Abstract

Δεδομένου ότι η παρατεταμένη έκθεση σε οιστρογόνα και την αυξημένη δραστηριότητα τελομεράσης σχετίζονται με ενδομήτρια καρκινογένεση, στόχος μας ήταν να αξιολογηθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ της οδού ΜΑΡΚ και επαγωγή οιστρογόνου δραστικότητας τελομεράσης σε καρκινικά κύτταρα του ενδομητρίου. Οιστραδιόλη (Ε2) που προκαλείται από τη δράση της τελομεράσης και η έκφραση hTERT mRNA στον υποδοχέα οιστρογόνου (ER) -α θετική, Ishikawa ενδομητρίου καρκινικής κυτταρικής γραμμής. UO126, ένας πολύ εκλεκτικός αναστολέας του ΜΕΚ1 /ΜΕΚ2, ανέστειλε τη δράση της τελομεράσης και η έκφραση του mRNA hTERT επαχθεί από την Ε2. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν και μετά από επιμόλυνση με ERK 1/2-ειδικό siRNA. Η θεραπεία με Ε2 είχε σαν αποτέλεσμα ταχεία φωσφορυλίωση της p44 /42 ΜΑΡΚ και την αυξημένη δραστηριότητα ΜΑΡΚ η οποία καταργήθηκε με UO126. Ο υποκινητής hTERT περιέχει δύο στοιχεία απόκρισης οιστρογόνου (Eres), και προσδιορισμούς λουσιφεράσης δείχνουν ότι αυτές οι Eres ενεργοποιούνται από Ε2. Η έκθεση σε UO126 ή ERK 1/2-ειδικό siRNA σε συνδυασμό με E2 παρεμπόδισαν την διεγερτική δράση της Ε2 επί λουσιφεράσης δραστηριότητα από αυτές Eres. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η Ε2-επαγωγή της δραστηριότητας της τελομεράσης διαμεσολαβείται μέσω της οδού ΜΑΡΚ σε ανθρώπινα ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Zhou C, Steplowski ΤΑ, Ντίκενς Χονγκ Κονγκ, Malloy KM, Gehrig PA, Boggess JF, κ.ά. . (2013) Estrogen Επαγωγή τελομεράσης δραστηριότητας μέσω κανονισμού του Mitogen-Activated Protein Kinase (ΜΑΡΚ) Εξαρτημένη Pathway σε ανθρώπινα κύτταρα του ενδομητρίου Cancer. PLoS ONE 8 (2): e55730. doi: 10.1371 /journal.pone.0055730

Επιμέλεια: Antimo Migliaccio, ΙΙ Università di Napoli, Ιταλία

Ελήφθη: 6 Νοεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 29, Δεκ 2012? Δημοσιεύθηκε: 7η Φεβρουαρίου, 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο γενναιόδωρα υποστηρίζεται από το Ίδρυμα V για την Έρευνα του Καρκίνου και του Ταμείου Steelman (Bae-Jump VL και Gehrig PA). Το έργο που περιγράφεται υποστηρίχθηκε επίσης από (1) Βραβείο Αριθμός KL2RR025746 (UNC Κλινική Μεταγραφική Science Award-Κ12 Scholars Program) από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων (Bae-Jump VL) και (2) Βραβείο Αριθμός 1K23CA143154-01A1 (ΝΙΗ /ΝΟΙ K23 Mentored γνώμονα τον ασθενή Έρευνα Εξέλιξης Grant). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του ενδομητρίου είναι η πιο πιο συχνή κακοήθεια στις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Ενδογενών και εξωγενών έκθεση σε οιστρογόνα είναι σημαντικοί παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη του τύπου Ι ενδομητρίου καρκίνων? Ωστόσο, το μοριακό σύνδεσμο μεταξύ οιστρογόνων και του ενδομητρίου καρκινογένεση παραμένει ελάχιστα κατανοητή. προηγούμενη εργασία μας κατέδειξαν ότι η ρύθμιση των οιστρογόνων τελομεράσης μπορεί δυνητικά να διαδραματίσουν ένα ρόλο στην κακοήθη μετασχηματισμό του ενδομητρίου [2].

Τα τελομερή είναι εξειδικευμένες δομές του περιφερικού άκρου των χρωμοσωμάτων και λειτουργίας σε προστασία χρωμόσωμα, τοποθέτηση, και αντιγραφής. Με τη γήρανση, την ανθρώπινη τελομερή υποβάλλονται αναπόφευκτα η προοδευτική μείωση σε φυσιολογικά σωματικά κύτταρα μέσω του αναδιπλασιασμού εξαρτώμενη απώλεια αλληλουχία στον ακροδέκτη άκρα του DNA. Η προοδευτική βράχυνση των τελομερών τελικά οδηγεί σε χρωμοσωμική αστάθεια, οδηγώντας σε κυτταρική γήρανση. Η τελομεράση είναι μια αντίστροφη μεταγραφάση ριβονουκλεοπρωτεΐνης που συνθέτει τελομερές DNA στο χρωμοσωμικό άκρα. Αυτό το ένζυμο αναγνωρίζει την G-πλούσιο κλώνος μιας υπάρχουσας αλληλουχίας τελομερούς επανάληψης και συνθέτει ένα νέο αντίγραφο του επαναλαμβανόμενη αλληλουχία με την απουσία ενός συμπληρωματικού κλώνου DNA, με ένα τμήμα του εσωτερικού συστατικού RNA της που εξυπηρετούν ως μήτρα [3], [4 ]. Έτσι, τελομεράση αποτελείται από ένα πρότυπο RNA (RNA ανθρώπινης τελομεράσης, hTR) και η καταλυτική πρωτεΐνη hTERT (ανθρώπινης τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης, hTERT) το οποίο έχει δραστικότητα αντίστροφης μεταγραφάσης [5] – [7]. Η έκφραση του hTERT παρατηρείται σε υψηλά επίπεδα σε τελομεράση θετικά καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε τελομεράση αρνητικά κύτταρα και θεωρείται το περιοριστικό του ρυθμού καθοριστικό παράγοντα της δράσης της τελομεράσης [7], [8].

Περισσότερα από 85% των ανθρώπινων καρκινωμάτων του ενδομητρίου εκφράζουν δραστικότητα τελομεράσης [9] – [12], και το επίπεδο της δράσης της τελομεράσης έχει συσχετιστεί με προχωρημένη νόσο στάδιο και με πυελική μετάσταση λεμφαδένα [12]. Το ανθρώπινο ενδομήτριο είναι ένα μοναδικά δυναμικός ιστός, που αποτελείται από επιθηλιακά αδένων και του συνδετικού ιστού που υφίσταται πολύπλοκα σχήματα του πολλαπλασιασμού, έκκριση, και την κατανομή σε όλη την αναπαραγωγική χρόνια. Κατά τη διάρκεια του έμμηνου κύκλου, τα επιθηλιακά κύτταρα του ενδομητρίου που ρυθμίζονται από το φύλο ορμονών οιστρογόνων και της προγεστερόνης, και του ενδομητρίου carcionogenesis πιστεύεται ότι σχετίζεται με την παρατεταμένη έκθεση σε οιστρογόνα, ομόφωνα από την προγεστερόνη. Στην κανονική ενδομήτριο, η έκφραση τελομεράσης συσχετίζεται με κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τυπικώς εντοπίζεται σε επιθηλιακά αδενικά κύτταρα, και ρυθμίζεται σε ένα ορμονικώς οδηγείται, εμμηνόρροιας τρόπο φάση εξαρτώμενη [13], [14]. Η αυξημένη δράση της τελομεράσης παρατηρείται στην φάση πολλαπλασιασμού όταν τα επίπεδα των οιστρογόνων μέγιστη ακολουθείται από κοντά απουσιάζει επίπεδα στην εκκριτική φάση όταν τα επίπεδα προγεστερόνης είναι υψηλά [13]. Τέτοια στοιχεία δείχνουν μια σχέση μεταξύ των επιπέδων στεροειδούς του φύλου, η ρύθμιση της δραστικότητας της τελομεράσης και την ανάπτυξη του καρκίνου του ενδομητρίου.

Η περιοχή υποκινητή του hTERT έχει κλωνοποιηθεί και χαρακτηριστεί και περιέχει δύο υποθετικές στοιχεία απόκρισης οιστρογόνου (Eres), υπονοώντας μια άμεση σύνδεση μεταξύ των οιστρογόνων και της ρύθμισης της τελομεράσης [2], [15] – [18]. Έχουμε βρει προηγουμένως ότι η δραστηριότητα της τελομεράσης και hTERT mRNA αυξήθηκαν σε απόκριση προς οιστρογόνο σε υποδοχέα α (ΕΡα) εξαρτώμενο τρόπο οιστρογόνων στο ενδομητρίου καρκινικές κυτταρικές γραμμές [2]. Επιπλέον, αποδείξαμε σύνδεση του συμπλοκοποιημένου οιστρογόνου με ΕΚα στις Eres βρίσκονται εντός του υποκινητή hTERT, ενδεικτική μιας πιθανής υποκείμενου μηχανισμού μεταξύ επαγωγή της τελομεράσης και την κακοήθη εξαλλαγή των εξαρτώμενων από ορμόνες κύτταρα του ενδομητρίου [2].

μιτογόνο πρωτεϊνικές κινάσες που ενεργοποιούνται (ΜΑΡΚ) είναι μία σημαντική οικογένεια των πρωτεϊνικών κινασών που εμπλέκονται στην μετάδοση σημάτων από την κυτταρική μεμβράνη προς τον πυρήνα. Είναι γνωστό ότι η ρ44 /42 ΜΑΡΚ μονοπάτι σηματοδότησης ενεργοποιείται από μιτογόνα ερεθίσματα από αυξητικούς παράγοντες και ορμόνες φύλου στεροειδών όπως τα οιστρογόνα, προγεστερόνη, και του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) στα ανθρώπινα μαστού, των ωοθηκών και του ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα, μεταξύ άλλων [ ,,,0],19] – [21]. Προκειμένου να αποκτήσουμε γνώση των μοριακών μηχανισμών που ελέγχουν τη ρύθμιση της δράσης της τελομεράσης από τα οιστρογόνα, εξετάσαμε τη σχέση μεταξύ του μονοπατιού ΜΑΡΚ και δράση της τελομεράσης των οιστρογόνων που προκαλείται σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του ενδομητρίου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια και Αντιδραστήρια

Η ρύθμιση της έκφρασης της τελομεράσης διερευνήθηκε σε ER-θετικό (Ishikawa) και ER-αρνητικό ανθρώπινο καρκίνο του ενδομητρίου κυτταρικές γραμμές (HEC-1Β) [22], [23]. Αυτές οι κυτταρικές σειρές που παρέχονται ως δώρο από τον Δρ Bruce Lessey (Κέντρο Γυναικείων Ιατρικής, Greenville, SC). Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, τα οιστρογόνα που προκαλείται ERE ακετυλοτρανσφεράση χλωραμφαινικόλης (CAT) δραστηριότητα προσδιορίστηκε σε κάθε μία από αυτές τις κυτταρικές σειρές για να επιβεβαιώσει λειτουργική κατάσταση ER [24]. Ishikawa και HEC-1B κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ΜΕΜ συμπληρωμένο με ορό 5% εμβρυϊκό ορό (FBS), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, παρουσία 5% CO

2 στους 37 ° C. Οι ενδομητρίου κυτταρικές σειρές καρκίνου καλλιεργήθηκαν σε ελεύθερο ερυθρού φαινόλης μέσο με 0.5% ξυλάνθρακα-δεξτράνης επεξεργασμένο FBS για 1 ημέρα πριν από τη θεραπεία με οιστρογόνα ή U0126.

Χημικά και το πλασμίδιο

All hTERT ρεπόρτερ υποκινητή λουσιφεράσης πλασμίδια που παρέχονται από τον Dr. Ι Horikawa (Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, Bethesda, MD). 17-β οιστραδιόλη (Ε2) αγοράστηκε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). UO126 αγοράστηκε από την Calbiochem (La Jolla, CA). Το αντι-φωσφορυλιωμένο ρ42 /44 και αντι-μη φωσφορυλιωμένη ρ42 /44 αντισώματα ήταν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Το αντίσωμα αντι-β-ακτίνης ήταν από τη Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Οι Western blotting αντιδραστήρια ανίχνευσης αυξημένης χημιφωταύγειας ήταν από την Amersham (Arlington Heights, IL). Όλα τα άλλα χημικά ήταν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ).

Ε2 και U0126 Θεραπεία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 4 Χ 10

5 κύτταρα ανά φιάλη καλλιέργειας Τ25 ή 1.5 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο ενός 12 φρεατίων, που περιέχουν είτε 5 ml ή 1,2 ml κανονικό μέσο, ​​αντίστοιχα. Το μέσο στη συνέχεια άλλαξε σε ελεύθερο ερυθρού φαινόλης μέσο με 0,5% απογυμνωμένο FBS για επώαση στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Αμέσως πριν από τη θεραπεία, το μέσο στις πλάκες καλλιέργειας αναρροφήθηκε, τριπλά πλύθηκε με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) και αντικαθίσταται με φρέσκο ​​μέσο. Ε2 διαλύεται εντός αιθυλικής αλκοόλης ή U0126 διαλύονται σε DMSO στη συνέχεια προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Ταυτόχρονα, η ίδια ποσότητα αιθυλικής αλκοόλης ή DMSO προστέθηκε στα φρεάτια ελέγχου.

Η τελομεράση Δοκιμασία Δραστηριότητα

δραστικότητα της τελομεράσης μετρήθηκε με τη χρήση ενός πρωτοκόλλου τελομερή επαναλαμβανόμενη ενίσχυση PCR-based (TRAP) (TRAP -eze κιτ ανίχνευσης τελομεράσης, Oncor, Gaithersburg, ΜΑ). Εν συντομία, κυτταρικά ιζήματα λύθηκαν, ομογενοποιείται με 105 uL παγωμένου 1 × CHAPS, τοποθετήθηκε επί πάγου επί 30 λεπτά, και φυγοκεντρήθηκε στα 13.000 g για 21 λεπτά στους 4 ° C. Το προκύπτον υπερκείμενο στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε έναν φρέσκο ​​σωλήνα και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Ένα δείγμα από το εκχύλισμα στη συνέχεια παρελήφθη και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ BCA (Bio-Rad, Hercules, CA). Μεταξύ 0,25 και 05 μg πρωτεΐνης, τοποθετούνται σε ένα μίγμα αντίδρασης 50-μΙ, χρησιμοποιήθηκε για την δοκιμασία TRAP. Μετά από 30 λεπτά επώασης στους 30 ° C, εκτελέστηκαν 27 κύκλοι PCR ενίσχυσης (30 λεπτά στους 94 ° C που ακολουθείται από 30 λεπτά στους 59 ° C). Τα προϊόντα PCR κατόπιν αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 10% πολυακρυλαμίδη μη μετουσιωτικές γέλες. Τα πηκτώματα αναλύθηκαν και ποσοτικοποιείται χρησιμοποιώντας το σύστημα φωσφοροαπεικόνιση με Imagequant λογισμικό (Molecular Dynamics inc., Sunnyvale, CA). Κάθε πείραμα διεξήχθη δύο φορές.

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR για hTERT

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNAqueous (Ambion, Austin, ΤΧ) και καθαρίστηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας το κιτ ελεύθερο DNA (Ambion, Austin, TX). Η αντίστροφη μεταγραφή και PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το TaqMan Gold ενός σταδίου κιτ RT-PCR με τον ΑΒΙ Prism 7700 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems, Foster City, CA). Αντίστροφη μεταγραφή εκτελέστηκε στους 48 ° C για 30 λεπτά. Οι συνθήκες PCR αποτελούνταν από ένα βήμα 10-λεπτά στους 95 ° C και 40 κύκλους μεταξύ 95 ° C για 15 s και 65 ° C για 1 λεπτό. Ένα γονίδιο ελέγχου καθαριότητας, όξινη ριβοσωμική φωσφοπρωτεΐνη P0 (RPLP0, επίσης γνωστή ως 36Β4), χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για τη διόρθωση των διαφορών στην ποσότητα του RNA σε κάθε δείγμα [25]. έχουν Εκκινητές και ανιχνευτές για φθορισμογόνο hTERT και RPLP0 έχουν περιγραφεί προηγουμένως [25]. Η πρότυπη καμπύλη για hTERT δημιουργήθηκε με χρήση αραιώσεων γνωστής ποσότητας cRNA που συντίθεται από

in vitro

μεταγραφή ενός κλωνοποιημένου θραύσματος. Η κανονικοποιημένη επίπεδο hTERT σε κάθε δείγμα υπολογίστηκε από την αναλογία του επιπέδου hTERT στο επίπεδο RPLP0, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν και επαναλήφθηκαν δύο φορές για λόγους συνέπειας.

Ανάλυση Western Blot

κύτταρα Ishikawa απλώθηκαν σε μια πυκνότητα 3 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, το μέσο αναρροφήθηκε και αντικαταστάθηκε με μέσο χωρίς ορό. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ε2, UO126 ή και τα δύο σε συνδυασμό, για τουλάχιστον 15 λεπτά και το μέγιστο 24 ώρες. Οι πλάκες αποξέστηκαν με RIPA ρυθμιστικό διάλυμα και κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν σε 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα SDS. Τα κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με 12% γέλη SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε για 1 ώρα σε ΤΒδ-Τ + 5% άπαχο ξηρό γάλα, και στη συνέχεια επωάστηκαν με phosphophorylated-ρ44 /42 ΜΑΡΚ μονοκλωνικό αντίσωμα (1:2000) ή παν-ρ44 /42 ΜΑΡΚ πολυκλωνικό αντίσωμα (1:1000) επί μία νύκτα στους 4 ° C (Cell Signaling, Beverly, ΜΑ). Η μεμβράνη στη συνέχεια πλύθηκε σε ΤΒδ-Τ και επωάστηκαν με ένα δευτερεύον συζευγμένο με υπεροξειδάση αντίσωμα για 1 ώρα. σύνδεση αντισώματος ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενός συστήματος ενισχυμένης ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (ECL). καθαρές εντάσεις μπάντα ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας Millipore Ψηφιακό Σύστημα bioimaging (Bedford, ΜΑ). Κάθε πείραμα διεξήχθη δύο φορές.

Δοκιμασία Κινάσης Vitro

Η

δραστικότητα της δραστικότητας ρ44 /42 κινάσης μετρήθηκε

in vitro

χρησιμοποιώντας το ρ44 /42 kit ΜΑΡ δοκιμασία κινάσης (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ). Εν συντομία, τα κύτταρα Ishikawa απλώθηκαν σε μια πυκνότητα 3 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων. Μετά Ε2 και θεραπεία UO126, οι πλάκες πλύθηκαν 4 φορές με παγωμένο PBS, και 0,5 mL παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος λύσης 1 mM PMSF προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα αποξέστηκαν, κατεργασία με υπερήχους, και φυγοκεντρήθηκε στα 10.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το προκύπτον υπερκείμενο επωάστηκε με 15 υί επαναιωρήθηκαν ακινητοποιημένη κινάση φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡ (Thr202 /Tyr204) μονοκλωνικό αντίσωμα για 12 ώρες στους 4 ° C. Το ανοσολογικό σύμπλοκο πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης 5 φορές και μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα κινάσης χωρίς υπόστρωμα. Ανοσοκαταβυθίστηκαν ΜΑΡΚ στη συνέχεια επωάστηκε για 30 λεπτά στους 30 ° C σε ρυθμιστικό διάλυμα κινάσης με πρωτεΐνη σύντηξης ΕΙκ1 2 ug και 200 ​​υΜ ΑΤΡ. Η αντίδραση κινάσης διακόπηκε με προσθήκη 25 υΐ 3 χ SDS ρυθμιστικό. ΕΙκ1 διαχωρίστηκε με SDS-PAGE γέλη, και στη συνέχεια επωάστηκε με αντι-φωσφο-ΕΙκ1 (Ser 308) αντίσωμα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. ΕΙκ1 ανιχνεύθηκε με ECL, όπως περιγράφεται για την ανάλυση κηλίδος western. Κάθε πείραμα διεξήχθη δύο φορές.

δοκιμασία Λουσιφεράσης

Παροδική διαμόλυνση των πλασμιδίων αναφοράς λουσιφεράσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Επιμόλυνσης TransFast (Promega, Madison, WI). Εν συντομία, 8 × 10

4 κυττάρων Ishikawa σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων όλη τη νύκτα και διαμολύνθηκαν με πλασμίδια λουσιφεράσης προαγωγό (0,5 μg /φρεάτιο). Το pRL-SV40 (2 ng /φρεάτιο) που περιέχει Renilla reniformis λουσιφεράση ήταν συν-επιμολύνθηκε σε κάθε επιμόλυνση ως ένας εσωτερικός έλεγχος για ομαλοποίηση της μεταγραφικής δραστικότητας των πλασμιδίων hTERT υποκινητή. Η δοκιμασία λουσιφεράσης στη συνέχεια διεξήχθη χρησιμοποιώντας το Luciferase Reporter σύστημα διπλών Assay (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που παρέχονται από τον κατασκευαστή. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για κάθε πλασμίδιο, και κάθε πείραμα εκτελέστηκε δύο φορές.

ERK 1/2 siRNA δοκιμασία

ERK 1/2 μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, τα κύτταρα Ishikawa επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων ή πλάκες 12-φρεατίων στη συνιστώμενη συγκέντρωση κυττάρων. Μετά από 24 ώρες, επιμολύνσεις διεξήχθησαν σε περίπου 60% συρροή χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Για κάθε αντίδραση επιμόλυνση, 100 ηΜ ERK 1/2 siRNA ή ελέγχουν siRNA χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή συμπλοκών siRNA επιμόλυνση σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν σε 0,5 (πλάκα 12 φρεατίων) ή 1,5 ml (πλάκα 6 φρεατίων) μέσο χωρίς ορό για 8 ώρες. Μετά την επώαση, τα σύμπλοκα επιμόλυνσης αφαιρείται και αντικαθίσταται με αντίστοιχο media τους. Σε κάθε πείραμα, συμπεριελήφθησαν χωρίς θεραπεία ελέγχους που λαμβάνουν αντιδραστήριο επιμόλυνσης. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης (80% -90%) προσδιορίστηκε με μικροσκόπιο φθορισμού σε μη ειδική επιμολυσμένα κύτταρα siRNA φλουορεσκεΐνη επισημαίνονται και με ανάλυση Western blotting. Τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για κηλίδωση Western ανάλυση, ανάλυση TRAP, lucifersae δραστηριότητα και σε πραγματικό χρόνο PCR σε 36-48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Αποτελέσματα

Η επίδραση της Ε2 για hTERT mRNA και τη δράση της τελομεράσης σε Ishikawa κύτταρα

στην κυτταρική σειρά Ishikawa, Ε2 βρέθηκε να αυξάνει τη δράση της τελομεράσης σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο όπως αξιολογείται με ποσοτικό προσδιορισμό TRAP (Σχήμα 1Α). Η αυξημένη δραστηριότητα ήταν εξαρτώμενη τόσο από τη συγκέντρωση της Ε2 και το χρονικό διάστημα της έκθεσης. Όταν προστέθηκε 0,1-10 μΜ Ε2, η δραστηριότητα της τελομεράσης ήταν up-ρυθμίζονται σε 12 ώρες, η οποία συνεχίστηκε μέχρι τουλάχιστον 72 ώρες μετά τη θεραπεία. Αγωγή κυττάρων με 1-10 μΜ Ε2 για περισσότερο από 48 ώρες επαγόμενη μέγιστη δραστικότητα τελομεράσης. Καμία επίδραση της Ε2 στην δραστικότητα τελομεράσης ανιχνεύτηκε στο αρνητικό ενδομητρίου κυτταρική σειρά καρκίνου ΕΡα (HEC-1 Β), κάτω από τις ίδιες συνθήκες θεραπείας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Ε2 (0,1 -10 μΜ) για 48 ώρες ή επεξεργασία με 1 υΜ Ε2 σε μια μόδα χρονική πορεία (Α). Η δραστικότητα τελομεράσης προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία TRAP. έκφραση hTERT RNA εκτιμήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR (Β). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD του διπλές δειγμάτων από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα. (ITAS = εσωτερικό πρότυπο δοκιμασία της τελομεράσης, C = έλεγχος).

Η

Για να κατανοήσουμε τον υποκείμενο μηχανισμό της επαγωγής της δραστηριότητας της τελομεράσης, έχουμε ποσοτικά με πραγματικού χρόνου RT-PCR δοκιμασία το επίπεδο της έκφρασης hTERT mRNA κάτω οι ίδιες συνθήκες. Το γονίδιο hTERT κωδικοποιεί την καταλυτική υπομονάδα τελομεράσης και είναι συνήθως το περιοριστικό του ρυθμού καθοριστικός παράγοντας της τελομεράσης ενζυματική δραστικότητα. Ε2 αυξημένη έκφραση mRNA hTERT με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (1-10 μΜ). Αυτό τα πάνω ρύθμιση της δραστικότητας παρατηρήθηκε μέσα σε 6 ώρες μετά τη θεραπεία Ε2, και μέγιστη επαγωγή της έκφρασης hTERT mRNA παρατηρήθηκε σε 48 ώρες. έκφραση hTERT mRNA Ε2 επαγόμενη παρέμεινε αυξημένη για περισσότερο από 72 ώρες (Εικόνα 1Β). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ρύθμιση της δραστηριότητας της τελομεράσης με Ε2 μπορεί να συμβεί σε μεταγραφικό επίπεδο του ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα.

Η επίδραση της UO126 σχετικά με τη δραστηριότητα της τελομεράσης και της έκφρασης hTERT mRNA σε κύτταρα Ishikawa

Για την αντιμετώπιση ο ρόλος της οδού ΜΑΡΚ σε E2-επαγόμενη δραστικότητα τελομεράσης σε κύτταρα Ishikawa, μπορούμε αρχικά αξιολόγησε την ικανότητα του UO126, ενός ειδικού αναστολέα ΜΕΚ1 και ΜΕΚ2, να αναστέλλουν άμεσα τη δράση της τελομεράσης. Στα κύτταρα Ishikawa, UO126 ανέστειλε τη δράση της τελομεράσης με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (0,1-10 μΜ) όπως αποδεικνύεται από ποσοτικό προσδιορισμό TRAP (Σχήμα 2Α και 2Β). Παράλληλα, UO126 μειωμένη έκφραση mRNA hTERT με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, όπως ποσοτικοποιείται με πραγματικού χρόνου RT-PCR (Σχήμα 2C). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι UO126 είναι επαρκής για να αναστείλει τη δράση της τελομεράσης και μεταγραφή hTERT mRNA σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα.

Τα κύτταρα Ishikawa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με UO126 σε διάφορες συγκεντρώσεις (0.1-10 μΜ) για 24 ώρες. δραστικότητα τελομεράσης εκτιμήθηκε με ποσοτικό προσδιορισμό TRAP (Α και Β) έκφραση hTERT εκτιμήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR (C). (C = έλεγχος).

Η

Η επίδραση της UO126 στο Ε2 που προκαλείται από τη δράση της τελομεράσης και της έκφρασης hTERT mRNA σε κύτταρα Ishikawa

Για να διερευνηθεί η επίδραση της UO126 στο Ε2 που προκαλείται από τη δράση της τελομεράσης και η έκφραση hTERT mRNA, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ του UO126, 1 μΜ Ε2, ή και τα δύο σε συνδυασμό (10 μΜ UO126 + 1 μΜ Ε2) για 24 ώρες, και τη δράση της τελομεράσης και η έκφραση hTERT στη συνέχεια προσδιορίστηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, Ε2 αυξημένος δράση της τελομεράσης και η έκφραση του mRNA hTERT σε περίπου 2-3 ​​φορές εκείνη των ελέγχων, και αυτά τα διεγερτικά αποτελέσματα ήταν σχεδόν καταργήθηκε με την παρουσία UO126 (10 μΜ). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η λειτουργία του αναστολέα ΜΕΚ, UO126, λαμβάνει χώρα όχι μόνο στο επίπεδο της ίδιας της ένζυμο τελομεράση, αλλά και στο μεταγραφικό επίπεδο του γονιδίου hTERT.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ UO126 ( U), 1 υΜ Ε2 ή και τα δύο σε συνδυασμό για 24 ώρες. (Α) Δράση της τελομεράσης εκτιμήθηκε με ποσοτικό προσδιορισμό TRAP. δραστηριότητα (Β) Η τελομεράση γραφικά απεικονίζονται από τη χρήση TPG (ολικό προϊόν παράγεται) που αντιστοιχεί στο σχετικό δραστικότητα τελομεράσης. TPG υπολογίζεται από τον λόγο της μπάντας προϊόντος TRAP προς το εσωτερικό πρότυπο συγκρότημα προσδιορισμού τελομεράσης. έκφρασης (C) hTERT mRNA προσδιορίστηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. (C = έλεγχος).

Η

Η επίδραση της UO126 επί E2-επαγόμενη ενεργοποίηση του ρ44 /42

Προκειμένου να αξιολογηθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ Ε2 και της οδού ΜΑΡΚ, χρησιμοποιήσαμε ένα φωσφορυλιωμένο ειδικό ρ44 /42 ΜΑΡΚ αντισώματος για να ταυτοποιηθούν Ε2 επαγόμενη φωσφορυλίωση τυροσίνης αυτών των κινασών στην κυτταρική σειρά Ishikawa. Υπό συνθήκες άνευ ορού, παρατηρήσαμε ένα χαμηλό βασικό επίπεδο της τυροσίνης-φωσφορυλιωμένες μορφές της ρ44 /42. Μετά τη θεραπεία με 1 μΜ Ε2, φωσφορυλίωση ρ44 /42 ταχέως επάγεται και έφθασε μέγιστη επαγωγή 30 λεπτά μετά τη θεραπεία. Το επίπεδο της φωσφορυλίωσης του ρ44 /42 παρέμειναν αυξημένα για περίπου 60 λεπτά (Σχήμα 4Α). Η συνολική ρ44 /42 ΜΑΡΚ επίπεδο πρωτεΐνη παρέμεινε σταθερή κατά τη διάρκεια αυτών των πειραμάτων, όπως προσδιορίζεται με τη χρήση ενός μη φωσφορυλιωμένου αντισώματος σε ρ44 /42 για τις ίδιες κυτταρικές μεμβράνες. Η επώαση με 10 μΜ UO126 μπλοκαριστεί εντελώς E2-επαγόμενη φωσφορυλίωση του ρ44 /42 (Σχήμα 4Β και 4C).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μΜ Ε2, 10 μΜ UO126 (U) ή και τα δύο σε συνδυασμό για ένα ελάχιστο 15 λεπτά και ένα μέγιστο των 24 ωρών. Φωσφορυλίωση της p42 /44 προσδιορίστηκε με ανάλυση Western αποτύπωση. δραστικότητα ΜΑΡΚ εκτιμήθηκε με δοκιμασία ανοσοκαταβύθισης για Elk1. Ε2 επαγόμενη φωσφορυλίωση του ρ42 /44 (Α) και δραστηριότητα ΜΑΡΚ σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (D). UO126 ανέστειλε φωσφορυλίωση της δραστηριότητας ρ42 /44 ΜΑΡΚ και επαχθεί από την Ε2 (B, C και Ε). (C = έλεγχος).

Η

Για να επιβεβαιωθεί ότι η αυξημένη φωσφορυλίωση της ρ44 /42 αντιπροσώπευε την ενζυματική δραστικότητα της πρωτεΐνης, μετρήσαμε ρ44 /42 δραστικότητα κινάσης μέσω ενός ανοσοσυμπλόκου δοκιμασία κινάσης στο οποίο ΕΙκ1 εξυπηρετούνται ως υπόστρωμα. Ο παράγοντας μεταγραφής ΕΙκ1 είναι ένα πολύ γνωστό κατάντη στόχος της ρ44 /42 και θεωρείται ένα δείκτη δραστηριότητας ΜΑΡΚ. Παρατηρήσαμε μία μετρήσιμη αύξηση στην δραστικότητα του ρ44 /42 μετά από διέγερση Ε2, με μια μέγιστη κορυφή στα 30 λεπτά. Η δραστηριότητα της κινάσης ρ44 /42 ήταν ανάλογη με το βαθμό της φωσφορυλίωσης του ρ44 /42. UO126 μείωσε επίσης την ενεργότητα κινάσης ρ44 /42 επαχθεί από την Ε2 (Σχήμα 4D και 4Ε). Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώνουν μια σχέση μεταξύ Ε2 σηματοδότηση και την οδό ΜΑΡΚ στην κυτταρική σειρά Ishikawa.

Η επίδραση της Ε2 και UO126 επί της δραστικότητας προαγωγού hTERT

Με βάση προηγούμενη εργασία μας σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του ενδομητρίου [2], η μεταγραφική δραστικότητα του προαγωγού hTERT μπορεί να επιτυγχάνονται μέσω σύνδεσης ΕΚα να Eres βρίσκονται σε αυτόν τον υποκινητή. Η ρυθμιστική αλληλουχία προαγωγέα του γονιδίου hTERT περιέχει δύο υποθετικών Eres στην πλευρική αλληλουχία 5 ‘: το περιφερικό ένα στο -2777 /-2755 και το εγγύς ένα στο -979 /-956 που επικαλύπτει μια θέση σύνδεσης Sp1 [16], [ ,,,0],17]. Για να προσδιοριστεί εάν UO126 εμπλέκεται στη ρύθμιση δραστηριότητας hTERT υποκινητή επάγεται από Ε2, πραγματοποιήσαμε μια σειρά από παροδικές επιμολύνσεις με πλασμίδια ανταποκριτές λουσιφεράσης που περιέχουν τα διάφορα μήκη της περιοχής προαγωγέα 5 ‘του γονιδίου hTERT. Εν συντομία, τα κύτταρα Ishikawa επιμολύνθηκαν με δύο ERE αποκρίνονται ρεπόρτερ, ένα από τα οποία περιείχε και τις δύο θέσεις ΕΡΕ, και από την άλλη η οποία περιείχε μόνο το εγγύς ERE /Sp1 θέση (Σχήμα 5Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, Ε2 αυξημένη δραστηριότητα λουσιφεράσης από τις δύο ρεπόρτερ σε περίπου 2,5 έως 3 φορές εκείνη του μάρτυρα. UO126 μπλοκάρει αποτελεσματικά δραστικότητα λουσιφεράσης από αυτές ρεπόρτερ υπό την παρουσία Ε2 (Σχήμα 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο μονοπάτι ΜΑΡΚ εμπλέκεται σε E2 /ΕΚα-ενεργοποίηση των Eres στον υποκινητή hTERT? και ως εκ τούτου, αυτή η οδός μπορεί να είναι κρίσιμη στη μεσολάβηση hTERT μεταγραφική δραστικότητα επαχθεί από την Ε2.

Σχηματικό διάγραμμα των πλασμιδίων λουσιφεράσης hTERT υποκινητή που δείχνει δύο θέσεις πρόσδεσης ΕΡΕ και υποκινητή πυρήνα (Α). κύτταρα Ishikawa επιμολύνθηκαν με πλασμίδια λουσιφεράσης hTERT προαγωγό και δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε μετά από έκθεση σε 1 μΜ Ε2 ή 10 μΜ UO126 (U) για 36 ώρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD του διπλές δειγμάτων από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα. (C = έλεγχος).

Η

Τα αποτελέσματα των ERK1 /2-ειδικό siRNA σε συνδυασμό με Ε2 στη δραστηριότητα της τελομεράσης, η έκφραση hTERT και της δραστηριότητας υποστηρικτής hTERT σε Ishikawa κύτταρα

Για να επαληθεύει τη συμμετοχή του μονοπατιού ΜΑΡΚ στην επαγωγή Ε2 της δράσης της τελομεράσης, εξετάσαμε τις συνέπειες επιμόλυνση με ERK 1/2-ειδικό siRNA σε συνδυασμό με Ε2 για τη δράση της τελομεράσης, η έκφραση hTERT και της δραστηριότητας προαγωγού hTERT στην κυτταρική σειρά Ishikawa. ERK1 /2-ειδικό siRNA μειωμένη φωσφορυλίωση του ρ42 /44 που επάγεται από το οιστρογόνο στις 48 ώρες, όπως προσδιορίζεται με κηλίδωση Western ανάλυση (Σχήμα 6Α). Με πυκνομετρική ποσοτικοποίηση κανονικοποιούνται για τον έλεγχο πρωτεΐνη eIF4E, Ε2 αυξημένη φωσφορυλίωση της ρ42 /44 κατά 29%, και Ε2 παρουσία ERK1 /2 ειδικό siRNA μειωμένη φωσφορυλίωση του ρ42 /44 κατά 79%. δραστικότητα τελομεράσης και έκφραση hTERT αναλύθηκαν με ποσοτικό προσδιορισμό TRAP και σε πραγματικό χρόνο RT-PCR στις 48 ώρες (Σχήμα 6Β και 6C). Παρόμοια με τη θεραπεία με U0126, Ε2 που επάγεται αυξημένη δραστηριότητα τελομεράσης και έκφραση hTERT mRNA σε περίπου 2-3 ​​φορές εκείνη των ελέγχων, και αυτά τα διεγερτικά αποτελέσματα ήταν σχεδόν καταργήθηκε με την παρουσία ERK 1/2-ειδικό siRNA. δραστηριότητα Lucifersae προσδιορίστηκε αφού τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ERK1 /2 siRNA για 24 ώρες, που ακολουθείται από επιμόλυνση με το πλασμίδιο λουσιφεράσης hTERT υποκινητή (P3915) και στη συνέχεια επεξεργασία με 1 υΜ οιστρογόνων για 36 ώρες (Σχήμα 6D). Όπως διαπιστώθηκε για UO126, επιμόλυνση με ERK 1/2-ειδικό siRNA αποτελεσματικά μπλοκάρει δραστηριότητα λουσιφεράσης από τον προαγωγό P3915 παρουσία Ε2. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν περαιτέρω απόδειξη της σχέση μεταξύ της οδού ΜΑΡΚ και Ε2 μεσολάβηση επαγωγή της hTERT μεταγραφικής δραστηριότητας.

Τα κύτταρα είτε επιμολυσμένα με ERK1 /2 siRNA ή αρνητικός έλεγχος (Neg) για 8 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται με 1 υΜ οιστρογόνων για 36-48 ώρες. Η επίδραση της διαμολύνσεως με ERK 1/2-specfic siRNA επί της φωσφορυλίωσης για ρ42 /ρ44 που προκαλείται από τα οιστρογόνα εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western στις 48 ώρες (Σχήμα 6Α). δραστικότητα τελομεράσης και έκφραση hTERT αναλύθηκαν με ποσοτικό προσδιορισμό TRAP και σε πραγματικό χρόνο RT-PCR στις 48 ώρες (Σχήμα 6Β και 6C). δραστηριότητα Lucifersae προσδιορίστηκε αφού τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ERK1 /2 siRNA για 24 ώρες, που ακολουθείται από επιμόλυνση με το πλασμίδιο λουσιφεράσης hTERT υποκινητή (P3915) και στη συνέχεια επεξεργασία με 1 υΜ οιστρογόνων για 36 ώρες (Σχήμα 6D). (ITAS = εσωτερικό πρότυπο δοκιμασία της τελομεράσης, C = έλεγχος).

Η

Συζήτηση

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι Ε2 επάγει τη δράση της τελομεράσης και της έκφρασης hTERT mRNA σε ER-θετικό καρκίνο του ενδομητρίου κυτταρικές σειρές , ενδεχομένως μέσω της σύνδεσης του σε σύμπλοκο οιστρογόνου με Ετα να Eres βρεθεί εντός του υποκινητή hTERT. Στην παρούσα μελέτη, θέλαμε να αποσπάσει τον υποκείμενο μοριακό μηχανισμό που εμπλέκεται στη ρύθμιση της δράσης της τελομεράσης και η έκφραση του mRNA hTERT που προκαλείται από Ε2 ΕΚα-θετική κυτταρική σειρά Ishikawa. Δεδομένης της καλά-καθιερωμένη σχέση μεταξύ ΕΚα και της οδού ΜΑΡΚ, φαινόταν λογικό ότι αυτή η οδός μπορεί να εμπλέκεται στην επαγωγή τελομεράσης με Ε2.

Η θεραπεία με UO126, ένα πολύ εκλεκτικός αναστολέας και των δύο ΜΕΚ1 και ΜΕΚ2, ανέστειλε τη δράση της τελομεράσης και η έκφραση του mRNA hTERT στα κύτταρα Ishikawa. Επιπλέον, U0126 μπλοκαριστεί εντελώς E2-διεγερμένα δράση της τελομεράσης και η έκφραση hTERT mRNA. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν και μετά από επιμόλυνση με ERK 1/2-ειδικό siRNA. Η θεραπεία με Ε2 είχε σαν αποτέλεσμα ταχεία φωσφορυλίωση της p44 /42 MAPK και αυξημένη λειτουργική δραστηριότητα ΜΑΡΚ, και αυτό το αποτέλεσμα θα μπορούσε να καταργηθεί με την προσθήκη UO126. προσδιορισμοί λουσιφεράσης δείχνουν ότι η έκθεση σε UO126 ή ERK 1/2-ειδικό siRNA παρεμπόδισαν την διεγερτική δράση της θεραπείας Ε2 επί Eres βρίσκεται στον υποκινητή hTERT. Έτσι, παρέχουν αποδείξεις που Ε2 επάγει τη δράση της τελομεράσης και η έκφραση hTERT mRNA σε ΕΚα-θετικά καρκινικά κύτταρα του ενδομητρίου που εξαρτάται από τη σηματοδότηση μέσω της οδού ΜΑΡΚ. Για τις γνώσεις μας, μόνο μία άλλη μελέτη έχει ενοχοποιηθεί για έναν ρόλο συνεταιρισμό για ΜΑΡΚ στη ρύθμιση της hTERT με το ER, και αυτό ήταν ειδικά για Ετβ σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές του παγκρέατος [26].

Μια πληθώρα μελετών έχουν φαίνεται ότι η απόκριση των γονιδίων-στόχων σε οιστρογόνα εξαρτάται από διάφορους σημαντικούς παράγοντες που περιλαμβάνουν τη φύση του υποδοχέα οιστρογόνου, πλαίσιο συνδετήρα και κύτταρο, γονίδιο στόχο υποκινητή και ειδικών μεταγραφικών παραγόντων, καθώς επίσης και παράγοντες που επηρεάζουν την ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης και φωσφορυλίωση πρωτεΐνη [2] , [16], [27] – [29]. Ο υποκινητής της ανθρώπινης hTERT περιέχει μια ατελή στοιχείο απόκρισης οιστρογόνου (ERE) και ένα μισό χώρο ΕΡΕ /SP1. Εμείς και άλλοι έχουν βρει ότι η έκφραση του γονιδίου hTERT οιστρογόνων που προκαλείται από τη δράση της τελομεράσης και μπορεί να προκύψει από την άμεση σύνδεση του ΕΚα σε δύο ERE τοποθεσίες που βρίσκονται στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου hTERT [2], [15] – [17]. Εκτός Eres, η περιοχή αυτή διαθέτει συναινετικές αλληλουχίες για την πρόσδεση των παραγόντων μεταγραφής όπως Sp1, ΑΡ2, AP4, c-myc, NF-1 και Ε-box [8], [29] – [31]. Έχει αποδειχθεί ότι η ενεργοποίηση Ε2 του προωθητή hTERT πυρήνα μπορεί να εξαλειφθεί εντελώς όταν οι θέσεις C-Myc καταργηθεί από μεταλλάξεις [16]. Ε2 έχει επίσης βρεθεί να ενεργοποιήσει σημαντικά το υποκινητή c-Myc σε δοκιμασίες λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας c-Myc πλασμίδια υποκινητή-αναφοράς [16]. Με βάση αυτή κορυφώθηκε αποδείξεις, μπορεί να υποτεθεί ότι τα οιστρογόνα μπορεί να μεσολαβεί hTERT μεταγραφική δραστηριότητα μέσω ΕΚα Eres άμεσα δεσμευτικές στον υποκινητή hTERT ή εναλλακτικά, με E2-ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής που αλληλεπιδρούν με αυτόν τον υποκινητή, ή πιθανότατα μέσω ενός συνδυασμού και των δύο μηχανισμών.

Η ΜΑΡΚ καταρράκτη σηματοδότησης ρυθμίζει μια ποικιλία κυτταρικών δραστηριοτήτων, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης, την επιβίωση και τον κυτταρικό θάνατο. Αυτή η οδός πιστεύεται ότι είναι απαραίτητη για τη ρύθμιση του ΕΚα μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένου ενός νέου μηχανισμού με τον οποίο ΕΚα και ERK2 συν-εντοπίζεται σε θέσεις δέσμευσης χρωματίνη και συνεργάζονται στην ρύθμιση της ορμόνης διέγερσης του πολλαπλασιασμού [32], [33]. σηματοδότηση του υποδοχέα οιστρογόνου και ενεργοποίηση της οδού ΜΑΡΚ έχουν επίσης ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη και την εξέλιξη του ορμονικά γνώμονα καρκίνων, όπως του μαστού και καρκίνου του ενδομητρίου. Η προγεστερόνη έχει βρεθεί ότι αναστέλλει την επαγόμενη από οιστρογόνο-ενεργοποίηση της δραστικότητας τελομεράσης σε καρκίνο του ενδομητρίου κυτταρικές γραμμές [34] του μαστού και, και η οδός ΜΑΡΚ αποδείχθηκε να είναι εν μέρει υπεύθυνη για αυτή την ανταγωνιστική δράση. Tamoxifen, ένα κοινό επικουρική θεραπεία για τον καρκίνο του μαστού, έχει οιστρογόνο-όπως ιδιότητες στον ιστό της μήτρας και σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του ενδομητρίου. Θεραπεία του καρκίνου του ενδομητρίου κυττάρων με tamoxifen έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί στην επαγωγή της δράσης της τελομεράσης η οποία θα μπορούσε να μπλοκαριστεί αποτελεσματικά από έναν αναστολέα ΜΕΚ. Οι θέσεις δέσμευσης Sp1 και μοτίβα μέλος της οικογένειας ETS έχουν βρεθεί στον υποκινητή hTERT 5′-πλευρικής αλληλουχίας [30], [35] – [37], και αυτές αντιπροσωπεύουν πιθανούς παράγοντες μεταγραφής που στοχεύονται από την οδό ΜΑΡΚ και μπορεί να επαχθεί μέσω οιστρογόνα και προγεστερόνη σηματοδότησης.