Αφηρημένο

Ιστορικό

Η γυμνή mole-αρουραίου (NMR) είναι ένα μακράς διάρκειας ζωής και του καρκίνου ανθεκτικά είδη. Προσδιορισμός των πιθανών αντι-καρκίνου και των μηχανισμών που σχετίζονται με την ηλικία έχει μεγάλο ενδιαφέρον και να κάνει αυτό το είδος επιφανείς να διερευνήσει στρατηγικές για την καταπολέμηση του καρκίνου και την κατανόηση μηχανισμών γήρανσης. Εφόσον είναι γνωστό ότι η NMR εκφράζει υψηλότερα mRNA επίπεδα των ηπατικών-άλφα 2-μακροσφαιρίνη από τα ποντίκια, τίποτα δεν είναι γνωστό σχετικά με το επίπεδο δομή, τη λειτουργικότητα ή την έκφραση του στο NMR σε σύγκριση με την ανθρώπινη A2m.

Αποτελέσματα

Εδώ μπορούμε να δείξουμε μια ολοκληρωμένη ανάλυση των ΝΜΚ και ανθρώπινο πλάσμα A2m, δείχνει μια διαφορετική πρόβλεψη στην γλυκοζυλίωση των NMR-A2m, η οποία οδηγεί σε ένα μεγαλύτερο μοριακό βάρος σε σύγκριση με την ανθρώπινη A2m. Επιπλέον, βρήκαμε μία υψηλότερη συγκέντρωση A2m (8,3 ± 0,44 mg /mL

vs

. Και 4.4 ± 0.20 mg /mL) και ένα κατώτερο συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες του πλάσματος (38,7 ± 1,79 mg /mL

vs

. 61.7 ± 3.20 mg /mL) σε NMR σύγκριση με την ανθρώπινη. NMR-A2m μπορεί να μετασχηματιστεί με μεθυλαμίνη και θρυψίνη με αποτέλεσμα μια διαμορφωτική αλλαγή παρόμοια με την ανθρώπινη A2m. NMR-A2m είναι ανιχνεύσιμη με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα εναντίον ανθρώπινου A2m. Προσδιορισμός τρυπτικών και αντι-θρυπτικών δραστικότητα των NMR και ανθρώπινου πλάσματος απεκάλυψε μία υψηλότερη αντι-τρυπτικών δραστικότητα του πλάσματος NMR. Από την άλλη πλευρά, μικρότερη πρωτεολυτική δραστικότητα βρέθηκε στο πλάσμα σε σύγκριση με NMR ανθρώπινο πλάσμα.

Συμπέρασμα

Βρήκαμε μετασχηματισμένα NMR-A2m σύνδεσης σε ειδικούς LRP1 υποδοχέα της. Θα μπορούσαμε να αποδείξουν χαμηλότερη έκφραση πρωτεΐνης του LRP1 στο ήπαρ ιστό NMR σύγκριση με την ανθρώπινη, αλλά υψηλότερη έκφραση του A2m. Αυτό συνοδεύτηκε από μια υψηλότερη έκφραση πρωτεΐνης EpCAM ως κεντρικό μόριο προσκόλλησης σε εξέλιξη του καρκίνου. NMR πλάσματος ήταν ικανή να αυξήσει την προσκόλληση σε ανθρώπινων ινοβλαστών

in vitro

πιθανότατα με την αύξηση της έκφρασης της πρωτεΐνης CD29. Αυτή είναι η πρώτη έκθεση, αποδεικνύοντας ομοιότητες καθώς και σαφείς διαφορές μεταξύ A2m σε NMR και ανθρώπινο πλάσμα. Αυτό μπορεί να συνδέονται άμεσα με την ενδιαφέρουσα φαινότυπο του NMR και δείχνει ότι A2m μπορούσε ίσως να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην καταπολέμηση του καρκίνου και των μηχανισμών αντι-γήρανσης στο NMR

Παράθεση:. Thieme R, Kurz S, Kolb Μ, Debebe Τ, Holtze S, Morhart M, et al. (2015) Ανάλυση της Alpha-2 μακροσφαιρίνης από την μακρόβια και Καρκίνος-Resistant Γυμνή Mole-Rat και ανθρώπινο πλάσμα. PLoS ONE 10 (6): e0130470. doi: 10.1371 /journal.pone.0130470

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Klaus Roemer, του Πανεπιστημίου του Saarland Ιατρική Σχολή, Γερμανία

Ελήφθη: 10, Μαρτίου του 2015? Αποδεκτές: 20η Μαΐου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιουνίου, 2015

Copyright: © 2015 Thieme et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση: το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από το Europäischer Sozialfond – www.esf.de ΕΚΤ (100098250) για να GB.. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Ένωση Leibniz (SAW 2012) www.leibniz-gemeinschaft.de/να MP

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

Η γυμνή mole-αρουραίου (

Heterocephalus glaber

) (NMR) που ζουν στην Ανατολική Αφρική είναι ένα eusocial κτίριο αποικία θηλαστικό (O’Rianin et al. 2008 Οικολογία της κοινωνικής εξέλιξης). Με αυτόν τον τρόπο, eusociality εμφανίζεται συνήθως με έντομα όπως τα μυρμήγκια, μέλισσες, σφήκες, και άλλοι, το NMR είναι ένα από τα σπάνια γνωστά eusocial θηλαστικών-κυρίως περιγραφεί μέχρι στιγμής μόνο στην οικογένεια

Bathyergidae

. NMR έχει μερικά ασυνήθιστα χαρακτηριστικά σε σύγκριση με άλλα θηλαστικά. Το NMR είναι ένα πολύ μακρόβια είδη τρωκτικών, η οποία έχει διάρκεια ζωής πάνω από 30 χρόνια [1]. Αυτό υποδηλώνει συγκεκριμένους μηχανισμούς γήρανσης, τα οποία συνοδεύονται ή δυνητικά προκαλείται από την αντίσταση του καρκίνου. Μέχρι στιγμής, δεν όγκου παρατηρήθηκε ποτέ στις NMR [2]. Υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι η μακροζωία NMR διατηρείται κυρίως από την αντίσταση του καρκίνου, επειδή νεοπλασία είναι η κύρια αιτία θανάτου σε άλλα είδη θηλαστικών, όπως ποντικούς [3]. Υπάρχει μια αναδυόμενη ενδιαφέρον να ευθυγραμμίσουν τη μακροβιότητα και την αντοχή του καρκίνου με τον προσδιορισμό των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών για να κατανοήσουν τις πιο συναρπαστικές και έκτακτες NMR φαινοτύπων.

Προηγουμένως, μια χούφτα άρθρα είχε δημοσιευθεί, δίνοντας συμβουλές και δοκιμές για να εξηγήσει οι μηχανισμοί αυτοί στο NMR [4-8]. Με αυτόν τον τρόπο οι κοινωνικές και βιολογικές /βιοχημικές λειτουργίες προσαγωγή. Από κοινωνική άποψη, η eusocial τρόπος ζωής με ένα συνεταιρισμό φροντίδα των απογόνων και των γενεών διάδοση των δεξιοτήτων [2], καθώς ζουν σε μια ομάδα που συνδέεται ευρέως με μεγαλύτερη διάρκεια ζωής [9]. Ένας άλλος υγεία υποστηρίζοντας επίδραση αυτή σχετίζεται με το υπόγειο ζωή. Αυτά τα ζώα προστατεύονται από τις ακραίες κλιματικές συνθήκες και τα αρπακτικά ζώα, που ευνοεί την μακροζωία και ένα χαμηλότερο ποσοστό θνησιμότητας [2, 10]. Στο κυτταρικό και βιοχημικό επίπεδο NMR παρουσιάζουν πολλά μοναδικά χαρακτηριστικά αντινεοπλασματική σαν αργή κυτταρική ανάπτυξη, την αποτελεσματική αναστολή επαφής, σχηματισμό υψηλού μοριακού μάζα υαλουρονάνη και βελτιστοποιημένη σύνθεση των πρωτεϊνών [11].

Άλφα-2 μακροσφαιρίνη ( A2m) είναι μια σημαντική εξωκυττάρια πρωτεΐνη στο αίμα. Πρόσφατα, τα επίπεδα μεταγραφής A2m δείχθηκαν να αυξηθεί στο ήπαρ NMR σε σύγκριση με εκείνη των ποντικών με 140-πλάσια [12]. Μέχρι στιγμής, NMR-A2m πρωτεΐνη δεν χαρακτηρίζονται περαιτέρω. ανθρώπινο ομόλογό του είναι μια ομοτετραμερείς πρωτεΐνη 720 kDa που παίζουν ένα ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης των κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων [13]. Η λειτουργία του A2m στον άνθρωπο είναι εν μέρει διαφορετική σε σύγκριση με τα τρωκτικά (π.χ. ποντικούς, αρουραίους και κουνέλια), όπου A2m είναι μια σημαντική πρωτεΐνη οξείας φάσης [14]. Σε γενικές γραμμές, A2Ms από διαφορετικά είδη είναι πολύ καλά περιγραφεί και εν συντομία χαρακτηρίζονται με ανασκόπηση από Sottrup-Jensen [15]. Ανθρώπινη A2m είναι σε θέση να δεσμεύσει ένα πολύ ευρύ φάσμα των κυτοκινών, αυξητικών παραγόντων, ειδικά ΤΟΡ-SS1, TNF-α και IL-1β και ορμόνες [16-18]. Μια άλλη σημαντική λειτουργία είναι η ικανότητα να αδρανοποιούν μια μεγάλη ποικιλία πρωτεϊνασών, όπως θρυψίνη, χυμοθρυψίνη, ελαστάση ή μεταλλοπρωτεϊνασών. Κατά την δέσμευση του πρωτεϊνασών, A2m υπόκειται σε σημαντική διαμορφωτική αλλαγή, η οποία οδηγεί στην έκφραση προηγουμένως κρυφές θέσεις σύνδεσης υποδοχέα στην επιφάνειά του. Αυτό επιτρέπει τη λεγόμενη «μετασχηματισμένο A2m» (A2m *) να συνδέονται με ειδικό υποδοχέα του, που ονομάζεται LRP1 (CD91) [19, 20]. Η πρόσδεση του LRP1 επάγει τη μεσολάβηση υποδοχέα ταχεία εκκαθάριση των A2m-πρωτεϊνάσης-σύμπλοκα από το αίμα και τους ιστούς [21]. Άλλες πρωτεΐνες όπως αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες δεσμεύονται αναστρέψιμα στο A2m. Με αυτόν τον τρόπο, A2m εκπληρώνει σημαντικές λειτουργίες όσον αφορά την ομοιοστασία των ιστών αυτών των μορίων [22, 23].

A2m προτείνεται να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στον καρκίνο και τη γήρανση [24, 25]. Το ανθρώπινο αίμα συγκέντρωση A2m συσχετίζεται αρνητικά με την ηλικία, μειώνοντας από περίπου 4 mg /mL κατά τη γέννηση έως 1,5 mg /mL στους ηλικιωμένους [26]. Ως εκ τούτου, η λειτουργία του στην ομοιόσταση του αίματος και ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία έχουν μεγάλη κλινική και γηριατρική ενδιαφέροντος. Βασικούς παράγοντες που ευθύνονται για την κακοήθεια περιλαμβάνουν συμφύσεις επίσης μόρια. Εφόσον είναι γνωστό ότι η NMR είναι ανθεκτικός καρκίνος, αυτά είναι από επιζήμιες ενδιαφέρον και μια βαθύτερη ανάλυση του μορίου προσκόλλησης έκφρασης και λειτουργίας του NMR είναι δικαιολογημένη. Για παράδειγμα, το επίπεδο μεταγραφής του επιθηλιακού EpCAM μορίου προσκόλλησης βρέθηκε να αυξηθεί στο ήπαρ NMR με 290fold σύγκριση με τα ποντίκια, το οποίο παρέχει ισχυρή απόδειξη, ότι κύτταρο συνοχή και η ακεραιότητα επηρεάζεται από την έκφραση των μορίων προσκόλλησης [12].

στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε A2m πλάσμα από NMR σε σύγκριση με το ανθρώπινο ομόλογο του. Για πρώτη φορά θα μπορούσαμε να δείξουμε ένα αυξημένο επίπεδο πρωτεΐνης πλάσματος του NMR-A2m και τις ομοιότητες όσο και διακριτές διαφορές της μοριακής δομής και της λειτουργίας σε σύγκριση με την ανθρώπινη A2m. Επιπλέον, βρήκαμε αναπάντεχα πλάσμα NMR για την αύξηση της κυτταρικής πρόσφυσης σε ανθρώπινους ινοβλάστες. Επιπλέον, περιγράψαμε και σχολιάζονται από NMR A2m ανάλογα με την ανθρώπινη-A2m πρωτεΐνη με μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και θα μπορούσε να εντοπίσει ομοιότητες και τις διαφορές, πράγμα που θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα ρόλο στην NMR που σχετίζονται με ιδιαιτερότητες.

Αποτελέσματα

στην ακολουθία silico αναλύσεις

Ψάχνοντας για αλληλουχίες NMR-A2m στις σχετικές βάσεις δεδομένων οδήγησε σε δύο διαθέσιμες ακολουθίες mRNA. Η πρώτη (Ref.Seq .: NM_001279851.1? UniProt: E3VX34_HETGA) περιγράφηκε από Szafranski et al. (Καταχώρηση στη βάση δεδομένων) και ένα δεύτερο είχε προβλεφθεί από γονιδιωματική αλληλούχιση του γονιδιώματος NMR (GenBank: JH171302.1? UniProt: G5BPM1_HETGA) [27]. Μόνο η μεταγραφή του NMR-A2m είχαν επαληθευθεί και περιγραφεί μέχρι τώρα. Η ύπαρξη της πρωτείνης NMR-A2m είχε προβλεφθεί μόνο. Η αλληλουχία του NMR-A2m απέδωσε 1.475 (UniProt: E3VX34_HETGA) και 1595 [27] αμινοξέα, αντίστοιχα, με αποτέλεσμα μια υπολογισμένη μοριακή μάζα των 162.519 kDa και 175.364 kDa, αντίστοιχα. Συγκρίνοντας αυτά τα ευρήματα με την ανθρώπινη αλληλουχία A2m, την αλληλουχία NMR περιγράφεται από Szafranski et al. (2010) είναι περισσότερο όμοια από εκείνη των Kim et al. (2011). Επομένως, όλες οι ακόλουθες αναλύσεις έγιναν με το περισσότερο παρόμοια ακολουθία NMR-A2m σε σύγκριση με την ανθρώπινη ένα (UniProt: E3VX34). (Πίνακας 1)

Η

NMR-A2m έχει συνολικό ταυτότητα mRNA του 85% και μια ομοιότητα για την πρωτεϊνική αλληλουχία του 98% για την ανθρώπινη A2m. Η φυλογενετική ανάλυση με ClustalW2 οδήγησε σε μια στενή σχέση του NMR-A2m να mole αρουραίο Ansell και ινδικού χοιριδίου A2m (Σχήμα 1).

Το ανθρώπινο A2m καθώς και η NMR-A2m έχουν μια πεπτιδική αλληλουχία σηματοδότησης (αα θέση 1-23) στο Ν-τελικό άκρο, η οποία σχολιάζονται με ομοιότητα. Η περιοχή δόλωμα, το οποίο είναι ένα σήμα κατατεθέν των A2m σε όλα τα είδη, βρίσκεται στη NMR στη θέση 688 έως 738. Περιλαμβάνει τρία θρυψίνη θέσεις διάσπασης στο αργινίνης είναι 703, 711 και 729 (Πίνακας 2). Η ανάλυση των θέσεων Ν-γλυκοζυλίωσης οδήγησε σε 10 πιθανές Ν-γλυκοζυλιωμένη αμινοξέα στην θέση 55, 70, 263, 396, 410, 870, 992, 1078, 1367, και 1427. Ως εκ τούτου, οι μετοχές NMR-A2m 7 N -glycosylation sites με το ανθρώπινο A2m, το οποίο έχει οκτώ προβλεπόμενες θέσεις Ν-γλυκοζυλίωσης. Η θέση Ν-γλυκοζυλίωσης στη θέση 247 του ανθρώπινου A2m δεν είναι παρούσα στο NMR-A2m. Όλες οι γέφυρες δισουλφιδίου στο ανθρώπινο A2m προσδιορίζονται στην NMR-A2m με ομοιότητα (Πίνακας 2). Το δυναμικό ισο-γλουταμυλ λυσίνη ισοπεπτιδικούς διασταυρούμενη σύνδεση στη θέση 693 στον ανθρώπινο A2m θα μπορούσε να βρεθεί στο NMR-A2m στην αντίστοιχη θέση 694 (Πίνακας 2). Η Cys972 και Gln975 υπεύθυνη για την πρόσδεση στο ανθρώπινο A2m θειολοεστέρας βρίσκονται στην θέση Cys973 και Gln976 στη NMR-A2m

Η φυλογενετική ανάλυση των πρωτεϊνικών αλληλουχιών A2m έγινε χρησιμοποιώντας την ClustalW2 onlinetool (https:. //Www .ebi.ac.uk /εργαλείο /φυλογένεση /clustalw2phylogeny). Τα συγκριτικά πρωτεϊνικές αλληλουχίες A2m ήταν ανάγνωση από τη βάση δεδομένων UniProt.

Η

σύνθεση Plasma

Διαφορετικές παραλλαγές του ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου (PAGE) έγιναν για να διερευνηθεί η κατανομή πρωτεΐνης των πλάσμα NMR σε γενικές γραμμές και η παρουσία των χαρακτηριστικών γνωρισμάτων του NMR-A2m ειδικότερα.

ηλεκτροφόρηση Native πολυακρυλαμιδίου κλίση gel (αυτοφυή PAGE) έδειξε NMR-A2m να τρέξει σε μια θέση που εμφανίζεται να έχει χαμηλότερη ηλεκτρική κινητικότητα από ό, τι A2m στο ανθρώπινο πλάσμα και καθαρισμένη ανθρώπινη A2m, που θα μπορούσε να υποδεικνύει ένα υψηλότερο μοριακό βάρος (σχήμα 2Α). Η φυσική ανθρώπινη A2m είναι ένα τετραμερές με μοριακή μάζα 720 kDa. Χρησιμοποιώντας SDS-PAGE βαθμίδος (4-20%) υπό μη αναγωγικές συνθήκες NMR-A2m κινείται ως διμερές με μοριακό βάρος περίπου παρόμοια με την ανθρώπινη A2m (360 kDa) (Σχήμα 2Β). Κάτω από συνθήκες μειωμένου NMR-A2m διασπάται σε μονομερή 180 kDa παρόμοια με την ανθρώπινη A2m (Σχήμα 2C). Επιπλέον, η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης πλάσματος NMR βρέθηκε να είναι χαμηλότερο σε σχέση με την ανθρώπινη (38,7 ± 1,79 mg /mL

vs

61,7 ± 3,20 mg /mL?. Η = 5) (Εικ 2Δ). Ανθρώπινο πλάσμα φαίνεται να περιέχει υψηλότερο περιεχόμενο ανοσοσφαιρίνες (Σχ 2Α και 2Β) και του συνολικού σχεδίου πρωτεΐνη φαίνεται να είναι διαφορετικά, πάρα πολύ. NMR σε αντίθεση με το ανθρώπινο πλάσμα εμφανίζει διαφορετικές ζώνες πρωτεΐνης (απόσταση μεταξύ Alb και IgG) σε μη ανηγμένη SDS-PAGE (μεταξύ δείκτη 43 kDa και 212 kDa). Τουλάχιστον στο ανθρώπινο πλάσμα, γενετικές παραλλαγές haptoglobin- και GC-ομάδα πρωτεΐνη κινούνται σε αυτή τη θέση. Παρ ‘όλα αυτά, μια συνολική ανάλυση των τριών διαφορετικών τύπων ηλεκτροφόρηση εμφανίζεται ισχυρότερη εντάσεις ζώνη A2m στο πλάσμα σε σύγκριση με NMR ανθρώπινο πλάσμα, δεικνύοντας υψηλότερη περιεκτικότητα σε A2m NMR.

NMR, ανθρώπινο πλάσμα (30μg) και καθαρίστηκε ανθρώπινη A2m (2,5μg) διαχωρίστηκαν με αυτοφυή PAGE (4-20%) (Α) και SDS-PAGE (4-20%) υπό μη αναγωγικές (Β) και αναγωγικές συνθήκες (C). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των NMR και ανθρώπινου πλάσματος προσδιορίστηκε σύμφωνα με τον Bradford (** – p & lt? 0,01) (D). Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από ανθρώπινο και NMR ήπαρ (20 μg έκαστο) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (4-20%) (Ε) και υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινο πολυκλωνικό κουνελιού A2m αντίσωμα (5 μg /ml) και ένα ποντικού μονοκλωνικό β-υπομονάδας ειδικό αντι-ανθρώπινο αντίσωμα LRP1 (10 μg /mL) (F). (A2m άλφα-2 μακροσφαιρίνη, Alb-αλβουμίνης, IgG-ανοσοσφαιρίνης, Trf-τρανσφερίνης).

Η

Η πιο άφθονη πρωτεΐνη στο πλάσμα NMR είναι αλβουμίνη όπως στο ανθρώπινο πλάσμα. Τρανσφερρίνης με μοριακή μάζα 80 kDa σε ανθρώπους ήταν λιγότερο μεταναστευτικών σε NMR, υποδηλώνοντας διαφορετικές μοριακές μάζες ή παραλλαγές στην γλυκοζυλίωση.

πρωτεϊνών και ανάλυση ανοσοστυπώματος ήπατος αποσπάσματα από NMR και ανθρώπους έδειξε έναν υψηλό αριθμό χαμηλής μοριακής μάζας πρωτεΐνες και για τα δύο είδη. Μια αξιοσημείωτη διαφορά είναι η εμφάνιση ενός μοριακού είδους υψηλής πρωτεϊνικής μάζας σε NMR ήπαρ (Εικ 2Ε). Αυτή η ζώνη πρωτεΐνης δείχθηκε ότι αντιδρούν με αντισώματα κατά της ανθρώπινης A2m με κηλίδα western (Σχήμα 2F) δείχνει ένα μεγαλύτερο ποσό πρωτεΐνης A2m σε εκχύλισμα ήπατος NMR σε σχέση με την ανθρώπινη. Σε αντίθεση, μια χαμηλότερη ποσότητα των ανοσοδραστικών LRP1 ανιχνεύθηκε στο εκχύλισμα ήπατος NMR σε σύγκριση με την ανθρώπινη (Σχήμα 2Ε).

ενεργοποίηση A2m

A2m είναι γνωστό ότι συμβαίνει σε δύο διαφορετικές διαμορφωτική καταστάσεις. Η δέσμευση του πρωτεϊνασών, οδηγεί σε μια διαμορφωτική αλλαγή προς μια πιο συμπαγή δομή της πρωτεΐνης.

In vitro

, μια τέτοια μετάβαση διαμόρφωσης της A2m μπορεί επίσης να ληφθεί με την κατεργασία A2m με μεθυλαμίνη, η οποία είναι γνωστό ότι διασπά δεσμού θειοεστέρα A2m και συνεπώς προκαλώντας μια σημαντική διαμορφωτική αλλαγή παρόμοια με επεξεργασία με πρωτεϊνάση. Η διαμορφωτική μεταβολή μπορεί να απεικονιστεί από το λεγόμενο PAGE ρυθμό (Σχήμα 3Α). Αυτή η μέθοδος επιτρέπει την διάκριση μεταξύ των δύο διαφορετικών μορφών A2m, η επιβράδυνση (φυσική μορφή) και η γρήγορη μετακινείται (ενεργοποιημένη μορφή με την διασπασμένου δεσμού θειοεστέρα) μορφή, το οποίο λέγεται ότι προκαλείται λόγω των αλλαγών στο globularity [28]. Η πρόσδεση της τρυψίνης καθώς επίσης και αντίδραση με μεθυλαμίνη έδειξε παρόμοια κινούμενο σχέδιο, ανάλογα με την πληρότητα του διαμορφωτική αλλαγή, και στα δύο, NMR και ανθρώπινο πλάσμα. Συνολικά, A2m από NMR έδειξε να είναι αντιδραστική προς μεθυλαμίνη και θρυψίνη δείχνοντας έτσι παρόμοιες λειτουργικές ιδιότητες ως ανάλογο ανθρώπινης της. Ωστόσο, η διαμορφωτική μετατρεψιμότητα φαίνεται να είναι περισσότερο περίπλοκο NMR-A2m υποδεικνύεται από την εμφάνιση των ζωνών πρωτεΐνης μεταξύ των θέσεων των αργές και γρήγορες μορφές ανθρώπινης A2m.

ηλεκτροφόρηση RATE έγινε χρησιμοποιώντας 50 μg φυσικής NMR και ανθρώπινο πλάσμα και 50 μg μεθυλαμίνης και επεξεργασία με πλάσμα θρυψίνη, αντιστοίχως. Απομονωμένη ανθρώπινη A2m χρησίμευσαν ως έλεγχος. Μεθυλαμίνη καθώς και τα ανθρώπινα μετατόπιση θρυψίνη και NMR-A2m από την επιβράδυνση στην κινούνται γρήγορα μορφή. Για την οπτικοποίηση των αντίστοιχων ζώνες πρωτεϊνών, το πήκτωμα βάφτηκε με Commassie (Α). Καθαρίστηκε LRP1 (100-500 ng) επισημάνθηκε σε μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και επωάστηκαν είτε με 10 μg /mL του ανθρώπου ή πλάσμα NMR. BSA χρησίμευσαν ως αρνητικός μάρτυρας. A2m σύνδεση προς LRP1 ανιχνεύθηκε με ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα A2m πολυκλωνικό κουνελιού (5 μg /mL) (Β). Για να αποκλείει τη σύνδεση του A2m να LRP1 ο στίγματα LRP1 προ-επωάστηκαν με 1,5 μΜ RAP για 30 λεπτά πριν από την προσθήκη του ανθρώπου ή των NMR πλάσμα (C). (☐ – μητρική /αργή μορφή A2m, ◆-μεταμορφωμένων /γρήγορη μορφή A2m).

Η

Υποδοχέων δέσμευση του A2m από NMR και ανθρώπινο πλάσμα

Ανθρώπινο A2m * (μεταμορφωθεί A2m ) είναι γνωστό ότι δεσμεύονται ειδικά σε διαλυτή ή ακινητοποιημένη LRP1. Για το καθαρισμένο ανθρώπινο LRP1 επισημάνθηκε σε μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και επωάστηκε με ανθρώπινο ή NMR πλάσματος, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β). Όπως φαίνεται, A2m * από τα δύο είδη συνδεθούν με το ακινητοποιημένο υποδοχέα που δείχνει την παρουσία περιοχών δέσμευσης υποδοχέα σε ΝΜΚ-A2m. Σε αντίθεση, καθόλου δέσμευση παρατηρήθηκε σε ακινητοποιημένο λευκωματίνη επιβεβαιώνουν την εξειδίκευση της αλληλεπίδρασης. Η συγγενής πρωτεΐνη υποδοχέα-RAP είναι γνωστό ότι εμποδίζουν την δέσμευση των διαφόρων προσδεμάτων LRP1. Πράγματι, RAP βρέθηκε να μειώνει την αλληλεπίδραση του NMR-A2m * να LRP1 (Σχήμα 3C). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι A2m από NMR περιέχει διατηρημένη περιοχή εις τον τομέα C-τερματικό ικανό να συνδέεται με την ανθρώπινη LRP1.

A2m ποσοτικοποίηση και ανοσολογικές

ανίχνευση

Α 7% SDS-PAGE για να αξιολογηθεί η συγκέντρωση του A2m στο πλάσμα του NMR και ανθρώπινης. Καθαρισμένη ανθρώπινη A2m χρησίμευσε ως εσωτερικό πρότυπο. Οι Coommassie Μπλε βάφονται γέλες σαρώθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. 30 μg NMR και πρωτεΐνη ανθρώπινου πλάσματος, αντίστοιχα, φορτώθηκε στις γέλες. Δημιουργώντας ένα πρότυπο καμπύλη με καθαρισμένο ανθρώπινο A2m, η υπολογισμένη συγκέντρωση A2m σε NMR και ανθρώπινο πλάσμα ήταν 8,3 ± 0,44 mg /mL και 4,4 ± 0,20 mg /mL, αντίστοιχα (η = 5). Αντίστοιχα, A2m αντιπροσωπεύει 6,9 ± 0,37% της συνολικής περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες του πλάσματος σε ανθρώπους και 15,3 ± 0,70% της συνολικής περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες του πλάσματος στο NMR (Σχ 4Α). Επιπλέον, η ανοσοαντιδραστικότητα NMR-A2m ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ένα διαμόρφωση ειδικό μονοκλωνικό ποντικού αντι-ανθρώπινο αντίσωμα A2m (άλφα-1), που είναι γνωστό ότι αναγνωρίζουν μια χωρική Ο-τερματικό επίτοπο που εκτίθενται μόνο σε μετασχηματισμένα A2m (Σχήμα 4Β) και ένα πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ανθρώπινο αντίσωμα A2m (σχήμα 4Γ). Για τη δοκιμή του μονοκλωνικού αντισώματος, τα δείγματα έτρεξαν σε γέλες υποχρεωτική εγγενή κλίση πριν blotting, επειδή SDS είναι γνωστό ότι τροποποιούν τη χωρική δομή του A2m. Όπως φαίνεται, το μονοκλωνικό αντίσωμα ανιχνεύεται το μετασχηματισμένο ανθρώπινο A2m (A2m *), αλλά καμία αντιδραστικότητα δεν παρατηρήθηκε προς NMR-A2m (Σχήμα 4Β). Από την άλλη πλευρά, το πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού expectedly ανιχνεύεται ανθρώπινη καθώς NMR-A2m (Σχήμα 4C), ο τελευταίος με προφανώς χαμηλότερο αντιδραστικότητα διότι περίπου 3fold η ποσότητα του NMR-A2m από το πλάσμα είναι απαραίτητη για να πάρετε μια συγκρίσιμη ανοσολογική έντασης σήματος ως με ανθρώπινη A2m (σχήμα 4Γ). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τα δεδομένα που ελήφθησαν με πυκνομετρική ανάλυση του χρωματισμένο ζώνες πρωτεΐνης (Σχήμα 4Α).

Ο προσδιορισμός της A2m σε δείγματα πλάσματος έγινε με ηλεκτροφόρηση σε 7% SDS-πήκτωμα χρησιμοποιώντας NMR και ανθρώπινο πλάσμα, 30 μg κάθε , και καθαρισμένα ανθρώπινα A2m (1-2,5 μg). A2m ποσοτικοποιήθηκε με χρώση Commassie χρησιμοποιώντας απομονωμένα ανθρώπινα A2m να προετοιμάσει μια καμπύλη βαθμονόμησης (Α). κηλίδα Western αναλύσεις χρησιμοποιώντας μία αυτοφυή PAGE κλίση (4-20%) εφαρμόστηκε για την ανίχνευση της μετασχηματισμένο μορφή A2m χρησιμοποιώντας το αντίσωμα άλφα-1 (Β) και ένα 7% μη-αναγωγική SDS-PAGE για την ανίχνευση A2m με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα χρησιμοποιώντας 9 και 3 μα NMR ή 3 μg ανθρώπινου πλάσματος και 250 ng απομονωμένο ανθρώπινο A2m (C).

Η

Anti-πρωτεολυτική και πρωτεολυτική δραστικότητα του ανθρώπινου και NMR

πλάσμα

Plasma όλων των θηλαστικών και πιθανότατα NMR περιέχει διαφορετικές αναστολείς πρωτεϊνάσης και πρωτεολυτικών ενζύμων που εμπλέκονται σε συγκεκριμένες οδούς, όπως η πήξη του αίματος /ινωδόλυσης και το σύστημα του συμπληρώματος ή εξυπηρετούν τις γενικές λειτουργίες. Είναι γνωστό ότι A2m δεσμεύει και αδρανοποιεί πρωτεϊνάσες όλων των κατηγοριών και ιδιαιτερότητες. Ως εκ τούτου, ήταν ενδιαφέρον να αναλυθεί η αντι-πρωτεολυτική δράση ολόκληρων πλάσμα χρησιμοποιώντας θρυψίνη ως ένζυμο αναφοράς. Η ικανότητα θρυψίνη ανασταλτική μετρήθηκε με τον υπολογισμό του ποσού του πλάσματος ικανά να αναστέλλουν 0,05 μg θρυψίνη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, η ανασταλτική ικανότητα στη χαμηλότερη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη (2,5-20 μα) ήταν υψηλότερη σε ανθρώπινο πλάσμα σε σχέση με NMR, που αντιπροσωπεύεται από το IC

50 μg 17,08 για ανθρώπινη και 25.11 μg για το πλάσμα NMR. Ωστόσο, σε υψηλότερες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης στο πλάσμα παρατηρήθηκε μία υψηλότερη συνολική ανασταλτική δραστικότητα στο πλάσμα σε σύγκριση με NMR ανθρώπινο πλάσμα. Υπήρξε λιγότερη υπολειμματική τρυπτικών δραστηριότητα στο πλάσμα NMR (8.06%) σε σύγκριση με το ανθρώπινο πλάσμα (17,22%) με τη χρήση πρωτεΐνης 100 μg πλάσματος να αναστέλλουν 0,05 μg θρυψίνη (Σχήμα 5Α και 5Β).

Η αδρανοποίηση των 0,05 μg θρυψίνη τιτλοδοτήθηκε με αυξανόμενες ποσότητες NMR (Β) στο πλάσμα που αντιστοιχούν σε 1-100 μg πρωτεΐνης ανθρώπου (Α) ή και μετράται με τη μετατροπή του ΒΑΡΝΑ σε ρ-νιτροανιλίνη στα 405 nm. Η εγγενής δραστηριότητα των τρυπτικών NMR και ανθρώπινο πλάσμα προσδιορίστηκε με μέτρηση της μετατροπής του ΒΑΡΝΑ σε π-νιτροανιλίνη που επάγεται από 1-100 μ§ πρωτεΐνης πλάσματος (C). (* -ρ & Lt? 0,05)

Η

Η εγγενής πρωτεολυτική δραστικότητα του ανθρώπινου και NMR πλάσμα προσδιορίστηκε με διάσπαση του ΒΑΡΝΑ προς π-νιτροανιλίνης. πλάσματος NMR έχει μια σημαντικά χαμηλότερη ενδογενή πρωτεολυτική δραστικότητα από ανθρώπινο πλάσμα (Σχ 5C). Αντικατοπτρίζοντας πλάσμα 100 μg NMR λιγότερο πρωτεολυτικά ενεργός (περίπου 40%) από ό, τι ισοδύναμη ποσότητα του ανθρώπινου πλάσματος. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από την υψηλότερη συγκέντρωση του κύριου A2m αναστολέα πρωτεϊνάσης.

Μόρια προσκόλλησης υπό θεραπεία NMR-A2m

δεδομένα αλληλούχισης επόμενης γενιάς έχει ήδη αναφερθεί υψηλή έκφραση των μορίων προσκόλλησης στο ήπαρ NMR [12 ]. Θα μπορούσαμε να επιβεβαιωθούν αυτά τα αποτελέσματα σε επίπεδο πρωτεΐνης και βρέθηκε υψηλότερη έκφραση της πρωτεΐνης EpCAM σε εκχύλισμα ήπατος NMR σε σύγκριση με την ανθρώπινη (Σχήμα 6Α). Στη συνέχεια υποθέσαμε ότι τα συστατικά του πλάσματος NMR μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση των μορίων προσκόλλησης κυττάρου και έτσι την κυτταρική προσκόλληση. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε την συγκολλητική ιδιότητα καλλιεργημένων ανθρώπινων ινοβλαστών σε λεγόμενο δοκιμασία θρυψίνωση-προσκόλλησης. Το μέσο καλλιέργειας ανθρώπινων ινοβλαστών συμπληρώθηκε με 0,3 ή 1% πλάσματος NMR. Η συμπλήρωση με PBS ή 1% ανθρώπινο πλάσμα χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Μια σημαντική αύξηση στην προσκόλληση των κυττάρων παρατηρήθηκε μετά συμπλήρωση με 1% NMR πλάσματος (Σχήμα 6Β). Για να στοχεύουν το ερώτημα, το οποίο μόρια προσκόλλησης θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για την αυξημένη προσκόλληση, αναλύσαμε CD29, CD44 και EpCAM με ανάλυση Western blot σε ελέγχους και σε 0,3 και 1% πλάσμα NMR θεραπεία ανθρώπινων ινοβλαστών. Παρατηρήσαμε μια αύξηση στην ποσότητα πρωτεΐνης CD29 όταν οι ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,3 και 1% πλάσματος NMR. Από την άλλη πλευρά, τα επίπεδα CD44 δεν άλλαξε κάτω από την ίδια θεραπεία. EpCAM εκφράστηκε σε πολύ χαμηλό ποσό στους ινοβλάστες αλλά μειώνεται περαιτέρω κάτω από NMR επεξεργασίας πλάσματος (Σχήμα 6C).

Ο προσδιορισμός της πρωτεΐνης EpCAM σε NMR και ανθρώπινα δείγματα ήπατος αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 10% SDS- γέλη χρησιμοποιώντας 20 μg πρωτεΐνης σε συνδυασμό με ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα EpCAM μονοκλωνικά ποντικού (Α). Ανθρώπινα ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν σε μέσο συμπληρωμένο με 0,3 ή 1% πλάσματος NMR για 24 ώρες και, οι έλεγχοι συμπληρώθηκαν με PBS (CTR) ή 1% ανθρώπινη (HU) πλάσμα), αντίστοιχα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάλυμα θρυψίνης /ΕϋΤΑ επί ακριβώς 1 λεπτό, πλύθηκαν και τα υπόλοιπα προσκολλητικά κύτταρα βάφτηκαν με διάλυμα Gentiana. Η απορρόφηση της απελευθερωμένης χρωστικής είναι ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των προσφυόμενων κυττάρων (Β) (** – ρ & lt? 0,01? * – 0.05). Η ανάλυση στυπώματος Western για CD29, CD44, EpCAM και GAPDH πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε 8% SDS-πήκτωμα χρησιμοποιώντας 10-25 μg πρωτεΐνης μετά συμπλήρωση του πλάσματος 0,3 ή 1% NMR για 24 ώρες. CD29, CD44, EpCAM και GAPDH ανιχνεύθηκαν με τα αντίστοιχα μονοκλωνικά αντισώματα (C).

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιείται συγκριτική ανάλυση των συστατικών του πλάσματος από το μακρόβιο τρωκτικό NMR με εκείνο από τους ανθρώπους. Λόγω των πολλών ιδιαιτεροτήτων του NMR, όπως η αντίσταση του καρκίνου και τη μακροζωία αυτές οι έρευνες είναι υψηλού επιστημονικού ενδιαφέροντος. Από τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ορισμένα διακριτικά χαρακτηριστικά θα μπορούσε τουλάχιστον εν μέρει να εξηγήσει τις ασυνήθιστες ιδιότητες του NMR.

Μια πρόσφατη ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης στο ήπαρ των NMR και ποντίκια καταδεικνύοντας 660 γονίδια σημαντικά 5 φορές υπερεκφράζεται [12]. Τα περισσότερα εξέχοντα έκφραση σχετιζόταν με το πλάσμα πρωτεϊνάσης A2m αναστολέα και πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση κυττάρου-κυττάρου και μηχανισμό άμυνας ROS. Να διευκρινίσει ανθεκτικό καρκίνο μηχανισμούς συγκρίναμε δύο μακρόβια είδη, η NMR και τους ανθρώπους, για να παρουσιάσει πιθανούς μηχανισμούς κατά του καρκίνου για την ανθρώπινη ευεξία.

Σε ένα πρώην μελέτη δείξαμε ότι η γήρανση συνοδεύεται με σημαντική μείωση του επιπέδου A2m στο αίμα [26]. Επί του παρόντος, πολλές μελέτες περιγράφουν την εξαιρετική λειτουργία του A2m στη ρύθμιση των κυττάρων και των ιστών ομοιόσταση. Αυτή η πρωτεΐνη είναι μοναδικό καθώς αναστέλλει πρωτεϊνασών όλων των κατηγοριών, εμπλέκεται στο μεταβολισμό της νόσου που σχετίζονται με αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες και στην παθογένεση διαφόρων ασθενειών, όπως ο καρκίνος, η νόσος Alzheimer`s, μόλυνση και φλεγμονή [24, 29-31] .

Αυτά τα ευρήματα μας ώθησε να επικεντρωθεί στην ανάλυση των δομικών και λειτουργικών ιδιοτήτων των A2m και από τα δύο είδη με βάση την υπόθεση ότι τα δεδομένα NMR μπορεί να προσφέρει σημαντική συμβολή για την αναγνώριση στρατηγικές για την καταπολέμηση του καρκίνου στον άνθρωπο.

οι διάφορες λειτουργίες του A2m μεσολάβηση μέσω σύνδεσης με τον υποδοχέα του, LRP1. Αυτή η τεράστια διαμεμβρανική πρωτείνη (600 kDa) εμπλέκεται στην παθογένεση της αθηροσκλήρωσης, η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή, το μεταβολισμό των λιπιδίων, καθώς και εκκαθάριση των Alzheimer αμυλοειδούς πεπτιδίου SS [32-35]. LRP1 δεσμεύει περισσότερο από 30 διαφορετικούς συνδετήρες και εμφανίζει την ταχύτερη και πιο αποτελεσματικό σύστημα εκκαθάρισης των πρωτεϊνών συνδέτες από το αίμα και τους ιστούς. Πρόσφατα, δείχθηκε ότι μορφές λεπτίνης σύμπλοκα με A2m και απομακρύνεται από το αίμα με ενδοκυττάρωση με μεσολάβηση υποδοχέα μέσω LRP1. Η προσομοίωση σε υπολογιστή του αυτό το τριαδικό αλληλεπίδρασης αποκάλυψε ότι η στατική συγκέντρωση της λεπτίνης στο πλάσμα επηρεάζεται έντονα από το επίπεδο του A2m [36]. Αυτό έχει σημασία, επειδή οι άλλοι παράγοντες ανάπτυξης όπως ΤΟΡ-SS1 και VEGF που εμπλέκονται αιτιολογικά στην πρόοδο του όγκου προσδένονται επίσης να A2m και εκκαθαρίζονται από τον ίδιο μηχανισμό. Επιπλέον, LRP1 δρουν ως συν-υποδοχέας για πλήθος υποδοχέων σήματος που εμπεριέχει στο μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης, το σύστημα και άλλους υΡΑ /υΡΑΚ [37]. Ως ένα σημαντικό αναστολέα που σχετίζονται με όγκους μεταλλοπρωτεϊνάσες και ρυθμιστής του συστήματος ενεργοποιητή πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (υΡΑ) στον καρκίνο, A2m ελέγχει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή [38]. Αυτά τα λίγα παραδείγματα μπορεί να εμφανίσει τη σημασία της A2m-LRP1 άξονα στη ρύθμιση της ομοιόστασης των ιστών και του αίματος.

Για πρώτη φορά εντοπίσαμε A2m στο NMR με άμεση σχέση με την ανθρώπινη A2m και με ανοσολογικές μεθόδους. Βρήκαμε ότι το πλάσμα NMR περιέχει περίπου δύο έως τρεις φορές υψηλότερο επίπεδο A2m σε σύγκριση με το ανθρώπινο πλάσμα. Δοκιμές διασταυρούμενη αντιδραστικότητα του NMR-A2m με ένα πάνελ A2m μονοκλωνικών αντισωμάτων αντι-ανθρώπινης δεν καταφέραμε να δούμε οποιαδήποτε αντιδραστικότητα. Ακόμη και ο υποδοχέας δέσμευσης-τομέα (RBD) ειδικό αντίσωμα, άλφα-1, είναι γνωστό ότι αντιδρούν μόνο με μετασχηματισμένο A2m, έδειξε καθόλου δέσμευση. Πρόσφατα βρέθηκε ότι το αντίσωμα αυτό αναγνωρίζει τις αλληλουχίες πεπτιδίου συναίνεση, S1349-R-S1351 … D1330-Ε-Ρ-K1333, δύο διαχωρίζονται επίτοπους που περιλαμβάνει ένα διαμορφωτικό επίτοπο εντός της RBD της ανθρώπινης A2m [39]. Η απουσία σύνδεσης προς NMR-A2m ήταν πιθανότατα οφείλεται σε ανταλλαγές αμινοξέων στο διαχωρισμό επίτοπο να N1350-R-P1352 … d1331-GP-K1334 σε NMR, αντικαθιστώντας 3 από 7 αμινοξέα στις θέσεις 1, 3 και 5 της επιτόπιο. Αντίθετα, η σύνδεση του NMR-A2m να ειδικό υποδοχέα του (LRP1) ως πειραματικά αποδειχθεί θα μπορούσε να αναμένεται, επειδή τα δύο ουσιώδη κατάλοιπα λυσίνης στη θέση 1395 και 1402 (NMR: Lys1393 και Lys1400) και το φακό σταθεροποιητικό Cys1355 και Cys1471 της ανθρώπινης A2m (NMR: Cys1353 και Cys1368) είναι παρόντα στο NMR-A2m [40]. Η προβλεπόμενη οκτώ βήτα-φύλλα και μία άλφα-έλικα μπορεί να βρεθεί από την ομοιότητα στο NMR-A2m [20]. Οι περισσότερες δομές που βρίσκονται στο ανθρώπινο A2m ήταν επίσης παρόντα στο NMR (δισουλφιδικές γέφυρες, Ν-γλυκοζυλίωσης, δόλωμα-περιοχή, θέσεις θρυψίνη-σύνδεση). Ωστόσο, η πρόβλεψη των θέσεων Ν-γλυκοζυλίωσης στο NMR-A2m αποκάλυψε δύο επιπλέον θέσεις (Πίνακας 2). Ενώ ο ανθρώπινος A2m έχει 8 θέσεις Ν-γλυκοζυλίωσης, η πρωτεΐνη NMR έχει 10. Αυτό θα μπορούσε να είναι μια εξήγηση για την υψηλότερου μοριακού βάρους του NMR-A2m δει στην αυτοφυή PAGE (Σχήμα 1Α), δεδομένου ότι αυτό δεν μπορεί να εξηγηθεί αποκλειστικά από την NMR-A2m σύνθεση αμινοξέων. Ωστόσο, και άλλες τροποποιήσεις, όπως Ο-γλυκοζυλίωση μπορεί να συμβάλει σε αυτό το φαινόμενο, δεδομένου O-γλυκοζυλιώσεις είναι τα ως επί το πλείστον εμφανίζονται και πιο πολύπλοκες τροποποιήσεις στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς με συγκεκριμένα είδη μόδας.

Ένας πιθανός μηχανισμός υπεύθυνος για την ακραία αντίσταση του καρκίνου σε NMR δείχθηκε προηγουμένως [5]. Ένα υψηλής μοριακής μάζας υαλουρονάνη (ΗΑ) ταυτοποιήθηκε, η οποία εκκρίνεται από τους ινοβλάστες NMR αλλά όχι από τους ινοβλάστες από ανθρώπους ή ποντίκια. Εφ ‘όσον αυτά τα κύτταρα που παράγονται ΗΑ εμποδίστηκαν από κακοήθεια. Να χτυπήσει κάτω του ενζύμου ΗΑ σύνθεσης (HAS2) ή υπερέκφραση της εξευτελιστικής ενζύμου (HYAL2) οδήγησε σε αυξημένη κακοήθεια των ινοβλαστών NMR. Η υφή, η σύνθεση και η σταθερότητα της εξωκυττάριας μήτρας προσδιορισμό σφραγίδες σε κακοήθεια. Η κύρια υποδοχέας για το ΗΑ σε ανθρώπου και ποντικού είναι CD44. Μπλόκο CD44 προκάλεσε καλλιεργημένα NMR κύτταρα να μεγαλώνουν γρηγορότερα [5]. Πρόσφατα, δείχθηκε ότι δεσμεύεται με LRP1 CD44 και έτσι ρυθμίζει τις συγκολλητικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων [41]. Τα ευρήματά μας που NMR-A2m συνδέεται με LRP1 και ότι αυτή η δέσμευση παρεμβολές από RAP μπορεί να ρίξει φως σχετικά με τον πιθανό ρόλο των A2m σε αυτή την αλληλεπίδραση. Η καλλιέργεια ανθρώπινων ινοβλαστών με 1% πλάσμα NMR έδειξαν αύξηση στην προσκόλληση των κυττάρων αυτών σε σύγκριση με την προσθήκη του ανθρώπινου πλάσματος. Μια ανάλυση κηλίδος western εμφανίζεται CD29 να αυξηθεί υπό NMR συμπλήρωση πλάσματος (Σχήμα 6C). Δεν μπορέσαμε να παρατηρήσουμε αλλαγές στην έκφραση CD44 σε ανθρώπινους ινοβλάστες κατά την κατεργασία NMR πλάσμα που θα μπορούσε να εξηγήσει την παρατηρούμενη αύξηση στην προσκόλληση των κυττάρων. Ένας λόγος μπορεί να είναι ότι τα άλλα μόρια προσκόλλησης κυττάρου όπως το ιντεγκρίνης CD29. Η πρωταρχική λειτουργία των μελών της οικογένειας ιντεγκρίνης είναι να μεσολαβήσει κυττάρου-κυττάρου και προσκόλληση κυττάρου-μήτρας. NMR πλάσματος αύξησε την έκφραση του CD29, η οποία θα μπορούσε ως εκ τούτου σταθεροποιούν αυτές τις αλληλεπιδράσεις καθιστώντας ινοβλαστών λιγότερο ευαίσθητη σε κατεργασία τρυψίνης. EpCAM (CD326) εκφράζεται από το επιθήλιο των υγιών ατόμων, αλλά υπερεκφράζεται στα περισσότερα καρκινώματα. Στις περισσότερες όγκοι έκφραση υψηλού EpCAM σχετίστηκε με μετάσταση και φτωχή πρόγνωση. Ωστόσο, για διαφορετικούς τύπους όγκων αντιφατικά αποτελέσματα έχουν αναφερθεί [42]. Παρ ‘όλα αυτά, έχει αναφερθεί ότι η ενεργοποίηση SS-κατενίνης επαγόμενη μεταγραφή EpCAM μέσω δέσμευσης του TCF παράγοντα μεταγραφής /Lef στον προαγωγό EpCAM [43]. Αυτό είναι ενδιαφέρον, όπως θα μπορούσαμε να δείξουμε πρόσφατα ότι A2m αναστέλλει Wnt /β-κατενίνης οδού στα κύτταρα του όγκου [24]. Αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει την ανασταλτική δράση του A2m επί EpCAM έκφραση (Εικ 6C).

Ως εκ τούτου, συμπεραίνεται ότι ένας σημαντικός παράγοντας υπεύθυνος για την αυξημένη προσκόλληση κυττάρου κατά NMR έκθεση ανθρώπινων ινοβλαστών πλάσμα θα μπορούσαν να A2m.