Αφηρημένο

Ιστορικό

προγραμματισμένο θάνατο συνδέτη-1 (PD -L1) έχει ταυτοποιηθεί ως ένας παράγοντας που σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε ένα εύρος καρκίνων, και αναφέρθηκε ότι επάγεται κυρίως από την απώλεια του ΡΤΕΝ σε γλοιώματα. Ωστόσο, η κλινική επίδραση της PD-L1 και η ρύθμιση της από PTEN δεν έχει ακόμη προσδιορισθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC). Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε τη ρύθμιση του PTEN για PD-L1 και περαιτέρω προσδιορίζεται η επίδραση του PTEN για την συσχέτιση μεταξύ PD-L1 έκφρασης και κλινικές παραμέτρους σε CRC.

Μέθοδοι /Αποτελέσματα

προσέγγιση παρεμβολή RNA χρησιμοποιήθηκε για να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση ΡΤΕΝ σε SW480, SW620 και κύτταρα HCT116. Ήταν έδειξε ότι η πρωτεΐνη PD-L 1, αλλά όχι mRNA, ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ΡΤΕΝ σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο. Επιπλέον, η ικανότητα του ΡΤΕΝ να ρυθμίζουν την έκφραση PD-L 1 δεν επηρεάστηκε προφανώς από την ΙΡΝ-γ, το κύριο επαγωγέα του PD-L1. Tissue microarray ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει PD-L1 και ΡΤΕΝ σε 404 CRC δείγματα ασθενών. Η υπερέκφραση του PD-L1 συσχετίστηκε σημαντικά με μακρινή μετάσταση (P & lt? 0.001), το στάδιο TNM (P & lt? 0.01), μεταστατική εξέλιξη (P & lt? 0,01) και της έκφρασης ΡΤΕΝ (P & lt? 0.001). Η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι οι ασθενείς με υψηλή έκφραση PD-L1 είχε μια κακή συνολική επιβίωση (P & lt? 0.001). Ωστόσο, πολυπαραγοντική ανάλυση δεν υποστηρίζει PD-L1 ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας (P = 0,548). Μονοπαραγοντική (P & lt? 0.001) και πολυμεταβλητή επιβίωση (P & lt? 0.001) ανάλυση των 310 βρίσκεται CRC ασθενείς έδειξε ότι το υψηλό επίπεδο έκφρασης PD-L1 συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο για τη μεταστατική εξέλιξη. Επιπλέον, η κλινική επίδραση της PD-L1 για CRC δεν ήταν στατιστικά σημαντική σε μια υποομάδα 39 ασθενών χωρίς έκφραση ΡΤΕΝ (μακρινή μετάσταση: P = 0,102? ΤΝΜ στάδιο: P = 0,634, η συνολική επιβίωση: P = 0.482).

Συμπεράσματα

PD-L1 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό ασθενών CRC με υψηλό κίνδυνο μετάστασης και κακή πρόγνωση. Αυτή η κλινική εκδήλωση μπορεί να σχετίζεται εν μέρει με την έκφραση ΡΤΕΝ

Παράθεση:. Τραγούδι Μ, Chen D, Lu Β, Wang C, Zhang J, Huang L, et al. (2013) PTEN Απώλεια Αυξάνει PD-L1 Έκφραση πρωτεϊνών και επηρεάζει ο συσχετισμός μεταξύ της PD-L1 Έκφρασης και κλινικές παραμέτρους στον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (6): e65821. doi: 10.1371 /journal.pone.0065821

Επιμέλεια: Jun Sun, του Πανεπιστημίου Rush Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20, Δεκεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 28 Απρίλη 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουνίου του 2013

Copyright: © 2013 Song et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την Sun Yat-sen University «100 Ταλέντα Πρόγραμμα»? Guangdong Πρόγραμμα Καινοτόμων Research Team (2009010058)? Επιστήμη και Τεχνολογία Πληροφοριών του Προεδρείου της Guangzhou, Guangdong (2011J5200009)? Επαρχιακό Τμήμα Γκουανγκντόνγκ της Επιστήμης και της Τεχνολογίας (2012B050500004)? και «985 Project» του Sun Yat-sen University και Guangdong Translational Medicine δημόσια πλατφόρμα (4.202.037). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις δυτικές χώρες. Σε παγκόσμιο επίπεδο, είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος στους άνδρες και η δεύτερη πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος στις γυναίκες [1]. Τι είναι χειρότερο είναι ότι η θνησιμότητα των CRC συνεχίζει να αυξάνεται σε πολλές χώρες με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου (mCRC) είναι η κύρια αιτία θανάτου στους περισσότερους ασθενείς. Πρώιμο στάδιο CRC ασθενείς είχαν ένα ποσοστό πενταετούς επιβίωσης έως και 90%, αλλά το ποσοστό θα μπορούσε να πέσει σε ασθενείς ποσό 60%, με τη συμμετοχή των λεμφαδένων, και ακόμη και στο 10%, όταν μεταστάσεις υπάρχουν [2]. Ωστόσο, είναι δύσκολο να ανιχνευθεί η mCRC σε πρώιμο στάδιο με βάση μόνο τα συμπτώματα, γεγονός που οδηγεί σε πολύπλοκη διαδικασία λήψης αποφάσεων της θεραπείας, που συχνά περιλαμβάνουν επιθετική θεραπεία ή θεραπεία διακοπές. Μια βιοδεικτών που μπορεί να προσδιορίσει τους ασθενείς με υψηλό κίνδυνο μετάστασης και κακή πρόγνωση θα μπορούσε να έχει ευρείες κλινικές εφαρμογές. Μελέτες που ψάχνουν για τέτοιες βιοδείκτες είναι άφθονα. PD-L1 είναι ένα από τα σημαντικότερα θέματα της έρευνας βιοδεικτών.

PD-L 1 (επίσης γνωστό ως CD274, Β7-Η1), ένας από τους συνδέτες για προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο 1 (PD-1), είναι ένα ανοσο-ανασταλτικός υποδοχέας που ανήκει στην CD28 /κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων αντιγόνο 4 (CTLA-4) οικογένεια. Μπορεί να παραδώσει ένα ανασταλτικό σήμα προς PD-1 /Β7-1 που εκφράζουν τα Τ κύτταρα, με αποτέλεσμα την ανοσολογική ανεπάρκεια [3], [4]. PD-L 1 πρωτεΐνη εκφράζεται συχνά σε ενεργοποιημένα Τ κύτταρα, Β λεμφοκύτταρα, κύτταρα ΝΚ, δενδριτικά κύτταρα, μακροφάγα, και ιστιοκύτταρα που προέρχονται από μυελό των οστών [5]. έκφραση PD-L 1 βρίσκεται επίσης σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων όγκων. Επιπλέον, οι μελέτες που αφορούν την έκφραση PD-L 1 σε έκβαση της νόσου έχουν γίνει στους περισσότερους όγκους, και τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση PD-L 1 συσχετίζεται έντονα με δυσμενή πρόγνωση σε νεφρό [6], των ωοθηκών [7], της ουροδόχου κύστης [8], του μαστού [9], το ήπαρ [10], γαστρικό [11], και τον καρκίνο του παγκρέατος [12], αλλά όχι σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [13]. Το πιο σημαντικό, οι μελέτες αυτές δείχνουν ότι υψηλότερη έκφραση PD-L 1 μπορεί να διευκολύνει την προώθηση του σταδίου του όγκου και αύξηση του δυναμικού εισβολής. Ωστόσο, στην CRC, η κλινική επίδραση του PD-L 1 και ο μηχανισμός ρύθμισης της δεν έχει ακόμη προσδιοριστεί.

PD-L1 έκφραση μπορεί να προκληθεί από πολλούς φλεγμονώδεις μεσολαβητές και κυτοκίνες, των οποίων η ιντερφερόνη-γ (ΙΡΝ γ) είναι η πλέον ισχυρή. Έχει δειχθεί ότι τόσο τύπου Ι και τύπου II IFNs ρυθμίζουν προς τα πάνω έκφραση PD-L 1 στις περισσότερες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Λίγες μελέτες επικεντρώνονται στο ρυθμιστικό ρόλο του PD-L 1 σε όγκους. Επιπλέον, οι μελέτες αυτές παράγονται αποκλίνοντα αποτελέσματα. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η απώλεια των ογκοκατασταλτικών ΡΤΕΝ (φωσφατάση και tensin ομόλογο διαγράφονται στο χρωμόσωμα δέκα) μπορεί να είναι ένας σημαντικός μηχανισμός που αυξάνει την έκφραση PD-L 1 σε κυτταρικές σειρές γλοιώματος και τα δείγματα των ασθενών όγκου [14]. ΡΤΕΝ είναι ένας σημαντικός ογκοκατασταλτικού γονιδίου η οποία ρυθμίζει κυρίως αρνητικά το κύτταρο-σηματοδότηση επιβίωσης κινάση Β (Akt) μονοπατιού ΡΙ3Κ-πρωτεΐνη [15], [16]. Επιπλέον, συσσωρεύοντας μελέτες έδειξαν ότι ΡΤΕΝ μπορεί να είναι ένα σημαντικό γονίδιο που συνδέεται με τη μετάσταση του όγκου [15], [17], [18]. Τόσο στο

vitro

και

vivo

πειράματα του CRC έδειξαν ότι ΡΤΕΝ ελέγχει το ογκογόνο και μεταστατικό δυναμικό. Έχει αναφερθεί ότι η ένεση του ΡΤΕΝ ελλειμματικών κυττάρων σε ποντικούς οδήγησε σε πολύ πιο πνευμονική και «πολυ-θέσης» μεταστάσεις από την ένεση των κυττάρων του ελέγχου [19]. Επιπλέον, ορισμένα κλινικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι η απώλεια του ΡΤΕΝ ανίχνευση με ανοσοχρώση συνδέθηκε με προχωρημένη νόσο, μετάσταση ήπατος και κακή επιβίωση των ασθενών [20] – [22]. Ωστόσο, ορισμένες πρόσφατες μελέτες δεν υποστηρίζουν το ρόλο του PTEN στην ρύθμιση της έκφρασης PD-L1. Λέγεται ότι «έκφραση PD-L 1 διαμορφώνεται μέσω διαφορετικών οδών μεταξύ των διαφορετικών τύπων κυττάρων του όγκου» [23].

Είναι γνωστό ότι PD-L1 είναι ένας ισχυρός αρνητικός ρυθμιστής της κατά του όγκου ανοσίας, αλλά είναι άγνωστο αν αυτό το ανοσοποιητικό διαφυγή αποτέλεσμα είναι επαρκής για να καταστήσει PD-L1 μια ξεχωριστή παράγοντας που σχετίζεται με κακή πρόγνωση για όλους τους τύπους ανθρώπινων καρκίνων. Αντιστρόφως, ΡΤΕΝ έχει ταυτοποιηθεί ως κρίσιμος παράγοντας σε διάφορες κεντρικές διαδικασίες της ανάπτυξης του καρκίνου, και ως ένα σημαντικό γονίδιο για τη διάγνωση του καρκίνου και την πρόγνωση. Μετά την πρόσφατη ανακάλυψη ότι η έκφραση πρωτεΐνης PD-L 1 συσχετίζεται με απώλεια του ΡΤΕΝ [14], καταλήξαμε στην υπόθεση ότι προόδου του όγκου και έκφραση PD-L 1 ανεξάρτητα σχετίζονται με την απώλεια ΡΤΕΝ, και ότι η κλινική επίδραση του PD-L 1 μπορεί, κατά τουλάχιστον εν μέρει, να αποδοθεί στην συσχέτιση μεταξύ της απώλειας PTEN και της έκφρασης PD-L1.

στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε για πρώτη φορά την επίδραση της απώλειας PTEN στην έκφραση PD-L 1 σε κυτταρικές σειρές CRC, και αποφασισμένοι αν η παρατηρούμενη επίδραση διατηρείται υπό την παρουσία ΙΡΝ-γ. Δεύτερον, αξιολογήσαμε τη συσχέτιση της έκφρασης PD-L1 με αποτέλεσμα τη νόσο και την έκφραση ΡΤΕΝ σε 404 ασθενείς CRC με διάμεση παρακολούθηση 5 ετών. Τέλος, διερευνήθηκε η κλινική σημασία του PD-L1 σε ένα υποσύνολο 39 ασθενών με PTEN πλήρη απώλεια να διερευνήσει κατά πόσον η επίδραση της PD-L1 στο CRC εξαρτάται από την έκφραση ΡΤΕΝ.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από τα θεσμικά διοικητικά συμβούλια αναθεώρηση του Sun Yat-Sen University (Guangzhou, Κίνα), και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή.

Συλλογή δείγματος και Cell Culture

Σε αυτή τη μελέτη, 404 φορμόλη σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη δείγματα CRC ελήφθησαν από την τράπεζα όγκων του Τμήματος Παθολογίας του πρώτου συνδεδεμένες νοσοκομείο, η Sun Yat-Sen University (Guangzhou, Κίνα ). Αυτοί οι 404 ασθενείς που είχαν διαγνωστεί με CRC και υποβλήθηκαν σε αρχική χειρουργική εκτομή για CRC μεταξύ Ιανουαρίου 2000 και τον Νοέμβριο του 2006 ήταν η παρακολούθηση μέσω τηλεφώνου ή γράμματα από τη χειρουργική επέμβαση μέχρι τον Απρίλιο του 2010 για να συλλέξει γενικές πληροφορίες, εκθέσεις παθολογίας, καθώς και πληροφορίες σχετικά με τους ασθενείς » κατάσταση μετά την επέμβαση.

Τρεις κυτταρικές σειρές CRC, SW480, SW620 και HCT116 αγοράστηκαν από την Συλλογή Καλλιεργειών της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα), και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% πενικιλίνη -streptomycin στους 37 ° C σε 5% CO

2

παρεμβολής RNA (RNAi)

Για να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση ΡΤΕΝ, τα ειδικά διπλά siRNA που στοχεύει ανθρώπινο ΡΤΕΝ (έννοια:. 5 «-GAGCGUGCAGAUAAUGACAdTdA-3 ‘? αντινόημα: 3′-dAdTCUCGCACGUCUAUUACUGU-5’) συντέθηκαν και αγοράστηκαν από RiboBio Co. Ltd (Guangzhou, Κίνα), και siRNA δίπολα με μη ειδικές αλληλουχίες χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος (NC). SiRNA διαμόλυνση εκτελέστηκε με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA) με συγκέντρωση 100 ηΜ. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης εξετάστηκε με qRT-PCR και κηλίδος western. Αυτά τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με την παρουσία και απουσία του ανασυνδυασμένου ανθρώπινου IFN-γ (500 IU /mL, Peprotech, NJ, USA) και επαναλήφθηκε εις τριπλούν.

Ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής (qRT-PCR)

Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, το ολικό κυτταρικό RNA εκχυλίστηκε με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το cDNA που προέρχεται από 500 ng ολικού RNA χρησιμοποιώντας cDNA κιτ αντίστροφη μεταγραφή (Toyobo, Osaka, Japan). Στη συνέχεια, σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της ποσοτικής κιτ SYBR Green PCR (Takara Bio, Dalian, Κίνα) σε ΑΒΙ 7500 RT-PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στον Πίνακα 1, ΡΤΕΝ και το επίπεδο έκφρασης σε σχέση γονίδιο PD-L 1 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική C

μέθοδος Τ (που αναφέρεται επίσης ως το 2

-ΔΔCT μέθοδος). Οι λεπτομέρειες της συγκριτικής C

μέθοδος Τ έχουν περιγραφεί προηγουμένως [24], [25]. Εν συντομία, τρεις επαναληπτικές ενισχύσεις PCR για κάθε δείγμα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Η μέση C

T υπολογίστηκε για αμφότερα τα γονίδια-στόχους και β-ακτίνης. Η ΔΟ

T προσδιορίστηκε ως (ο μέσος όρος των τριπλών C

τιμές Τ για το γονίδιο στόχο) μείον (της μέσης τιμής της τριπλούν C

τιμές Τ για β-ακτίνη). Η ΔΔC

T αντιπροσώπευε η διαφορά μεταξύ των ζεύγη κυτταρικών σειρών, όπου PTEN ΔΔC

T = ΔΟ

Τ κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA μείον ΔΟ

T αρνητικού ελέγχου και PD-L1 ΔΔC

T = ΔΟ

Τ κύτταρα επεξεργασμένα με ΙΡΝ-γ μείον ΔΟ

T των μη επεξεργασμένων κυττάρων ελέγχου. Το σχετικό επίπεδο έκφρασης εκφράστηκε ως 2

-ΔΔCT.

Η

Western Blot

Εβδομήντα δύο ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS ) και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Dingguo, Beijing, Κίνα) συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης (Merck Bioscience, Darmstadt, Germany). Στη συνέχεια, τα επίπεδα πρωτεΐνης ΡΤΕΝ προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας δύο χρωμάτων φθορίζοντος κηλίδωση Western με το σύστημα υπέρυθρης απεικόνισης Οδύσσεια (LI-COR, Nebraska, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [26]. Εν συντομία, ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 10% δωδεκυλ νάτριο ηλεκτροφόρηση πηκτής θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν σε ένα φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) (Pall, New York, USA). Οι μεμβράνες στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με 5% BSA για 1 ώρα και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C [Primary αντίσωμα: Κουνελιού αντι-ΡΤΕΝ (αραιωμένο 1:10000, Epitomics, CA, USA)? Rabbit anti-Ακί (αραιωμένο 1:1000, Cell Signaling Technology, ΜΑ, USA)? Κουνέλι αντι-φωσφο-Ακί

Ser473 (αραιωμένο 1:1000, Cell Signaling Technology, ΜΑ, USA)? Ποντίκι β-ακτίνης αντίσωμα (αραιωμένο 1:10000, Proteintech, Σικάγο, ΗΠΑ)]. Την επόμενη ημέρα, μετά από επώαση με φθορισμό δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα είδη κατάλληλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, οι μεμβράνες

Κυτταρομετρίας Ροής

PD-L 1 έκφραση αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα υπέρυθρης απεικόνισης Οδύσσεια. πάνω στην κυτταρική επιφάνεια προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρητές ροής. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επωάστηκαν με αντι-ανθρώπινο PD-L 1 ΡΕ-Cy7 (eBioscience, CA, USA) ή αντίσωμα ελέγχου ταιριαστού ισότυπου (eBioscience, CA, USA) για 30 λεπτά στο σκοτάδι επί πάγου (0,5 μg αντισωμάτων για 10

5 κύτταρα σε έναν τελικό όγκο 100 μL). Μετά τα δείγματα πλύθηκαν τρεις φορές, χρωματισμένα κύτταρα επαναιωρήθηκαν και αναλύθηκαν σε BD FACSCanto II (BD Biosciences, CA, USA) χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo (TriStar, CA, USA). Τυποποιημένα εντάσεις φθορισμού υπολογίστηκαν διαιρώντας τις διάμεσες εντάσεις φθορισμού ειδικών αντισωμάτων από τους διάμεσος εντάσεις φθορισμού των ισότυπο ελέγχου. Όλα τα δεδομένα συλλέχθηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα καθορίστηκε με ζευγαρωμένα δείγματα

t

τεστ.

Ιστός μικροσυστοιχιών (TMAs) και ανοσοϊστοχημεία (IHC)

TMAs κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας αυτοματοποιημένο όργανο μικροσυστοιχιών ιστού (ALPHELYS, Plaisir, Γαλλία). Μετά τον εντοπισμό των Η &? Ε-χρώση διαφάνειες για βέλτιστη ιστό όγκου, δύο κυλινδρικά βιοψίες πυρήνα (διαμέτρου 2-mm) τρυπήθηκαν από κάθε σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, τμήματα ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη και παρατάσσονται σε μπλοκ δέκτη TMA (2 χ 3 cm) ως περιγράφηκε προηγουμένως [27], [28]. Κάθε μπλοκ TMA περιλαμβάνει 108 πυρήνες ιστού από 54 ασθενείς. Ακολούθως παραλήπτης μπλοκ κόπηκαν σε 5-μm τμήματα και επικολλάται στις σιλανοποιημένο γυάλινες πλάκες για κηλίδωση IHC.

IHC διεξήχθη χρησιμοποιώντας το σούπερ HRP Elivision ™ (Mouse /Rabbit) IHC Kit (Maixin-Bio, Fuzhou, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά αφαιρείται η παραφίνη με ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε μια σειρά βαθμονομημένων αλκοολών (100%, 95%, 75%), τα πλακίδια ανασύρθηκαν αντιγόνο σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού νατρίου (ρΗ 6.0) σε microware. Στη συνέχεια τα πλακίδια επωάστηκαν με 3% Η

2O

2 να εμποδίσει ενδογενούς υπεροξειδάσης και ορό κατσίκας για να εμποδίσει μη ειδική σύνδεση. Στη συνέχεια, τα πλακίδια επωάστηκαν με PD-L 1 αντίσωμα (αραιωμένο 1:500, Abcam, Χονγκ Κονγκ, Κίνα) ή αντίσωμα ΡΤΕΝ (αραιωμένο 1:600, Abcam, Χονγκ Κονγκ, Κίνα) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Την επόμενη ημέρα τα πλακίδια επωάστηκαν με παράγοντα ενίσχυσης (αντιδραστήριο Α, Elivision σούπερ προσφορά Kit) και της πολυμεράσης (αντιδραστήριο Β, Elivision σούπερ προσφορά Kit). Τέλος, τα πλακίδια χρωματίστηκαν με DAB και αντίθετα με αιματοξυλίνη (40 δευτερόλεπτα). Ένας αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιώντας αραίωση του αντισώματος ως υποκατάστατο για την πρωτογενή αντισώματα πραγματοποιήθηκε για κάθε πείραμα.

χρώσης Αξιολόγηση

Για κάθε σημείο, μια ψηφιακή εικόνα σε 2592 × 1944 pixels ψήφισμα 100 × μεγέθυνση συνελήφθησαν από την Leica DMI 4000B ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Leica Micro-συστήματα, Wetzlar, Γερμανία). Η ανοσοϊστοχημική χρώση της εικόνας αναλύθηκε με τη χρήση του Image Pro-Plus (έκδοση 5.0, Media Cybernetics, Silver Spring, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) που θεσπίστηκε με τον Xavier [29]. Εν συντομία, η περιοχή του όγκου επιλέχθηκε ως η περιοχή ενδιαφέροντος (ΑΟΙ), και το άθροισμα περιοχή και ολοκληρωμένη οπτική πυκνότητα (IOD) της ΑΟΙ επιλέχθηκαν ως οι παράμετροι μέτρησης. PD-L1 και δείκτης έκφρασης ΡΤΕΝ ήταν ίσο με το πηλίκο μεταξύ του IOD και το συνολικό εμβαδόν του ΑΟΙ. Τέλος, ο δείκτης έκφραση σημαίνει για κάθε διπλούν χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση.

Στατιστική Ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με τη χρήση του SPSS v.17.0 (SPSS Inc, Chicago, USA). λογισμικό X-πλακιδίων (έκδοση 3.6.1, Yale University School of Medicine, New Haven, USA) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η βέλτιστη ενιαίο cut-σημείο της καμπύλης επιβίωσης. Όλες οι τιμές P ήταν δύο όψεων και η P & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Σύλλογοι του PD-L1 /έκφρασης ΡΤΕΝ με κλινικές παραμέτρους αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Wilcoxon τεστ rank sum (για δύο πληθυσμούς που έχουν σχέση) ή Kruskal- δοκιμή Wallis (για περισσότερο από δύο πληθυσμούς που σχετίζονται) επειδή τα δεδομένα του δείκτη έκφρασης /ΡΤΕΝ PD-L 1 δεν είναι σύμφωνο με μια κανονική κατανομή (δοκιμή Shapiro-Wilk: P & lt? 0.001). Η συνολική επιβίωση (OS) και η επιβίωση μετάσταση ελεύθερο (MFS) εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier. Όντας διαγνωστεί ως μετάσταση τη διάρκεια της παρακολούθησης των βρίσκονται CRC (pM0) ασθενείς ορίστηκε ως το τερματικό εκδήλωση για ανάλυση MFS. Οι ενώσεις του PD-L1 /έκφρασης ΡΤΕΝ με αποτέλεσμα ασθένεια αξιολογήθηκαν με τη χρήση αναλογικών κινδύνων κατά Cox μοντέλων παλινδρόμησης. Η βέλτιστη ενιαίο cut-σημείο για PD-L1 έκφρασης /ΡΤΕΝ ότι χωριστή ασθενείς σε μια ομάδα με PD-L 1 /ΡΤΕΝ υψηλότερη έκφραση και μια ομάδα με PD-L 1 /ΡΤΕΝ χαμηλότερη έκφραση δομήθηκαν από το λογισμικό X-πλακιδίων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23 ], [24]. Παρόμοια ενώσεις και ανάλυση επιβίωσης έγιναν στο υποσύνολο των 39 ασθενών, χωρίς καμία έκφραση PTEN, η οποία εκπροσωπεί την ομάδα στην οποία ελέγχεται η σύγχυση του ρόλου του PTEN.

Αποτελέσματα

Δεν PTEN Απώλεια αλλά IFN -γ επαγόμενη έκφραση PD-L 1 mRNA σε CRC Κυτταρικές Γραμμές

Τόσο το επίπεδο του mRNA και το επίπεδο πρωτεΐνης ΡΤΕΝ μειώθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ΡΤΕΝ σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο. Το επίπεδο του mRNA του ΡΤΕΝ μειώθηκε σε περίπου 12,4% σε SW480, 14,6% σε SW620, 22,6% σε HCT116 στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση σε κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ΡΤΕΝ σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο (Εικ. 1. Α). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο επίπεδο mRNA PD-L1 μεταξύ των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με siRNA ΡΤΕΝ και του αρνητικού μάρτυρα. Αντίθετα, το επίπεδο του mRNA PD-L 1 αυξήθηκαν σημαντικά σε κύτταρα τα οποία είχαν εκτεθεί σε ΙΡΝ-γ σε σύγκριση με τα κύτταρα συμφωνημένα ελέγχου χωρίς έκθεση σε ΙΡΝ-γ (περίπου 8-πτυχώσεις) (Εικ. 1 Β).

(Α) το σχετικό επίπεδο έκφρασης του ΡΤΕΝ mRNA (που ανιχνεύεται από qRT-PCR, η οποία υπολογίζεται από 2

-ΔΔCT μέθοδος) σε τέσσερις ομάδες: κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ΡΤΕΝ ή μη ειδικές αλληλουχίες με την παρουσία ή απουσία IFN -γ. (Β) Το σχετικό επίπεδο έκφρασης PD-L 1 mRNA σε τέσσερις ομάδες των κυττάρων. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD.

Η

Τόσο ΙΡΝ-γ και ΡΤΕΝ Απώλεια επαγωγή της έκφρασης PD-L 1 πρωτεΐνης σε CRC

Αξιολογήσαμε συνέπειες της ΡΤΕΝ knockdown στην ενεργοποίηση της Akt σε παρουσία /απουσία IFN-γ. Φωσφο-Ακί

Ser473 αυξήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ΡΤΕΝ σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο, ανεξάρτητα από την παρουσία ΙΡΝ-γ (Σχ. 2). έκφραση πρωτεΐνης PD-L 1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ΡΤΕΝ σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα (Ρ & lt? 0,05). Επιπλέον, η παρουσία της ΙΡΝ-γ δεν αλλάξει αυτή την αρχική κατάσταση (Εικ. 3).

Το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης ΡΤΕΝ, Akt και φωσφο-Ακί

Ser473 προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να επαληθευτεί η ίση φόρτωση. Αντιπροσωπευτικά εικόνες επιλέγονται από πραγματοποιήθηκαν πειράματα επαναλαμβάνονται εις τριπλούν

Η

επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης PD-L 1 επί της επιφανείας των SW480, SW620 και HCT116 προσδιορίστηκε με κυτταρόμετρο ροής:. κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ΡΤΕΝ (κόκκινες γραμμές) και κύτταρα επιμολυσμένα με μη-ειδικές αλληλουχίες (μπλε γραμμές) απουσία της ΙΡΝ-γ? κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ΡΤΕΝ (μαύρες γραμμές) και κύτταρα επιμολυσμένα με μη-ειδικές αλληλουχίες (πορτοκαλί γραμμές) σε παρουσία ΙΡΝ-γ? κύτταρα χρωματίστηκαν με αντίσωμα ελέγχου ταιριαστού ισότυπου (σκιασμένη περιοχή). Πρότυπο ένταση φθορισμού του PD-L 1 πρωτεΐνη που περιγράφεται από ιστόγραμμα στο δεξί πλαίσιο: κύτταρα κατεργασμένα (λευκή στήλη) ή χωρίς θεραπεία (γκρι στήλη) με ΙΡΝ-γ. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD. . (* P & lt? 0,05 κατά ζεύγη δείγματα

t

test)

Η

IFN-γ Induced PD-L1 πρωτεΐνη με δύο διαφορετικές δομές στην γραμμή κυττάρων SW480

Η κυτταρομετρία ροής ιστογράμματα έδειξε δύο κορυφές σε κύτταρα SW480 σε επεξεργασία με ΙΡΝ-γ (500 IU, 72 ώρες), ενώ υπήρχε μόνο μία διακριτή κορυφή στο μη επεξεργασμένο ομάδα. Επιπλέον, μόνο μία διακριτή κορυφή παρατηρήθηκε σε κύτταρα SW620 και κύτταρα HCT116 τόσο με την παρουσία και απουσία της ΙΡΝ-γ (Σχ. 3). Για να καθοριστεί εάν αυτές οι δύο κορυφές ήταν εξαρτώμενη από το χρόνο ή εξαρτώμενη από τη δοσολογία, υποβάλλαμε σε αγωγή SW480 κυττάρων με διαφορετική δοσολογία της ΙΡΝ-γ για 48 ώρες. PD-L 1 πρωτεΐνη σε μέγιστο βαθμό αυξήθηκε στα 500 IU /ml IFN-γ. Χρονικά πορεία επίδραση της ΙΡΝ-γ επί της πρωτεΐνης PD-L 1 προσδιορίστηκε στη συνέχεια. SW480 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 500 IU /ml ΙΡΝ-γ για 0, 24, 48 και 72 ώρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπό την παρουσία ΙΡΝ-γ, ανεξάρτητα από την δοσολογία της ΙΡΝ-γ και τον χρόνο της αγωγής, PD-L 1 πρωτεΐνη με δύο διαφορετικές δομές αναγνωρίστηκε στην επιφάνεια των κυττάρων SW480 (Εικ. 4).

(Α) SW480 σε επεξεργασία με ΙΡΝ-γ στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση (0 IU /ml, 50 IU /ml, 100 IU /ml, 500 IU /ml, 1000 IU /ml). (Β) SW480 σε επεξεργασία με 500 IU /ml ΙΡΝ-γ για κατηγορούνται χρόνους (0 h, 24 h, 48 h και 72 h). Οι σκιασμένες περιοχή αντιπροσωπεύει SW480 χωρίς θεραπεία ΙΡΝ-γ, και αριθμοί δίπλα από κορυφές αντιπροσωπεύουν πρότυπο ένταση φθορισμού του PD-L1. Αντιπροσωπευτικά εικόνες επιλέγονται από πραγματοποιήθηκαν πειράματα επαναλαμβάνονται εις τριπλούν

Η

παρακολούθηση των ασθενών

Ανάμεσα στους 404 ασθενείς, 5 ασθενείς (& lt? 3%). είχε χάσει στο τέλος της παρακολούθησης, 110 ασθενείς (27,2%) είχαν πεθάνει σε διάμεσο χρόνο παρακολούθησης 2,7 ετών (εύρος: 0,1 – 9,1 ετών), και οι υπόλοιποι 288 ασθενείς είχαν διάμεσο χρόνο παρακολούθησης 5,8 ετών (εύρος: 0,1 -10,2 έτη). Όταν IHC διεξήχθη, ο ιστός του 57 ασθενείς εκπλύθηκε από τις γυάλινες πλάκες και οι υπόλοιπες 347 ασθενείς είχαν ανοσοϊστοχημικά δεδομένα. Δεν υπήρξε καμία διαφορά στην συνολική επιβίωση μεταξύ των ασθενών με και χωρίς ανοσοϊστοχημική δεδομένων (P = 0,716, δοκιμασία log-rank). Επίσης δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στη μεταστατική εξέλιξη (διαγνωστεί ως μετάσταση μετά την χειρουργική επέμβαση), τα ποσοστά μεταξύ των ασθενών με και χωρίς ανοσοϊστοχημική δεδομένα (12.4% και 14.0%, P = 0,682).

Συσχέτιση του PD-L1 /ΡΤΕΝ έκφρασης και κλινικές παραμέτρους

Η ανοσοϊστοχημική χρώση του PD-L 1 που βρίσκεται στο σύστημα της κυτταρικής μεμβράνης και Ενδομεμβρανώδες είχε ένα δείκτη έκφραση κυμαίνεται από 0 έως 15.9 (διάμεση τιμή: 2,33) (Εικ 5.

1-D

1, Α

2-D

2). PTEN βρισκόταν στο κυτταρόπλασμα με ένα δείκτη έκφραση κυμαίνονταν μηδέν έως 54,7 (μέσος όρος: 5,57) (Εικ. 5. Ε

1-G

1, E

2-G

2) .Υπάρχουν ήταν 39 ασθενείς που δεν είχαν καμία έκφραση ΡΤΕΝ (Εικ. 5. H

1, Η

2).

(Α

1, Α

2, E

1 , Ε

2) Αρνητικός μάρτυρας? (Β

1, Β

2, F

1, F

2) Τα δείγματα από τον ίδιο ασθενή με μεταστατικό εξέλιξη? (C

1, C

2, G

1, G

2) Δείγματα από άλλο ασθενή χωρίς μεταστατική εξέλιξη? (D

1, D

2) Ένας τυπικός εκπρόσωπος οποία έδειξε ότι η έκφραση PD-L 1 είναι αυξημένη στην περιοχή του όγκου (Τ) σε σχέση με εκείνες των γειτονικών φυσιολογικού βλεννογόνου (N)? (H

1, Η

2) Δείγματα από τον ασθενή, χωρίς καμία έκφραση ΡΤΕΝ? (J, K) Στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η έκφραση PD-L 1 είναι αυξημένη στους ασθενείς με μεταστατική εξέλιξη σε σύγκριση με εκείνους χωρίς μεταστατική εξέλιξη, ενώ τέτοια στατιστική ανάλυση της ΡΤΕΝ δεν ήταν σημαντική. (Δύο επάνω πάνελ, χρωματίστηκαν με PD-L 1 αντίσωμα? Δύο πλάκες κάτω, χρωματίστηκαν με ΡΤΕΝ αντίσωμα), (Α

1-Η

1, × 100? A

2-Η

2, × 400)

Η

Όπως φαίνεται στον πίνακα 2, οι ασθενείς με υψηλότερη έκφραση PD-L1 είχαν περισσότερες πιθανότητες να εμφανίζουν απομακρυσμένες μεταστάσεις (pM) (P & lt?. 0,01), δυσμενείς παθολογικές λειτουργίες (2007 ΤΝΜ ταξινόμηση) (Ρ & lt? 0,01), και μεταστατική εξέλιξη (Ρ & lt? 0.001) έκφραση (Εικ. 5. J), και PD-L 1 συσχετίστηκε με έκφραση ΡΤΕΝ σε κάποιο βαθμό (Ρ & lt? 0.001). Δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο φύλων, την ηλικία, την τοποθεσία του όγκου, πρωτεύουσα ταξινόμηση των όγκων (PT), την περιφερειακή συμμετοχή λεμφαδένων (PN), ή υποτροπή μετά τη χειρουργική επέμβαση. Αντίθετα, η έκφραση ΡΤΕΝ δεν είχε σημαντική σχέση με τις πρωτογενείς μεταβλητές (PT: P = 0.221? ΕΡ: P = 0.131? PM: P = 0,525? Στάδιο TNM: P = 0,337? Επανάληψης: P = 0,397? Μεταστατική εξέλιξη: P = 0.710 ). Η συνολική επιβίωση και τη μετάσταση επιβίωση χωρίς επίσης δεν σχετίζεται με την έκφραση ΡΤΕΝ (P = 0,366, P = 0.141 αντίστοιχα) (Εικ. 6. C, D).

(Α, Β) το λειτουργικό σύστημα και MFS ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε ασθενείς με PD-L 1-υψηλότερης έκφρασης σε σύγκριση με ασθενείς PD-L 1-κατώτερο-έκφραση (και τα δύο Ρ & lt? 0.001). (C, D) Το λειτουργικό σύστημα και MFS δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ασθενών PTEN-υψηλότερης έκφρασης και των ασθενών PTEN-κάτω-έκφραση (OS, P = 0,366? MFS, P = 0.141). (Ε) Στην υποομάδα των 39 ασθενών με πλήρη απώλεια PTEN, η έκφραση PD-L 1 δεν συνδέεται πλέον με το λειτουργικό σύστημα (P = 0.482).

Η

Ανάλυση Επιβίωσης

Ανάλυση του λογισμικού X-πλακιδίων αποκαλύπτει ότι 1,49 ήταν η βέλτιστη cut-σημείο που χώριζε τους ασθενείς σε μια ομάδα με PD-L1 υψηλότερη έκφραση και μια ομάδα με PD-L1 χαμηλότερη έκφραση. Η καμπύλη Kaplan-Meier και δοκιμασία log-rank έδειξε ότι το συνολικό ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με χαμηλότερη έκφραση PD-L1 ήταν σημαντικά υψηλότερες από τις ασθενείς με υψηλότερη έκφραση PD-L1 (Σχήμα 6Α, χ2 = 13,964, P & lt?. 0.001). Το ποσοστό OS 5 ετών ήταν 62,9% για τους ασθενείς με υψηλότερη έκφραση PD-L1 και 81,1% για τους ασθενείς με χαμηλότερη έκφραση PD-L1. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση Cox μοντέλο αναλογικού κινδύνου, PD-L1 δεν ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για CRC μετά την προσαρμογή για τις μεταβλητές που ικανοποιούν υπόθεση PH (ηλικία, τη θέση του όγκου, το βαθμό διαφοροποίησης, PT, PN, ρΜ, μεταστατική εξέλιξη) (P = 0.548). Ωστόσο, αν μεταβλητές που σχετίζονται σημαντικά με την έκφραση PD-L 1 (ρΜ, μεταστατική εξέλιξη) δεν προσαρμόστηκαν στην πολυμεταβλητή ανάλυση, η έκφραση PD-L 1 έγινε ένα σημαντικό προγνωστικό παράγοντα για CRC (Ρ & lt? 0,01). (Πίνακας 3)

Όπως φαίνεται στα αποτελέσματα μας, PD-L1 διατεθειμένοι να συνδέσουν με τις μεταβλητές μετάσταση. Έτσι για να καθορίσει περαιτέρω τη σύνδεση των PD-L1 με μεταστατικό καρκίνο εξέλιξη, μελετήσαμε το υποσύνολο των 310 ασθενών με εντοπισμένο CRC (pM0), από τους οποίους 28 (9,03%) προχωρήσει σε απομακρυσμένες μεταστάσεις σε μια μέση παρακολούθηση 5,14 ετών ( φάσμα, 0,06 έως 10,14 ετών). Σε αυτήν την υποομάδα, η έκφραση PD-L1 ήταν σημαντικά σχετίζεται με μετάσταση επιβίωση χωρίς (MFS) (Σχήμα 6Β, χ2 = 21,444, P & lt?. 0.001). Η MFS ποσοστό 5 ετών ήταν 99,5% για τους ασθενείς-κάτω-έκφραση PD-L1 και 72,1% για τους ασθενείς PD-L1-υψηλότερη έκφραση. Επιπλέον, η ανάλυση Cox αποκάλυψε ότι η έκφραση PD-L1 ήταν ένας σημαντικός προγνωστικός παράγοντας για τη μεταστατική εξέλιξη. (RR: 1.165? 95% CI: 1,072 – 1,268? P & lt? 0.001)

Είναι ενδιαφέρον ότι, στο υποσύνολο των 39 ΡΤΕΝ ασθενείς -δεν-έκφραση, στο οποίο ελέγχεται η σύγχυση επίδραση του ΡΤΕΝ επί PD-L1, έκφραση PD-L 1 δεν συνδέεται πλέον με μακρινή μετάσταση (Ρ = 0,102), το στάδιο ΤΝΜ (Ρ = 0,634), και ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στη συνολική επιβίωση μεταξύ της ομάδας PD-L 1-υψηλότερης έκφρασης και ομάδα PD-L 1-κατώτερο-έκφραση (Σχ. 6Ε, χ2 = 0,494, Ρ = 0,482).

Συζήτηση

PD-L 1 υπήρξε ένα από τα σημαντικότερα θέματα της έρευνας βιοδείκτη όγκου κατά την τελευταία δεκαετία. Ένας μεγάλος αριθμός μελετών έχουν καταδείξει μια συσχέτιση μεταξύ της επιθετικότητας του όγκου και η έκφραση πρωτεΐνης PD-L1. Στην παρούσα μελέτη, θα παρέχονται επίσης ισχυρές ενδείξεις ότι ένα υψηλότερο επίπεδο έκφρασης PD-L1 στο CRC διευκολύνει την πρόοδο του σταδίου του όγκου και τη μεταστατική εξέλιξη. Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με χαμηλότερη έκφραση του PD-L 1 ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των ασθενών με υψηλότερη έκφραση του PD-L1. Επιπλέον, η έκφραση PD-L 1 επίσης σημαντική συσχέτιση με μετάσταση επιβίωση χωρίς τα 310 βρίσκονται ασθενείς CRC. Ωστόσο, η έκφραση PD-L1 δεν συσχετίστηκε σημαντικά με δυσμενή πρόγνωση μετά την προσαρμογή για μετάσταση και τη μεταστατική εξέλιξη από πολυπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με την προηγούμενη παρατήρηση ότι η έκφραση PD-L1 παραμένει συνδεδεμένη με δυσμενή πρόγνωση από πολυπαραγοντική ανάλυση σε ασθενείς με νεφρική καρκίνωμα [6]. Μια εξήγηση για αυτή την ανακολουθία μπορεί να είναι οι διαφορετικές μεταβλητές που προσαρμόζονται στο πολυπαραγοντικό μοντέλο. Στην προηγούμενη μελέτη, η μεταστατική μεταβλητή πορεία (διαγνωστεί ως μετάσταση μετά την χειρουργική επέμβαση) δεν προσαρμόστηκε στο πολυπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης. Είναι καλά γνωστό ότι η μετάσταση είναι η κύρια αιτία θανάτου σε ασθενείς CRC? έτσι ώστε όταν θα προσαρμοστεί για αυτή τη μεταβλητή θανάτου που σχετίζονται με PD-L1 δεν ήταν πλέον ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για CRC.

τεκμήρια από τη βιβλιογραφία και την έρευνα μας έδειξε ότι PD-L1 υπερέκφραση συνδέεται στενά με την εξέλιξη του καρκίνου ( ειδικά με την εξέλιξη μετάσταση), καθιστώντας PD-L1 ένα υποσχόμενο βιοδεικτών και θεραπευτικών στόχων για όγκους. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο PD-L 1 ενισχύει την πρόοδο του καρκίνου δεν είναι καλά κατανοητή. Όπως περιγράφεται στην βιβλιογραφία, οι ενώσεις αυτές μπορούν να αποδοθούν στην καλά αναγνωρισμένο «μοριακή ασπίδα» που παρέχεται από PD-L1. Έχει αναφερθεί ότι PD-L1 παρέχει ένα «θωράκισης» αποτέλεσμα για την προστασία των κυττάρων όγκου από λύση από κυτταροτοξικά Τ κύτταρα. Επιπλέον, PD-L 1 βρέθηκε να έχει ένα αντι-αποπτωτικό αποτέλεσμα σε κύτταρα όγκου [3], [30]. Ωστόσο, ένα στο

vivo

μελέτη έδειξε ότι τα διαγονιδιακά έκφραση του PD-L1 σε μια PD-L1 ανεπάρκεια αφελές ποντίκι δεν μετέβαλε το ογκογόνο της [31]. Στην δοκιμή φάσης Ι πολυκεντρική, Brahmer et al δήλωσε ότι το αντίσωμα με τη μεσολάβηση αποκλεισμό του PD-L1 προκαλεί διαρκή υποχώρηση του όγκου και παρατείνει τη σταθεροποίηση της νόσου σε ασθενείς με επιλεγμένα προχωρημένους καρκίνους. Δυστυχώς, καρκίνο του παχέος εντέρου δεν είναι ένα από αυτά τα επιλεγμένα καρκίνων [32]. Έχουμε αναρωτηθεί αν η ικανότητα του να καταστρέψει το «μοριακή ασπίδα» μπορεί να παρέχει επαρκή βάση για αυτή την κλινική συσχέτιση με CRC. Andrew T Parsa πρότεινε, επίσης, ότι ο βαθμός στον οποίο η έκφραση της πρωτεΐνης PD-L1 επηρεάζει άμεσα την εξέλιξη του καρκίνου μένει να καθοριστεί [14].

Σε αυτή τη μελέτη, να εντοπίσει πρόσθετες έμμεσες επιδράσεις της έκφρασης PD-L1 για την εξέλιξη του καρκίνου , μελετήσαμε τις οδούς σηματοδότησης που εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης PD-L 1 σε CRC.