Αφηρημένο

ανδρογόνων υποδοχέων (AR) με τη μεσολάβηση σηματοδότηση είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική ανάπτυξη του προστάτη αδένα και οδηγεί επίσης καρκίνο του προστάτη (PCA) κυτταρική ανάπτυξη και επιβίωση, με πολλές μελέτες που δείχνουν μια συσχέτιση μεταξύ της αύξησης των επιπέδων του υποδοχέα και αντίσταση θεραπεία με εξέλιξη σε θανατηφόρα ευνουχισμού επαναλαμβανόμενες προστάτη (CRPC). Παρά το γεγονός ότι έχει διατηρηθεί για κάποιο χρονικό διάστημα που ο μεταγραφικός παράγοντας Sp1 είναι ο κύριος διεγέρτης του γονιδίου AR μεταγραφής, ολοκληρωμένη γνώση της ρύθμισης του γονιδίου AR παραμένει ατελής. Εδώ περιγράφουμε και χαρακτηρίζουν λεπτομερώς δύο νέα δραστική ρυθμιστικά στοιχεία στο 5’UTR του ανθρώπινου γονιδίου AR. Και τα δύο αυτά στοιχεία περιέχουν επικαλυπτόμενες θέσεις σύνδεσης για το θετικό παράγοντα μεταγραφής Sp1 και την πρωτεΐνη καταστολέα PUR-α. Η ανώμαλη κυτταρική σηματοδότηση είναι χαρακτηριστική του προστάτη και η μεταγραφική δραστικότητα του προαγωγού AR σε κύτταρα προστάτη εξαρτάται από τις σχετικές ποσότητες των δύο παραγόντων μεταγραφής. Μαζί με επιβεβαίωση μας για τον κυρίαρχο ρόλο του SP1, τα ευρήματα υποστηρίζουν τη λογική της στόχευσης αυτού του μεταγραφικού παράγοντα για την αναστολή της εξέλιξης του όγκου. Αυτό θα πρέπει να είναι ιδιαίτερα θεραπευτική αξία στην CRPC όταν μειώνονται τα επίπεδα των καταστολέα PUR-α

Παράθεση:. Hay CW, Hunter Ι, MacKenzie Α, McEwan IJ (2015) Μια Sp1 Διαμορφωμένη Ρυθμιστική Περιφέρεια Μοναδικό ανώτερα πρωτεύοντα Ρυθμίζει τα Ανθρώπινα ανδρογόνων υποδοχέων Διοργανωτή στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 10 (10): e0139990. doi: 10.1371 /journal.pone.0139990

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ΑΥΣΤΡΙΑ

Ελήφθη: 16 Ιούνη 2015? Αποδεκτές: 20 Σεπ 2015? Δημοσιεύθηκε: 8 Οκτωβρίου 2015

Copyright: © 2015 Hay et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Γραφείο του επικεφαλής επιστήμονας του (CSO) της κυβέρνησης της Σκωτίας (https://www.cso.scot.nhs.uk/) : CWH (CZB-4-477) και IH (ΕΤΜ /382)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

προστάτη καρκίνο (PCA) είναι ο δεύτερος συχνότερος καρκίνος στους άνδρες και αποτελεί την δεύτερη κύρια αιτία της ανδρικής θανάτων από καρκίνο στις δυτικές χώρες και την έκτη παγκοσμίως αντίστοιχα [1]. Επιπλέον, η συχνότητα εμφάνισης του προστάτη αυξάνεται σχεδόν σε όλες τις χώρες με το ποσοστό των νέων περιπτώσεων αναμένεται να διπλασιαστεί μέχρι το 2030-1700000 με αποτέλεσμα 500.000 επιπλέον θανάτους [2].

Η ανάπτυξη και η διαφοροποίηση των φυσιολογικών επιθηλιακών προστάτη κύτταρα, καθώς και την ανάπτυξη και την εξέλιξη του προστάτη, οδηγούνται από ανδρογόνο σηματοδότηση που διαμεσολαβείται από τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR) [3]. Ως εκ τούτου, η αναστολή της λειτουργίας AR από θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT) χρησιμοποιώντας ανταγωνιστές ή μείωσης των όρχεων ή εντός του όγκου των ανδρογόνων σύνθεση αποτελεί την κύρια διαδικασία για την αντιμετώπιση προχωρημένο και μεταστατικό προστάτη [4-6]. Αρχικά, οι περισσότεροι ασθενείς παρουσιάζουν σημαντική βελτίωση και ύφεσης, αλλά ο καρκίνος εξελίσσεται πάντα να γίνουν ανεξάρτητοι των κυκλοφορούντων ανδρογόνων και αναφέρεται ως ευνουχισμού ανθεκτικά προστάτη (CRPC) [7]. Αυτό αργά, μεταστατικό στάδιο είναι συνήθως μοιραία και αποτελεί τη μεγαλύτερη πρόκληση για την ανάπτυξη νέων, αποτελεσματικών θεραπειών [8]? απαιτούν πολλαπλές αγωγές AR-στοχευμένη (αναθεωρηθούν [9]). Κυρίως, CRPC όγκοι παραμένουν εξαρτάται από τη σηματοδότηση AR? παραδειγματικά στα δύο ανδρογόνων ευαίσθητα (AS) και CRPC κύτταρα όπου μειωμένη έκφραση AR επάγει μια συνακόλουθη απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων [10].

Οι λειτουργίες του υποδοχέα των ανδρογόνων, ως παράγοντας μεταγραφής ανδρογόνο ενεργοποιείται το οποίο συνδέεται με στοιχεία απόκρισης ανδρογόνων ( AREs) [4] σε υποκινητές και ενισχυτές άπω (86% έως 95% του Άρη [11]). Η ικανότητα διενεργοποίηση του υποδοχέα διαμορφώνεται από τις αλληλεπιδράσεις με μια συνεχώς αυξανόμενη λίστα των coregulators και μεταγραφικών παραγόντων (αναθεωρούνται στο [12]) που δρουν στον ίδιο τον υποδοχέα ή να τροποποιήσει το περιβάλλον χρωματίνης. Για παράδειγμα, η μεταγραφή πρωτοπόρος παράγοντες FOXA1 και GATA2 προωθήσει μια ανοικτή δομή χρωματίνης που διευκολύνει AR δεσμευτική, και το γονιδίωμα μεγάλη μελέτες δείχνουν συν-εντοπισμό των χώρων για τους τρεις αυτούς παράγοντες [13,14] δεσμευτική. GATA2 διαδραματίζει ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο, διότι καθώς και την αύξηση AR δεσμευτική για ενισχυτές, συμμετέχει στη χρωματίνη looping και απορυθμίζει απευθείας την έκφραση του γονιδίου AR [13,14]. Αυξημένα επίπεδα GATA2 σε προστάτη συσχετίζεται με υψηλή βαθμολογία Gleeson, και μειωμένη δραστηριότητα μέσω βρεγμένο έκφρασης [13,14] ή αναστολή της GATA2 πληρότητας σε αρ, με τον κουρκουμίνη ισοφλαβόνες [15] οδηγήσει σε μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του προστάτη.

η πλειοψηφία των CRPC όγκοι υπερεκφράζουν τον υποδοχέα [16-19] με κλωνική επιλογή επιδεινώνει το πρόβλημα [20]. Τα αυξημένα επίπεδα της άδειας AR σύνδεσης προς χρωματίνη σε 100 φορές χαμηλότερη συγκέντρωση της ρίζας συνδέσεως από το κανονικό [21] και την παρεκκλίνουσα AR-καθοδηγείται μεταγραφικό πρόγραμμα σε CRPC όγκους επιτρέπει στα κύτταρα να αναπτύσσονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις ανδρογόνων [22] ή την εμφανή απουσία ορμόνη [23-25], καταργώντας έτσι ADT [26] και κατεργασία με αμπιρατερόνη [20].

Στους ανθρώπους, το γονίδιο AR εκτείνεται περίπου 180 kbp του X-χρωμόσωμα (Xq11.2-Q12) και δημιουργεί ένα μεταγράφημα 4,3 kb που περιλαμβάνει έναν ασυνήθιστα μακρύ 5 ‘αμετάφραστη περιοχή (5’UTR) του 1,1 kb. Ο υποκινητής στερείται ΤΑΤΑ και CCAAT κουτιά και, από κοινού με πολλές ΤΑΤΑ γονιδίων, η μεταγραφή οδηγείται κυρίως από δέσμευση του εκφράζεται παντού μεταγραφικός παράγοντας δακτύλου ψευδαργύρου, Εξειδίκευση πρωτεΐνη 1 (SP1) για το πλαίσιο GC ρυθμιστικά στοιχεία. Ο πυρήνας υποκινητή βρίσκεται μεταξύ -74 και 87 bp [27] και την ενεργό κουτιά GC έχουν επιβεβαιωθεί σε -46 -41 bp να καθώς και στο 5’UTR κατά 429 και 442 bp [27-29]. Sp1 με γνώμονα την έκφραση του γονιδίου AR διευκολύνεται από ένα περίπου 90 bp τέντωμα του ομοπουρίνης /ομοπυριμιδίνης αμέσως ανάντη του υποκινητή (-150 έως -60 bp) που παρέχει άφθονη προσφορά του μεταγραφικού παράγοντα να δεσμεύεται με τον πυρήνα υποκινητή [30 ]. Μόλις συνδεδεμένο με τον υποκινητή, Sp1 συνεργάτες άμεσα με την πρωτεΐνη ΤΑΤΑ δεσμευτική και ΤΒΡ που σχετίζονται με συντελεστή 4 (TAf4) [31], για να καθοριστεί η σύνθετη κίνηση. Επιπλέον, Sp1 μπορούν να σχηματίσουν πολυμερή και πολλαπλές στοιβάζονται τετραμερή παρέχοντας πολυάριθμες θέσεις σύνδεσης για μία ποικιλία άλλων πρωτεϊνών να ρυθμίζουν μεταγραφή τόσο άμεσα όσο και μέσω της ακετυλίωσης ιστόνης και επαναμοντελοποίηση χρωματίνης (που επισκοπείται στο [32]). Εκτός από τις upregulatory κουτιά GC, η 5’UTR περιοχή κωδικοποιεί διάφορες ανασταλτικές ρυθμιστικά στοιχεία συμπεριλαμβανομένου ενός, τοποθεσία σύνθετο ΝΡ-κΒ Β-myb πρόσδεσης [33], ένα αρνητικό ΕΙΝΑΙ [34] και μια Suppressor ανδρογόνων υποδοχέων (ARS) [35 ] που δεσμεύει PUR-α και hnRNP-K σε αντίθετους κλώνους του DNA [36].

το AR αντιπροσωπεύει σαφώς η αχίλλειος πτέρνα του καρκίνου του προστάτη αλλά η τρέχουσα πρωτοβάθμια επεξεργασία που περιλαμβάνει ανδρογόνων ανταγωνιστές έχει περιορισμούς και επίσης οδηγεί για έκφραση μιας εναλλακτικής AR-οδηγείται μεταγραφικό με μεταβλητών αποτελεσμάτων προστάτη [37]. Μια πολύ πιο αποτελεσματική προσέγγιση θα ήταν να μειώσουν τη δραστηριότητά AR μέσω της μειωμένης έκφρασης ή παρεμβολές με αιθέρια συμπαράγοντες μεταγραφή π.χ. ένα μικρό αναστολέας μόριο του GATA2 έχει αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματικός [13]. Και οι δύο προσεγγίσεις εξαρτάται από λεπτομερή γνώση των αλληλεπιδράσεων των πολλαπλών παραγόντων μεταγραφής και ρυθμιστικά στοιχεία που εμπλέκονται στην AR έκφρασης. Επομένως, όπως ο παράγοντας μεταγραφής Sp1 θεωρείται γενικά να είναι ένα σημαντικό διεγερτικό της έκφρασης του γονιδίου AR, έχουμε μελετήσει λειτουργία Sp1 στην άμεση υποκινητή και 5’UTR του ανθρώπινου γονιδίου AR. Στην έκθεση αυτή θα περιγράψουμε δύο νέα δραστική ρυθμιστικών στοιχείων στο ανθρώπινο AR 5’UTR ότι τόσο περιέχει επικαλυπτόμενες θέσεις δέσμευσης για θετικές και αρνητικές παράγοντες μεταγραφής. Η μεταγραφική αποτέλεσμα σε κύτταρα προστάτη εξαρτάται από τις σχετικές ποσότητες των διεγερτικών Sp1 και ανασταλτικών PUR-α. Τα ευρήματα τεκμηριώνουν επίσης τον κυρίαρχο ρόλο του Sp1 στην οδήγηση έκφρασης AR και έτσι θα ενισχύσει τη λογική της στόχευσης αυτού του μεταγραφικού παράγοντα, όπως η ενέργεια αυτή θα προωθήσει δέσμευσης των ανταγωνιστικών PUR-α και αναστέλλουν την εξέλιξη του όγκου. Τέλος, τα ρυθμιστικά στοιχεία εμφανίζουν πολύ κακή εξελικτική διατήρηση απεικονίζει το διακριτικό χαρακτήρα της γονιδιακής ρύθμισης AR άνθρωπο.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκινώματος του προστάτη LNCaP και DU145 ελήφθησαν από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών κυττάρων και την American Type Culture Collection, αντίστοιχα. DU145 αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ ενώ LNCaP διατηρήθηκαν σε RPMI που περιέχει 1 mM Να πυροσταφυλικό και 10 mM HEPES. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (ΡΑΑ) και διατηρήθηκαν στους 37 ° C χωρίς αντιβιοτικά σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 95% αέρα και 5% CO

2.

κηλίδωση Western

κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα LNCaP και DU145, και στυπώματα Western πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως [38]. Ανθρώπινα Sp1, PUR-α, hnRNP-K, και GAPDH ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα ab13370, ab79936, ab52600 και ab36840 (όλα από την Abcam) σε αραιώσεις 1: 6000, 1: 60.000, 1: 17.000 και 1: 12.500, αντιστοίχως. Anti-AR από την Santa Cruz Biotechnology (sc-7305) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1: 100. σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αρμορακίας αντι-κουνελιού IgG δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Sigma) όπως περιγράφηκε προηγουμένως. ανάλυση Ενσωμάτωση των κηλίδων Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J.

RT-PCR

LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 50 ηΜ μιθραμυκίνη Α (Sigma) για 24 ώρες. Εκχύλιση RNA και RT-PCR για τον AR και GAPDH mRNA διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34].

Πλασμίδια και τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση

Μεταλλάξεις των πιθανών ρυθμιστικών στοιχείων εισήχθησαν στο πλασμίδιο phAR1. 6Luc, όπου η έκφραση λουσιφεράσης καθοδηγείται από 1,6 kbp του προαγωγού και 5’UTR του ανθρώπινου γονιδίου υποδοχέα ανδρογόνων (μεταξύ -741 και 842 bp) [34], με τη χρήση δύο μεθοδολογιών. υποκαταστάσεις Base δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ QuikChange II Mutagenesis (Agilent Technologies) χρησιμοποιώντας τα ολιγονουκλεοτίδια που απαριθμούνται στον πίνακα Α σε S1 File, μαζί με αντίστροφη συμπληρώματά τους. μεταλλάξεις διαγραφής έγιναν με την In-Fusion Advantage σύστημα κλωνοποίησης PCR από Clontech με τη χρήση των ολιγονουκλεοτιδίων που παρατίθενται στον Πίνακα Β σε S1 αρχείου. Αμφότερα τα πρωτόκολλα εκτελέσθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και την ακεραιότητα όλων των κατασκευασμάτων επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση του DNA.

Επιμόλυνση και δοκιμασίες γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης

Είκοσι πλάκες τεσσάρων φρεατίων ενοφθαλμίστηκαν με LNCaP ή DU145 κύτταρα σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /cm

2 και 1,2 x 10

4 κύτταρα /cm

2 αντίστοιχα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο για 24 ώρες, στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με 440 ng /φρεάτιο πυγολαμπίδας πλασμιδίου αναφοράς λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας JetPEI πολυαιθυλενιμίνη (Polyplus επιμόλυνση) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά από 24 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για περαιτέρω 24 ή 48 ώρες.

Το πλασμίδιο διαμόλυνση διεξήχθη τουλάχιστον εις τριπλούν και λουσιφεράσης μετρήθηκε εις διπλούν ή εις τριπλούν με τη χρήση ενός Microplate GloMax 96 φωτόμετρο (Promega) και κανονικοποιημένες για συγκέντρωση πρωτεΐνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [38].

Παρασκευή πυρηνικών εκχυλισμάτων

Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα DU145 με την παρουσία αναστολέων πρωτεάσης (πλήρες πρωτεάσης κοκτέιλ αναστολέα από τη Roche συν 1,0 mM PMSF) και αναστολείς φωσφατάσης πρωτείνης (5 mM β-γλυκεροφωσφορικό και 100 μΜ ενεργοποιήθηκε Na

3νο

4) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του Dignam

κ.ά.

[39].

ηλεκτροφορητικής δοκιμασίες μετατόπισης κινητικότητας (EMSAs)

είτε 10 μg LNCaP κυττάρων πυρηνικό εκχύλισμα ή 120 ηΜ καθαρίστηκε ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη Sp1 (Active Motif) επωάστηκαν με 20 fmol βιοτίνη 3 ‘άκρο σημασμένο δίκλωνο DNA ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιώντας προηγουμένως περιγραφείσες συνθήκες [34]. Τα εμπρός αλληλουχίες των ολιγονουκλεοτιδίων ήταν: Sp1-1, 5’-CGGCCCGGTGGGGGCGGGACCCGACTCGCA-3 ‘? ARS, 5’-TCTCCACCCCGCCTCCCCCCACCCTGCCTT-3 ‘? και Sp1-3, 5’-TTCTCCCCACCCGCCCCCCCGCCCCCGTCG-3 ‘. Μια μη επισημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο ενός ρυθμιστικού στοιχείου συναίνεσης Sp1, μειονεκτήματα Sp1, 5’-ATTCGATCGGGGCGGGGCGAGC-3 ‘προστέθηκε 15 λεπτά πριν από τον σημασμένο ανιχνευτή. Για προσδιορισμούς υπερμετατόπισης τα αντισώματα ab13370 και ab52600 (Abcam) κατά της ανθρώπινης Sp1 και hnRNP-K αντιστοίχως προστέθηκαν 15 λεπτά πριν από την προσθήκη του επισημασμένου ανιχνευτή

Τα προκύπτοντα DNA:. Προϊόντα πρωτεΐνης αναλύθηκαν σε ψυχρό 6% μη μετουσιωτικές πηκτές πολυακρυλαμιδίου τρέχουν σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ 0,5χ, ρΗ 8,3 (45 mM Tris-βορικό, 1 mM EDTA) και ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια Pierce LightShift χημιφωταύγειας (Thermo Scientific) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Στοιχεία αυτά καταρτίζονται με βάση autorads του EMSA τζελ με τη σειρά των λωρίδων μέσα σε μερικά τζελ να μεταβληθεί για λόγους σαφήνειας και θα διευκολύνει τις συγκρίσεις. Ψηφιακή ενσωμάτωση των DNA:. Συμπλέγματα πρωτεϊνών διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα Vilber Loumat Fusion SL ψύχεται αισθητήρα CCD με προσοχή να ληφθούν για να εξασφαλιστεί ότι δεν υπήρξε κορεσμός pixel

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασία

Μια λεπτομερής απολογισμός της μεθοδολογίας ChIP έχει παρουσιαστεί στο παρελθόν [34]. Εν συντομία, τα κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με το σχετικό πλασμίδιο phAR1.6Luc με βάση και αναπτύχθηκαν με το συνήθη τρόπο. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά στους 37 ° C και οι πυρήνες παρασκευάστηκαν. Χρωματίνης και το πλασμίδιο σε πέψη με 200 μονάδες HphI (ΝΕΒ) για 20 λεπτά στους 37 ° C? που ακολουθείται από λύση και την απομάκρυνση των αδιάλυτων συντριμμάτων με φυγοκέντρηση. Το υπερκείμενο αραιώθηκε σε ρυθμιστικό chip και προκαταρκτική διαύγαση χρησιμοποιώντας Πρωτεΐνη-G και Πρωτεΐνης-Α Dynabeads (Life Technologies). Δείγματα των καθαρισμένων προϊόντων λύσης διατηρήθηκαν ως είσοδος (IP) και το υπόλοιπο επωάσθηκε με αντισώματα εναντίον είτε Sp1 (07-645, Millipore) ή IgG. Ανοσοσύμπλοκα συλλέχθηκαν με μαγνητισμό, πλένεται δύο φορές το καθένα με: χαμηλή περιεκτικότητα σε αλάτι? υψηλή αλάτι? LiCl και ΤΕ ρυθμιστικά, ακολουθούμενη από έκλουση. DNA-πρωτεΐνης διασυνδέσεις αντιστράφηκαν με NaCl στους 65 ° C και το DNA καθαρίζεται. Απομονωμένα DNA ποσοτικοποιήθηκε με ημι-ποσοτική PCR λογαριθμικής φάσεως και αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης σε ρυθμιστικό ΤΑΕ. Η προς τα εμπρός (F) και αντίστροφη (R) εκκινητές ήταν: ARS-F, 5′-GCTGCTAAAGACTCGGAGGA-3 ‘? ARS-R, 5’-CTGAGAGTAGCCGACTGAGG-3 ‘? Sp1-3-F, 5’-CCCGAGTTTGCAGAGAGGTA-3 ‘και vect-R, 5′-TCTTCCATGGTGGCTTTACC-3’.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών στα σύνολα δεδομένων του DNA :. σχηματισμού συμπλόκου πρωτεΐνης σε πειράματα EMSA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ΑΝΟνΑ και αντιστοιχισμένο t-test ανάλυση διακύμανσης χρησιμοποιήθηκε για όλες τις άλλες συγκρίσεις μεταξύ των συμπληρωματικών στοιχείων

Αποτελέσματα

Το ανθρώπινο γονίδιο AR 5 ‘ UTR περιέχει δύο περιοχές με επικαλυπτόμενες ρυθμιστικά στοιχεία

Εξέταση του ανθρώπινου γονιδίου AR που κωδικοποιεί την περιοχή 5’UTR του μεταγραφήματος (Σχήμα 1Α) απεκάλυψε ένα πιθανό Sp1 δέσμευσης κουτί GC (328 να +332 bp), ότι βρέθηκε να βρίσκονται εντός της αλληλουχίας που περιγράφηκε προηγουμένως ανδρογόνων υποδοχέων Suppressor (ARS) [35] (Εικόνα 1Β). Το πρώτο παράδειγμα μιας ARS ρυθμιστικού στοιχείου που μπορεί να δεσμεύει την πανταχού εκφραζόμενη πρωτεΐνη PUR-α περιγράφηκε στο γονίδιο AR 5’UTR ποντίκι πάνω από 400 bp καθοδικά από την αντίστοιχη ανθρώπινη αλληλουχία [40]. Επειδή και τα δύο κουτιά GC και sites ARS έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε GC, η πιθανότητα άλλα παραδείγματα αυτών των δύο ρυθμιστικών στοιχείων σωρεύσεως διερευνήθηκε περαιτέρω. Αν και δέσμευση του pur-α είναι αλληλουχία ειδική με προτίμηση επαναλήψεις (GGN), δεν υπάρχει σαφής αλληλουχία αναγνώρισης συναίνεση, ως εκ τούτου, η περιοχή του ARS ποντικού προστατευμένο από την πέψη ϋΝάσης Ι χρησιμοποιήθηκε για την αναζήτηση άλλων πιθανών θέσεων στην ανθρώπινο 5’UTR. Μία περιοχή της ανθρώπινης 5’UTR, περιφερικά προς την αλληλουχία ARS, κατέχοντας το 85% ταυτότητα ανιχνεύθηκε (Σχήμα 1 C) η οποία είναι μεγαλύτερη από την ταυτότητα του 70% που παρατηρείται με τον ίδιο ανιχνευτή και των καθιερωμένων ανθρώπινη ARS (S1A Εικ). Χρήση της ARS αλληλουχία ορίζεται ποντικού [41] παρήγαγε ένα παρόμοιο εύρημα με 75% ταυτότητα που, πάλι, ήταν μεγαλύτερη από την αξία του 67% για τα ανθρώπινα ARS (S1B και S1c σχήμα) αντίστοιχα. Η πιθανή περιοχή μυθιστόρημα καταστολέα επικαλύπτονται το Sp1-3 ρυθμιστικό στοιχείο που είναι γνωστό ότι φιλοξενούν δύο ενεργά κουτιά GC [29]. Αυτό εγείρει την ενδιαφέρουσα πιθανότητα ότι αυτές οι δύο περιοχές μπορούν να δράσουν είτε διεγείρουν ή μειώνουν την έκφραση AR.

(Α) Σχηματική απεικόνιση του ανθρώπινου γονιδίου AR 5’UTR και άμεση εγγύς υποκινητή που δείχνει τα κύρια ρυθμιστικά στοιχεία και τις περιοχές υπό μελέτη. Bent βέλος δείχνει την θέση έναρξης της μεταγραφής (+1) και ATG με στερεά βέλη δείχνουν την έναρξη της μετάφρασης. (Β) Πιθανή κουτί GC (πράσινη διακεκομμένη κουτί) εντός του ρυθμιστικού στοιχείου επιβεβαιωμένο ανθρώπινο ARS (μπλε υπογραμμισμένο). (C) Ευθυγράμμιση του ανθρώπινου 5’UTR AR και το ποντίκι AR 5’UTR στοιχείο καταστολέα που προστατεύονται από την πέψη ϋΝάσης Ι [40] (μπλε υπογραμμισμένο) με τις επιβεβαιωμένο ανθρώπινο κουτιά GC (πράσινο στερεό κιβώτιο). Οι ομόλογες αλληλουχίες υποδεικνύονται με κάθετες γραμμές.

Η

Πολλαπλές στοιχίσεις των ισοδύναμων περιοχές του γονιδίου AR 5’UTR άνθρωπο σε 11 άλλα είδη χρησιμοποιώντας δημοσίως διαθέσιμες αλληλουχίες DNA (Εικόνα 2) έδειξαν ότι αμφότερες οι αλληλουχίες είναι ελάχιστα συντηρημένα. Η περιοχή ARS είναι παρούσα μόνο σε πρωτεύοντα και η αλληλουχία στον χιμπατζή, η οποία αποκλίνει από τον άνθρωπο πριν 6,6 εκατομμύριο έτη [42], έχει τέλεια ομολογία με την ανθρώπινη. Επιπλέον, και πέρα ​​από την έκταση 42,2 εκατομμύριο χρόνια από την απόκλιση των ανθρώπων και marmoset, το πιο αποκλινόντων πρωτευόντων που εξετάστηκαν, η πλειονότητα των αλληλουχιών δείχνουν μόνο λίγες υποκαταστάσεις νουκλεοτιδίων. Η περιοχή Sp1-3 εμφανίζεται ακόμη λιγότερο ομολογία μόνο με χιμπατζή που μοιράζονται δύο κουτιά GC με τους ανθρώπους. Και για τις δύο περιοχές ενδιαφέροντος, μη πρωτεύοντα είδη κατείχε πολύ χαμηλά επίπεδα ομολογίας με την ανθρώπινη, και δεν ισοδύναμες αλληλουχίες βρέθηκαν στην γρίπη ή piscine ειδών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, το ποντίκι ARS περιοχή είναι εξαιρετικά φτωχά συντηρημένη και καμία αλληλουχία δέσμευσης PUR-α έχει βρεθεί στην ισοδύναμη γονιδιωματική περιοχή των άλλων ζώων, συμπεριλαμβανομένου του συνδέονται στενά τρωκτικό? ο αρουραίος (S2 Εικ).

Οι περιοχές του γονιδίου 5’UTR Har υπό έρευνα συγκρίθηκαν με εκείνες των υποδεικνυόμενων πλακούντα είδη. (Α) οι ARS (blue box), και (Β) η Sp1-3 ρυθμιστικό στοιχείο (πράσινο κουτί). Οι διαφορές από την ανθρώπινη αλληλουχία που υποδεικνύεται από τολμηρή, υπογράμμισε γραμματοσειρά.

Η

Το κουτί GC είναι η κύρια θέση δέσμευσης Sp1 στην AR υποστηρικτής των ανθρωπίνων

Τα αρχικά πειράματα εξετάστηκε η επίδραση του Sp1 ανταγωνιστής, μιθραμυκίνη Α, επί του ενδογενούς γονιδίου AR σε κύτταρα LNCaP. Ένα μιθραμυκίνη Παρατηρήθηκε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση της δόσης σε επίπεδα πρωτεΐνης AR (Σχήμα 3Α) με συγκέντρωση 50 ηΜ μιθραμυκίνη Α που χρησιμοποιείται σε μετέπειτα πειράματα. μελέτες RT-PCR επιβεβαίωσε ότι η μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης AR συσχετίζεται με μειωμένη μεταγραφή (Σχήμα 3Β).

LNCaP κύτταρα επωάστηκαν με μιθραμυκίνη Α για 24 ώρες και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν. (Α) ανάλυση κηλίδας Western με τις σχετικές τιμές του AR /GAPDH φαίνεται παρακάτω. (Β) RT-PCR του AR και GAPDH mRNA. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με phAR1.6Luc (WT) ή phAR1.6Luc-ΔCG και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή 50 ηΜ μιθραμυκίνη Α για 24 ώρες και η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα και τη στατιστική σημασία των υποδεικνυόμενων συγκρίσεων είναι: * ρ ​​& lt? 0,05? ** P & lt? 0,01 και *** ρ & lt?. 0.001

Η

Αν και έχει από καιρό έκρινε ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Sp1 είναι η βασική κινητήρια δύναμη της έκφρασης του γονιδίου της ανθρώπινης AR box-λείπει ΤΑΤΑ, η σχετική σημασία του πλαισίου GC (Sp1-1? -45 έως -40 bp) στον πυρήνα υποκινητή παραμένει ασαφές με μελέτες διαγραφή γεγονός που υποδηλώνει ότι είτε είναι απαραίτητο [27], ή δεν παίζει σημαντικό ρόλο [43]. Μετάλλαξη του κουτιού GC στο πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης phAR1.6Luc [34] που περιέχει ένα τμήμα 1,6 kbp του υποκινητή Har και 5’ΙΙΤΚ μεταξύ των θέσεων -741 bp έως 842 bp οδήγησε σε μείωση 80% στην έκφραση λουσιφεράσης σε επιμολυσμένα ανδρογόνο ανταποκρινόμενα κύτταρα LNCaP (Σχήμα 3C). Παρομοίως, μια μείωση 46% παρατηρήθηκε με το ανδρογόνο δεν αποκρίνονται προστάτη κυτταρική γραμμή DU145 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μαζί, αυτές οι αναλύσεις έδειξαν ότι το πλαίσιο GC υποκινητή πυρήνα, και Sp1 δεσμευτική, διαδραματίζουν εξέχοντα ρόλο στην έκφραση του AR mRNA και πρωτεΐνης. Είναι σημαντικό ότι, το μεταλλαγμένο πλασμίδιο αναφοράς παρέμεινε ευαίσθητες σε αναστολή από μιθραμυκίνη Α (Σχήμα 3C), επιβεβαιώνοντας έτσι ότι το Sp1 μεσολάβηση προς τα πάνω ρύθμιση του γονιδίου AR εμφανίζεται σε θέσεις άλλες από το κουτί GC.

Η 5’UTR επικαλυπτόμενων ρυθμιστικών στοιχεία μπορούν προηγούμενους ή ρυθμίζουν προς τα κάτω δράση προαγωγού

για να διευκρινιστεί η λειτουργική δραστηριότητα των άλλων πιθανών ρυθμιστικών στοιχείων υπό μελέτη, περαιτέρω μεταλλάξεις εισήχθησαν στο πλασμίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης phAR1.6Luc. Πειράματα επιμόλυνσης πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση τόσο των ανδρογόνων ανταποκρίνεται, LNCaP και δεν ανταποκρίνονται, κυτταρικές γραμμές DU145 PCa, που καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο για να εξασφαλιστεί ότι όλα κύτταρο οδούς που εξαρτώνται από τα συστατικά μέσα (παράγοντες ανάπτυξης και ορμόνες) σηματοδότησης, ήταν λειτουργικά.

για να καθοριστεί ο ρόλος της δέσμευσης Sp1 στο δυναμικό κουτί GC στις ARS (322 – 345 στο 5’UTR), υποκαταστάσεις βάσεων εισήχθησαν για να δημιουργήσετε ρεπόρτερ phAR1.6Luc-UTRm1 που είχε ως αποτέλεσμα μειώσεις της έκφρασης των 29% και 13% σε DU145 και LNCaP κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 4Α και 4Β) επιβεβαιώνοντας ενεργό ρόλο για αυτό το μυθιστόρημα κουτί GC στην προς τα πάνω ρύθμιση έκφρασης AR. Αντιστρόφως, η περιοχή αυτή του 5’UTR έχει δειχθεί ότι δρα ως αρνητικού ρυθμιστικού στοιχείου, μέσω της σύνδεσης του παράγοντα μεταγραφής PUR-α που έχει αναφερθεί να διαταραχθεί υπό συνθήκες EMSA με την συμπερίληψη ενός ζεύγους υποκαταστάσεων δύο βάσεων [35] και αυτά χρησιμοποιούνται για την παρασκευή ρεπόρτερ phAR1.6Luc-UTRm2. Ωστόσο, η χρήση αυτή ρεπόρτερ μεταγραφική δραστηριότητα μειώθηκε κατά 36% και 20% σε DU145 και LNCaP αντίστοιχα αντί αυξημένη (Σχήμα 4Β), όπως θα μπορούσε να προβλεφθεί κατά την απελευθέρωση ενός αναστολέα. Επιθεώρηση των αλλαγών αλληλουχίας που παράγεται από τη μετάλλαξη αποκαλύπτει ότι η γουανίνη και cyctosine στο κέντρο του υποτιθέμενου κουτί GC αντικαταστάθηκαν από αδενίνη κατά τρόπο ανάλογο προς το Sp1-ειδική μετάλλαξη σε phAR1.6Luc-UTRm1. Ως εκ τούτου, η απώλεια της δέσμευσης Sp1 σε αυτό το ρυθμιστικό στοιχείο είναι το κυρίαρχο αποτέλεσμα, παρέχοντας περαιτέρω ενδείξεις ότι η υποτιθέμενη κουτί GC μπορεί να ρυθμίζουν προς τα πάνω ενεργά έκφραση AR. Στην πιθανότητα ότι η μετάλλαξη υποκατάσταση της περιοχής ARS ήταν ανεπαρκής για την πρόληψη PUR-α και hnRNP-K πρόσδεσης κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, το σύνολο ρυθμιστικό στοιχείο διαγράφηκε για να δημιουργήσει phAR1.6Luc-UTRΔm1. Σε αυτήν την περίπτωση, η δραστικότητα προαγωγέα ρυθμίζεται αυξητικά από 1,27 και 1,67 φορές σε DU145 και LNCaP αντίστοιχα (Σχήμα 4Β) με τη διαφορά μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών που είναι σημαντική (ρ & lt? 0,01).

(Α) Σχηματικό διάγραμμα η λουσιφεράσης κατασκεύασμα ανταποκριτή phAR1.6Luc οδηγείται από 1,6 kbp του υποκινητή Har και 5’ΙΙΤΚ με δεσμευτική δυναμικό παράγοντα μεταγραφής στις περιοχές ενδιαφέροντος. Sp1-3 περιέχει δύο θέσεις δέσμευσης Sp1. Τα υποδεικνυόμενα κυτταρικές σειρές προστάτη (Β και Γ), καλλιεργούνται σε πλήρες μέσο, ​​επιμολύνθηκαν είτε με phAR1.6Luc που περιέχει την αλληλουχία WT (μαύρες μπάρες) ή την μεταλλαγμένη εκδοχή (γκρίζες ράβδοι) που δείχνεται πάνω από κάθε διάγραμμα. Λουσιφεράσης δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα και τη στατιστική σημασία των υποδεικνυόμενων συγκρίσεων είναι: * ρ ​​& lt? 0,05? ** P & lt? 0,01 και *** ρ & lt?. 0.001

Η

Ανάλογες μεταλλάξεις εισήχθησαν επίσης στο τρίτο ρυθμιστική αλληλουχία ενδιαφέροντος (423-446). Πρώτον, οι δύο κουτιά GC στο Sp1-3 μεταλλάχθηκαν είτε ατομικά (phAR1.6Luc-UTRm3 και phAR1.6Luc-UTRm4) ή μαζί (phAR1.6Luc-UTRm5). Η δραστικότητα λουσιφεράσης αποκάλυψε ότι η διάσπαση των κιβωτίων GC είχε ως αποτέλεσμα σημαντικές μειώσεις στην διέγερση προαγωγού. Οι δύο μονές μεταλλάξεις μειωμένη μεταγραφική δραστηριότητα κατά 42% και 29% σε κύτταρα DU145 και κατά 29% και 17% σε κύτταρα LNCaP, και τα διπλά μειώσεις μετάλλαξη εμφανίζεται από το 34% και 16% στις δύο κυτταρικές σειρές, αντίστοιχα (Σχήμα 4C). Και πάλι, οι μειώσεις στην δραστικότητα προαγωγέα ήταν μεγαλύτερες σε DU145 από LNCaP. Οι επιδράσεις των μεταλλάξεων δεν ήταν αθροιστικές όπως θα ήταν αναμενόμενο από δύο επικαλυπτόμενες θέσεις πρόσδεσης. Με τρόπο παρόμοιο με αυτόν που παρατηρείται με το +322 να +345 περιοχή, η μετάλλαξη υποκαταστάσεως βάσεως του δυναμικού επικαλυπτόμενες αρνητικό ρυθμιστικό στοιχείο σε phAR1.6Luc-UTRm6 παράγεται απώλειες μεταγραφικής δραστικότητας του 9% και 4% στις DU145 και LNCaP αντίστοιχα (Εικ 4C). Αυτές οι τιμές ήταν λιγότερο εκείνα που παρατηρήθηκαν με το 322-345 περιοχή που περιγράφεται παραπάνω, ωστόσο, ότι ήταν συνεπής με την ακολουθία που αλλάζει με μικρή μόνο επίπτωση στις θέσεις δέσμευσης Sp1. Η διαγραφή ολόκληρης της πιθανών αρνητικών ρυθμιστικό στοιχείο σε phAR1.6Luc-UTRΔm2 οδήγησε σε 1,18 και 1,50 φορές προς τα πάνω ρύθμιση μεταγραφικής δραστικότητας σε DU145 και LNCaP αντίστοιχα (Σχήμα 4C). Όπως και με την μετάλλαξη εξάλειψης phAR1.6Luc-UTRΔm1, η αύξηση της δραστηριότητας προαγωγέα ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε LNCaP από DU145.

Τα χαρακτηριστικά δέσμευσης του 5’UTR επικαλυπτόμενων ρυθμιστικών στοιχείων

Η πιθανότητα ότι Sp1 δεσμεύεται σε όλες τις τρεις περιοχές υπό μελέτη εξετάστηκε με δοκιμασίες μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSAs). Σε αρχικά πειράματα, η καθαρισμένη ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη Sp1 επωάστηκε με τα επισημασμένα ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές που περιέχουν είτε το πρωτεύον κουτί GC (Sp1-1), το δυναμικό νέα θέση δέσμευσης Sp1 στην περιοχή ARS ή Sp1-3. Ηλεκτροφορητική ανάλυση των προϊόντων που προκύπτουν με τις τρεις σημασμένους ανιχνευτές έδειξε απλή υψηλού μοριακού βάρους DNA:. Πρωτεϊνικό σύμπλοκο κοντά στην κορυφή της γέλης (Σχήμα 5Α, λωρίδες 2-4) σύμφωνο με Sp1 που έχει μοριακό βάρος 95 kDa

η καθαρισμένη πρωτεΐνη Sp1 (πίνακας Α) ή πυρηνικό εκχύλισμα από κύτταρα DU145 (πάνελ (Β) έως (D)) επωάστηκαν με τα επισημασμένα ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές υποδεικνύονται κάτω από κάθε πήκτωμα και τα προϊόντα επιλύονται με ανάλυση μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας. Οι προσθήκες φαίνονται πάνω από τις γέλες και ήταν: Ab, αντίσωμα? ΡΙ, προ-άνοσο ορό? Mith, μιθραμυκίνη? Sp1 μειονεκτήματα, συναίνεση Sp1 ολιγονουκλεοτιδίων. Οι ανταγωνιστικές μη επισημασμένο ολιγονουκλεοτίδια (100 φορές μοριακή περίσσεια) ή άνοσοι οροί προστέθηκαν πριν την προσθήκη του ανιχνευτή. EMSAs είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. (Α) Τα αναφερόμενα σημασμένοι ανιχνευτές επωάζονται με καθαρισμένη πρωτεΐνη Sp1 εκτός λωρίδα 1, η οποία δεν είχε καμία προσθήκη. Μαύρο βέλος δείχνει τη σύνθετη Sp1-DNA. (Β) Αντι-Sp1 αντίσωμα προστέθηκε όπως υποδεικνύεται, και το σύμπλοκο απουσιάζει μετά από επώαση με αντίσωμα υποδεικνύεται από το βέλος. (Γ) Μιθραμυκίνη (120 ηΜ) προστέθηκε σε υποδεικνύεται λωρίδες και το σύμπλοκο εξαντληθεί μετά από επώαση με το φάρμακο υποδεικνύεται από το στερεό βέλος. (Δ) Η μη σημασμένη ανταγωνιστικά θέση δέσμευσης ολιγονουκλεοτιδίου που κωδικοποιεί Sp1 συναίνεση προστέθηκε όπως δείχνεται.

Η

Η επώαση του πυρηνικού εκχυλίσματος που παρασκευάζεται από την κυτταρική γραμμή καρκίνου του προστάτη DU145 είτε με Sp1-1, ARS ή Sp1-3 ολιγονουκλεοτίδια που παράγονται διάφορες ζώνες με σχεδόν ταυτόσημη ηλεκτροφορητική motilities (Σχήμα 5Β, λωρίδες 1, 4 και 6 αντίστοιχα). Η πρόσδεση του Sp1 επιβεβαιώθηκε σε όλες τις περιπτώσεις με την προσθήκη αντι-Sp1 αντίσωμα το οποίο παρήγαγε ένα υπερμετατόπισης με το ολιγονουκλεοτίδιο Sp1-1 και πολύ μειωμένη συναρμολόγηση ενός υψηλού μοριακού βάρους DNA: σύμπλοκο πρωτεΐνης με δύο ARS και Sp1-3 (Σχήμα 5Β , λωρίδες 2, 5 και 7 αντίστοιχα), ενώ προάνοσο ορό δεν είχε καμία επίδραση (Σχήμα 5Β, λωρίδα 3). Διαφορετικά αποτελέσματα από επώαση με αντίσωμα αντι-παράγοντα μεταγραφής μπορεί να συμβεί σε EMSA αναλύσεις π.χ. CREB-1 σε δικτυακούς τόπους CRE στα ανθρώπινη ινσουλίνη και σωματοστατίνη υποκινητές [44], οφείλεται σε διάφορους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων: τη δύναμη της πρόσδεσης στο DNA? η χωρική /διαμορφωτική οργάνωση της πρωτεΐνης επί ρυθμιστικά στοιχεία, ο προσανατολισμός του DNA δίπλα στο συναίνεση και την παρουσία του δεσμευμένου συμπαράγοντες.

Η προσθήκη μιθραμυκίνη Α, το οποίο παρεμβάλλεται στην δέσμευση του Sp1 να ρυθμιστικού στοιχείου του [45 ], σημαντικά μειωμένο σχηματισμό των συμπλοκών υψηλού μοριακού βάρους και με τα τρία ολιγονουκλεοτίδια (Σχ 5C, σύγκρινε λωρίδες 1 και 2, 3 και 4, και 5 και 6). Ομοίως, προεπώαση με περίσσεια μη επισημασμένου ολιγονουκλεοτιδίου που περιέχει την αλληλουχία συναίνεσης δέσμευσης Sp1 σχεδόν εξαλειφθεί όλη DNA: πρωτεΐνη σχηματισμό συμπλόκου (Σχήμα 5D, σύγκρινε λωρίδες 1 και 2, 3 και 4, και 5 και 6). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν πρόσδεση του Sp1 σε όλες τις ακολουθίες κουτί που περιέχει τρία GC, υποστηρίζοντας τα συμπεράσματα από τα πειράματα του γονιδίου αναφοράς (Σχήμα 4). Περαιτέρω, η διαφορά στα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν με τα ολιγονουκλεοτίδια για την τοποθεσία Sp1-1 στον πυρήνα υποκινητή σε σύγκριση με τις ARS και τοποθεσίες Sp1-3, η οποία εμφανίζεται φαινομενική χαμηλότερη συγγένεια για το φυσικό Sp1, διαφορετικά αποτελέσματα κατά την επώαση με αντι-Sp1 αντίσωμα και χαμηλότερες μετάλλαξη που προκαλείται από τη μείωση σε δοκιμασίες λουσιφεράσης (Σχήμα 4), πρότεινε ότι η δέσμευση του Sp1 στον πυρήνα κουτί GC υποστηρικτής ήταν ισχυρότερη από ό, τι στο 5’UTR.

Η μεταγραφή παράγοντας PUR-α συνδέεται κατά προτίμηση με guanine- πλούσια μονόκλωνο DNA ή οι ισοδύναμες αλληλουχίες σε δίκλωνο DNA. Η επώαση του πυρηνικού εκχυλίσματος είτε με το δίκλωνο ή η G-πλούσιο και μόνο αντίστροφη σκέλος του ARS και Sp1-3 ανιχνευτές απέδωσε αρκετά ανόμοια αποτελέσματα. Και οι δύο ανιχνευτές κλώνου ενιαία παρήγαγε ένα DNA: σύμπλοκο πρωτεΐνης (συμβολίζεται με ανοιχτό βέλος) που μετανάστευσαν ελαφρώς μπροστά από Sp1: DNA και άλλα σύμπλοκα υψηλού μοριακού βάρους που συνήθως παρατηρούνται με το λανθάνον καθετήρα διπλού (Σχήμα 6Α). Σε συμφωνία με την ικανότητα του PUR-α να δεσμεύει επίσης dsDNA, τόσο οι ARS και Sp1-3 δίκλωνο ολιγονουκλεοτίδια παρήγαγε ένα αχνό DNA: σύμπλοκο πρωτεΐνης που μετανάστευσαν σε μια πολύ παρόμοια θέση με το προϊόν που παρατηρείται με τα λανθάνον ανιχνευτές ενιαία. Είναι σημαντικό ότι το DNA: σύμπλοκο πρωτεΐνης που σχηματίζεται με τον G-πλούσιο κλώνο Sp1-3 συμπεριφέρθηκε με τον ίδιο τρόπο με εκείνο της ισοδύναμης ARS ολιγονουκλεοτίδιο το οποίο είναι γνωστό ότι συνδέεται PUR-α [36]. Είναι ενδιαφέρον ότι, PUR-α δεσμεύει DNA ως διμερή και πολυμερή [46], το οποίο θα επιβιώσουν οι μη μετουσιωτικές συνθήκες EMSA με αποτέλεσμα τα προφανή χαρακτηριστικά υψηλής μοριακού μετανάστευση βάρος των DNA: πρωτεϊνικών συμπλοκών. Το εμπορικό αντίσωμα αντι-PUR-α απέτυχε να προκαλέσει ένα αποτέλεσμα και η καθαρισμένη πρωτεΐνη δεν είναι διαθέσιμο. Παρ ‘όλα αυτά, οι συμπληρωματικές κυτοσίνη πλούσια κλώνους εμπρός του ARS και Sp1-3 ολιγονουκλεοτίδια απέτυχε πλήρως να παραχθεί το DNA: σύμπλοκο πρωτεΐνης επιβεβαιώνοντας την ειδικότητα σύνδεσης προς την G-πλούσιο κλώνου (Σχήμα 6Β? Σύγκρινε λωρίδες 1 και 7, και 4 και 8).

Πυρηνικό εκχύλισμα από κύτταρα DU145 επωάστηκαν με τα επισημασμένα ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές υποδεικνύονται κάτω από κάθε πήκτωμα και τα προϊόντα επιλύονται με ανάλυση μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας. Οι προσθήκες φαίνονται πάνω από τις γέλες και ήταν: Ab, αντίσωμα? ΡΙ, προ-άνοσο ορό. EMSAs είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. (ΣΙ). (ΝΤΟ).