Αφηρημένο

Ιστορικό & amp? Στόχοι

καρκίνο του στομάχου είναι η πιο συχνή γαστρεντερικών όγκων σε ενήλικες και είναι η πιο θανατηφόρος μορφή καρκίνου στον άνθρωπο. Παρά τις βελτιώσεις σε θεραπείες, ο υποκείμενος μηχανισμός της γαστρικής καρκινογένεσης δεν είναι γνωστή. Για να ορίσετε νέα ρυθμιστές που ρυθμίζουν την ευαισθησία στην ογκογένεση, εστιάσαμε στην miR-219-2-3p.

Μέθοδοι

Ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να διερευνηθεί το επίπεδο των miR-219 – 2 -3p σε γαστρικό καρκίνο (GC) ιστούς (n = 113) και συμφωνημένα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους (n = 113). In vitro τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, δοκιμασίες απόπτωσης, μετανάστευση κυττάρων και δοκιμασίες εισβολή διεξήχθησαν για να διαλευκανθεί βιολογικές επιδράσεις του miR-219-2-3p. Από φίμωση των miRNA από υποστηρικτής CpG νησί μεθυλίωση μπορεί να είναι ένας σημαντικός μηχανισμός στην ογκογένεση, κύτταρα GC έλαβαν θεραπεία με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη και τριχοστατίνη Α, και τις αλλαγές έκφρασης του miR-219-2-3p εξετάστηκαν στη συνέχεια, από ποσοτική RT-PCR. Τέλος, η κατάσταση μεθυλίωσης CpG νησίδα ανάντη του miR-219-2-3p αναλύθηκε με μεθυλίωση-ειδική PCR σε ιστούς GC (n = 22).

Αποτελέσματα

miR-219- 2-3p ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω στις γραμμές GC και των κυττάρων. Επιπλέον, τα πειράματα τεκμηριώνεται η χαμηλότερη έκφραση του miR-219-2-3p σε δείγματα GC με υψηλότερο βαθμό και αργότερα όγκοι στάδιο. Εν τω μεταξύ, miR-219-2-3p ασκείται αντιπολλαπλασιαστική, προαποπτωτικά, και αντιμεταστατική ρόλους και μειωμένα επίπεδα ρ-ERK1 /2 σε κύτταρα GC. Επιπλέον, 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη και τριχοστατίνη Α αύξησε την έκφραση (~ 2 φορές) του miR-219-2-3p σε κύτταρα GC. Με μεθυλίωση-ειδική PCR, μεθυλίωση του DNA στην ανάντη περιοχή του miR-219-2-3p ανιχνεύθηκε σε δύο παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς και καρκινικούς ιστούς. Όπως ήταν αναμενόμενο, το επίπεδο μεθυλίωσης ήταν σημαντικά υψηλότερο στο miR-219-2-3p κάτω-ρυθμίζονται ομάδα από ό, τι μέχρι ρυθμίζεται ομάδα.

Συμπεράσματα

miR-219-2-3p είναι δυνητικά που εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου του γαστρικού και τη μετάσταση με ρύθμιση ERK1 /2 που σχετίζονται με οδούς σημάτων, η οποία μπορεί να παρέχει μία νέα θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία του καρκίνου του στομάχου. μηχανισμό μεθυλίωσης μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση του επιπέδου έκφρασης του miR-219-2-3p στο γαστρικό καρκίνο

Παράθεση:. Lei Η, Ζου D, Li Ζ, Luo M, L Dong, Wang Β, et al . (2013) microRNA-219-2-3p Λειτουργίες ως ογκοκατασταλτικό στο γαστρικό καρκίνο και ρυθμίζεται από μεθυλίωση του DNA. PLoS ONE 8 (4): e60369. doi: 10.1371 /journal.pone.0060369

Επιμέλεια: Arun Ρίσι, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο Wayne, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 του Δεκέμβρη του 2012? Αποδεκτές: 26 Φεβρουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Απρ 2013

Copyright: © 2013 Lei et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας [2012, 91129716, για να JY] και το Πεκίνο Δημοτική Επιστήμης & amp? Τεχνολογίας της Επιτροπής [2010B071, να JY]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η 4

ου πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη μεγαλύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Σήμερα, οι ασθενείς με τελικού σταδίου GC είναι με συνολική επιβίωση 5 ετών περίπου το 20% [1]. Ο καρκίνος αναπτύσσεται ως αποτέλεσμα της συσσώρευσης των διαφόρων ενδογενών και εξωγενών αιτίες. Διατροφικές συνήθειες και μια αύξηση στο Helicobacter pyloriinfection είναι σημαντικές εξωγενείς αιτίες για GC [2], ενώ οι γενετικοί, καθώς και διατροφικές, τα επίπεδα της ορμόνης γαστρίνης [3], και άλλες χρόνιες γαστρικού παράγοντες φλεγμονή που προκαλούν βρέθηκε να σχετίζεται με προδιάθεση για την ανάπτυξη του καρκίνου. Gene αλλοιώσεις διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε GC, και αλλαγές σε ένα μεγάλο αριθμό των ογκογονιδίων και γονιδίων καταστολής όγκου έχουν ήδη αναφερθεί σε GC.

Ορισμένες προγνωστικούς βιοδείκτες όγκου σε GC όπως ο παράγοντας ανθρώπινου υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού 2 (HER2 ), αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), του επιδερμικού υποδοχέα αυξητικού παράγοντα (EGFR), έχουν συσχετιστεί με τα χαρακτηριστικά της νόσου και μπορεί επομένως να χρησιμοποιηθεί για την ενημέρωση της διαχείρισης του ασθενούς. Για παράδειγμα, οι ασθενείς με όγκους που είναι θετικό σε HER2 μπορεί να αντιμετωπιστεί με τραστουζουμάμπη και χημειοθεραπεία [4], και οι ασθενείς με όγκους που είναι θετικό για τον VEGF μπορεί να αντιμετωπιστεί με bevacizumab συν χημειοθεραπεία [5]. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν την ανάπτυξη του GC παραμένουν μια πρόκληση, έτσι επιπλέον ενημερωτικό βιοδείκτες χρειάζονται επειγόντως.

Τα microRNAs (miRNA) είναι μια κατηγορία των μικρών μορίων RNA που εμπλέκονται στη ρύθμιση της μετάφρασης και της υποβάθμισης των mRNAs [6 ]. MiRNAs προσδένονται σε συμπληρωματικές αλληλουχίες στο 3 ‘αμετάφραστες περιοχές (UTR) του mRNA που στόχο τους και επάγουν αποικοδόμηση mRNA ή μεταφραστική καταστολή [7]. Οι πιο γνωστές λειτουργίες των miRNAs που σχετίζονται με την αρνητική ρύθμιση των γονιδίων: γονιδιακή έκφραση miRNAs σιωπή, συνήθως παρεμβαίνοντας με τη σταθερότητα του mRNA ή μετάφραση πρωτεΐνης. Τα τελευταία χρόνια, miRNAs πιστεύεται ότι δρουν ως ογκογονίδιο ή ογκοκατασταλτικό γονίδιο, και να συμβάλλει στην έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου με τη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων [8]. Η ανακάλυψη του καρκίνου-ειδικών ανοδική περιοχή υπερμεθυλίωση πολυάριθμων miRNAs έχει επιδείξει επιγενετικές μηχανισμό για παρεκκλίνουσα έκφραση miRNA [9], [10].

Στην ανθρώπινη και ποντίκια, υπάρχουν δύο γονιδιωματικές loci (miR-219- 1 και miR-219 – 2) που κωδικοποιούν miR-219 πρόδρομος μεταγραφές. miR-219-1 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6 (MI0000296) και Mir-219-2 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9 (MI0000740) [11] (Εικ. 1Α). Επεξεργασία των προδρόμων μεταγραφές από Dicer δημιουργεί τρεις ώριμη miRNAs: miR-219-5p από το 5 ‘άκρα των δύο πρόδρομων ουσιών, και miR-219-1-3p και miR-219-2-3p από το 3′ άκρο του προ- miR-219-1 και προ-miR-219-2, αντίστοιχα. Δεδομένου ότι η περιοχή σπόρων αυτών των τριών ώριμων προϊόντων είναι μοναδική, κάθε miRNA προβλέπεται να ρυθμίσει το μοναδικό τους στόχους. Αν και miR-219-5p είναι γνωστό ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε πολλαπλές καρκίνο όπως κακοήθη αστροκύτωμα [12] και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [13], η έκφραση του miR-219-1-3p και miR-219-2-3p δεν έχει μελετηθεί. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι miR-199b και miR-219-2-3p γονίδια βρίσκονται σε εγγύτητα με ένα τμήμα του χρωμοσώματος 9q34.11 (Εικ. 1Α). Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι miR-199b-5P ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε μυελοβλάστωμα με μεθυλίωση ενός νησιού CpG 3 kb ανοδικά της 5’-θέση του miR-199b-5P υποκινητή [14]. Από μεθυλίωσης του DNA μπορεί να επηρεάσει μεγάλες περιοχές της χρωματίνης και ρυθμίζουν τη μεταγραφή των μακρινών γονιδίων, είναι απαραίτητο να διερευνηθεί κατά πόσο miR-219-2-3p ρυθμίζεται προς τα κάτω και ρυθμίζεται από τη μεθυλίωση όπως miR-199b-5P στον καρκίνο. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το miR-219-2-3p ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε ιστούς GC και σχετίζεται με την προοδευτική φαινοτύπους του GC. Επιπλέον, η εκ νέου εισαγωγή του miR-219-2-3p μείωσε την βιωσιμότητα των κυττάρων GC και προκάλεσε κυτταρική απόπτωση, γεγονός που υποδηλώνει ότι το miR-219-2-3p ήταν ένας καταστολέας υποψήφιος όγκου σε GC. Περαιτέρω ανάλυση μεθυλίωσης του υποκινητή miR-219-2-3p έδειξε ότι η έκφραση του ρυθμίστηκε με μεθυλίωση των συσχετισμένων νησιών CpG σε κάποιο βαθμό. Τέλος, βρήκαμε ότι miR-219-2-3p ενήργησε ως καταστολέας όγκου μέσω αναστολής της δραστικότητας ERK1 /2 οδό σήματος σε κύτταρα GC.

(Α) Σχηματική παρουσίαση του ανθρώπου Mir-219-1 και mir -219 – 2 γονιδιωματικής δομές. Επεξεργασία των προδρόμων μεταγραφές παράγει το ίδιο miR-219-5p και δύο μοναδικά miRNAs, 219-1-3p και 219-2-3p. (Β) MiR-219-2-3p ανιχνεύθηκε σε 113 ασθενείς GC με πραγματικού χρόνου -PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως log 2 φορές μεταβολής των ιστών GC σε σχέση προς μη-όγκο γειτονικούς ιστούς. (C) Τα επίπεδα έκφρασης (ως log 2 φορές μεταβολής των ιστών GC σε σχέση προς μη-όγκο γειτονικούς ιστούς) του miR-219-2-3p σε στάδια Ι-ΙΙ (n = 39) έναντι στάδια III-IV (n = 71 ) των ασθενών με καρκίνο. (D) Οι τέσσερις ασθενείς που είχαν διαγνωστεί ως γαστρικού καρκίνου σε Η &? Ε χρώση (αρχική μεγέθυνση, x100). (Ε) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-219-2-3p εξετάστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου σε τέσσερις ασθενείς όπως περιγράφεται στην εικόνα 1δ και τέσσερις κυτταρικές γραμμές GC. Τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές. Όλα τα δεδομένα χρησιμοποιεί ανεξάρτητο t-test και παρουσιάζεται ως μέση τιμή ± SD. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Αποτελέσματα

miR-219-2-3p ήταν διαφορικά εκφράζεται σε GC και κυτταρικές σειρές GC

Για να εκτιμηθεί η έκφραση του miR-219-2-3p σε GC, ανάλυση TaqMan RT-PCR διεξήχθη σε 113 ζεύγη ιστών GC και συμφωνημένα γειτονικό φυσιολογικό δείγματα ιστών. Σε σύγκριση με δείγματα φυσιολογικού ιστού, περισσότερο από το ήμισυ των πρωτοπαθών όγκων παρουσίασαν χαμηλά επίπεδα του miR-219-2-3p (58%, 65 113? Εικ. 1Β). Επιπλέον, τέσσερις ασθενείς των οποίων η έκφραση του miR-219-2-3p ήταν σημαντικές κάτω ρυθμισμένα επιλέχθηκαν (Σχ. 1D). Το miR-219-2-3p έκφρασης σε αυτούς τους ασθενείς και τέσσερις κυτταρικές σειρές GC (MGC-803, HGC-27, ΜΚΝ-45, ΓΓΕ-7901) αναλύθηκε για να αποκαλύψει ότι το miR-219-2-3p επίσης υποβαθμίσουν τα ρυθμίζεται σε κύτταρα GC (Εικ. 1 Ε). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω miR-219-2-3p ήταν ένα συχνό γεγονός στην ανθρώπινη GC και μπορεί να εμπλέκεται σε γαστρικό καρκινογένεση. Λόγω της γενικής κάτω ρύθμιση των miR-219-2-3p στο δοκιμαστεί κυτταρικές σειρές GC, MGC-803 και HGC-27 είχαν επιλεγεί τυχαία για περαιτέρω μελέτη.

Σχέση μεταξύ κλινικοπαθολογοανατομικών παραγόντων και miR-219- 2-3p έκφραση σε GC

Αυτή η μελέτη συμπεριέλαβε 113 ασθενείς με GC. Για να αξιολογηθεί η συσχέτιση μεταξύ miR-219-2-3p έκφρασης και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά, οι ασθενείς χωρίστηκαν σε ομάδες με ρύθμιση προς τα κάτω και προς τα πάνω ρύθμιση. Όπως φαίνεται στον πίνακα 1 και σχήμα 1 Ο, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-219-2-3p και GC κλινικό στάδιο. Οι ασθενείς με χαμηλότερα επίπεδα miR-219-2-3p έκφραση φάνηκε να σχετίζεται με υψηλής ποιότητας και όψιμου σταδίου όγκους (ρ = 0.047, ανεξάρτητο t-test). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι οι μεταβολές του miR-219-2-3p θα μπορούσε να συμμετέχει στην εξέλιξη της GC.

Η

Η υπερέκφραση του miR-219-2-3p στα κύτταρα GC αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων

Η αξιοσημείωτη μείωση του miR-219-2-3p έκφραση σε δείγματα GC μας προωθείται για να διερευνηθεί η πιθανή βιολογική σημασία του miR-219-2-3p στην ογκογένεση. Δεδομένου ότι miR-219-2-3p έπαιξε ρόλο στην ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού [15], τα κύτταρα MGC-803 και HGC-27 διαμολύνθηκαν με miR-219-2-3p και σκαρφάλωμα μιμείται και αναλύθηκαν για την κυτταρική ανάπτυξη, την κυτταρική απόπτωση και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, αντίστοιχα. Πρώτα απ ‘όλα, RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση του επιπέδου του miR-219-2-3p μετά από πειράματα υπερέκφρασης. Βρήκαμε ότι το miR-219-2-3p αυξήθηκαν κατά περισσότερο από 100 πτυχώσεις miRNA επιμολυσμένα MGC-803 και HGC-27 κύτταρα (2Α). Επιπλέον, η δοκιμασία πολλαπλασιασμού CCK-8 φαίνεται ότι ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων μειώθηκε σε miR-219-2-3p μιμείται-επιμολυσμένα MGC-803 και HGC-27 κύτταρα όταν συγκρίνεται με σκαρφάλωμα-επιμολυσμένα κύτταρα ή μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 2Β). Μετά την επιμόλυνση, η αναλογία αναστολής ήταν 26% (48 ώρες) και 28% (96 ώρες) στα κύτταρα MGC-803 και 13% (72 ώρες) και 14% (96 ώρες) σε HGC-27 κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι miR-219-2-3p πράγματι εμπλέκεται στην αρνητική ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης. Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική επίδραση στη διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη θεραπεία GC κύτταρα miR-219-2-3p (Εικ. S1). Για την αντιμετώπιση είτε προς τα πάνω ρύθμιση του miR-219-2-3p θα επάγει κυτταρική απόπτωση GC και κυτταρικό θάνατο, ο αριθμός των πρώιμων αποπτωτικών MGC-803 και HGC-27 κύτταρα μετά από θεραπεία με miR-219-2-3p μιμείται εξετάστηκε. Όπως ήταν αναμενόμενο, μερικά πρώτα αποπτωτικά κύτταρα (10% σε MGC-803 ή 2.9% σε HGC-27) ανιχνεύθηκαν στα κύτταρα σκαρφάλωμα-αγωγή, ενώ η αγωγή miR-219-2-3p μιμείται αύξησε το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων νωρίς (17,5 % σε MGC-803 ή 8.3 σε HGC-27) όπως κρίθηκε με χρώση αννεξίνης V (Σχ. 2C). Ως εκ τούτου, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το miR-219-2-3p θα μπορούσαν να επηρεάσουν την επιβίωση των κυττάρων σε κύτταρα GC.

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-219-2-3p εξετάστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου μετά από επιμόλυνση με 50 nmol /L miR-219-2-3p μιμείται ή αγωνίζομαι ή χωρίς επιμόλυνση. (Β) Ανάπτυξη του MGC-803 και HGC-27 κύτταρα δείχθηκε μετά από επιμόλυνση με 50 nmol /L miR-219-2-3p μιμείται ή σκαρφάλωμα ή καμία διαμόλυνση. Ο δείκτης ανάπτυξης εκτιμήθηκε σε 1, 2, 3, 4, και 5 d. (C) MGC-803 και HGC-27 κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΕ Annexin V και 7-AAD 72 ώρες μετά την αγωγή με miR-219-2-3p μιμείται ή σκαρφάλωμα. Πρόωρη Τα αποπτωτικά κύτταρα φαίνονται στο δεξί τεταρτημόριο. *,

P

& lt? 0,05? ***

P

& lt?. 0.001

Η

Η υπερέκφραση του miR-219-2-3p στα κύτταρα GC αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή

Για την ανίχνευση περαιτέρω αν miR-219-2-3p συνδέεται με την εξέλιξη του GC, επούλωση τραυμάτων και δοκιμασία φρεατίων πραγματοποιήθηκαν για να αναλυθεί η επίδραση του miR-219-2-3p έκφρασης στο μεταναστευτικό και επεμβατική συμπεριφορά των MGC-803 και HGC-27 κύτταρα . Βρήκαμε ότι η εισαγωγή του miR-219-2-3p σε MGC-803 και HGC-27 κύτταρα οδήγησε σε σημαντική μείωση της κυτταρικής μετανάστευσης κατά το κλείσιμο ενός τεχνητού τραύμα που δημιουργείται κατά τη διάρκεια μιας συρρέουσα μονοστιβάδα (Εικ. 3Α). Αυτά τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού κατά τη διάρκεια της επούλωσης του τραύματος για να εξασφαλίσει ότι κάθε επαυξημένης μεταναστευτική συμπεριφορά δεν μπορούσε να επηρεαστεί από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αλλαγμένη. Επιπλέον, η αποκατάσταση του miR-219-2-3p ανέστειλε δραματικά την κανονικά ισχυρή επεμβατική ικανότητα των MGC-803 και HGC-27 κύτταρα, τα οποία μεταφέρονται χαμηλή ενδογενή επίπεδο miR-219-2-3p (Σχ. 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι miR-219-2-3p υπερέκφραση συμβάλλει στη ρύθμιση της κυτταρικής κινητικότητας GC και εξέλιξης in vitro.

27 HGC κύτταρα (Α) MGC-803 και δεν επιμολύνθηκαν ή επιμολυσμένο με 50 nmol /L του miR-219-2-3p μιμείται ή αγωνίζομαι για 24 ώρες, και πληγές έγιναν. Η σχετική αναλογία του κλεισίματος του τραύματος ανά πεδίο εμφανίζεται. (Β) MGC-803 και HGC-27 κύτταρα δεν επιμολύνονται ή επιμολυσμένο με 50 nmol /L miR-219-2-3p μιμείται ή σκαρφάλωμα για 24 ώρες, και transwell δοκιμασία εισβολή πραγματοποιήθηκε. Η σχετική αναλογία των μεταστατικών κυττάρων ανά πεδίο εμφανίζεται. Μεγέθυνση για την αναγνώριση της μετανάστευσης είναι × 400 και η εισβολή είναι × 40. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD.

Η

MiR-219-2-3p έκφραση είναι επιγενετικώς ρυθμιζόμενη

Με βάση τις ανωτέρω διαπιστώσεις, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι το miR-219-2- 3p ήταν ένα σημαντικό ρυθμιστή στο GC. Ωστόσο, οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί του miR-219-2-3p έκφρασης ήταν ακόμα άγνωστη. Δεδομένου ότι πολλοί miRNAs αναγνωρίστηκαν ως στόχοι της ρύθμισης μεθυλίωσης, όπως miR-9, miR-34b /c και miR-148a στο μεταστατικό καρκίνωμα [16], και miR-137 και miR-193a στον καρκίνο του στόματος [17], ΜΙΚ 193b και miR-145 στον καρκίνο του προστάτη [18], [19], αποφασίσαμε να αναλύσουμε το ρυθμιστικό μηχανισμό του miR-219-2-3p έκφραση από γονιδιωματική μεθυλίωση του. Μετά την ανάλυση της γονιδιωματικής περιοχής που καλύπτει το γονίδιο miR-219-2-3p, εντοπίσαμε ένα μεγάλο νησί CpG (Σχ. 4Α). Για να διερευνηθεί αν miR-219-2-3p ήταν επιγενετικώς ρυθμίζεται σε GC, MGC-803, HGC-27 κύτταρα κατεργάστηκαν με τον αναστολέα demethyltransferase, 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα-CDR) και το ιστόνης αποακετυλάσης- αναστολέας τριχοστατίνη Α (TSA). Στη συνέχεια, η έκφραση του miR-219-2-3p με RT-PCR αναλύθηκε (Σχ. 4Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του miR-219-2-3p ήταν ρυθμισμένη σε δύο περιπτώσεις: για τη θεραπεία 5-Αζα-CdR, η έκφραση του miR-219-2-3p ήταν ρυθμισμένη σε MGC-803 ( 5-Αζα-CdR 1,5 μmol /L? 2,14 φορές) και HGC-27 (5-Αζα-CdR 0,5 μmol /L? 3,07 φορές) σε σύγκριση με DMSO θεραπεία ομάδα ελέγχου? για τη θεραπεία συνδυασμού 5-Αζα-CDR και TSA, η έκφραση του miR-219-2-3p ήταν πολύ υψηλότερη σε MGC-803 (5-Αζα-CdR 1,5 μmol /L? 1,98 φορές) και HGC-27 (5 αζα-CdR 1,5 mmol /L? 1,28 φορές) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου TSA. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι επιγενετικών παραγόντων θα μπορούσε να επηρεάσει miR-219-2-3p έκφραση σε GC. Συνέργεια των απομεθυλίωση και απακετυλάσης ιστόνης αναστολή οδήγησε στην εκ νέου έκφραση του miR-219-2-3p στο GC. Για την περαιτέρω ανιχνεύσει αν miR-219-2-3p συνδέθηκε με μεθυλίωση του GC, εξετάσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης της περιοχής miR-219-2-3p ανάντη χρησιμοποιώντας μεθυλίωσης-ειδική PCR (MSP? Εικ. 4C). 22 ζεύγη των ιστών (πρωτοπαθείς όγκους και συμφωνημένα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους) στα 113 ζεύγη επιλέχθηκαν, συμπεριλαμβανομένων 11 ασθενών που κατείχε χαμηλότερη miR-219-2-3p επίπεδα (κάτω ρύθμιση ομάδα) και 11 ασθενείς οι οποίοι κατείχαν υψηλότερο miR-219 -2-3p επίπεδα (πάνω ρύθμιση ομάδα). Βρήκαμε ότι η μεθυλίωση του DNA στην ανάντη περιοχές του miR-219-2-3p υπήρχε και στα δύο παρακείμενα φυσιολογικούς ιστούς και καρκινικούς ιστούς. Ωστόσο, η αναλογία υπερμεθυλίωση ανοδική περιοχή του γονιδίου miR-219-2-3p στην ομάδα κάτω ρύθμιση ήταν 63,6% (7 από τους 11), η οποία ήταν υψηλότερη από την ομάδα πάνω ρύθμιση (36,3%, 4 από τους 11 ). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι το επίπεδο μεθυλίωσης του ανάντη περιοχή CpG του miR-219-2-3p ήταν υψηλότερη στην miR-219-2-3p ρυθμισμένα προς τα κάτω ομάδα σε σχέση με την επάνω ρυθμισμένη όνη.

( Α) μία σχηματική απεικόνιση της διαγραφής ενός τμήματος (90 Μ-141 Μ) του χρωμοσώματος 9q34.11 όπου βρίσκονται οι miR-219-2-3p γονίδια. (Β) Επίδραση των 5-Aza-CdR και TSA για miR-219-2-3p έκφραση σε MGC-803 και HGC-27 κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. 5-Αζα-CDR ή 5-αζα-CdR συνδυασμό με TSA αύξησε σημαντικά miR-219-2-3p επίπεδα. αποτελέσματα (C) Εκπρόσωπος MSP του miR-219-2-3p μεθυλίωση στην πρωτοβάθμια γαστρικό καρκινικούς όγκους και φυσιολογικό παρακείμενους ιστούς όγκων. Οι αριθμοί περίπτωση που παρουσιάζεται στην κορυφή. M: μεθυλιωμένα εκκινητές? U: μη μεθυλιωμένη εκκινητές. Περιπτώσεις με υπερμεθυλίωση σημαδεύτηκαν.

Η

Η υπερέκφραση του miR-219-2-3p μειώνει ERK1 /2 σηματοδοτικό μονοπάτι

Η ενεργοποίηση των ERK1 /2 μονοπατιού ήταν καλά τεκμηριωμένο σε διάφορους τύπους όγκων, όπως GC [20], του καρκίνου του παγκρέατος [21] και του καρκίνου του μαστού [22]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει την σημασία των ERK1 /2 σηματοδοτικό μονοπάτι στη ρύθμιση της μετανάστευσης, εισβολή και μετάσταση των καρκινικών κυτταρικών σειρών [23]. Για να διερευνηθεί κατά πόσο miR-219-2-3p επηρεάζει τις δραστηριότητες των κυττάρων μέσω της ERK1 /2 μονοπατιού, το επίπεδο φωσφορυλίωσης των ERK1 /2 στο MGC-803 και HGC-27 κυττάρων εξετάστηκε μετά miR-219-2-3p υπερέκφραση. Κυτταρικά επίπεδα της p-ERK1 /2 μειώθηκε σημαντικά το miR-219-2-3p μιμείται-επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με αγωνίζομαι-επιμολυσμένα ή μη επεξεργασμένα κύτταρα. Ωστόσο, καμία εμφανής διαφορά δεν παρατηρήθηκε στο σύνολο των /2 επίπεδο ERK1 (Εικ. 5Α). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η ταχεία ανάπτυξη των κυττάρων GC μπορεί να οφείλεται εν μέρει στην ενεργοποιημένη ERK1 /2 μονοπάτια.

(Α) MGC-803 και HGC-27 κύτταρα χωρίς θεραπεία και επιμολυσμένα με ομελέτα ή miR-219-2-3p μιμείται υποβλήθηκαν σε ανάλυση στυπώματος Western φωσφορυλιωμένης ERK1 /2, σύνολο ERK1 /2 και GAPDH (ως έλεγχος φόρτωσης). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών μεμονωμένων western blot αναλύσεις. (Β) Οι ογκο-στόχοι υποψήφιος του miR-219-2-3p προβλέπεται από TargetScan Release 5.2, και miRDB. (C) Bioinformatically και λειτουργικά εμπλέκεται miR-219-2-3p στο GC.

Η

προσέγγιση Βιοπληροφορική να αναζητήσουν πιθανούς στόχους του miR-219-2-3p

miRNAs ρυθμίζουν γονίδιο έκφραση από την αλληλεπίδραση με τα mRNA στόχο τους με αποτέλεσμα την υποβάθμιση του mRNA ή μεταγραφική καταστολή. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το μηχανισμό του miR-219-2-3p σε GC, εμείς bioinformatically (TargetScan Release 5.2 και miRDB) και λειτουργικά εμπλέκεται miR-219-2-3p σε GC, και βρήκε τα γονίδια στόχαστρο miR-219-2- 3P (Πίνακας S2). Μεταξύ των 371 προβλεπόμενων στόχων του miR-219-2-3p, 31 εκ των οποίων φαίνεται υψηλού δυναμικού από τη στιγμή που προβλέπεται από τα δύο προγράμματα, ενώ άλλα είχαν προβλεφθεί μόνο με ένα από τα προγράμματα. Από αυτά τα 31 γονίδια, ErbB3, MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1, SOX4 βρέθηκαν να είναι ογκογονιδίου ή την απόπτωση που σχετίζονται με γονίδια από προηγούμενες δημοσιευμένες εργασίες. (Εικ. 5Β και 5C).

Συζήτηση

Τα τελευταία χρόνια, τα συσσωρευμένα στοιχεία που έχει οδηγήσει τους ογκολόγους να εικάζουν ότι αφανέρωτο μοριακών παραγόντων, ιδιαίτερα των μη-κωδικοποίησης RNAs που είχαν ταξινομηθεί προηγουμένως ως «junk», το παιχνίδι σημαντικούς ρόλους στην ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου. Ανάλογα με τους στόχους τους mRNA, miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως καταστολείς όγκων ή υποστηρικτές της ογκογένεσης. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που απορρυθμισμένης miRNAs δεν έχουν ευρέως μελετηθεί, συμπεριλαμβανομένων παρεκκλίνουσα βιογένεση miRNA και μεταγραφή [24], [25], επιγενετικές μεταβολές [26], [27], και ενίσχυση ή απώλεια γονιδιωματικών περιοχών που κωδικοποιούν miRNAs [28] .

Όπως φαίνεται στην παρούσα έκθεση, αναλύσαμε την έκφραση του miR-219-2-3p σε 113 ασθενείς με GC και βρέθηκε ότι τα επίπεδα φαίνεται να είναι χαμηλότερη σε GC. Αν και miR-219-2-3p έχει αναφερθεί ότι είναι στενά συναφείς προς διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια [29], ολιγοδενδροκύτταρα [15], τη νόσο του Alzheimer [30] και το γλοιοβλάστωμα [12], η λειτουργία του σε GC μένει να καθοριστεί. Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι η εκ νέου έκφραση του miR-219-2-3p σε κύτταρα GC είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης και μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα. Αυτά τα αποτελέσματα μας επέτρεψε να υποθέσουμε ότι κάτω ρύθμιση των miR-219-2-3p μπορεί να παρέχει ένα πλεονέκτημα επιβίωσης στα κύτταρα GC. Ωστόσο, ο μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για το miR-219-2-3p κάτω ρύθμιση σε GC είναι ακόμα άγνωστη. Επειδή η απώλεια σε 9q34.11, όπου βρίσκεται miR-219-2-3p, σπάνια ανιχνεύεται σε GC [31], είναι απίθανο ότι αλληλική απώλεια είναι υπεύθυνη για την ρύθμιση προς τα κάτω της. Από την άλλη πλευρά, βρήκαμε ότι miR-219-2-3p ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα όταν τα κύτταρα GC, MGC-803 και HGC-27, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία τόσο με 5-Αζα-CDR και TSA. Επιπλέον, υπολογιστική ανάλυση αποκαλύπτει ότι το miR-219-2-3p βρίσκεται σε ένα νησί CpG στο χρωμόσωμα 9q34.11. Ως εκ τούτου, φαίνεται πιθανό ότι το DNA μεθυλίωση και απακετυλίωση ιστόνης μπορεί να σχετίζεται με το miR-219-2-3p ρύθμιση. Με MSP, συχνότητες δείγματα μεθυλίωση ανιχνεύθηκε στην ανάντη περιοχή του miR-219-2-3p ήταν υψηλότερη στην miR-219-2-3p ρυθμισμένα προς τα κάτω ομάδα από ό, τι στον άνω-ρυθμιζόμενες ομάδα. Αυτή η ιδιαιτερότητα επιπλωμένο την υπόθεση μιας σχέσης μεταξύ miR-219-2-3p έκφρασης και μεθυλίωσης του DNA. Συνολικά, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μεθυλίωση ήταν ένας σημαντικός μηχανισμός για miR-219-2-3p ρύθμιση προς τα κάτω στο GC.

Πραγματοποιήσαμε πρόβλεψη από τα προγράμματα TargetScan και miRDB και διαπίστωσε ότι 6 γονίδια θα μπορούσαν να είναι πιθανοί στόχοι του miR -219-2-3p. Μεταξύ των υποψήφιων στόχων του miR-219-2-3p, η τυροσίνη υποδοχέα κινασών ErbB3 (επιδερμικού οικογένεια υποδοχέων αυξητικού παράγοντα) επέστησε την προσοχή μας. Τα υψηλά επίπεδα του erbB3 συνδέεται στενά με την εξέλιξη του όγκου και κακή πρόγνωση των ασθενών με GC [32] – [34] και οι αναστολείς κινάσης EGFR θα μπορούσε να αποτρέψει gefitinib EGFR και ERBB2 ενεργοποίηση του erbB3. Εν τω μεταξύ, η έκφραση ErbB3 χρησιμεύει επίσης ως ένα αποτελεσματικό προγνωστικό της ευαισθησίας στο gefitinib [35]. Είναι γνωστό ότι η καταπιεσμένη μεταγραφή ErbB3 αναστέλλει καταρράκτες σηματοδότησης από ERK1 /2 οδών [36]. Ωστόσο, η προβλεπόμενη γονιδίων-στόχων πρέπει να αξιολογηθούν περαιτέρω πειραματικά. Επιπλέον, miRNAs μπορεί να λειτουργήσει σύμφωνα με μια συνδυαστική κυκλώματα μοντέλο, στο οποίο ένα ενιαίο miRNA μπορούν να στοχεύουν πολλαπλά mRNA, και αρκετές συνεκφράζονται miRNAs μπορούν να στοχεύουν σε ένα και μόνο mRNA. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η βιολογική έννοια «ένα χτύπημα-πολλαπλούς στόχους» θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε κλινικές θεραπευτικές ουσίες [37]. Είναι πιθανό ότι ένα συγκεκριμένο miRNA μπορεί να λειτουργεί μέσω της συνεργατικής κάτω ρύθμιση των πολλαπλών στόχων και miRNAs λειτουργία επίσης καταστέλλοντας τη μετάφραση των γονιδίων στόχων τους. Για να εξερευνήσετε τον πλήρη αντίκτυπο ενός miRNA, γονιδίωμα-ευρεία πρωτεομική μελέτες πρέπει να γίνουν.

Εν κατακλείδι, η έκφραση μας και λειτουργικές μελέτες πρότειναν ότι το miR-219-2-3p ήταν διαφορικά εκφράζεται από μηχανισμό μεθυλίωσης και είχε μια καρκινική λειτουργία καταστολής με τη ρύθμιση ERK1 /2 που σχετίζονται με οδούς σήματος σε GC. Εν τω μεταξύ, η χαμηλότερη έκφραση του miR-219-2-3p σε δείγματα GC συσχετίστηκε με υψηλότερο βαθμό και μεταγενέστερο στάδιο. Επανεισαγωγή έκφραση του miR-219-2-3p σε κύτταρα GC κατασταλεί κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μετανάστευση, εισβολή και απόπτωση που επάγεται έδειξαν ότι miRNA με βάση theraputic πρότυπο θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως βάση για την ανάπτυξη νέων δυνητικών θεραπειών σε γαστρικό καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

ιστών Δείγματα

γαστρικών όγκων και μορφολογικά φυσιολογικούς ιστούς τους (που βρίσκεται & gt? 3 εκατοστά μακριά από τον όγκο) ελήφθησαν από το Νοέμβριο του 2009 και το Νοέμβριο 2011 από 113 ασθενείς που υποβάλλονται σε GC χειρουργική επέμβαση σε νοσοκομείο του καρκίνου της κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών (CICAMS, n = 21), κινέζικα Γενικό νοσοκομείο PLA (301 νοσοκομείο, n = 31), και το πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο της Shanxi Medical University (n = 61). Η χρήση των δειγμάτων ιστού για όλα τα πειράματα εγκρίθηκε από την ηθική του διοικητικού συμβουλίου του Ινστιτούτου Βασικών Ιατρικών Επιστημών, Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών. Όλοι οι συμμετέχοντες παρέχεται προφορική συγκατάθεση τους να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη, και λεκτική πληροφορημένες συγκαταθέσεις τους γράφτηκαν κάτω. Αυτή η διαδικασία συναίνεσης εγκρίθηκε επίσης από το διοικητικό συμβούλιο δεοντολογίας. Δείγματα ιστών κόπηκαν σε δύο μέρη, το ένα σταθεροποιήθηκε με 10% φορμαλίνη για ιστοπαθολογική διάγνωση, και η άλλη αμέσως συμπληρωματικό καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και φυλάχθηκαν στους -196 ° C σε υγρό άζωτο μέχρι την εκχύλιση του RNA. Η ομάδα αυτή αποτελούνταν από 95 άνδρες, 17 γυναίκες και ένα χωρίς πληροφοριών μεταξύ των φύλων, με μέση ηλικία 58 έτη (εύρος, 31 έως 82 ετών) .Formalin-σταθερής εμπεδωθεί με παραφίνη μπλοκ ιστού της GC συλλέχθηκαν από το Αντικαρκινικό Νοσοκομείο της Κινεζικής Ακαδημίας ιατρικών Επιστημών (CICAMS, n = 4) μεταξύ 2009 και 2011. Λόγω ατομικές διαφορές μεταξύ των ασθενών, μας έλειπε πληροφορίες για κάποιες κλινικοπαθολογική δεδομένων. Η χρήση των δειγμάτων ιστού για όλα τα πειράματα εγκρίθηκε από όλους τους ασθενείς και από την Επιτροπή Δεοντολογίας του ιδρύματος. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών που περιγράφονται στον Πίνακα 1.

καλλιέργειες κυττάρων και Επιμόλυνση

Ένα σύνολο των 4 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές GC MGC-803 (βλεννώδες γαστρικό καρκίνο, κακώς διαφοροποιημένο), HGC-27 ( μεταστατικό λεμφαδένα, αδιαφοροποίητο καρκίνωμα), ΜΚΝ-45 (Σφραγιστικό καρκίνωμα δαχτυλίδι φτωχά διαφοροποιημένα), SGC-7901 (αδενοκαρκίνωμα, μετρίως διαφοροποιημένων) εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη. Το MGC-803 HGC-27, ΜΚΝ-45, ΓΓΕ-7901 κυτταρική σειρά αγοράστηκε από το κινητό Resource Center του Ινστιτούτου Βασικών Ιατρικών Επιστημών, Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών και του Πεκίνου Ένωσης Ιατρικό Κολέγιο (Πεκίνο, Κίνα). MGC-803 πολλαπλασιάστηκε σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (Gibco? Invitrogen? Technologies Life, Γερμανία), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? ΡΑΑ, Pasching, Αυστρία) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml), πενικιλλίνη (100 U /ml). Η HGC-27, ΜΚΝ-45, SGC-7901 διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (ΡΑΑ) συμπληρωμένο με 10% FBS (ΡΑΑ). Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές GC MGC-803, HGC-27 διαμολύνθηκαν με miR-219-2-3p μιμείται και αρνητικών μιμείται miRNA ελέγχου (GenePharma? Σαγκάη, Κίνα, Πίνακας S1) σε τελική συγκέντρωση 10 nmol /L χρησιμοποιώντας Dharmafect 1 (Thermo Fisher? IL, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

TaqMan RT-PCR για miRNA έκφραση

το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα και τους ιστούς με αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Calsbad. , CA, USA). MiRNAs ποσοτικοποιήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA δοκιμασίας (Invitrogen, USA). Πρώτου κλώνου συμπληρωματικού DNA σύνθεση (cDNA) διεξήχθη από 1 μg του ολικού RNA σε 12 μΐ τελικού όγκου που περιείχε 2 Μ εκκινητή stem-loop, 10 mM dNTP Mix (Invitrogen, USA). Το μίγμα πλάκα στους 65 ° C για 5 λεπτά, και στη συνέχεια αναμιγνύεται με 5 × ρυθμιστικό RT, 0,1 Μ DTT, 200 U /μl MultiScribe αντίστροφης μεταγραφάσης και 40 U /μl αναστολέα RNase (Invitrogen, USA). Το μίγμα πλάκα στους 37 ° C για 55 λεπτά, 70 ° C για 15 λεπτά και κατόπιν διατηρήθηκε στους -20 ° C. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο πρωτόκολλο TaqMan PCR. Τα 20 μΙ ΡΟΚ αντιδράσεις περιλαμβάνονται 1 μl του προϊόντος RT, 1 × Οικουμενική TaqMan Master Mix και 1 × TaqMan ανιχνευτής /μείγμα εκκινητή (Invitrogen, ΗΠΑ, Πίνακας S1). Όλες οι αντιδράσεις RT συμπεριλαμβανομένων μάρτυρες χωρίς πρόπλασμα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Όλα τα δεδομένα mRNA ποσοτικοποίηση ομαλοποιήθηκε με U6. Η σχετική ποσότητα του μεταγραφήματος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο Ct.

5-Αζα-CDR και τριχοστατίνη Α θεραπεία των κυτταρικών σειρών

κυτταρικές σειρές GC MGC-803 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-αζα- 2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα-CdR? Sigma-Aldrich, USA) σε 0,7 μmol /L, 1,5 μmol /L, 3 μmol /L και HGC-27 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-αζα-CdR σε 0,5 μmol /L, 1 mmol /L, 1,5 mmol /L για 3 ημέρες ή 300 nmol /λ τριχοστατίνης Α (TSA? Sigma-Aldrich, USA) για 24 ώρες. Για τη θεραπεία συνδυασμού, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-CdR για 48 ώρες κατ ‘αρχάς. Στη συνέχεια, TSA (300 nmol /L) προστέθηκε, και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί άλλες 24 ώρες. Το μέσο καλλιέργειας που περιέχει το φάρμακο αντικαταστάθηκε κάθε 24 ώρες. RNA κυτταρικών γραμμών καθαρίστηκε με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ ακολουθώντας τις οδηγίες από τον κατασκευαστή. Η σύνθεση του cDNA διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως, και 1 ml του αραιωμένου cDNA για κάθε δείγμα ενισχύθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο που περιγράφηκε προηγουμένως.

απομόνωση DNA και όξινο θειώδες τροποποίηση

Γενωμικό DNA ελήφθη από -196 ° C σε υγρό άζωτο πρωτογενείς όγκους, και τους συμφωνημένα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (n = 22, περιλαμβάνουν 11 ασθενείς η οποία έκφραση του miR-219-2-3p ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω και οι άλλοι επάνω ρυθμισμένη) και μεταχειρισμένα Biomed DNA Kit (Biomed, Πεκίνο, Κίνα), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κατεργασία όξινου θειώδους και ανάκτηση των δειγμάτων διεξήχθησαν με το κιτ Epitect Bisulfite (Qiagen? Hilden, Germany). Γονιδιωματικό DNA (2 μ§) σε 20 μΐ νερό χρησιμοποιήθηκε για κάθε αντίδραση και αναμίχθηκε με 85 μλ διθειώδες μίγματος και 35 μΐ DNA προστατεύουν ρυθμιστικό. Μετατροπή διθειώδους εκτελέστηκε σε θερμοκυκλοποιητή ως εξής: 99 ° C για 5 λεπτά, 60 ° C για 25 λεπτά, 99 ° C για 5 λεπτά, 60 ° C για 85 λεπτά, 99 ° C για 5 λεπτά, 60 ° C για 175 min και 20 ° C επ ‘αόριστον. Η κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA ανακτήθηκε με στήλη σπιν Epitect και ακολούθως αλληλουχίας για να επιβεβαιωθεί η αποτελεσματικότητα της διθειώδους μετατροπής.

Η μεθυλίωση ανάλυση

MSP χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση μεθυλίωσης του miR-219-2-3p ανάντη περιοχή σε κυτταρικές σειρές και ιστούς. Methprimer χρησιμοποιήθηκε για το σχεδιασμό MSP εκκινητή (Πίνακας S1). MSP αντιδράσεις σε νέα εναύσματα βελτιστοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μεθυλιωμένος θετικός έλεγχος (Μ-DNA), το οποίο με τη χρήση φυσιολογικού ανθρώπινου DNA περιφερικών λεμφοκυττάρων κατεργασία in vitro με Sss Ι μεθυλοτρανσφεράση (New England Biolabs, Beverly, ΜΑ). Το DNA των δύο φυσιολογικών ανθρώπινων περιφερικών λεμφοκυττάρων χρησιμοποιήθηκε σαν κανονικός έλεγχος. Touchdown PCR αποτελείτο από δύο φάσεις: Φάση 1, περιλαμβάνεται μια αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 30 s, ανόπτηση σε μεταβλητές θερμοκρασίες για 30 s, και επέκταση στους 72 ° C για 40 s. Στον πρώτο κύκλο, η θερμοκρασία ανόπτησης ρυθμίστηκε στους 58 ° C και, σε κάθε ένα από τα 10 επόμενους κύκλους, η θερμοκρασία ανόπτησης μειώθηκε κατά 0,6 ° C. Φάση 2 αποτελούνταν από 35 κύκλους των 95 ° C για 30 s, 52 ° C για 30 s, και 72 ° C για 40 s. προϊόντα MSP αναλύθηκαν σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 3%

πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, και του κυτταρικού κύκλου δοκιμασία

Τα κύτταρα επωάστηκαν σε 10% CCK-8. (Dojindo? Kumamoto, Japan) αραιωμένο σε φυσιολογικό μέσου καλλιέργειας στους 37 ° C μέχρι τη μετατροπή οπτική χρώμα εμφανίστηκε.