Αφηρημένο

Το διαγραμμένα σε καρκίνο του ήπατος μία (Dlc1) ογκοκατασταλτικό γονίδιο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη ενεργοποίησης RhoGTPase (RhoGAP). Το γονίδιο Dlc1 έχει πολλαπλές ισομορφές της μεταγραφής και έχουμε δημιουργήσει προηγουμένως ένα στέλεχος ποντικού που περιέχει ένα γονίδιο παρεμβολή παγίδα (GT), η οποία μειώνει ειδικά την έκφραση της ισομορφής 6,1 kb (ισομορφή 2). Αυτό το γονίδιο παγιδευτεί αλληλόμορφο όταν ομόζυγη αποτελέσματα σε εμβρυϊκά θνησιμότητα και τα ετερόζυγα γονίδιο παγιδευτεί ποντίκια δεν παρουσιάζουν αυξημένη συχνότητα καρκίνων, γεγονός που υποδηλώνει ότι συνεργαζόμενοι ογκογόνο αλλαγές μπορεί να απαιτείται για το μετασχηματισμό. Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε η

in vivo

συνεργασία μεταξύ των ογκογόνων γονιδίων K-Ras2 και Dlc1 στην ογκογένεση. Έχουμε παρατηρήσει μια αύξηση στην επεμβατική θυμικό καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων τόσο thymomas και λεμφώματα, με αποτέλεσμα σημαντικά μικρότερη διάρκεια ζωής στα ποντίκια ετερόζυγο για το αλληλόμορφο gt Dlc1 και ένα διεγέρσιμο LSL-K-Ras2

αλληλόμορφο G12D σε σύγκριση με την LSL-Κ- Ras2

G12D μόνο τα ποντίκια. Η ετεροζυγωτικά ποντίκια εμφάνισαν έναν υψηλό βαθμό μετάσταση στον πνεύμονα. Έχουμε βρει όγκου ειδική επιλεκτική υπερμεθυλίωση της ισομορφής 2 προαγωγό Dlc1 και αναγωγή της αντίστοιχης έκφρασης πρωτεΐνης σε θυμικό λέμφωμα (TL) και θυμικό καρκίνωμα επιθηλιακών (TEC) που προέρχονται από τα θυμικά όγκους. Οι ελλιπείς θυμικού λεμφώματος κυτταρικές σειρές Dlc1 παρουσίασαν αυξημένη trans-μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. ΣΕΚ κυτταρικές σειρές παρουσίασαν επίσης αυξημένο σχηματισμό ινών άγχος και τη δραστηριότητα Rho. Η εισαγωγή των τριών Dlc1 ισομορφές με ετικέτα GFP σε αυτά τα κύτταρα είχε σαν αποτέλεσμα διαφορετικές μορφολογικές αλλαγές. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η απώλεια της έκφρασης της ισομορφής μόνο 2 μπορεί να είναι επαρκής για την ανάπτυξη του θύμου αδένα όγκων και μεταστάσεων

Παράθεση:. Sabbir MG, Prieditis Η Ravinsky Ε, Mowat ΣΑΑ (2012) Ο ρόλος της Dlc1 Ισόμορφης 2 στο K-Ras2

G12D Induced θύμου Καρκίνου. PLoS ONE 7 (7): e40302. doi: 10.1371 /journal.pone.0040302

Επιμέλεια: Chun-Ming Wong, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 8 Δεκέμβρη του 2011? Δεκτές: 7 Ιουνίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 Ιουλ 2012

Copyright: © 2012 Sabbir et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε με επιχορηγήσεις από τον Cancer Research Society Inc. (https://www.src-crs.ca/en-CA) και CancerCare Μανιτόμπα Foundation Inc. (https://www.cancercarefdn.mb.ca). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το διαγραμμένα στον καρκίνο του ήπατος 1 (Dlc1) ογκοκατασταλτικό γονίδιο κωδικοποιεί μια Rho ΟΤΡάσης ενεργοποίηση πρωτεϊνών (RhoGAP) που αυξάνει την εγγενή υδρόλυση του GTP δεσμεύονται Rho στο ανενεργό δεσμευμένη μορφή ΑΕΠ της Rho. Το γονίδιο Dlc1 έχει βρεθεί διαγραφεί συχνά ή, κάτω ρυθμίζονται από υπερμεθυλίωση προαγωγού σε μαστού, του πνεύμονα, του ήπατος, του παχέος εντέρου και όγκων του προστάτη [1] – [6]. Μια πρόσφατη μελέτη που χρησιμοποίησε παραστατική ανάλυση ολιγονουκλεοτιδίου μικροσυστοιχιών έχει δείξει ετερόζυγη διαγραφή Dlc1 τόπο σε -50% του ήπατος, του μαστού και του πνεύμονα όγκων και το 70% των καρκίνων του παχέος εντέρου [7].

In vitro

μελέτες έχουν δείξει ότι η επιμόλυνση του γονιδίου Dlc1 μπορούν να αναστείλουν την ανάπτυξη των κυττάρων [5], [7], καταργούν

in vivo

σχηματισμό όγκων [2] και να επάγει απόπτωση. Πρόσφατα, πειράματα χρησιμοποιώντας το

ex vivo

νοκ ντάουν της Dlc1 στο p53 άκυρη και Myc που προκαλείται από το συκώτι προγονικά κύτταρα έχουν δείξει μειωμένη επιβίωση μετά την ένεση σε ποντίκια [7].

Το γονίδιο Dlc1 έχει τουλάχιστον τρεις μεγάλες μεταγραφική ισόμορφα εκφράζονται υπό την επίδραση τριών εναλλακτικών υποκινητών στον ποντικό [8]. Έχουμε αναπτύξει προηγουμένως ένα στέλεχος ποντικού που περιέχει ένα ένθεση παγίδα γονίδιο, το οποίο μειώνει ειδικά την έκφραση του 6,1 kb μεταγραφικό ισομορφή (ισομορφή 2) του Dlc1, δημιουργώντας έτσι ένα hypomorph [8]. Τα ομόζυγα Dlc-1 γονίδιο παγιδευτεί ποντίκια εμφανίζουν μια εμβρυϊκή θανατηφόρο φαινότυπο [8], η οποία phenocopies την Dlc1 εξόνιο 5 knockout ποντικό Durkin et al. [6]. Τα ετερόζυγα νοκ-άουτ και γονίδιο παγιδευμένα ποντίκια είναι βιώσιμα και δεν παρουσιάζουν καμία αύξηση στην αυθόρμητη όγκους [6], [8]. Αυτό δείχνει ότι οι πρόσθετες ογκογόνο εκδηλώσεων παράλληλα διαγραφή Dlc1 απαιτούνται για τον μετασχηματισμό

Έχει αποδειχθεί ότι σε ορισμένες περιπτώσεις η ενεργοποίηση των Ras σηματοδότησης συλλήψεις μονοπάτι του κυτταρικού κύκλου που επάγει γήρανση αντί να προκαλέσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [9] -. [12 ] μέσω της επαγωγής της p21

WAF1 [13], [14]. Έχει επίσης δειχθεί ότι σε Ras ενεργοποιημένα κύτταρα, μία προϋπόθεση για Rho σηματοδότηση είναι για την καταστολή της ρ21

WAF1 [15]. Και πάλι, σε Ras μετασχηματισμένα ινοβλάστες, η παρατεταμένης σηματοδότηση ΕΚΚ-ΜΑΡ Κινάσης ευνοεί την επιλογή των υψηλών επιπέδων των ενεργών Rho-GTP για να επιτρέψει για προς τα κάτω ρύθμιση των υψηλών επιπέδων ρ21

WAF1 [16]. Ως εκ τούτου, γίνεται η υπόθεση ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού Rho μέσω της απώλειας της έκφρασης Dlc1 RhoGAP θα συμπληρώσουν τα Ras ογκογονίδιο σε μεταμόρφωση κυττάρων

in vivo

. Δεν είναι επίσης γνωστό, το οποίο Dlc1 ισομορφή είναι κρίσιμη για την καταστολή του όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε υψηλή συχνότητα εμφάνισης του μεταστατικού καρκίνου του θυμικού σε ετερόζυγη Dlc1 ισομορφή 2 γονίδιο παγιδευτεί ποντίκια με ένα ογκογόνο Κ-Ras2

αλληλόμορφο G12D. Μπορούμε επίσης να βρείτε επιλεκτική υπερμεθυλίωση του υποκινητή Dlc1 ισομορφή 2 σε αυτούς τους όγκους.

Αποτελέσματα

Υψηλή συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του θύμου στην Dlc1

κβ /gtLSL-Κ-Ras2

κ.β. /G12D ποντίκια μολυσμένα με ΑάΟΜν-CRE

Για να ελέγξετε αν η απώλεια Dlc1 θα συνεργαστεί με το γονίδιο K-Ras2 στο μετασχηματισμό, κάναμε χρήση της LSL-Κ-Ras2

G12D διαγονιδιακών ποντικών [17]. Για να ενεργοποιήσετε το ογκογόνο Κ-Ras2

αλληλόμορφο G12D, Dlc1

κβ /gt? Κ-Ras2

κβ /G12D (KD) και Dlc1

β /β? Κ-Ras2

κβ /G12D (K

+) ποντίκια ενέθηκαν με Cre-εκφράζοντα AdCMV-Cre αδενοϊού μέσω της φλέβας της ουράς. Η πλειοψηφία των ποντικών ανέπτυξαν πρωτογενείς όγκους εντός του θύμου αδένα 6 έως 9 μήνες με 52,6% (10/19) των Κ

+ ποντικό έναντι 69,5% (16/23) των ποντικών που έχουν όγκους KD (Σχήμα 1Α & amp? B , Τραπέζι 1). Οι ποντικοί θανατώθηκαν συνήθως για σοβαρές αναπνευστικές πρόβλημα λόγω της συμπίεσης της θωρακικής κοιλότητας με τις αυξανόμενες θυμικά όγκους (Σχήμα 1 C). Μετά necroscopy, ορισμένοι από αυτούς τους ποντικούς επίσης έδειξαν νεοπλασματικές αλλοιώσεις σε άλλα όργανα, συμπεριλαμβανομένων των νεφρών, του ήπατος, των πνευμόνων, των όρχεων και των ωοθηκών αλλά, η πλειοψηφία των ποντικών έδειξαν θυμικού όγκους (Σχήμα 1Α, Πίνακας 1). Η πλειονότητα των όγκων του πνεύμονα ήταν μεταστατικών θυμικά κύτταρα λεμφώματος προέλευσης (Σχήμα 2Ε, Πίνακας 2). Για τον προσδιορισμό της συνολικής επιβίωσης, Kaplan-Meier ανάλυση της ΑάΟΜν-CRE ποντίκια ένεση εκτελέστηκε. Αυτό αποκάλυψε σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης στα ετερόζυγα γονίδιο παγιδευμένοι ποντικών ΚΟ σε σύγκριση με Κ

+ ποντίκια (τιμή Ρ = 0,0077, Σχήμα 3Α).

(Α) Συχνότητα των διαφόρων τύπων πρωτογενούς όγκου. (Β) Σχετική συχνότητα των διαφόρων τύπων των πρωτογενών θύμου αδένα καρκίνους (C) Εικόνα της διευρυμένης θύμου αδένα (βέλος) με το ποντίκι και τεμαχίζεται θύμου με λέμφωμα.

Η

Η

Για να κατανοήσουμε το φύση του θυμικού καρκίνων, εκτελέσαμε ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας ένα Τ-κυττάρου ειδικό δείκτη CD3 και θυμική ειδικούς δείκτες επιθηλιακού κυττάρου, κυτοκερατίνης 5 (CK5) και κυτοκερατίνη 8 (Ck8 /Troma) [18]. Στην κανονική νεαρά ποντίκια (6 εβδομάδων παλιό) τα Τ λεμφοκύτταρα βρέθηκαν ομοιόμορφα κατανεμημένα στο τόσο φλοιό και μυελό περιοχές του θύμου, ενώ το νωτιαίο επιθηλιακά κύτταρα ήταν έντονα CK5 και φλοιώδη επιθηλιακά κύτταρα ήταν έντονα θετικά Ck8 (Σχήμα 2Α). Ωστόσο, στα ενήλικα ποντίκια τα Τ λεμφοκύτταρα κατά κύριο λόγο μετατοπίζεται προς την κεντρική περιοχή μυελό και τα φλοιώδη επιθηλιακά κύτταρα ήταν έντονα θετικά Ck8 με απομονωμένες μπαλώματα του CK5 θετικών κυττάρων (Σχήμα 2Β). Χρησιμοποιώντας αυτούς τους δείκτες έχουμε βρει ένα σημαντικά υψηλότερο αριθμό θυμικού λεμφωμάτων 80% (8/10) στην Κ

+ ποντικό έναντι 68,7% (11/16) στους ποντικούς KD (Εικόνα 1Β & amp? 2D, Πίνακας 3) . Ένα μικρότερο κλάσμα (20% (2/10)) ήταν κυρίως θυμικά επιθηλιακά καρκινώματα (thymomas) στην Κ

+ ποντικό έναντι 31,2% (5/16) στις ετερόζυγους ποντικούς KD (Σχήμα 1Β & amp? 2C), όπως Σύμφωνα με την ιστολογική κατάταξη των Bernatz et al. [19]. Η συχνότητα του thymomas μεταξύ της K + και KD ποντίκια δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Έχουμε βρει ένα μόνο όγκου σε έναν ποντικό KD, η οποία έδειξε ένα μικτό τύπο θύμωμα, η οποία μπορεί να έχουν τόσο λέμφωμα Τ-κυττάρων και θυμώματος.

Κανονικό θύμο ποντικού στις 6 εβδομάδες (Α) και 18 εβδομάδες (Β) που δείχνει έκφραση του δείκτη Τ-κυττάρων (CD3) και διαφορετικοί δείκτες κυτοκερατίνης ειδικά για θυμικά επιθηλιακά κύτταρα μυελού (CK5) και φλοιώδη επιθηλιακά κύτταρα (Ck8). Ανοσοϊστοχημεία δείχνει θυμικό καρκίνωμα επιθηλιακών (C), λέμφωμα Τ-κυττάρων (D) και την πνευμονική μετάσταση των Τ-κυττάρων λεμφώματος (F).

Η

Πρωτοβάθμια θύμου όγκοι συχνά μεταστάσεις στον πνεύμονα

η ανοσοϊστοχημεία αποκάλυψε επίσης ότι οι περισσότερες από τις θυμικού όγκων λεμφώματος είχε κάνει μετάσταση σε πολλαπλές εστίες στον πνεύμονα. Η πλειονότητα των πνευμονικών μεταστάσεων ήταν Τ-κυττάρων λεμφώματος προέλευσης (Σχήμα 2Ε, Πίνακας 2). Ποσοτικοποίηση των βλαβών των πνευμόνων μεταστατική κάθε κοόρτη δείχνει σημαντικά υψηλότερη συχνότητα των μεταστάσεων σε ποντικούς KD σε σύγκριση με το K

+ ποντίκια (Σχήμα 3Β).

(Α) Σωρευτική επιβίωση των ετερόζυγων LSL-K-Ras2

G12D? Dlc1

κβ /gt και LSL-Κ-Ras2

G12D? Dlc1

β /β ποντίκια μετά από Cre εκφράζοντας την ένεση αδενοϊού μέσω της φλέβας της ουράς. χρόνος επιβίωσης ορίζεται ως ο χρόνος μετά την ένεση για τον θάνατο ή σφαγή, λόγω φθάνοντας ανθρώπινες τελικά σημεία. Συνολικά 15 LSL-Κ-Ras2

G12D? Dlc1

β /β και 18 LSL-Κ-Ras2

G12D? Dlc1

κβ /gt ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη επιβίωσης. Τα λογοκριμένα δεδομένα ήταν τα ποντίκια που πέθαναν από άγνωστες αιτίες, χωρίς ανιχνεύσιμο όγκο ή λευχαιμία. (Β) Συχνότητα των μεταστατικών όγκων του πνεύμονα. Οι τετράγωνο σχήμα γκρι τελείες υποδεικνύουν τις μεταστατικές αλλοιώσεις που προέρχεται από τα ποντίκια που ήταν η πηγή των κυτταρικών σειρών Τ λεμφώματος 1 και 2. τιμή Ρ = 0.0257 (από το Mann-Whitney U).

Η

Πρωτογενής Τ-κυτταρικό λέμφωμα και Thymoma κυτταρικές σειρές είναι Ελλειμματική στην Ισόμορφης 2 Dlc1 πρωτεϊνών και έδειξαν αυξημένη RhoA Δραστηριότητα

Ιδρύσαμε 4 θυμικό λέμφωμα (TL) και κυτταρικές σειρές 3 καρκινώματος θυμικά επιθηλιακά (ΣΕΚ) (Εικόνα 4Α) από το πρωτογενείς όγκους για να μελετηθεί η έκφραση του Dlc1 πρωτεΐνης. Αυτοί οι όγκοι ήταν είτε CD3 + Τ-κύτταρα ή CK 5 ή CK 8 θετικά επιθηλιακών κυττάρων (Σχήμα 2C & amp? D). Οι γραμμές TL και κυτταρικές TEC αυθόρμητα αθανατοποιημένη και αναπτύχθηκαν μέχρι 20 διελεύσεις χωρίς οποιαδήποτε μείωση της δυνητικής ανάπτυξης. ρυθμούς πολλαπλασιασμού των κυττάρων, με μία μέθοδο μέτρησης κυττάρων, έδειξαν ότι οι κυτταρικές γραμμές TEC 1-2 (KD) είχαν αυξημένο ρυθμό ανάπτυξης σε σύγκριση με την κυτταρική γραμμή TEC 3 (Κ +) (Σχήμα 4Α /π). Οι κυτταρικές σειρές TL δεν έδειξε σημαντική διαφορά στο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων στην καλλιέργεια.

Α (i) Φωτεινό πεδίο μικρογραφία της ΣΕΚ και των κυττάρων TL στον πολιτισμό. (Ii) ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυτταρικών σειρών ΣΕΚ. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων και στη συνέχεια η κυτταρική ανάπτυξη αναλύθηκε με μέτρηση των αριθμών των κυττάρων κατά συνέπεια, για 7 ημέρες. Β (i) ανοσοφθορισμού δείχνει επιθηλιακά κύτταρα του θύμου που εκφράζουν του Ck8 και CK5 και (ii) λέμφωμα Τ κυττάρων που δείχνουν έκφραση του CD3. (C) έκφραση Dlc1 mRNA σε ΣΕΚ και κυτταρικές σειρές TL. (I) Σχηματική απεικόνιση του τόπου και μάτισμα μοτίβο Dlc1 από τις τρεις κύριες ισομορφές. Η στρατηγική και εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τη σχετική ποσοτικοποίηση του Dlc1 ισομορφών 2 και 3 χρησιμοποιώντας πολλαπλή RT-PCR. (Ii) πολλαπλή RT-PCR δείχνει σχετική ένταση του ισομορφής 2 και έκφραση 3 mRNA σε κυτταρικές γραμμές λεμφώματος Τ-κυττάρων και θυμώματος. (Iii) Multiplex PCR δείχνει σχετική ένταση του ισομορφής 2 και 3 mRNA έκφραση σε 5-AzaC αγωγή TL και TEC κυτταρικές γραμμές (D) έκφρασης πρωτεΐνης Dlc1: (i) Dlc1 πρωτεΐνη από Τ-κυτταρικό λέμφωμα και θυμικά επιθηλιακά κυτταρικές γραμμές καρκινώματος, καθώς και φυσιολογικά ενήλικα θύμου και ηπατικού ιστού από C57BL /6J ποντικών και Τ κυττάρων από λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος (PBL). (Ii) γραφική παράσταση που δείχνει τη σχετική ένταση του Dlc1 123 kDa (ισομορφή 2) και 127 ανώνυμες πρωτεΐνες KDa σε Τ-κυτταρικό λέμφωμα και κυτταρικές γραμμές καρκινώματος, καθώς και ενηλίκων θύμου και ηπατικού ιστού του C57Bl /ποντικό 6J (* ρ & lt? 0,05, * * P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001, **** P & lt? .0001). έκφραση της πρωτεΐνης Ε Dlc1 από 5 AzaC αντιμετωπίζονται TL και κυτταρικές σειρές ΣΕΚ.

Η

Σε προηγούμενη μελέτη μας, έχουμε αναφερθεί η ύπαρξη δύο διαφορετικών ισομορφών μοριακό βάρος Dlc1 πρωτεΐνης σε διαφορετικούς ιστούς του ποντικιού και το ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών (MEF), το οποίο προέρχεται πιθανώς από τις ισομορφές 2 και 3 mRNAs ή με μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις [8]. Η τακτική 123 KDa Dlc1 πρωτεΐνη (ισομορφή 2) εκφράζεται σε χαμηλό επίπεδο στον ενήλικο θύμο. Ότι, η αντίδραση της πρωτεΐνης 127 KDa σταυρό εκφράζεται σε υψηλότερο επίπεδο στο θύμο αδένα, σε σύγκριση με το ήπαρ σε κηλίδες Western (Εικόνα 4D /i). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι κυτταρικές σειρές θυμώματος και λέμφωμα έδειξαν χαμηλότερη έκφραση του KDa ζώνη 123 πρωτεΐνης και την αντίστοιχη mRNA ισομορφή 2 σε σύγκριση με φυσιολογικό θύμο αδένα (Σχήμα 4C & amp? D /I-II). Οι κυτταρικές σειρές TL4 και TEC3 από την K + ποντίκια έδειξαν επίπεδα Dlc1 έκφρασης συγκρίσιμα με άγριου τύπου θύμο αδένα. (Εικ. 4C /Ι-ΙΙ). Η TL1, 2 & amp? 3 και ΣΕΚ 1 & amp? 2 γραμμές έδειξαν χαμηλότερα επίπεδα σε σχέση με τις γραμμές από ποντικούς K + (Σχήμα 4D). Επίσης, υπήρξε μια σημαντική αύξηση στην KDa ζώνη πρωτεΐνης 127 στους όγκους σε σχέση με το θύμο αδένα (Εικόνα 4D). Στην προηγούμενη μελέτη μας, καθώς και στην παρούσα μελέτη, έχουμε παρατηρήσει ότι το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης 127 KDa πρωτεΐνη αυξήσεις στην παρουσία των μειωμένων επιπέδων της KDa πρωτεΐνη 123, η οποία είναι ιδιαίτερα εμφανής στην ομόζυγη γονίδιο εμβρυϊκά κύτταρα ινοβλαστών παγιδευτεί ποντικού ( Εικόνα 4D). Τα περισσότερα από τα κύτταρα του λεμφώματος και TEC επίσης έδειξαν αυξημένη έκφραση του 127 KDa πρωτεΐνη (Εικόνα 4D).

Για να προσδιοριστεί εάν τα πρόσθετα υψηλού μοριακού ζώνες είναι φωσφορυλιωμένες μορφές της πρωτεΐνης Dlc1, τα κυτταρικά προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε αγωγή με αλκαλική φωσφατάση. Η συνεχής παρουσία του συγκροτήματος 127 KDa μετά τη θεραπεία φωσφατάση δείχνει ότι δεν είναι μια φωσφορυλιωμένη μορφή της τακτικής 123 KDa Dlc1 πρωτεΐνης (Εικόνα 4C /i & amp? Ε).

Για να προσδιορίσετε το 127 ΚΕ σταυρό αντίδραση πρωτεΐνη, ανοσοϊζήματα με τη χρήση των αντισωμάτων Dlc1 υποβλήθηκαν σε φασματομετρία μάζας. Έχουμε καταφέρει να εντοπίσει 7 πεπτίδια που αντιστοιχούν στην συναινετική περιοχή του Dlc1 κοινά σε όλες τις ισομορφές και ως εκ τούτου, η φασματομετρία μάζας ασαφές για την ύπαρξη των άλλων ισομορφών Dlc1 (συμπληρωματική Εικόνα S1).

Η πλειοψηφία των οι γραμμές του λεμφώματος και των κυττάρων TEC επίσης έδειξαν υψηλή έκφραση της ρ21

WAF1 πρωτεΐνη σε αντίθεση με ομόζυγη γονίδιο παγιδευμένα κύτταρα εμβρύου ινοβλαστών ποντικού όπου p21

WAF1 έκφραση μειώθηκε (Σχήμα 5Α /Ι-ΙΙ). Το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης ρ21 ήταν συγκρίσιμη σε MEF

+ /+ και οι κυτταρικές γραμμές TL4 και TEC3, τα οποία έχουν άγριου τύπου αλληλόμορφα Dlc1 Ωστόσο, οι ετερόζυγοι genetrap Dlc1 αλληλόμορφο που περιέχει TL 2/3 κυτταρικές σειρές και την TEC1 /2 κυτταρική σειρές παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ρ21 σε σύγκριση με αντίστοιχα φυσικά τους, TL4 και κυτταρικές γραμμές TEC-3 αντίστοιχα. Σε αντίθεση, η ετερόζυγη γραμμή TL1, με τη χαμηλότερη έκφραση Dlc1, έδειξε έκφραση ρ21 συγκρίσιμη με άγριου τύπου MEF

+ /+ και TEC 4 κύτταρα. Ως εκ τούτου, η έκφραση του p21 δεν συσχετίζεται με Dlc1 έκφραση στο θυμικό κυτταρικές σειρές, σε αντίθεση με ινοβλάστες.

Α (i) p21

WAF1 πρωτεΐνη σε λέμφωμα Τ-κυττάρων και κυτταρικές γραμμές καρκινώματος, (ii) Οικόπεδο που δείχνει η σχετική ένταση του ρ21

WAF1 πρωτεΐνη σε λέμφωμα Τ-κυττάρων και κυτταρικές γραμμές καρκινώματος σε σχέση προς ακτίνη. Μέσα και το τυπικό σφάλμα της μέσης προσδιορίστηκαν από τουλάχιστον πέντε ανεξάρτητα πειράματα. (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001, **** P & lt? .0001). (Β) Μέτρηση της δραστικής RhoGTP σε κυτταρικές σειρές. (I) RhoGTP τραβήξει κάτω δοκιμασίας δείχνουν συστατική και ΙΡΑ επαγόμενη επίπεδα ενεργού RhoGTP σε Τ-κυτταρικό λέμφωμα και θυμικά επιθηλιακά κυτταρικές γραμμές καρκινώματος. (Ii) διάγραμμα που δείχνει το RhoGTP προς το σύνολο των πρωτεϊνών Rho σαρώνοντας την σχετική ένταση των ζωνών πρωτεΐνης σε μη-επεξεργασμένα και Ι_ΡΑ επάγεται στο TEC, TL, MEF κυτταρικές σειρές. Μέσα και τυπικό σφάλμα του μέσου προσδιορίζεται από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001 και **** P & lt?. .0001 Από Student t test και δοκιμή αμφίδρομη ANOVA

Η

Όλα τα thymoma και . κυτταρικές σειρές λεμφώματος έδειξαν διάφορους βαθμούς ενεργοποιημένων RhoA όταν έλαβαν θεραπεία με λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA) (σχήμα 5Β /Ι-ΙΙ) Η επαγωγή LPA δραστικών RhoA ήταν σημαντικά υψηλότερη σε δύο λέμφωμα (TL-1 & amp? -2) και δύο γραμμές TEC (TEC-1 & amp? -2), η οποία έδειξε επίσης τις χαμηλότερες Dlc 1 ισομορφή 2 επίπεδα, σε σύγκριση με τις αντίστοιχες κυτταρικές σειρές άγριου τύπου (Σχήμα 5Β /I-II) Αυτό ήταν παρόμοια με ομόζυγο Dlc1

GT /GT. κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι αυτές οι γραμμές μπορεί να έχουν αδρανοποιηθεί το άγριου τύπου Dlc1 αλληλόμορφο.

οι όγκοι έχουν Ενεργός K-Ras2 G12D Μετάλλαξη

για να καθορίσει ότι οι όγκοι ήταν λόγω της ενεργοποίησης των Κ-Ras2

αλληλόμορφο G12D, εξάγαμε κυτταρικό RNA από τους πρωτογενείς όγκους και τις κυτταρικές γραμμές όγκου και στη συνέχεια διεξήχθη ανάλυση μετάλλαξης Pyrosequencing βάση για K-Ras2

μετάλλαξη G12D (Σχήμα 6). Όλες οι πρωτογενείς όγκους έδειξαν έκφραση του μεταλλαγμένου Κ- Ras2 αλληλόμορφο (Σχήμα 6F). Ωστόσο, η έκφραση του μεταλλαγμένου αλληλίου ήταν λιγότερο από 50% στις πρωτογενείς όγκους, όπως αποκαλύπτεται από την πυρόγραμμα, προφανώς λόγω της κανονικής διήθηση κυττάρων (Σχήμα 6D & amp? Ε). Στις κυτταρικές γραμμές όγκου το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο και αγρίων τύπου εκφράστηκαν σε ίσα επίπεδα που υποδεικνύει απουσία φυσιολογικής μόλυνσης κυττάρων (Σχήμα 6F).

(Α) Σχηματική απεικόνιση της στρατηγικής PCR για ενίσχυση Κ-Ras2 cDNA. (Β) αλληλουχία K-Ras2 που παρουσιάζουν τη θέση των μεταλλάξεων και των εκκινητών Pyrosequencing σχετικές θέσεις. (C) κορυφές αναφοράς του προγράμματος δείχνει τη σειρά της χορήγησης και της ακολουθίας. (D) Ένα πυρόγραμμα του άγριου τύπου Κ-Ras2 αλληλόμορφο που δεν εμφανίζει καμία μετάλλαξη, (Ε) ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο σε ένα καρκινικό κύτταρο γραμμή δείχνει την παρουσία του μεταλλαγμένου καθώς και αλληλόμορφα άγριου τύπου και (F) το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο σε ένα μικρο τεμαχίστηκαν πρωτογενούς όγκος. Στο Σχήμα Ε, η διαφορά στην σχετική ένταση μεταξύ της κανονικής και μεταλλαγμένο αλληλόμορφο ειδική βάση νουκλεοτιδίου δεικνύει την παρουσία του φυσιολογικά κύτταρα στον όγκο.

Η

Dlc1 Ισόμορφης 2 υποστηρικτής Μεθυλίωση thymomas και λεμφώματα

για να κατανοήσουμε τον μηχανισμό για μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης Dlc1 σε κυτταρικές γραμμές όγκου, έχουμε μελετήσει την κατάσταση μεθυλίωσης του Dlc1 ισομορφής 2 και 3 υποκινητές από την κατεργασία όξινου θειώδους του DNA που ακολουθείται από PCR και Pyrosequencing (Σχήμα 7). Έχουμε εντοπίσει ισχυρή νησιά CpG στους υποκινητές Dlc1 ισομορφών 2 και 3 χρησιμοποιώντας την έκδοση v1.0 Methyl Primer Express Software (Applied Biosystems) (Σχήμα 7Α). Περαιτέρω ανάλυση των νησιών αυτών CpG χρησιμοποιώντας MatInspector (Genomatix σουίτα λογισμικού) αποκάλυψε δύο κατάλληλες θέσεις για θειώδους αλληλουχίας κοντά σε μια θέση δέσμευσης Sp1 υποστηρικτής για Dlc1 ισομορφή 2 και 3 υποστηρικτές. Έχουμε στοχευμένες πέντε νησίδες CpG βρίσκεται 502 bp ανοδικά του κωδικονίου έναρξης για την ισομορφή 2 και τέσσερα νησιά CpG βρίσκεται 851 bp ανοδικά του κωδικονίου έναρξης της ισομορφής 3 (Σχήμα 7Β). DNA από μικροδιατομή πρωτογενείς όγκους, καθώς και κυτταρική γραμμή όγκου που προέρχεται DNA αποκάλυψε εκτεταμένη μεθυλίωση του υποκινητή Dlc1 ισομορφή 2 (30-70%) σε όλες τις 5 νησίδες CpG σύγκριση με το κανονικό θύμο DNA (Σχήμα 7F). Ο υποκινητής της ισομορφής Dlc1 3 έχει βρεθεί ότι είναι πολύ μεθυλιωμένη (40-100%) σε φυσιολογικό ιστό και σε πρωτογενείς όγκους για όλα τα 4 CpG νησίδες που αναλύθηκαν (Σχήμα 7F). Η συχνότητα της μεθυλίωσης στον πρωτογενή όγκο, επίσης ταιριάζει με το μοτίβο μεθυλίωσης που παρατηρείται στην κυτταρική σειρά DNA.

(Α) Σχηματική απεικόνιση των νησιών CpG (ροζ οριζόντια γραμμή), θέση σύνδεσης Sp1 υποκινητή (κίτρινη κάθετη μπάρα ), κωδικόνιο έναρξης της μετάφρασης (κόκκινη κάθετη γραμμή κοντά στο 3 ‘άκρο), και τα νησιά CpG που επιλέγονται για ανάλυση μεθυλίωσης (σκούρο πράσινο κάθετη γραμμή) στην περιοχή του υποκινητή της Dlc1 ισομορφών 2 και 3. (Β) αλληλουχία DNA και τη θέση του εκκινητές αλληλουχίας για Pyrosequencing (υπογραμμισμένη με κόκκινο και πράσινο – εμπρός και όπισθεν εκκινητή PCR, αντίστοιχα, αστάρι πλάγιους-αλληλουχίας). (Γ) Για την χορήγηση και την πυρόγραμμα αναφοράς των ισομορφών 2 (i) και (ii). Πυρόγραμμα της κανονικής (D) και καρκινικό ιστό (Ε) για ισομορφές 2 (i) και 3 (ii). F: διάγραμμα που δείχνει το μέσο ποσοστό μεθυλίωσης στις διάφορες θέσεις CpG στις ισομορφές Dlc1 2 και 3 υποκινητές σε όγκους και κανονικό θύμο

Η

Η διαγραφή της Dlc1 locus έχει αναφερθεί ότι είναι υπεύθυνος για την απώλεια. έκφραση της πρωτεΐνης σε διαφορετικούς ανθρώπινους όγκους. Ως εκ τούτου, για να εξετάσει την απώλεια αλληλόμορφων στον τόπο Dlc1, χρησιμοποιήσαμε πολυμορφική μικροδορυφορική βασίζεται απώλεια ετεροζυγωτίας ανάλυση (LOH) γύρω από το γονιδιακό τόπο Dlc1 (Σχήμα 8). Η ανάλυση LOH δεν αποκάλυψε σημαντική απώλεια στον τόπο Dlc1 στην πλειονότητα των όγκων? Ωστόσο, έχουμε βρει μεταβολή μέγεθος μικροδορυφόρων για το δείκτη D8Mit293 σε ένα όγκο, καθώς και την αντίστοιχη κυτταρική γραμμή DNA (Σχήμα 8C). Έχουμε επίσης βρει ετερόζυγα απώλεια του δείκτη D8Mit174 σε μία μεταστατική βλάβη πνεύμονα (Σχήμα 8C).

(Α) Σχηματική απεικόνιση της σχετικής θέσης των διαφόρων δεικτών microsattelite χρησιμοποιούνται για απώλεια της ετεροζυγωτίας ανάλυση. (Β) Εκπρόσωπος αυτοραδιογραφίες που δείχνει τα αλληλόμορφα ειδικά για τους διάφορους δείκτες μικροδορυφορικού. Το βέλος δεικνύει LOH ενός αλληλόμορφου και ο αστερίσκος υποδεικνύει αλλοίωση μέγεθος μικροδορυφόρων (ΜΑ) ενός αλληλόμορφου, Ν-Κανονική, T-Ογκου (C) Αλληλόμορφο κατάσταση των δεικτών χρωμοσώματος 8qA4 στα θυμικό όγκους και TEC και κυτταρικές σειρές TL καθώς και αντίστοιχες πρωτογενείς και μεταστατικούς όγκους? RH – Διατήρηση των ομοζυγωτία. Οι όγκοι 1-7 είναι πρωταρχικό θυμική όγκοι που αντιστοιχούν σε κυτταρικές σειρές TL και ΣΕΚ. Η υποκατηγορία Α και Β σύμφωνα όγκου 1-7 αντιπροσωπεύει DNA που λαμβάνεται από δύο ανεξάρτητες βλάβες του πνεύμονα μεταστατικό της αντίστοιχης πρωτογενούς όγκου, αντίστοιχα.

Η

Για να μάθετε αν μεθυλίωση του υποκινητή Dlc1 ήταν υπεύθυνος για μειωμένη έκφραση του Dlc1 mRNA και της πρωτεΐνης, υποβάλλαμε σε αγωγή, των παραγώγων του όγκου κυτταρικές γραμμές με παράγοντα απομεθυλίωσης DNA 5′-αζακυτιδίνη (5 AzaC) και, στη συνέχεια, μελέτησαν την έκφραση της Dlc1 mRNA και της πρωτεΐνης. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία με 5 AzaC αύξησε την έκφραση του Dlc1 ισομορφής 2 σε σύγκριση με τις κυτταρικές γραμμές όγκου ελέγχου (Σχήμα 4C-/ΙΙΙ & amp? Ε). Η πολλαπλή RT- PCR χρησιμοποιώντας cDNA που προέρχεται από 5 AzaC αντιμετωπίζονται κυτταρικές σειρές έδειξαν επίσης ομοιόμορφα υψηλή έκφραση της ισομορφής Dlc1 2 και 3 mRNA σε όλες τις αντιμετωπίζονται κυτταρικές σειρές.

αλλαγμένη δομή Κυτταροσκελετού και αυξημένη κυτταρική κινητικότητα σε κύτταρα όγκου

από αυξημένη δραστικότητα Rho σχετίζεται με το σχηματισμό ινών στρες και κυτταρική κινητικότητα, εξετάσαμε τη συχνότητα του σχηματισμού ινιδίων του στρες και εστιακή προσκόλληση στα καλλιεργημένα TEC κυτταρικές σειρές και σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του θύμου. Τα καρκινικά κύτταρα περιείχαν σημαντικά υψηλότερο αριθμό των ινών στρες (26 ± 11/1000 μm

2) και το εστιακό συμφύσεις (28 ± 18/1000 μm

2) σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα με 8 ± 9/1000 μm

2 και 7 ± 15/1000 μm

2 συχνότητας αντίστοιχα (P τιμή & lt? 0.0001) (Σχήμα 9). Το μέσο μέγεθος των καρκινικών κυττάρων (8-12 × 10

3 μm

2) ήταν επίσης σημαντικά μεγαλύτερο από το κανονικό τους ομολόγους τους (6-8 × 10

3 μm

2) (p αξία = 0,016). Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν περισσότερο κοιλιακό ίνες στρες [20], ενώ, σε φυσιολογικά θυμικά επιθηλιακά κύτταρα τονίζουν ίνες κυρίως οργανώνονται ως εγκάρσια τόξα [21] (Σχήμα 9 Α-Ο). Έχουμε επίσης παρατηρήσει ίνες στρες οργανώνονται σε τριγωνικό πλέγμα, όπως τα δίκτυα πρωταρχικούς τον πυρήνα στην ραχιαία επιφάνεια των κυττάρων στα κύτταρα θυμώματος (Σχήμα 9C).

(Α) Κανονική θυμικά επιθηλιακά κύτταρα που δείχνει τον σχηματισμό ινών στρες με τη μορφή μια δακτυλιοειδή εγκάρσια τόξου. (Β) Η θυμική κυττάρων επιθηλιακό καρκίνωμα (Ζ stack-1) που δείχνει εκτεταμένο σχηματισμό κοιλιακό ινών στρες και την αύξηση της συχνότητας των εστιακών συμφύσεων, (Γ) το ίδιο κύτταρο όγκου που δείχνει μια διαφορετική δομική οργάνωση βινκουλίνης και ακτίνης στο Z στοίβα -7 στο ραχιαίο επιφάνεια του κυττάρου. (D) κηλίδα Western που δείχνει την παροδική έκφραση του Dlc1 ισομορφής 2 &? 3 πρωτεΐνες με ετικέτα C τερματικό GFP στη ΣΕΚ κυτταρική σειρά. Η θυμική επιθηλιακών κυττάρων καρκινώματος επιμολυσμένα με (Ε) pEGFP C1 φορέα, κατασκεύασμα (F) Dlc1 ισομορφή 2 GFP? ισομορφή 3 κατασκεύασμα GFP (G) Dlc1. (H) Μπαρ διάγραμμα που παριστάνει τον σχετικό αριθμό των κυττάρων τα οποία παρουσιάζουν την έκφυση σαν επεκτάσεις που εκφράζεται ως ποσοστό των συνολικών GFP διαγονιδιακής εκφράζοντα κύτταρα.

Η

Οι ίνες στρες καταργήθηκαν όταν τα κύτταρα TEC επιμολύνθηκαν με GFP ετικέτα πλήρους μήκους Dlc1 ισομορφή 2 (Σχήμα 9Ε-G). Η έκφραση των GFP-Dlc1 πρωτεΐνες σύντηξης επίσης επαληθεύονται σε κηλίδα western χρησιμοποιώντας αντι αντίσωμα GFP (Σχήμα 9D). Η πρωτεΐνη σύντηξης ισομορφή 2 GFP-Dlc1 βρέθηκε εντοπισμένη στις εστιακές συμφύσεις (Εικόνα 9F). Έχουμε επίσης παρατηρήσει ότι τα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν ακατάσχετη σχηματισμό «νευριτών όπως» κυτταροπλασματική επέκταση ή filipodial δομές μαζί με την καταστροφή των διάταξης ινών στρες όταν επιμολυσμένα με GFP ετικέτα Dlc1 ισομορφή 3 (Σχήμα 9Η). Όλα Dlc1 επιμολυσμένα κύτταρα πέθαναν τελικά 3-4 ημέρες μετά την επιμόλυνση.

Για να προσδιοριστεί εάν τα κύτταρα Τ-λεμφώματος με χαμηλότερα επίπεδα Dlc1 έδειξαν αυξημένη εξαγγείωση και τη μετανάστευση, μία δοκιμασία transendothalial μετανάστευση πραγματοποιήθηκε (Σχήμα 10). Ο ρυθμός εισβολή των κυττάρων λεμφώματος Τ βρέθηκαν σημαντικά υψηλότερες σε κυτταρική γραμμή λεμφώματος 1 και 2 σε σύγκριση με φυσιολογικό περιφερικό αίμα (PBL) που προέρχεται Τ-κυτταρική γραμμή (τιμή ρ = 0.0007 και 0.021 αντίστοιχα, Σχήμα 10C). Ωστόσο, οι υπόλοιπες κυτταρικές σειρές 2 λεμφώματος, με συγκριτικά υψηλότερη έκφραση Dlc1, δεν έδειξε σημαντικές διαφορές στην εισβολή (τιμή p = 0,068). Όλες οι κυτταρικές σειρές λεμφώματος έδειξαν επίσης σημαντικά υψηλότερο ποσοστό από τους κορυφαίους δομής pseudopodal άκρη σε σύγκριση με τις κανονικές PBL Τ-κύτταρα (Ρ τιμή & lt? 0,04) (Εικόνα 10D). Η αυξημένη εμπρόσθια ακμή ψευδοποδίου σχηματισμό και διαενδοθηλιακή μετανάστευση σε κυτταρική γραμμή λεμφώματος 1 και 2 συνδυάζεται με αυξημένη μετάσταση στην αντίστοιχη κοόρτη ποντικούς (Σχήμα 3).

(Α) που απεικονίζονται είναι δύο κύτταρα TL που είχαν εισβάλει μεταξύ της ενδοθηλιακής κύτταρα. Τα κύτταρα TL βάφτηκαν με δείκτη υποδοχέα Τ-κυττάρου ειδικά αντισώματα αντι-CD3 και τα ενδοθηλιακά κύτταρα βάφτηκαν με DAPI και ΤΚΙΤΟφαλλοειδίνη. Η κορυφή του πίνακα δείχνει αντιπροσωπευτικές εικόνες Ζ στοίβα κορυφή φέτα (πάνω από τα ενδοθηλιακά κύτταρα) και το βέλος δείχνει ψευδοποδίου σχηματισμό (Β) δοκιμασία μετανάστευσης δια μέσω του ενδοθηλίου των κυττάρων του λεμφώματος Τ. Τρισδιάστατη ανακατασκευή δείχνει δύο κύτταρα TL που είχαν εισβάλει τη συρροή ενδοθηλιακή μονοστοιβάδα. έχουν Z στοιβάζονται εικόνες που λαμβάνονται σε διαστήματα 0,5 μm έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανακατασκευή της εικόνας 3D. (Γ) Το ποσοστό των trans-ενδοθηλιακών μετανάστευσαν κυτταρικές σειρές Τ-λεμφώματος. Η μέση τιμή και η τυπική λάθους εμφανίζονται για 5 πειράματα (Δ) Ποσοστό των κυττάρων που έδειξαν μια ηγετική δομή άκρη ψευδοποδίου κάτω από τα κύτταρα bEND.3. Η μέση και η τυπική σφάλμα του μέσου όρου εμφανίζονται για 4 πειράματα στα οποία περισσότερα από 200 κύτταρα αναλύθηκαν ανά πείραμα. (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001 και **** P & lt? .0001 Από Student t test).

Η

Συζήτηση

Η γονίδιο Dlc1 όπως και άλλα γονίδια καταστολής όγκου, για παράδειγμα ΤΡ53, APC και BRCA1, χρησιμοποιεί εναλλακτικές υποκινητές για να αποδώσει τουλάχιστον τρεις ισομορφές πλήρους μήκους σε ποντικούς [22] – [25]. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις εκλεκτικής χρήση εναλλακτικών υποκινητών, η οποία ρυθμίζει διαφορική μεταγραφή, μπορεί να εμπλέκονται σε έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου [26]. Η παρεκκλίνουσα χρήση ενός υποκινητή πάνω από το άλλο σε γονίδια, όπως TGFB3, LEF1 και CYP19A1, συνδέεται άμεσα με την καρκινική κυτταρική ανάπτυξη (ανασκόπηση από [26]). Οι εναλλακτικές υποκινητές που χρησιμοποιούνται από το γονίδιο Dlc1 είναι εξελικτικά συντηρημένες και συχνή μεταξύ των άλλων μελών της οικογένειας Dlc [27], [28]. Το γονίδιο Dlc1 έχει τρεις σημαντικές εναλλακτικές μεταγραφές που είχαν προηγουμένως περιγραφεί ως 7.4, 6.1 και 6.2 Kb μεταγραφής από Sabbir et al. [8]. Αυτές οι ισομορφές έχουν οριστεί ως Ισόμορφης 1, 2 και 3 αντίστοιχα του προγράμματος περιήγησης UCSC Γονιδιώματος στο ποντίκι Ιουλίου 2007 (NCBI37 /mm9) Συνέλευση. Για τη συζήτηση αυτή, θα χρησιμοποιήσουμε την ονοματολογία UCSC των ισομορφών. Προηγουμένως, έχει δειχθεί ότι οι τρεις μεταγραφικές ισομορφές του γονιδίου Dlc1 εκφράζονται σε διάφορους βαθμούς σε διαφορετικούς ιστούς ποντικού αλλά ατομική ο ρόλος τους στην ογκογένεση είναι ακόμα άγνωστος [8]. Η χωροχρονική έκφραση των ανθρώπινων ισομορφών Dlc1 ισοδύναμο με το ποντίκι Dlc1 εξακολουθεί να απουσιάζει. Πρόσφατα, Low et al. έχουν ταυτοποιήσει μία νέα Dlc1 ισομορφή 4 στον άνθρωπο, η οποία αντιστοιχεί στην ισομορφή Dlc1 3 στον ποντικό και έχει βρεθεί σιγήσει σε πολλαπλές γραμμές καρκινώματος με υπερμεθυλίωση προαγωγέα [29]. Το ποντίκι genetrap που χρησιμοποιήσαμε στη μελέτη μας έχει προηγουμένως δειχθεί να παγιδεύουν Dlc1 ισομορφή 2 και μειώνει την έκφραση της, αλλά, όχι ισομορφές 1 και 3 [8]. Ο υποκινητής ισομορφή 3 έδειξε υψηλό βαθμό συστατική μεθυλίωσης σε φυσιολογικό ιστό θύμου και θυμικά κύτταρα του όγκου. Και οι δύο αυτοί τύποι κυττάρων έδειξε ακόμη την έκφραση του ισόμορφου 3 mRNA. Υψηλή μεθυλίωση του υποκινητή Dlc1 με συνεχή έκφραση του γονιδίου έχει επίσης αναφερθεί για ισομορφή 2 σε κυνικός λέμφωμα [30]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι κατάστασης μεθυλίωσης από μόνη της δεν μπορεί να είναι επαρκής για να προβλέψει την έκφραση του Dlc1 ισομορφής 3, τουλάχιστον στον θύμο και Τ λεμφοκύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι επιλεγμένα απώλεια Dlc1 έκφρασης ισομορφής 2 μπορεί να είναι επαρκής για την εξέλιξη του όγκου.

Η genetrap Dlc1 μόνη της δεν είναι σε θέση να προκαλέσουν όγκους, ωστόσο, στην παρουσία του Κ-Ras2

μετάλλαξη G12D, αυξάνει συχνότητες και μετάσταση όγκου σε σύγκριση με K-Ras2

G12D μετάλλαξη μόνο ποντίκια, υποδεικνύοντας ένα επιπρόσθετο αποτέλεσμα. Το υπό όρους Κ-Ras2

G12D ποντίκι χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη αυτή είχε προηγουμένως αναφερθεί ότι αναπτύσσουν αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα κατά την ενδορρινική χορήγηση του ιού AdenoCre [17]. Ένα άλλο διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού, LA1-K-Ras2, όπου το Κ-Ras2

αλληλόμορφο G12D μπορεί να ενεργοποιηθεί από ένα σωματικό ενδοχρωμοσωμική συμβάν ανασυνδυασμού, έδειξαν υψηλή συχνότητα εμφάνισης όγκων του πνεύμονα, αλλά, επίσης μια συχνότητα 30% του θυμικού λεμφώματος και άλλων όγκων τύπων [31]. Στη μελέτη μας, έχουμε βρει κυρίως θυμικό όγκων μαζί με νεοπλασματικές αλλοιώσεις σε πολλά άλλα όργανα που χρησιμοποιούν ένεση στην ουραία φλέβα του AdenoCre. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ένεση στην ουραία φλέβα του AdenoCre στοχεύει κυρίως στο ήπαρ, σπλήνα και νεφρά και σε μικρότερο βαθμό το θύμο, την καρδιά και τον πνευμονικό ιστό [32], [33].

Η συνολική συχνότητα νεοπλασματικών βλαβών και θυμική όγκους ήταν σημαντικά υψηλότερη σε KD ποντίκια υποδηλώνοντας ότι παγίδευση Dlc1 ισομορφή 2 μπορεί να παρέχεται πλεονέκτημα από την έναρξη της ογκογένεσης. Οι ποντικοί KD έδειξε επίσης μια σημαντική μείωση στην συνολική επιβίωση. Η αύξηση των μεταστάσεων λεμφώματος στους πνεύμονες των ποντικών KD μπορεί να είναι η αιτία της μειωμένης επιβίωσης σε αυτά τα ποντίκια.