Αφηρημένο

Ιστορικό

Emodin έχει έδειξε να επάγει απόπτωση του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων και να αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου σε προηγούμενες μελέτες μας. Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να διερευνήσει κατά πόσο εμοδίνη θα μπορούσε να αναστείλει την αγγειογένεση των ιστών καρκίνου του παγκρέατος και του μηχανισμού του.

Μεθοδολογία /Principal εύρεση

Σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη μας, εμοδίνη ανέστειλε την ανάπτυξη του παγκρέατος καρκινικών κυττάρων, επαγόμενη απόπτωση, και ενίσχυσε την επίδραση κατά του όγκου της γεμσιταβίνης επί παγκρεατικών κυττάρων Caner

in vitro

και

in vivo

με αναστολή της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ. Εδώ, για πρώτη φορά, αποδείξαμε ότι εμοδίνης ανέστειλαν την αγγειογένεση όγκων

in vitro

και σε εμφυτευμένο παγκρεατικό καρκινικούς ιστούς, μείωσε την έκφραση της αγγειογένεσης που σχετίζεται με τους παράγοντες (NF-κΒ και ρυθμιζόμενη παράγοντες VEGF της, ΜΜΡ-2 , ΜΜΡ-9, και eNOS), και μειωμένη φωσφορυλίωση eNOS, όπως αποδεικνύεται τόσο από ανοσοϊστοχημεία και ανάλυση Western blot των εμφυτευμένων όγκων. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι εμοδίνης δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση VEGFR

in vivo

.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι εμοδίνης έχει τη δυνατότητα αντικαρκινική δράση σε παγκρεατικά καρκίνου μέσω διττό ρόλο της στην προώθηση της απόπτωσης και την καταστολή της αγγειογένεσης, πιθανώς μέσω ρυθμίζουν την έκφραση του NF-κΒ και NF-κΒ-ρυθμιζόμενη αγγειογένεση που σχετίζεται με παράγοντες

Παράθεση:. Lin SZ, Wei WT, ο Τσεν Η Chen KJ, Tong HF, Wang ZH, et al. (2012) αντικαρκινική δράση της Emodin κατά του καρκίνου του παγκρέατος Εξαρτάται από το διπλό της ρόλο: Προώθηση της απόπτωσης και καταστολή της αγγειογένεσης. PLoS ONE 7 (8): e42146. doi: 10.1371 /journal.pone.0042146

Επιμέλεια: Dominique Heymann, Faculté de Ιατρικής de Nantes, Γαλλία

Ελήφθη: 22, Μαρ 2012? Αποδεκτές: 2 Ιούλη, 2012? Δημοσιεύθηκε: δεύτερης Αυγούστου του 2012

Copyright: © Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς είναι ευγνώμων για χρηματοδοτική στήριξη από: Η διοίκηση της Παραδοσιακής Κινέζικης Ιατρικής της επαρχίας Zhengjing, Κίνα (Grant Νο 2011ZZ010), Zhejiang Provincial Ταμείο Επιστήμη Διακεκριμένου νέους επιστήμονες (Grant Νο LR12H280001) και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Όχι . 81173606). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επί του παρόντος, η θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος εξαρτάται από χειρουργική εκτομή. Ωστόσο, μόνο περίπου 25% των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος είναι εφικτά για χειρουργική εκτομή, λόγω της εισβολής του καρκίνου του παγκρέατος. Πολλοί ασθενείς με τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό καρκίνο του παγκρέατος επικαλεστεί γκεμσιταμπίνης χημειοθεραπεία [1]. Ωστόσο, ο καρκίνος του παγκρέατος είναι ένας εκπρόσωπος των περισσότερα αγγεία και αγγειογόνων συμπαγών όγκων, η οποία ανταποκρίνεται ανεπαρκώς σε γεμσιταβίνη χημειοθεραπεία. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η θεραπεία με τα αποτελέσματα gemcitabine στο μέσο χρόνο επιβίωσης περίπου 6,2 μήνες [2]. Έτσι, αναζητώντας νέες θεραπευτικές στρατηγικές που στοχεύουν στη βελτίωση της αντι-αγγειογενετική ικανότητα είναι επείγον στην κλινική πράξη, προκειμένου να ενισχυθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα και αναστέλλουν τη μετάσταση του καρκίνου του παγκρέατος.

ιδρυτική ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα-κΒ (NF-κΒ ) μπορούν να προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αναστέλλουν την κυτταρική απόπτωση, και ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την αγγειογένεση [3], [4]. Επιπλέον, συσσωρεύοντας ενδείξεις υποδηλώνουν ότι η ΝΡ-κΒ παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, η αναστολή της απόπτωσης, και την αγγειογένεση των παγκρεατικό καρκίνο [5]. Η γεμσιταβίνη μπορεί να ενισχύσει την έκφραση και την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [6], η οποία σχετίζεται με την ανάπτυξη του χημειοαντίσταση του καρκίνου του παγκρέατος. Επομένως, ένα νέο φάρμακο που αναστέλλει την έκφραση ΝΡ-κΒ και της ενεργοποίησης μπορεί να επάγει την απόπτωση των κυττάρων να ακυρώσει και να μειώσει την αγγειογένεση του καρκίνου του παγκρέατος, ενισχύοντας έτσι τη δραστικότητα κατά του όγκου της γεμσιταβίνης και ενδεχομένως επωφελούνται οι ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος.

Emodin (1,3,8-τριυδροξυ-6-μεθυλανθρακινόνη), ένα παράγωγο φυσικού ανθρακινόνης που απομονώνεται από Rheum palmatum L, είναι σε θέση να αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος, όπως αποδεικνύεται από τις προηγούμενες μελέτες [6], [7], [ ,,,0],8]. Εντυπωσιακά, έχει αναφερθεί ότι εμοδίνη έχει τη δυνατότητα να αναστέλλει διάφορες διαδικασίες αγγειογένεσης [9], [10]. Έχει προταθεί ότι εμοδίνη μπορεί να αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με το φράξιμο του υποδοχέα αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGFR) σηματοδότησης σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, υποδεικνύοντας ότι εμοδίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα δυνητικό αναστολέα για αγγειογένεση όγκου [11]. Ωστόσο, παραμένει ασαφές εάν εμοδίνης θα μπορούσε να αναστείλει την αγγειογένεση του καρκίνου του παγκρέατος. Είναι ενδιαφέρον, έχει βρεθεί ότι εμοδίνη μπορεί να αναστέλλουν την έκφραση και ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ [6], [12]. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει κατά πόσον εμοδίνη μπορεί να αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος και την αγγειογένεση του καρκίνου του παγκρέατος μέσω μιας πιθανής ΝΡ-κΒ εμπλέκονται μηχανισμό. Βρήκαμε ότι η θεραπεία με εμοδίνη ενίσχυσε την γεμσιταβίνη επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος

in vitro

. Δείξαμε περαιτέρω η αναστολή της ανάπτυξης του όγκου και αντι-αγγειογένεσης επιδράσεις της εμοδίνης επί καρκίνου του παγκρέατος

in vivo

, με προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του NF-κΒ και NF-κΒ-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες (δηλαδή VEGF, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ -9, και eNOS) και με τους ρόλους στην αναστολή της αγγειογένεσης και τη μείωση της eNOS φωσφορυλίωση.

Αποτελέσματα

Η κυτταροτοξικότητα της Emodin κατά SW1990 κύτταρα, Panc-1 κύτταρα, HPNE και ECs

για να δοκιμαστεί η κυτταροτοξικότητα των εμοδίνης, τα κύτταρα SW1990 και τα κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές δόσεις του εμοδίνης (10 μΜ, 20 μΜ, 40 μΜ και 80 μΜ) για 72 ώρες, και οι βιωσιμότητες των κυττάρων αυτών προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το CCK-8 δοκιμασίας. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, η θεραπεία με εμοδίνη μόνο μείωσε το κύτταρο βιωσιμότητα τόσο των SW1990 κύτταρα και τα κύτταρα Panc-1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. CCK-8 ανάλυση αποκάλυψε ότι αφού τα κύτταρα SW1990 και τα κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με εμοδίνη (40 μΜ) για 12 ώρες, 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες, εμοδίνη μείωσε την κυτταρική βιωσιμότητα και των δύο κυτταρικών γραμμών σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1Β). Είναι ενδιαφέρον, εμοδίνη (40 μΜ) αγωγή για 72 ώρες μείωσε την κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων και των κυττάρων SW1990 Panc-1 με 46,4% και 40,8%, αντίστοιχα. Ωστόσο, η συνδυασμένη θεραπεία και των δύο εμοδίνης και gemcitabine μείωσε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων SW1990 και κύτταρα Panc-1 με 72,4% και 54,7%, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας μία ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα της συνδυασμένης θεραπείας φαρμάκου έναντι κυττάρων SW1990 και Panc-1 κύτταρα σε σύγκριση με ενιαία θεραπεία με παράγοντα (Εικ. 1Γ) (

P

& lt? 0,05). Επιπλέον, βρήκαμε ότι εμοδίνη, γεμσιταβίνη, και ο συνδυασμός τους δεν αλλάζει την ανάπτυξη των ανθρώπινων παγκρεατικών φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα (HPNE) (Σχ. 1D). Βρήκαμε ότι η γεμκιταβίνη (20 μmol /L) αγωγή μείωσε σημαντικά τον κυτταρικό θάνατο σε παγκρεατικού καρκίνου που προέρχεται από ECs, ενώ η εμοδίνη (/L 40 μιτιοΙ) θεραπεία και η συνδυασμένη θεραπεία της εμοδίνης και gemcitabine ενισχυμένη κυτταρικό θάνατο σε αυτά τα κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι εμοδίνη έχει ανασταλτική δράση στον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του παγκρέατος προερχόμενου ECs.

Τα κύτταρα χωρίς θεραπεία απεξάρτησης χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. (Α) Emodin ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τα κύτταρα SW1990 Panc-1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. (Β) Emodin ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τα κύτταρα SW1990 Panc-1 σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. (Γ) Emodin ενίσχυσε την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και των κυττάρων SW1990 Panc-1 με γεμσιταβίνη. (D, E) Βιωσιμότητα HPNE και ECs εκτιμήθηκε μετά επεξεργάστηκε με έλεγχο αραιωτικό, γεμσιταβίνη (20 μmol /L), εμοδίνη (40 μmol /L), ή συνδυασμός τους για 72 ώρες. Ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε με υπολογισμό της αναλογίας της τιμής με τον έλεγχο. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD από κάθε ομάδα κυττάρων από τρία ξεχωριστά πειράματα. Emo: εμοδίνης? Gem: gemcitabine. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Επίδραση των Emodin στην απόπτωση των SW1990 κύτταρα και Panc-1 κύτταρα

Περαιτέρω ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι η θεραπεία με εμοδίνης και μόνο αύξησε το ποσοστό της απόπτωσης των κυττάρων SW1990 από 3,7% σε 15,3% και των κυττάρων Panc-1 από 7,7% έως 26,0%. Σε σύγκριση με ενιαία φαρμακευτική αγωγή, η συνδυασμένη θεραπεία με δύο φάρμακα που επάγεται σημαντικά υψηλότερα ποσοστά απόπτωσης (

P

& lt? 0,05), τα οποία ήταν 41,2% για τα κύτταρα SW1990 και 38,7% για Panc-1 κύτταρα (Σχήμα 2Α και Β). Αυτά τα δεδομένα συμφωνούν με προηγούμενες μελέτες της αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης με χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ, υποδεικνύοντας ότι η απώλεια των βιώσιμων κυττάρων με εμοδίνη και /ή γεμσιταβίνη είναι τουλάχιστον εν μέρει λόγω της επαγωγής της απόπτωσης των κυττάρων.

(Α) Εκπρόσωπος dot-οικόπεδα που απεικονίζει την αποπτωτική κατάσταση των κυττάρων SW1990 και κύτταρα Panc-1. (Β) Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων SW1990 και τα κύτταρα Panc-1. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Επίδραση των Emodin στην αγγειογένεση του καρκίνο του παγκρέατος που προέρχονται από ECs

Η δοκιμασία αγγειογένεσης διεξήχθη για να διερευνηθεί η επίδραση της εμοδίνης από την αγγειογένεση

in vitro

. Βρήκαμε ότι η επεξεργασία γεμκιταβίνης (20 μmol /L) επάνω ρυθμισμένο το δείκτη της αγγειογένεσης, ενώ η εμοδίνη (40 μmol /L) θεραπεία και η συνδυασμένη θεραπεία της γεμσιταβίνης και εμοδίνης ρυθμισμένα προς τα κάτω με το δείκτη, που δείχνει ότι εμοδίνη μπορεί να αναστείλει την αυθόρμητη και gemcitabine επαγόμενη αγγειογένεση (Σχήμα 3).

(Α) Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα (200 Χ) της αγγειογένεσης μετά την επεξεργασία του ελέγχου αραιωτικό, γεμσιταβίνη (20 μmol /L), εμοδίνη (40 μmol /L), ή ο συνδυασμός τους για 72 ώρες. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν επί των Matrigel-προεπικαλυμμένα φρεάτια (5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν σε 10% FBS μέσου-DMEM. Αρχική μεγέθυνση. (Β) Η αγγειογένεση των ενδοθηλιακών κυττάρων (ECs) που απομονώνεται από παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς.

In vitro

αγγειογένεση αναλύθηκε ποσοτικά όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Επίδραση της Emodin στην έκφραση και την δραστηριότητα της NF-κΒ

Τα αποτελέσματα της ανάλυσης EMSA έδειξαν ότι η θεραπεία με εμοδίνης σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται η δραστικότητα δέσμευσης DNA του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα SW1990 και τα κύτταρα Panc-1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 4Α και Β). Τα σχετικά επίπεδα του ΝΡ-κΒ /p65 σε κύτταρα SW1990 και τα κύτταρα Panc-1 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία κηλίδος Western. Βρήκαμε ότι γεμσιταβίνης επάνω ρυθμισμένη η έκφραση του ΝΡ-κΒ /p65 σε κύτταρα SW1990 και τα κύτταρα Panc-1. Ωστόσο, η θεραπεία με μόνη εμοδίνη ή σε συνδυασμό γεμκιταβίνης μείωσε σημαντικά την αυθόρμητη έκφραση του ΝΡ-κΒ /p65 και στους δύο τύπους κυττάρων. ΝΡ-κΒ είναι ένας ισχυρός παράγοντας μεταγραφής για τη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση (4Γ και D). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι εμοδίνη ανέστειλε την έκφραση του NF-κΒ και την προώθηση του παγκρέατος απόπτωση των καρκινικών κυττάρων

in vitro

, ενισχύοντας έτσι την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού με τη συνδυασμένη θεραπεία.

(Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες που δείχνουν ότι η θεραπεία με εμοδίνης για 72 ώρες ανέστειλε την δραστικότητα του ΝΡ-κΒ σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα SW1990 και τα κύτταρα Panc-1. (Β) Τα στοιχεία εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD% των σχετικών επιπέδων της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα SW1990 και τα κύτταρα Panc-1 από δέντρο ξεχωριστά πειράματα. Ίση φόρτωση πρωτείνης διασφαλίστηκε με ανοσοστύπωμα 10 μg πυρηνικής πρωτεΐνης με αντίσωμα αντι-ρετινοβλάστωμα. Τα πυρηνικά εκχυλίσματα από μη διεγερμένα κύτταρα γαστρικού καρκίνου του SGC7901 χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος, και SGC7901 κύτταρα διεγερμένα με 50 ng /mL ΤΝΡα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. +: Θετικός έλεγχος? -: Αρνητικός έλεγχος. (Γ) Emodin εξασθένησε την αυθόρμητη και gemcitabine επαγόμενη έκφραση ΝΡ-κΒ σε κύτταρα SW1990 και τα κύτταρα Panc-1. (Δ) Ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε με υπολογισμό της αναλογίας της τιμής με την ομάδα ελέγχου. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Επίδραση της Emodin για την ανάπτυξη της μεταμοσχεύεται ορθοτοπικά καρκίνο του παγκρέατος

Το πρωτόκολλο θεραπείας φαίνεται στο Σχ.5. Την ημέρα 56 μετά εμφυτεύθηκαν όγκους, το μέσο βάρος των όγκων αγωγή με φυσιολογικό ορό, εμοδίνη (40 mg /kg), γεμσιταβίνη (100 mg /kg), και εμοδίνη (40 mg /kg) συν gemcitabine (80 mg /kg) ήταν (1.721 ± 0.149) g (1.021 ± 0.109) g, (0,794 ± 0,082) g, και (0,393 ± 0,057) g, αντίστοιχα. Παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση (

P

& lt? 0,05) σε βάρος του όγκου στο εμοδίνη ή gemciatabine ομάδα σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο έλεγχο και τη μεγαλύτερη ανασταλτική δράση στην ανάπτυξη του όγκου στην ομάδα συνδυασμού (ΕΙΚΟΝΑ 5Β και C) (

P & lt?

0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο ή την ενιαία ομάδα φαρμάκου).

(Α) Σχηματική απεικόνιση του πειραματικού πρωτοκόλλου. (Β) Οι φωτογραφίες του ορθοτοπικά εμφυτευμένων παγκρεατικών όγκων κατά την 28η ημέρα μετά την αγωγή. Η συνδυασμένη θεραπεία του εμοδίνης και gemcitabine ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου. (Γ) Τα βάρη των όγκων των επιμέρους ομάδες ποντικών κατά την τελευταία ημέρα του πειράματος (Ημέρα 37). *,

P

& lt?. 0.05

Η

Επίδραση της Emodin για την ανάπτυξη των ορθοτοπικά εμφυτεύεται καρκίνο του παγκρέατος Εντοπίστηκε από MicroPET

Μετά την αγωγή για 4 εβδομάδες, η γυμνά ποντίκια απεικονίστηκαν με τομογραφία υψηλής ανάλυσης εκπομπής ποζιτρονίων (MicroPET) (Εικ. 6Α) και φθόριο-18-επισημασμένο φθοροδεοξυγλυκόζης (

18F-FDG) για να προσδιοριστεί η αναλογία του όγκου προς φυσιολογικό μυϊκό ιστό (T /NT αναλογία) στις ίδιες περιοχές μεγέθους ενδιαφέροντος (ROI) και κατ ‘αποκοπή τιμών πρόσληψης (SUV). Σε σύγκριση με την αναλογία T /NT της ομάδας ελέγχου (2,78 ± 0,042), εκείνες της ομάδας γεμσιταβίνης (1.88 ± 0.043) και της ομάδας εμοδίνη (2,20 ± 0,052) ήταν σημαντικά μειωμένη (

P & lt?

0.05 ), και η ομάδα συνδυασμού (1.55 ± 0.058) μειώθηκε περαιτέρω (

P

& lt?. 0.05, σε σύγκριση με το ενιαίο ομάδες φαρμάκων) (Σχήμα 6Β). Τα SUV της ομάδας γεμσιταβίνης (3,61 ± 0,12) και στην ομάδα εμοδίνης (4.10 ± 0.35) ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (5.49 ± 0.22) (

P & lt?

0,05), και η ομάδα συνδυασμού ( 2,72 ± 0,08) είχαν ακόμα χαμηλότερη πρόσληψη από τα ενιαία ομάδες του φαρμάκου (

P & lt?..

0,05) (Σχήμα 6C)

(α) MicroPET δείχνει μια μεγάλη στεφανιαία τομή ορθοτοπική μεταμόσχευση του όγκου ενός γυμνό ποντίκι. (Β και Γ) αναλογία Τ /NT και τα SUV στην ομάδα γεμσιταβίνη, η ομάδα εμοδίνη και η ομάδα συνδυασμού ήταν χαμηλότερη από εκείνη της ομάδας ελέγχου (0,9% χλωριούχο νάτριο) (

P

& lt? 0,05), και η ομάδα συνδυασμού έδειξε ακόμη χαμηλότερη αναλογία Τ /ΝΤ και SUV από την ομάδα εμοδίνης και της ομάδας γεμσιταβίνη. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Επίδραση των Emodin στην αγγειογένεση των ορθοτοπικώς εμφυτεύεται καρκίνο του παγκρέατος Εντοπίστηκε από αγγειακά Imaging

Όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 7Α και Β, ανάλυση του όγκου αγγειακή απεικόνιση αποκάλυψε ότι γεμσιταμπίνη αύξησε την διανομή σκάφος (

P

& lt? 0,05), αν και μειώθηκε ο όγκος του όγκου σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, όπως φαίνεται από MicroPET (

P

& lt ? 0,05). Ωστόσο, βρήκαμε ότι τόσο ο όγκος του όγκου και η κατανομή σκάφος στην ομάδα εμοδίνης και η ομάδα συνδυασμού σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου και gemcitabine (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 7Α και Β). Περαιτέρω, η ανάλυση ανοσοϊστοχημείας έδειξαν ότι η θεραπεία γεμσιταβίνης σημαντικά επάνω ρυθμισμένη τα επίπεδα έκφρασης του CD31 και CD105, το οποίο μπορεί να μειωθεί σημαντικά με την κατεργασία εμοδίνης και τη συνδυασμένη θεραπεία του εμοδίνης και gemcitabine (Fig.7C και D). Οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν ότι εμοδίνη θα μπορούσε να αναστείλει την αγγειογένεση του ορθοτοπικά εμφυτευμένων όγκων

Α:. Το αγγειακό εικόνα των όγκων είχαν συλληφθεί από μηχάνημα ακτίνων Χ. Β: Αγγειακή πυκνότητα υπολογίστηκε ως ο συνολικός αριθμός των αιμοφόρων αγγείων του όγκου διαιρεμένο με τον όγκο του όγκου, και στη συνέχεια κανονικοποιούνται με την ομάδα ελέγχου. (Γ) Emodin μόνο του ή σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη ανέστειλε την έκφραση του CD31 και CD105. (δ) Ποσοτικά στοιχεία που παρουσιάζονται. Η ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε με υπολογισμό της αναλογίας της τιμής με την ομάδα ελέγχου. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Επίδραση της Emodin στην έκφραση της αγγειογένεση που σχετίζεται με Πρωτεΐνες σε ορθοτοπική καρκίνο του παγκρέατος ιστοί Εντοπίστηκε με ανοσοϊστοχημεία και Western Blot

Όπως φαίνεται στο Σχ. 8, η ανάλυση ανοσοϊστοχημείας αποκάλυψε ότι εμοδίνης και gemcitabine κάτω ρυθμισμένα την έκφραση του Ki-67 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

P

& lt? 0,05), και ο συνδυασμός τους πιο κάτω ρυθμισμένα την έκφραση Ki-67 σε σύγκριση με τα ενιαία φαρμακευτικές αγωγές (

P

& lt? 0,05). Τόσο η ανάλυση ανοσοϊστοχημείας και ανάλυση κηλίδας Western απεκάλυψε ότι γεμσιταβίνης επάνω ρυθμισμένη την έκφραση του VEGF, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, eNOS, και ΝΡ-κΒ σε ορθοτοπικά thanspanted όγκους σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

P

& lt ? 0,05), ενώ εμοδίνη μόνη ή σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη κάτω-ρυθμίζεται η έκφραση της αγγειογένεσης που σχετίζεται με τους παράγοντες (VEGF, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, eNOS, και ΝΡ-κΒ) εντός του παγκρέατος καρκινικούς ιστούς (

P

& lt? 0,05). Επιπλέον, η θεραπεία εμοδίνη και η συνδυασμένη θεραπεία της εμοδίνης και gemcitabine ανέστειλαν σημαντικά τη φωσφορυλίωση της eNOS. Ωστόσο, βρήκαμε ότι κανένα από τα τρία θεραπείες μεταβάλλεται το επίπεδο έκφρασης του VEGFR σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς.

ανάλυση (Α) Ανοσοϊστοχημεία της έκφρασης του Ki-67, ΝΡ-κΒ, VEGF, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, και eNOS σε ορθοτοπική παγκρεατικό καρκινικούς ιστούς. (Β) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης του ΝΡ-κΒ, VEGF, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, eNOS, VEGFR, και π-eNOS σε ορθοτοπική παγκρεατικό καρκινικούς ιστούς. (C) ποσοτικά στοιχεία της ανάλυσης ανοσοϊστοχημείας παρουσιάζονται. (D) Ποσοτικός προσδιορισμός των αποτελεσμάτων των κηλίδος Western έγινε με υπολογισμό της αναλογίας της τιμής με την ομάδα ελέγχου. *,

P

& lt? 0,05? #,

P

& gt?. 0.05

Η

Επίδραση των Emodin για NF-κΒ Δραστηριότητα στο μεταμοσχευμένων καρκίνο του παγκρέατος ιστοί

Για να καθοριστεί αν η θεραπεία συνδυασμού της εμοδίνης και gemcitabine έχει οποιαδήποτε επίδραση επί της ενεργοποίησης ΝΡ-κΒ, η δραστικότητα δέσμευσης του DNA του ΝΡ-κΒ αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία EMSA. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα ανοσοστύπωση, εμοδίνη μόνη ή σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη μείωσε την δραστικότητα δέσμευσης του DNA του ΝΡ-κΒ σε καρκίνο του παγκρέατος ορθοτοπικά εμφυτευμένων με κύτταρα Panc-1 (Εικ. 9Α, Β).

(Α) ΝΡ δραστικότητα σύνδεσης κΒ DNA προσδιορίστηκε από τον EMSA και υπερμετατόπισης πείραμα. Ίσες πρωτεΐνη φόρτωσης εξασφαλίστηκε με ανοσοαποτύπωση 10 μg πυρηνικής πρωτεΐνης με αντίσωμα αντι-ρετινοβλάστωμα. +, Θετικός έλεγχος? -, Αρνητικός έλεγχος. Τα (Β) ποσοτικά δεδομένα που παρουσιάζονται. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Επίδραση της Emodin στα επίπεδα έκφρασης του mRNA του ΝΡ-κΒ, VEGF, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, και eNOS σε καρκίνο του παγκρέατος οι ιστοί Εντοπίστηκε με RT-PCR

σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας και αναλύσεως κηλίδος Western, η έκφραση του mRNA του ΝΡ-κΒ, VEGF, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και eNOS σε παγκρεατικό ιστό καρκίνου ήταν ανάντη ρυθμίζονται στην ομάδα γεμσιταβίνη, αλλά κάτω-ρυθμίζονται στην ομάδα εμοδίνης και ομάδα συνδυασμού σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς (

P

& lt? 0,05). (Εικ. 10Α, Β)

(Α) Τα επίπεδα mRNA του ΝΡ-κΒ, VEGF, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και eNOS σε παγκρεατικό ιστό καρκίνου σε διαφορετικές ομάδες θεραπείας ανιχνεύθηκαν με RT-PCR. παρουσιάστηκαν (Β) ποσοτικά δεδομένα. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Σύμφωνα με τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας [8], η θεραπεία των κυττάρων με εμοδίνης σημαντικά ενισχυμένη την αναστολή του κυτταρικού ανάπτυξη με gemcitabine, η οποία συσχετίστηκε καλά με τα αποτελέσματα της ανάλυσης απόπτωσης. Ομοίως, ανακαλύψαμε ότι εμοδίνη ανέστειλε την παγκρεατική ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vivo

. Εδώ, για πρώτη φορά, διαπιστώσαμε ότι εμοδίνη ανέστειλε την αγγειογένεση του καρκίνου του παγκρέατος σε βιολογικό περιβάλλον, μειωτικά την έκφραση του NF-κΒ και NF-κΒ-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες με ρόλους σε αναστολή αγγειογένεσης (VEGF, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, και eNOS). Αυτή η μελέτη εστιάστηκε στην αντι-αγγειογένεσης επίδραση της εμοδίνης

in vivo

και ο πιθανός μηχανισμός.

Έχει αναφερθεί ότι η γεμσιταβίνη επάγει την ενεργοποίηση του NF-κΒ και στη συνέχεια προκαλεί ανθεκτικότητα στο φάρμακο [ ,,,0],13]. Σε συμφωνία με τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας, η παρούσα μελέτη έδειξε σαφώς ότι εμοδίνη ανέστειλε την αυθόρμητη ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα SW1990 και Panc-1 κύτταρα, και κατήργησε την γεμσιταβίνη επαγόμενη ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ και στους δύο τύπους κύτταρα. Επιπλέον, βρήκαμε ότι εμοδίνης μόνο του ή σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη παρουσιάζονται κατά του όγκου αποτελέσματα σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο καρκίνου του παγκρέατος, όπως αποδεικνύεται από μια μείωση στο βάρος του όγκου. Παρομοίως, εμοδίνη μόνο ή σε συνδυασμό γεμκιταβίνης έχει δειχθεί ότι έχει ισχυρή αντικαρκινική δράση σε ένα υποδόριο μοντέλο όγκου σε προηγούμενη μελέτη μας [8].

Ένα κρίσιμο βήμα στην αγγειογένεση εμπλέκει την τοπική πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων. Hee-Jin Kwak et al. απέδειξαν ότι εμοδίνης αποτελεσματικά αναστέλλει VEGF-Α-επαγόμενη αγγειογένεση in vitro και in vivo [10]. Αλέξανδρος Δ Crawford et al. ανέφεραν ότι εμοδίνης ανέστειλε το σχηματισμό των θηλαστικών πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων και του σωλήνα in vitro [14]. Και έχει αναφερθεί ότι εμοδίνη μπορεί να αναστείλει σχετίζονται με όγκους αγγειογένεση σε ανθρώπινο καρκίνωμα κόλου

in vitro

[9]. Η μελέτη μας έδειξε ότι ο πολλαπλασιασμός του σχηματισμού του καρκίνου του παγκρέατος προερχόμενου ECs και των αιμοφόρων αγγείων αναστέλλεται από εμοδίνη μόνα ή σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη. Συστατική ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ παρατηρείται σε πολλούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπινων παγκρεατικού καρκίνου [15]. Οι στρατηγικές που απευθύνονται η ρυθμιζόμενη μονοπατιού ΝΡ-κΒ μπορεί να είναι χρήσιμη για τη βελτίωση των επιδράσεων χημειοθεραπευτικών παραγόντων όπως είναι η γεμσιταβίνη σε ενδοθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από όγκους [16]. Η μελέτη μας προτείνει ότι εμοδίνη μπορεί να αναστέλλει την αγγειογένεση του καρκίνου του παγκρέατος που προέρχονται από ECs μέσω NF-κΒ μονοπάτι ρυθμιζόμενη σηματοδότησης. Επιπλέον, τα καρκινικά αποτελέσματα αγγειακής απεικόνισης έδειξαν ότι η αγγειακή πυκνότητα στην ομάδα εμοδίνης και ομάδα συνδυασμού εμοδίνη /γεμσιταβίνη μειώνεται σημαντικά σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου και γεμσιταβίνη. Επιπλέον, σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου και γεμσιταβίνη, η θεραπεία εμοδίνη και η συνδυασμένη θεραπεία της εμοδίνης και gemcitabine μείωσε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης του CD31 και CD105. Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι εμοδίνη μπορεί να αναστείλει την αγγειογένεση του ορθοτοπικά εμφυτευμένων καρκίνου του παγκρέατος.

Προγενέστερες μελέτες έχουν δείξει ότι ο ΝΡ-κΒ μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση αρκετών αγγειογένεση σχετίζεται πρωτεΐνες όπως ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, VEGF , και eNOS [12], [17], [18], [19]. προηγούμενη μελέτη μας έχει δείξει ότι εμοδίνη μειωτικά την ενεργοποίηση και έκφραση του ΝΡ-κΒ σε εμφύτευση κυττάρων που προκαλείται SW1990 παγκρεατικού καρκίνου [20], ΝΡ-κΒ ανάλυση των ορθοτοπική καρκινικών ιστών σε αυτή τη μελέτη έδειξε ότι εμοδίνης μόνη ή σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη κατασταλεί ΝΡ έκφραση κΒ και τη δραστηριότητά της σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς. Επίσης βρήκαμε ότι εμοδίνης μόνο του ή σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη μειωτικά την έκφραση του NF-κΒ-ρυθμιζόμενα γονίδια (VEGF, eNOS, ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9), οι οποίες συνδέονται στενά με την αγγειογένεση.

ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 μπορεί να σχετίζεται με την αγγειογένεση των όγκων [9], [17]. Έχει αναφερθεί ότι εμοδίνη μπορεί να αναστείλει που σχετίζονται με όγκους αγγειογένεση μέσω καταστολής ΜΜΡ-9 έκφραση [9]. Σε αυτή τη μελέτη, ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε ότι εμοδίνης μόνο του ή σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη μειωτικά την έκφραση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 σε ορθοτοπική παγκρεατικό καρκινικούς ιστούς, ενώ gemcitabine δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι εμοδίνη μπορεί να αναστείλει την αγγειογένεση του παγκρεατικού καρκινικών ιστών μέσω καταστολής της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9.

Σαν ρυθμιστικός παράγοντας αγγειογένεσης, VEGF συνδέεται στενά με την αγγειογένεση [21] και της μετάστασης του καρκίνου του παγκρέατος [22]. Όπως αναφέρθηκε από Aggarwal et al., NF-κΒ-εξαρτώμενη αύξηση της έκφρασης του VEGF μπορεί να προάγει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και των αγγειακών αγγειογένεση [23]. Μια πρόσφατη μελέτη προτείνει ότι εμοδίνη μπορεί να αναστέλλει την έκφραση του VEGF σε ανθρώπινα κύτταρα νευροβλαστώματος [24]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι εμοδίνης μόνο του ή σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη μειωτικά σημαντικά την έκφραση VEGF σε ορθοτοπικά εμφυτευμένων καρκίνο του παγκρέατος. Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι εμοδίνη μπορεί να αναστέλλει την έκφραση του VEGF να καταστείλει την αγγειογένεση του καρκίνου του παγκρέατος. Περαιτέρω πειράματα έδειξαν ότι η εμοδίνη, γεμσιταβίνη, και ο συνδυασμός τους δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση VEGFR, υποδεικνύοντας ότι η αναστολή της αγγειογένεσης με εμοδίνης σε καρκίνο του παγκρέατος δεν συσχετίστηκε με VEGFR.

eNOS διεγείρει την απελευθέρωση του ΝΟ που με τη σειρά μπορεί να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των EPCs [25]. Αναστολή της eNOS σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και σωλήνας σχηματισμό των ενδοθηλιακών κυττάρων [10]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι εμοδίνης μόνο του ή σε συνδυασμό με gemctabine ανέστειλε την έκφραση της eNOS σε ορθοτοπική παγκρεατικό καρκινικούς ιστούς, υποδεικνύοντας ότι η αναστολή της έκφρασης της eNOS μπορεί να εμπλέκεται στην αναστολή της αγγειογένεσης του όγκου με εμοδίνης. Περαιτέρω πειράματα έδειξαν ότι η θεραπεία εμοδίνης και η συνδυασμένη θεραπεία της εμοδίνης και gemcitabine αναστέλλει σημαντικά eNOS φωσφορυλίωση, υποδεικνύοντας ότι η εμοδίνη μπορεί να αναστέλλει σημαντικά την γεμσιταβίνη επαγόμενη eNOS φωσφορυλίωση η οποία εμπλέκεται στην μετανάστευση ΕΚ, πολλαπλασιασμό, και ο σχηματισμός σωλήνα

in vitro

[26].

ΝΡ-κΒ συνδέεται στενά όχι μόνο με την αναστολή της απόπτωσης, αλλά και αγγειογένεσης των όγκων. Η μελέτη μας έδειξε για πρώτη φορά ότι η NF-κΒ μπορεί επίσης να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην αναστολή της αγγειογένεσης με εμοδίνης σε καρκίνο του παγκρέατος

in vivo

, και το ενισχυμένο φαινόμενο της γεμσιταβίνης επί καρκίνου του παγκρέατος μπορεί να επιτευχθεί μέσω μεσολάβηση εμοδίνης μειορύθμιση της έκφρασης του NF-κΒ και NF-κΒ-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες με ρόλους σε αναστολή αγγειογένεσης (δηλαδή VEGF, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και eNOS). Ωστόσο, πώς εμοδίνης ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση του NF-κΒ έχει ακόμη να μελετηθεί.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Τα πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review της First Ενταγμένο Νοσοκομείο, Zhejiang University School of Medicine.

γραμμές κυττάρων και ζώα

Τα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές SW1990 και Panc-1 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. Ανθρώπινη παγκρεατική φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα (HPNE) (CHI Scientific INC, Maynard, ΜΑ) εφοδιασμένο στο εργαστήριο μας. Θηλυκοί αθυμικοί BALB /c ποντίκια ηυ /ηυ (ηλικίας 4-6 εβδομάδων) αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Ινστιτούτο Καρκίνου για Tumor εμφύτευση. Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν σε ένα αποστειρωμένο περιβάλλον στο Κέντρο Ζώων Πείραμα της Zhejiang University School of Medicine, σύμφωνα με τους κανονισμούς του εργαστηρίου Ζώων του Υπουργείου Επιστήμης και Τεχνολογίας της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας (https://www.most.gov. cn /kytj /kytjzcwj /200411 /t20041108_32465.htm).

Αντιδραστήρια

Emodin αγοράστηκε από Sigma (St. Louis, USA), διαλύονται σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε 0,2 mmol /L σε απόθεμα και αποθηκεύεται στους -20 ° C. Η τελική συγκέντρωση του DMSO ήταν & lt? 0,1%. Γεμσιταμπίνη αγοράστηκε από Ely Lilly (Bad Homburg, Γερμανία) και διαλύεται σε αποστειρωμένο αλατούχο διάλυμα σε 50 g /L σε απόθεμα. RPMI-1640 και εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) λήφθηκαν από την Gibco BRL (Grand Island, ΝΥ, USA). κιτ αντιδραστηρίων κυτταρική απόπτωση (Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ) αγοράστηκε από Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, Κίνα). καταμέτρηση των κυττάρων kit-8 (CCK-8) αγοράστηκε από Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας (Haimen, Κίνα). Φθόριο-18-επισημασμένο φθοριοδεοξυγλυκόζη (

18F-FDG) παρεσχέθη από τη Zhejiang University School (Hangzhou, Zhejiang, Κίνα). Τα αντισώματα που παράγονται από τις ακόλουθες εμπορικές πηγές: αντι-ΜΜΡ-2, αντι-ΜΜΡ-9, αντι-VEGF, και τα αντισώματα αντι-β-ακτίνης αγοράστηκαν από Epitomics (Burlingame, California, USA)? αντι-ΝΡ-κΒ, αντι-CD31 και αντι-CD105 αντισώματα αγοράστηκαν από Abcam (Cambridge, ΜΑ, USA)? αντι-eNOS και αντι-VEGFR (Flk-1) (C1158) αντισωμάτων αγοράστηκαν από την Santa Cruz (Santa Cruz, USA)? αντι-φωσφο-eNOS (Ser1177) αντίσωμα αγοράστηκε από τη Cell Signaling (Beverly, ΜΑ, USA)? αντι-Ki-67 αντίσωμα και το κιτ DAB αγοράστηκαν από Zhongshan Bio-Tech Co, Ltd (Πεκίνο, Κίνα). Το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Το RNA γρήγορη κιτ 200 καθαρισμού αγοράστηκε από Fastagen Biotech (Σαγκάη, Κίνα).

Απομόνωση των μικροαγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων (ECS) από το εμφυτευμένο παγκρέατος καρκινικούς ιστούς.

εμφυτευμένα παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς κόπηκαν σε 1 μπλοκ ιστού mm και επωάζονται σε 0.1% κολλαγενάση Ι σε ΜΕΜ στους 37 ° C για 2 ώρες. Η μικροαγγειακή ECs απομονώθηκαν από τα μπλοκ ιστού χρησιμοποιώντας ένα μαγνητικό σφαιρίδιο ανοσοσυγγένειας κιτ απομόνωσης ενδοθηλιακών κυττάρων (Dynal Biotech, Brown Deer, WI). Εν συντομία, Dynabeads Μ-450 και τα πρόβατα IgG αντι-αρουραίου συζευγμένο με ένα αντι-ποντικού CD31 μονοκλωνικό αντίσωμα αρουραίου (30 μL υποπολλαπλάσιο ανά 5-ml σωλήνα) επωάστηκαν σε 1 ml υπερκειμένου ιστού στους 4 ° C όλη τη νύκτα και στη συνέχεια πλύθηκε τρεις φορές με 10% FBS-DMEM? 1 ml κυτταρικού εναιωρήματος τέθηκε σε σωλήνα που περιέχει τα πλυμένα σφαιρίδια. Μετά την επώαση με περιστασιακή ανάδευση στους 4 ° C για 30 λεπτά, το σφαιρίδιο δεσμευμένα κύτταρα ανακτήθηκαν, πλύθηκαν, και στη συνέχεια πέψη σε 1 ml θρυψίνη /EDTA (ΟΙΒΟΟ) για την απελευθέρωση των σφαιριδίων. Τα κύτταρα σφαιρίδιο χωρίς φυγοκεντρήθηκαν σε 10% FBS-RPMI-1640 και μετά επαναιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας 7 ml όπως περιγράφεται παρακάτω. Η απόδοση της αγγειακής ECs ήταν & gt? 98%. Η ταυτότητα των απομονωμένων κυττάρων επιβεβαιώθηκε με τον σχηματισμό in vitro σωλήνα σε Matrigel και χρώση για VE-cadherin, ένα αποκλειστικό δείκτης ΕΚ.

Cell Culture

HPNE, ECs, τα κύτταρα SW1990, και Panc -1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% θερμο-επωάστηκαν FBS (Invitrogen, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν σε 70-80% συρροή. Λουσιφεράσης-επιμολυσμένα κύτταρα SW1990 συλλέχθηκαν από 70-80% συρρέουσες καλλιέργειες μετά από μία σύντομη έκθεση σε 0,25% θρυψίνη συμπληρωμένο με 0,2% EDTA. Η επεξεργασία με θρυψίνη τερματίστηκε με RPMI-1640 που περιέχει 10% FBS. Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά σε μέσο άνευ ορού και επαναιωρήθηκαν σε PBS. Αναστολές που αποτελείται από Panc-1 κύτταρα, με & gt? 90% βιωσιμότητα, χρησιμοποιήθηκαν για τις ενέσεις

τηλέφωνα ποσοστό επιβίωσης Εντοπίστηκε από CCK-8

HPNE, ECs, τα κύτταρα SW1990, και Panc. -1 κύτταρα συλλέγονται σε εκθετική φάση σπάρθηκαν σε μια αρχική πυκνότητα 4 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Στη συνέχεια, τα κύτταρα χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες με διαφορετικά θεραπεία για 72 ώρες: η ομάδα ελέγχου (0,1% DMSO), την ομάδα γεμσιταβίνη (gemcitabine, 20 μmol /L), η ομάδα εμοδίνη (εμοδίνη, 40 μmol /L), και ο συνδυασμός ομάδα (gemcitabine 20 μmol /L + εμοδίνη 40 μmol /L), με πέντε φρεάτια για κάθε ομάδα. Τα φρεάτια χωρίς φάρμακα αλλά 0,1% DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Μία ώρα πριν τελείωσε η έκθεση, 0,01 mL CCK-8 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο.