

HCC827, HCC827 /GR και HCC827 /Er2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τις αναφερόμενες συγκεντρώσεις του gefitinib και erlotinib για 72 ώρες σε μέσο που περιέχει 1% FBS. Κυτταρική βιωσιμότητα και IC

50 τιμές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ.

Η

(Α) βασική έκφραση του EGFR και EGFR που σχετίζονται με μόρια σηματοδότησης σε HCC827, κύτταρα HCC827 /GR και HCC827 /ER ήταν αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western. Εξετάστηκαν επίσης οι επιπτώσεις της gefitinib (Β) και erlotinib (C) για σηματοδότηση EGFR σχετίζονται. HCC827, HCC827 /GR και HCC827 /ER κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,1 και 1 μΜ gefitinib και erlotinib για 72 ώρες σε μέσο που περιείχε 1% FBS. Πρωτεΐνη (30 μg) από κυτταρολύματα υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες.

Η

Απώλεια IGFBP-3 σε HCC827 /GR και HCC827 /ER Cells

Αξιολόγηση της IGFBP-3 έκφρασης και IGF1R σηματοδότησης σε γονικά και ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές έδειξαν ότι IGFBP-3 έκφραση ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε HCC827 /GR και κύτταρα /ER HCC827? Ωστόσο, δεν ανιχνεύθηκαν σημαντικές διαφορές στην ολική και ενεργοποιημένα IGF1R μεταξύ ανθεκτικών και γονικών κυττάρων (Σχήμα 2). έκκριση IGFBP-3 μειώθηκε σημαντικά σε HCC827 κύτταρα /GR και HCC827 /ER παράλληλα με μειωμένο επίπεδο έκφρασης του (Εικόνα 3Β). Ωστόσο, καμία συσχέτιση μεταξύ της πρωτεΐνης IGFBP-3 και τα επίπεδα mRNA ανιχνεύτηκε (Σχήμα 3Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι η προς τα κάτω ρύθμιση της IGFBP-3 λαμβάνει χώρα σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο.

IGFBP-3 mRNA (Α) και εκκρίνεται IGFBP-3 (Β) προσδιορίστηκαν με RT-PCR και ELISA σε HCC827, HCC827 /GR και HCC827 /ER. Η ELISA επαναλήφθηκε τρεις φορές και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση (SD). *

P

& lt?. 0.001 σε σύγκριση με HCC827 κύτταρα

Η

Ευαισθησία σε EGFR-TKIs σε ανθεκτικά κύτταρα δεν αποκατασταθεί από την επαγωγή της IGFBP-3

Για να διερευνήσουν η συμμετοχή των IGFBP-3 στο αντίσταση σε EGFR-ΤΚΙδ, HCC827 κύτταρα /GR ήταν ψευδο-μολύνθηκαν ή μολύνθηκαν με Ad /IGFBP-3, και επαγωγή της IGFBP-3 έκφραση αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, IGFBP-3 επίπεδα ήταν σημαντικά υψηλότερα σε HCC827 /κυττάρων GR μολυσμένα με διάφορους τίτλους ad /IGFBP-3 σε σύγκριση με ψευδο-μολυσμένα κύτταρα, η οποία επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western με ένα αντίσωμα αντι-σημαία. Επιπλέον, IGFBP-3 έκκριση μέσα στο μέσο καλλιέργειας των μολυσμένων HCC827 /GR και HCC827 /ER αυξήθηκε όπως μετρήθηκε με ELISA (Σχήμα 4Β). Για να εξεταστεί η επίδραση του EGFR-TKIs επί IGFBP-3 κύτταρα που υπερεκφράζουν, τα κύτταρα μολύνθηκαν με Ad /IGFBP-3 στους 100 ΜΟΙ και επεξεργάστηκε με EGFR-TKIs. Ωστόσο, συν-θεραπεία με Ad /IGFBP-3 και EGFR-TKIs δεν ανέστειλε αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 4C). Για να εξεταστεί περαιτέρω ο ρόλος του IGFBP-3 σε αντίσταση, HCC827 /GR και HCC827 /ER κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μg /mL ανασυνδυασμένο ανθρώπινο (rh) IGFBP-3 και 1 μΜ EGFR-TKIs για 72 ώρες. Συνδυασμένη θεραπεία οδήγησε σε μέτρια αναστολή της ανάπτυξης σε HCC827 /GR και HCC827 /ER (37,0% και 32,8%, αντίστοιχα) παρά την υψηλή συγκέντρωση του rh IGFBP-3 (Εικόνα 4D). Αν και η αποκατάσταση της IGFBP-3 ανέστειλε δραστηριότητα IGF1R, δεν θα μπορούσε να μειώσει Akt δραστηριότητα (Σχήμα 4Ε και F). Παρομοίως, η καταστολή της IGFBP-3 ενισχύεται ελαφρώς τη δραστηριότητα IGF1R (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), αλλά ευαισθησία σε EGFR-TKIs δεν επηρεάστηκε (Εικόνα 4G και Η). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αν και η επαγωγή της IGFBP-3 αυξήθηκαν ελαφρά την επίδραση των EGFR-ΤΚΙδ, ήταν ανεπαρκής για να υπερνικήσει EGFR-ΤΚΙ-επίκτητη αντοχή, υποδεικνύοντας ότι η απώλεια του IGFP-3 δεν μπορεί να είναι ο κύριος μηχανισμός ανθεκτικότητας σε HCC827 κύτταρα.

ανθεκτικά κύτταρα μολύνθηκαν με Ad /IGFBP-3 σε ΜΟΙ από το 0 έως 100 ΡΡΙΙ /κύτταρο για 48 ώρες και IGFBP-3 έκφραση προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western (Α) και ELISA (Β). (Γ) HCC827 /GR και κυττάρων HCC827 /ER υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του EGFR-TKIs για 72 ώρες μετά τη μόλυνση με 100 ΜΟΙ Ad /IGFBP-3. (D) HCC827 κύτταρα /GR και HCC827 /ER υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ EGFR-ΤΚΙδ και 1 μg /mL rh IGFBP-3 για 72 ώρες. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα, και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση (SD). (Ε και F) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με φάρμακα, rh IGFBP-3 ή Ad /IGFBP-3, όπως στο πάνελ C και D. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η διαμόρφωση του EGFR και IGF1R σηματοδότησης στις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. (G) Έλεγχος και IGFBP-3 siRNAs (100 ηΜ) εισήχθησαν σε HCC827 κύτταρα, και IGFBP-3 καταστολή επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western. (H) Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ 72 ώρες αργότερα.

Η

είναι ορός IGFBP3 επίπεδα δεν συσχετίζεται με την ανθεκτικότητα σε EGFR-TKIs

Serum επίπεδο IGFBP-3 μετρήθηκε με ELISA σε 20 ασθενείς με NSCLC που έδειξαν μερική ανταπόκριση στη θεραπεία EGFR-ΤΚΙ. Από αυτούς τους 20 ασθενείς, 16 είχαν μεταλλάξεις του EGFR και τέσσερις δεν αξιολογήθηκαν. Ορός IGFBP-3 επίπεδα δεν μεταβλήθηκαν σε απάντηση στην ανάπτυξη αντοχής σε EGFR-ΤΚΙδ (1815.3 ± 94.6 ng /mL πριν από τη θεραπεία έναντι 1778,9 ± 87,8 ng /mL μετά αντίσταση EGFR-ΤΚΙ, ρ = 0.678, Εικόνα 5).

IGFBP-3 επίπεδα προσδιορίστηκαν με ELISA στον ορό των ασθενών με NSCLC. Επίκτητη αντοχή αναπτυχθεί σε όλους τους ασθενείς που αρχικά ανταποκρίθηκαν σε EGFR-TKIs.

Η

Συζήτηση

Το μονοπάτι του IGF παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση της εμβρυϊκής ανάπτυξης, την ανάπτυξη των ιστών και το μεταβολισμό. Δύο ξεχωριστές συνδετήρες (IGF-1 και IGF-2) συν ινσουλίνη, και δύο υποδοχείς (IGF-1 R και του υποδοχέα της ινσουλίνης) ικανό τόσο ομο- και heteropolymerisation διαμεσολαβούν τις δράσεις αυτής της οδού [22]. IGF-1 R έχει 15 έως 20 φορές υψηλότερη συγγένεια για τον IGF-1 από ό, τι για τον IGF-2, και όλες οι IGFBPs έχουν μεγαλύτερη συγγένεια για τον συνδέτη IGF από τις αντίστοιχες IGF-υποδοχείς. Ως εκ τούτου, οι δραστηριότητες των IGF ρυθμίζεται αυστηρά από μια οικογένεια IGFBPs, και έχουν τουλάχιστον έξι IGFBPs (IGFBP-1 με IGFBP-6) έχουν ταυτοποιηθεί. Μεταξύ αυτών, η IGFBP-3 είναι η κυρίαρχη κυκλοφορούσα εταίρο δέσμευσης του IGF, αντιπροσωπεύοντας το 70-80% των IGF-1 δεσμευτική [23]. IGFBP-3 έχει από καιρό καθιερωθεί ως ισχυρός αρνητικός ρυθμιστής της ενεργοποίησης του IGF-1 R και πιστεύεται να εμποδίσει σύνδεσης συνδετήρα, αν και μπορεί επίσης να έχει IGF-ανεξάρτητο αντιπολλαπλασιαστικές δραστηριότητες [24].

Απορρύθμιση της σηματοδότησης IGF έχει έχουν περιγραφεί σε διάφορους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα. Πρόσφατα, η αναστολή της IGFR δείχθηκε να ενισχύσει τις ανασταλτικές της ανάπτυξης και αποπτωτικά αποτελέσματα του geftinib σε H1650 κύτταρα, τα οποία εμφανίζουν πρωτογενή αντίσταση σε EGFR-TKIs παρά το ότι έχει μια μετάλλαξη εξάλειψης σε εξώνιο 19 του γονιδίου EGFR. Αυτό το αποτέλεσμα υποδήλωσε ότι η συνδυασμένη αναστολή της IGFR μπορούσε να είναι χρήσιμη για την αντιμετώπιση αντίστασης σε EGFR-TKIs στον καρκίνο του πνεύμονα [25]. Ένας αριθμός αναστολέων υποδοχέων IGF, συμπεριλαμβανομένων μονοκλωνικών αντισωμάτων και αναστολέων μικρών μορίων είναι σήμερα σε κλινικές δοκιμές.

IGFBP-3 έκφραση είναι σημαντικά προς τα κάτω σε Α431 gefitinib-ανθεκτικά κύτταρα, τα οποία αναπτύσσονται υπό συνθήκες αναστολής χρόνιας EGFR [ ,,,0],18], και η θεραπεία αυτών των κυττάρων με AG1478, ένα EGFR-ΤΚΙ, ρυθμίζει προς τα κάτω IGFBP-3 [26]. Αυτά τα αποτελέσματα μπορεί να εξηγήσει την προσαρμογή των κυττάρων που αναπτύσσονται κάτω από συνθήκες αναστολής EGFR, που ενεργοποιούν το μονοπάτι που οδηγεί σε IGFIR ΡΙ3Κ σηματοδότησης /ΑΚΤ. Επανέκθεση των Α431 κυττάρων GR σε IGFBP-3 resensitised τόσο την οδό ΡΙ3Κ και κυτταρικής επιβίωσης στις επιδράσεις της gefitinib [18]. Ωστόσο, ένα μοντέλο της επίκτητης αντοχής σε gefitinib στο EGFR μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα δεν έχει αναπτυχθεί μέχρι σήμερα, παρά το γεγονός ότι η εξαγορά της αντίστασης EGFR-ΤΚΙ σε ασθενείς με NSCLC με μεταλλάξεις του EGFR υπογραμμίζει κλινική σημασία της. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, έχουμε δημιουργήσει δύο EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτική υποσειρές (HCC827 /GR και HCC827 /ER) από γονικά κύτταρα HCC827, τα οποία είναι ευαίσθητα σε EGFR-TKIs λόγω της μετάλλαξης διαγραφής στο εξόνιο 19, με συνεχή έκθεση σε gefitinib και erlotinib.

και οι δύο κυτταρικές σειρές έδειξε προς τα κάτω ρύθμιση της IGFBP-3 έκφραση με αποτύπωση κατά Western χωρίς αλλαγές στην μεταγραφική δραστηριότητα και ανεξάρτητα από το μηχανισμό αντίστασης. Επιπλέον, το επίπεδο της εκκρινόμενης IGFBP-3 στο μέσο καλλιέργειας των κυττάρων ανθεκτικών μειώθηκε σημαντικά, όπως φαίνεται με ELISA. Ωστόσο, καμία αλλαγή στην IGFR σηματοδότηση ανιχνεύθηκαν παρά την απώλεια του IGFBP-3. Αυτό το αποτέλεσμα έρχεται σε αντίθεση με εκείνο της προηγούμενης μελέτης δείχνουν ότι η απώλεια της έκφρασης του IGFBPs σε καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με EGFR-TKIs ενεργοποιεί IGFIR σηματοδότηση [18]. Αυτή η διαφορά θα μπορούσε να έχει προκληθεί από ταυτόχρονες αλλαγές σε συνδέτες όπως IGF-1 ή IGF-2, το επίπεδο της IGFBP-3, αν και η έννοια αυτή θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω.

Lee et al. εξέτασαν τις επιδράσεις της IGFBP-3 σε κύτταρα NSCLC μετά τη μόλυνση με έναν αδενοϊό που εκφράζει συστατικά IGFBP-3 υπό τον έλεγχο του υποκινητή του κυτταρομεγαλοϊού (Ad5CMV-BP3). IGFBP-3 η υπερέκφραση ανέστειλε την φωσφορυλίωση της Akt και την κινάση συνθάση γλυκογόνου-3β και τη δραστηριότητα της ΜΑΡΚ. Περαιτέρω, ο IGF-1 διέσωσε τα κύτταρα NSCLC από εξάντληση απόπτωση ορό, και αυτή η διάσωση αποκλείστηκε σε Ad5CMVBP-3-μολυσμένα κύτταρα Η1299 NSCLC [21]. Ωστόσο, στην παρούσα μελέτη, η αναγκαστική έκφραση του IGFBP-3 από τη μόλυνση με φορέα αδενοϊού ή προσθήκη ανασυνδυασμένης IGFBP-3 αυξήθηκαν ελαφρά μόνο τις ανασταλτικές της ανάπτυξης και αποπτωτικά αποτελέσματα του EGFR-TKIs. Μια μελέτη από Chang et al. έδειξαν ότι η μειωμένη IGFBP-3 έκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με βραχύτερη συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωση στο στάδιο Ι NSCLC ασθενείς και ανέφερε ότι υπερμεθυλίωση του προαγωγού IGFBP-3 θα μπορούσε να συνδέεται με την προς τα κάτω ρύθμιση της IGFBP-3 [27], [28]. Η σημασία της IGFBP-3 στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων NSCLC, κλωνογονικότητας, και η ανάπτυξη του όγκου φάνηκε σε μια in vitro μελέτη από την ίδια ομάδα. Ωστόσο, σε μια πιο πρόσφατη μελέτη, IGFBP-3 έκφραση δεν συσχετίζεται με οποιεσδήποτε κλινικές μεταβλητές και δεν σχετίστηκε σημαντικά με ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία και την επιβίωση [29], [30].

Γενικά, μια ένωση μεταξύ EGFR -TKI θεραπεία και τις αλλαγές στην IGFBP-3 επίπεδα, δεν έχει υποστηριχθεί από τα τρέχοντα δεδομένα. Στην παρούσα μελέτη, IGFBP-3 επίπεδα ορού μετρήθηκαν πριν από τη θεραπεία με EGFR ΤΚΙ και μετά την ανάπτυξη του EGFR-ΤΚΙ αντίσταση σε 20 ασθενείς με NSCLC δεν έδειξε σημαντικές αλλαγές (1815.3 ± 94.6 ng /mL πριν από τη θεραπεία έναντι 1778,9 ± 87,8 ng /mL μετά την αντίσταση του EGFR ΤΚΙ). IGFBP-3 είναι κατά κύριο λόγο παράγεται και απελευθερώνεται από την ηπατική Kupffer και ενδοθηλιακά κύτταρα στη συστηματική κυκλοφορία για να επηρεάσουν auxological ανάπτυξη μέσω ενδοκρινή ρύθμιση [31]. Ως εκ τούτου, το ποσοστό κυκλοφορούντος IGFBP-3 που εκκρίνεται από κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα μπορεί να είναι πολύ μικρό για την ανίχνευση των σημαντικών αλλαγών που σχετίζονται με την ανάπτυξη αντοχής, παρά την απώλεια του IGFBP-3 σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Τέλος , επαναλάβαμε ίδια πειράματα επί κυττάρων PC-9 με μια μετάλλαξη διαγραφής στο εξώνιο 19 του EGFR για την επικύρωση παρατήρηση μας. Προηγουμένως, ιδρύσαμε gefitinib-ανθεκτικών κυττάρων (PC-9 /GR) από PC-9 κύτταρα [32]. Αν και PC-9 /GR κύτταρα αποκτήθηκαν Τ790Μ μεσολάβηση αντοχή, μειωμένη έκφραση του IGFBP-3 βρέθηκε επίσης σε αυτούς (Συμπληρωματική Εικόνα S1). Κατά συνέπεια, επαναφορά της IGFBP-3 σε 9 PC-/GR κύτταρα ή αποσιώπηση της IGFBP-3 σε κύτταρα PC-9 δεν επηρεάζει την ευαισθησία σε EGFR-ΤΚΙδ.

Εν περιλήψει, αν και IGFBP-3 προς τα κάτω ρύθμιση σχετίζεται με την απόκτηση αντοχής EGFR-ΤΚΙ ανεξάρτητα από τον υποκείμενο μηχανισμό, μέτρια επίδραση της επί αντίσταση ανιχνεύεται στην παρούσα μελέτη υποδεικνύει ότι η IGFBP-3 δεν παίζει σημαντικό ρόλο στην αντίσταση των κυττάρων NSCLC στη θεραπεία του EGFR ΤΚΙ. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι IGFBP-3 στον ορό δεν είναι ένας χρήσιμος δείκτης της αντίστασης σε προχωρημένο NSCLC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

IGFBP-3 έκφραση δεν επηρέασε την ευαισθησία στην EGFR-ΤΚΙδ σε PC-9 κύτταρα. Βασική έκφραση και του mRNA της IGFBP-3 σε PC-9, PC-9 /GR και PC-9 /ER κύτταρα αξιολογήθηκαν με στύπωμα Western (Α) και RT-PCR (Β). (C) PC-9 /GR κύτταρα μολύνθηκαν με Ad /IGFBP-3 σε ΜΟΙ από το 0 έως 100 PFU /κυττάρων για 24 ώρες και η έκφραση IGFBP-3 προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. (D) PC-9 /GR κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του gefitinib και 1 μg /mL rh IGFBP-3 για 72 ώρες μετά τη μόλυνση με 100 ΜΟΙ Ad /IGFBP-3. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μετρητή αυτόματο κύτταρο ADAM-MC. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα, και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση (SD). (Ε) Έλεγχος και IGFBP-3 siRNA (100 ηΜ) εισήχθησαν σε PC-9 κύτταρα, και IGFBP-3 καταστολή επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western. (F) η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ 72 ώρες αργότερα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0081393.s001

(ΔΕΘ)