Οι

Αφηρημένο

Πολλά αντικαρκινικά φάρμακα που προορίζονται για να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα από επαγωγή της απόπτωσης. Ωστόσο, οι δοκιμασίες δραστικότητας χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της βιοδραστικότητας αυτών των προϊόντων είναι γενικά προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας τα οποία δεν κάνουν διάκριση μεταξύ κυτταρικού θανάτου και αναστολής της ανάπτυξης. Εδώ περιγράφουμε έναν βιοαισθητήρα που βασίζεται σε κύτταρα μεταφορά ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET) που έχουν σχεδιαστεί για τη μέτρηση της βιοδραστικότητας της απόπτωσης φάρμακα που προκαλούν καρκίνο. Η βιοαισθητήρα περιέχει κυανό φθορίζουσα πρωτεΐνη (ΚΑΠ) που συνδέονται μέσω της κασπάσης 3 και κασπάσης 8 σειρές ειδική αναγνώριση διάσπαση σε κίτρινο φθορίζουσα πρωτεΐνη (YFP). Κατά την ενεργοποίηση της κασπάσης, όπως στην περίπτωση της επαγωγής απόπτωσης, ο συνδέτης διασπάται κατάργηση του σήματος κυψελοειδούς FRET. Αυτή η δοκιμασία αντικατοπτρίζει στενά το μηχανισμό δράσης των φαρμάκων κατά του καρκίνου, στη θανάτωση καρκινικών κυττάρων και συνεπώς μπορεί να λειτουργήσει ως δοκιμή ισχύος για διαφορετικά φάρμακα του καρκίνου. Εμείς αυστηρά αποδείξει αυτό μέσω του χαρακτηρισμού μιας κατηγορίας πρωτεϊνών που στοχεύουν τους υποδοχείς θανάτου. Ο προσδιορισμός ενός σταδίου φαίνεται να είναι ανώτερη από άλλους προσδιορισμούς απόπτωσης με βάση λόγω της απλότητάς του, την ευκολία και την ευρωστία

Παράθεση:. Bozza WP, Di Χ, Takeda Κ, Rivera Rosado LA, Pariser S, Ζανγκ Β (2014) η χρήση μιας εκφράζεται σταθερά FRET βιοαισθητήρα για τον προσδιορισμό της ισχύος του καρκίνου των ναρκωτικών. PLoS ONE 9 (9): e107010. doi: 10.1371 /journal.pone.0107010

Επιμέλεια: Wei Xu, Πανεπιστήμιο του Wisconsin – Madison, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Απρίλη 2014? Αποδεκτές: 10 Αυγούστου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 4η Σεπτεμβρίου του 2014

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα στοιχεία που περιλαμβάνονται στο έγγραφο

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων, το Κέντρο για την Αξιολόγηση Φαρμάκων και Έρευνας, Critical Path Πρωτοβουλία ταμείο? και η Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων, το Κέντρο για την Αξιολόγηση Φαρμάκων και Έρευνας, ταμείο ιατρική αντιμέτρων πρωτοβουλίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η ισχύς είναι ένα μέτρο της δραστηριότητας ενός φαρμάκου όσον αφορά τη συγκέντρωση ή το ποσό που απαιτείται για να παραχθεί μια ορισμένη βιολογική επίδραση [1]. Ως εκ τούτου, μία δοκιμασία δραστικότητας θα πρέπει να σχεδιαστεί για να αντανακλά όσο το δυνατόν περισσότερο οι μηχανισμοί της δράσης ενός φαρμάκου. Για ογκογόνο φάρμακα, τα οποία προορίζονται να σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα, μία δοκιμασία δραστικότητας θα ήταν ένα μέτρο της κυτταροτοξικότητας του φαρμάκου σε καρκινικά κύτταρα. Ιστορικά, πολλά χημειοθεραπευτικά μέσα ταυτοποιήθηκαν με διαλογή υψηλής παραγωγικότητος βιβλιοθηκών ενώσεων χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας με ΜΤΤ (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου) ή άλλες σχετικές χρωστικές [2], [3]. Αυτή η μορφή ανάλυσης έχει ευρέως υιοθετηθεί ως δοκιμή ισχύος στην ανάπτυξη φαρμάκων κατά του καρκίνου. Ωστόσο, δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας δεν μπορούν να διακρίνουν μεταξύ κυτταρικού θανάτου και των αποτελεσμάτων διακοπή αύξησης, αφήνοντας μια προειδοποίηση στην αξιολόγηση της πραγματικής βιοδραστικότητας ενός φαρμάκου καρκίνου. Καθώς ο στόχος της θεραπείας του καρκίνου είναι να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα, είναι κρίσιμο να εκτιμηθεί η ικανότητα ενός φαρμάκου να επάγει θάνατο των καρκινικών κυττάρων. Η μορφή κυτταρικού θανάτου πιο συχνά συνδέεται με τη θεραπεία του καρκίνου, τόσο

in vivo

και

in vitro

είναι απόπτωση ή προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο.

Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης είναι η ενεργοποίηση των πρωτεασών κασπάσης, με αποτέλεσμα την διάσπαση των δομικών πρωτεϊνών και το σχηματισμό αποπτωτικών σώμα [4]. Υπάρχουν δύο διακριτών οδών, δηλαδή ενδογενείς και εξωγενείς, που οδηγούν σε ενεργοποίηση της κασπάσης σε απόκριση σε μία θεραπεία φαρμάκου. Κλασική χημειοθεραπείες όπως ετοποσίδη, κομπακτίνη, φθοριοουρακίλη (5-FU), ταξόλη, και καμπτοθεκίνη επάγει την ενεργοποίηση της κασπάσης 3 σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο [5] – [7], το οποίο συχνά περιλαμβάνει μιτοχονδριακή αλλοιώσεις. Αντίθετα, μια νέα κατηγορία πρωτεϊνών που στοχεύουν τους υποδοχείς θανάτου που εκφράζονται στην επιφάνεια των κυττάρων είναι υπό ανάπτυξη [8] – [11]. Αυτές οι πρωτεΐνες περιλαμβάνουν το ανασυνδυασμένο ανθρώπινο παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF) παραλλαγές, TNF συνδετήρα που σχετίζονται με την απόπτωση που επάγει (TRAIL) και αγωνιστικά αντισώματα υποδοχέα θανάτου. TRAIL δεσμεύεται στον υποδοχέα θανάτου 4 και /ή 5 (DR4 /5) και εν συνεχεία προκαλεί την συναρμολόγηση ενός επάγει θάνατο σύμπλεγμα σηματοδότησης (ΔΙΣΚΟΣ) που περιέχει πρωτεΐνη προσαρμογέα Fas-πρωτεΐνη που συνδέεται με πεδίου θανάτου (FADD) και προ-κασπάσης 8. Εντός ο δίσκος, προ-κασπάσης 8 ενεργοποιείται από την αυτο-διάσπαση και απελευθερώνεται στο κυτοσόλιο όπου ενεργοποιεί κασπάση 3. σε μερικούς τύπους κυττάρων, ο αποπτωτικός σηματοδότηση ενισχύεται περαιτέρω

μέσω

μιτοχόνδρια, ως αποτέλεσμα της μετατόπιση της κασπάσης 8 που προκαλείται διάσπαση της προσφοράς (BH3 πρωτεΐνη αλληλεπιδρά-περιοχή). Έτσι, η ισχύς ενός αντικαρκινικού φαρμάκου μπορεί να εκτιμηθεί με μέτρηση του μεγέθους της δραστηριότητας της κασπάσης σε επεξεργασμένα κύτταρα. Μία προσέγγιση στην μέτρηση της δραστικότητας κασπάσης υπήρξε η χρήση φθοριζόντων ανιχνευτών που περιέχουν υποστρώματα κασπάσης, εμφανίζοντας τις αλλαγές στην ένταση φθορισμού κατά την ενεργοποίηση της κασπάσης [12] – [16]. Εναλλακτικά, ενεργός κασπάσες μπορούν να ανιχνευθούν με ανάλυση ανοσοκηλίδος χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για το διασπασμένο μορφή του επιμέρους ενζύμου [14], [17] – [19]. Ωστόσο, αυτές οι δοκιμασίες μπορεί να συνδέονται με μεγάλη μεταβλητότητα λόγω των πολύπλοκων διαδικασιών λειτουργίας. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναπτύξει μια δοκιμασία FRET βασίζεται σε κύτταρα για τη δοκιμή της δραστικότητας των προϊόντων του καρκίνου. Ο ανιχνευτής FRET περιέχει αλληλουχίες αναγνώρισης για τις δύο κασπάσης 3 και κασπάση 8 και βρέθηκε να είναι ευαίσθητος προς φαρμάκων κατά του καρκίνου που δρουν μέσω ενδογενούς ή εξωγενούς οδών. Αξίζει να σημειωθεί ότι με την εκφράζονται σταθερά ανιχνευτή FRET, το φάρμακο που προκαλείται από απόκριση παρακολουθείται απευθείας επί των κατεργασμένων κυττάρων χωρίς επιπλέον στάδια επεξεργασίας. Επιπλέον, η δοκιμασία FRET ανιχνεύει κύτταρα που υφίστανται απόπτωση με αξιοσημείωτη ευαισθησία και πειραματική απλότητα, καθιστώντας το ένα ελπιδοφόρο δοκιμασία ισχύος για την αξιολόγηση των φαρμάκων κατά του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

MDA-MB-231 ανθρώπινου μαστού καρκινική κυτταρική σειρά αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ενα πλασμίδιο pCMV6-AC για την έκφραση μιας πρωτεΐνης σύντηξης (552 αμινοξέα) που περιέχει πλήρους μήκους κυανό φθορίζουσα πρωτεΐνη (ΚΑΠ) και κίτρινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (YFP) συνδέεται μέσω ενός αλληλουχία αναγνώρισης caspase αγοράστηκε από ΟηΟεηε (Rockville, MD). Ο συνδετήρας μεταξύ ΚΑΠ και YFP περιέχει δεκαέξι αμινοξέα, GSGDEVDGGIETDGSG, η οποία μπορεί να διασπαστεί με ενεργοποιημένο κασπάσης 3 σε G ↓ DEVD ή κασπάσης 8 στο G ↓ IETD, όπου ↓ υποδεικνύει θέση κοπής πρωτεάσης. Η αλληλουχία κωδικοποίησης cDNA (1656 ζεύγη βάσεων) για την πρωτεΐνη σύντηξης ΟΡΡ-συνδέτη-YFP κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα pCMV6-AC σε SGF Ι και ΜΙυ Ι θέσεις περιορισμού και το σωστό κατασκεύασμα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας νουκλεοτιδίων. Το πλασμίδιο διαμολύνθηκε σε κύτταρα ΜΒ231 χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 ανά τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen, Carlsbad, CA). Τα επιμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν κατά νεομυκίνη (G418) στο 1 mg /ml (Corning Cellgro, Manassas, VA). ανθεκτικοί σε G418 κλώνοι τη χρήση κυλίνδρων κλωνώσεως (Millipore, Temecula, CA) και εξετάστηκαν για τα επίπεδα έντασης φθορισμού και η έκφραση πρωτεΐνης. Ο σταθερός κλώνος με τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του ανιχνευτή ΚΑΠ-συνδέτη-YFP, αναφέρεται ως MB231_CFP-YFP, χρησιμοποιήθηκε στις ακόλουθες αναλύσεις. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM /F-12 50/50 μέσα συμπληρωμένα με 5% FBS, 4 mM L-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, και 0,4 mg /ml θειικής G418. Γονικά κύτταρα ΜΒ231 καλλιεργήθηκαν στο ίδιο μέσο χωρίς την προσθήκη θειικού G418. Τόσο ανασυνδυασμένου ανθρώπινου TRAIL (rhTRAIL, Cat # 375-TEC) και ένα αγωνιστικό μονόκλωνο αντίσωμα (Cat # MAB631) ειδικά για τον υποδοχέα θανάτου 5 αγοράστηκαν από την R &? Συστήματα D (Minneapolis, ΜΝ). Η rhTRAIL υπάρχει ως ομοτριμερές, όπου κάθε μονομερές αποτελείται από τα αμινοξέα 114-281 της φυσικής εξωκυτταρική περιοχή ανθρώπινου TRAIL. Η σταυροσπορίνη αγοράστηκε από ApexBio (Boston, ΜΑ). Η καμπτοθεκίνη και ετοποσίδη αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ). 5-FU αγοράστηκε από Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY). Κομπακτίνη αγοράστηκε από Santa Cruz (Ντάλας, Τέξας). Η ταξόλη αγοράστηκε από την Calbiochem (La Jolla, CA).

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5 -diphenyltetrazolium βρωμίδιο (ΜΤΤ) χρωματομετρικής δοκιμασίας όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Εν συντομία, 1,0-2,0 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο των 96 φρεατίων. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με τον κυτταροτοξικό παράγοντα. Μετά την επεξεργασία του φαρμάκου, το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας αναρροφήθηκε και ΜΤΤ (2 mg /ml σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS) προστέθηκε στη συνέχεια σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκε για 2 ώρες στους 37 ° C. Το υπερκείμενο στη συνέχεια αναρροφάται και το αδιάλυτο προϊόν φορμαζάνης διαλύθηκε σε DMSO. Η απορρόφηση για φορμαζάνης χρώση μετρήθηκε στα 562 nm χρησιμοποιώντας ένα SpectraMax Plus 384 αναγνώστη μικροπλακός (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Σχετική OD

562 για κάθε φρεάτιο απεικονίσθηκε συναρτήσει του log τιμή της συγκέντρωσης του κυτταροτοξικού παράγοντα σε μοριακή. ΕΚ

50 τιμές προσδιορίστηκαν με την τοποθέτηση της καμπύλης δόσης-απόκρισης στην εξίσωση 1, το Υ = Κάτω + (Top-Bottom) /(1 + 10∧ ((LogEC

50-Χ) * Hillslope)), χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism. Το Χ είναι ο λογάριθμος της συγκέντρωσης του παράγοντα κυτταροτοξικών σε μοριακή και το Υ είναι η μετρούμενη τιμή απορρόφησης. Κάθε σημείο δεδομένων επαναλήφθηκε εις τριπλούν.

Η κυτταρομετρία ροής

3,0 × 10

5 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κάθε φρεάτιο πλακών των 6 φρεατίων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με TRAIL ή αντίσωμα αντι-DR5. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν, χρωματίστηκαν με αννεξίνη-V-APC (eBioscience, San Diego, CA) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ, St Louis, ΜΟ), και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια ροή BD Accuri C6 κυτταρόμετρο (BD, Franklin Lakes, NJ) [ ,,,0],21].

ανάλυση ανοσοστυπώματος ανάλυση

Western blot πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA [0,5 Μ Tris-HCl (ρΗ 7.4), 1.5 Μ NaCl, 2.5% δεοξυχολικό οξύ, 10% ΝΡ-40, 10 mM EDTA, και αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ] (EMD Millipore, Darmstadt, Γερμανία ). Τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση και η συνολική ποσότητα πρωτείνης προσδιορίστηκε με δοκιμασία BCA (Pierce, Rockford, IL). Ίση ποσότητα πρωτεΐνης (30 μg) επιλύθηκε με SDS-PAGE χρησιμοποιώντας NuPAGE 4-12% κλίση γέλες Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Αντισώματα ειδικά για ΚΑΠ και YFP ήταν από Covance (Gaithersburg, MD), αντισώματα ειδικά για κασπάση 8 και κασπάσης 3 ήταν από τη Cell Signaling (Danvers, ΜΑ), και αντισώματα ειδικά για την ακτίνη ήταν από την Santa Cruz (Dallas, ΤΧ). Υπεροξειδάση συζευγμένο αντι-ποντικού, αντι-κουνελιού, ή IgG αντισώματα αντι-αίγας χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα. ανίχνευση ανοσοκηλίδας οπτικοποιήθηκε με Immobilon Western χημειοφωταύγειας HRP Substrate (Millipore, Billerica, ΜΑ) και ένα LAS-4000 σύστημα κάμερας CCD (Fujifilm, Edison, NJ).

τηλέφωνα που βασίζονται FRET ανάλυση κυτταροτοξικότητας

1.8 έως 5.4 × 10

4 κύτταρα MB231_CFP-YFP καλλιεργήθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας μαύρης μικροπλάκας 96. Μετά τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί μία νύκτα, μέσα κυτταρικής καλλιέργειας αναρροφήθηκε και ρυθμιστικό διάλυμα PBS που περιείχε κυτταροτοξικό παράγοντα (TRAIL, αντι-DR5 αντίσωμα, ή σταυροσπορίνη) προστέθηκε σε προσκολλημένα κύτταρα για υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Λόγω της απαίτησης της μεγαλύτερης περιόδου επώασης για τη θεραπεία καμπτοθεκίνη, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ϋΜΕΜ μέσο που περιέχει το κυτταροτοξικό φάρμακο για 48 ώρες πριν από την υποκατάσταση του μέσου με ρυθμιστικό διάλυμα PBS και επιτρέποντας την επώαση να προχωρήσει για επιπλέον 24 ώρες. Αυτή η διαδικασία εκτελείται επίσης για ετοποσίδη, κομπακτίνη, 5-FU, και ταξόλη. Μετά την επεξεργασία του φαρμάκου του σήματος FRET του κάθε δείγματος προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας φθορισμού FluoDia T70 (PTI, Edison, NJ). Επεξεργασμένα κύτταρα διεγέρθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο διέγερσης 425 ± 10 nm. Για τον προσδιορισμό FRET, μετά την αφαίρεση του υποβάθρου, υπολογίστηκαν αναλογίες εκπομπής YFP (530 ± 5 φίλτρου nm) και της Κοινής Αλιευτικής Πολιτικής (486 ± 5 φίλτρου nm). Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν FRET και συναρτήσει της τιμής log της συγκέντρωσης κυτταροτοξικού παράγοντα σε μοριακή χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism. ΕΚ

50 τιμές προσδιορίστηκαν μέσω μη γραμμικής καμπύλης με εξίσωση 2, Υ = 100 /(1 + 10∧ ((LogEC

50-Χ) * Χιλ Κλίση)). Το Χ είναι ο λογάριθμος της συγκέντρωσης του παράγοντα κυτταροτοξικών σε μοριακή και Υ είναι η κανονικοποιημένη τιμή FRET. Κάθε σημείο δεδομένων επαναλήφθηκε εις τριπλούν για ένα μόνο πείραμα και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε ανεξάρτητα τουλάχιστον δύο φορές.

Βιοχημικός χαρακτηρισμός του ανιχνευτή FRET

Για να χαρακτηριστεί η έκφραση του ΚΑΠ-συνδέτη-YFP ανιχνευτή , η εκφρασμένη πρωτεΐνη απομονώνεται χρησιμοποιώντας αντι-CFP αντισώματος /YFP. Εν συντομία, 1.2 χ 10

6 κύτταρα MB231_CFP-YFP συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε 1 ml ρυθμιστικού Pierce ανοσοκαθίζησης λύσης. 25 μΐ αντι-CFP /YFP αντίσωμα συζευγμένο με Sepharose (Abcam, Cambridge, ΜΑ) περιστράφηκε με κυτταρικό λύμα συντρίμμια ατελώς για 3 ώρες στους 4 ° C. Μετά από έκπλυση με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, δεσμεύεται CFP-ανιχνευτή συνδέτη-YFP FRET εκλούστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα 50 mM Tris (ρΗ 8.5) που περιείχε 1 Μ NaCl. Αμέσως μετά την έκλουση η πρωτεΐνη αραιώνεται με ρυθμιστικό διάλυμα Tris για να δώσει μία τελική συγκέντρωση NaCl 300 mM. καθαρότητα πρωτεΐνη οπτικοποιήθηκε με SDS-PAGE και χρώση με Coomassie blue και με ανάλυση ανοσοκηλίδος χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για ΚΑΠ και YFP (περιγράφεται ανωτέρω).

Για

in vitro

FRET προσδιορισμούς, ανοσο-καθαρισμένο ΚΑΠ ανιχνευτής -συνδετήρας-YFP FRET επωάστηκε με δραστική κασπάση 3, κασπάση 8, ή κασπάση 2 (R & amp? συστήματα D, Minneapolis, ΜΝ) για 3 ώρες στους 25 ° C σε ρυθμιστικό PBS που περιέχει 1 mM DTT χρησιμοποιώντας μαύρο 96 φρεατίων. Ως έλεγχος Z-VAD προστέθηκε επίσης σε ορισμένες αντιδράσεις. FRET μετρήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω.

συνεστιακή μικροσκοπία

1,5 × 10

4 κύτταρα MB231_CFP-YFP καλλιεργήθηκαν επί 4 καλά θάλαμο συστήματα βοριοπυριτικό coverglass (Nunc, Rochester, ΝΥ) για μία ημέρες πριν από το πείραμα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του TRAIL (0-25 ng /ml) για 2.5 ώρες πριν από την απεικόνιση. Τα κύτταρα απεικονίστηκαν με 63x αντικειμενικό φακό και ένα Zeiss κυττάρων Παρατηρητής Κλωστήρια σύστημα Disk Ομοεστιακή μικροσκόπιο (Thornwood, Νέα Υόρκη) με ένα περιβαλλοντικό θάλαμο Pecon. FRET αποδοτικότητα προσδιορίσθηκε με ανίχνευση ευαισθητοποιημένων εκπομπών [22], [23]. γραμμές λέιζερ διέγερσης με μήκος κύματος 458, 514, και 458 nm χρησιμοποιήθηκαν για δότης ΚΑΠ, δέκτη YFP, και FRET κανάλια, αντίστοιχα. Το φίλτρο εκπομπής για ΚΑΠ 485/30, ενώ το φίλτρο εκπομπής για YFP και FRET ήταν 535/30. Dichroic διαχωριστή δέσμης για το κεφάλι Yokogawa ομοεστιακή σάρωση ήταν RIFT 457/514/647 nm. Μετά την απόκτηση τους παράγοντες διόρθωσης για μεμονωμένα εξέφρασε ΚΑΠ και YFP, εικόνες κυττάρων αποκτήθηκαν για τα κύτταρα MB231_CFP-YFP μέσω της ΚΑΠ, YFP, και FRET κανάλια με τον ίδιο τρόπο. σύνολα δεδομένων από 9 εικόνες αποθηκεύονται ως μορφή Zvi για μελλοντική ποσοτική ανάλυση. λογισμικού Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση FRET ευαισθητοποιημένων εκπομπών. Η αποτελεσματικότητα FRET υπολογίστηκε με βάση ένα σύστημα τριών-φίλτρο, το οποίο ομαλοποιείται κατά δότη και δέκτη εντάσεις, επιτρέπει τον υπολογισμό των cross talk και την επαλήθευση της πραγματικής σήματος FRET [24], [25]. Η τιμή απόδοσης FRET υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο Xia [24]. Τρία τυχαία επιλεγμένες εικόνες ελήφθησαν για κάθε πείραμα. Από αυτές τις εικόνες υπολογίστηκε η απόδοση FRET. Δύο με τρεις περιοχές ενδιαφέροντος (ROI) τοποθετήθηκαν για ένα αντίστοιχο κύτταρο και δέκα με δεκαπέντε ROI που υποβλήθηκαν σε FRET ανάλυση.

Αποτελέσματα

Δημιουργία ενός κυττάρου που βασίζεται FRET βιοαισθητήρα

ΜΒ231 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού διαμολύνθηκαν σταθερά με μια έκφραση πλασμίδιο που κωδικοποιεί CFP-συνδέτη-YFP πρωτεΐνη σύντηξης (MB231_CFP-YFP), όπου λειτουργεί ΚΑΠ ως δότης και YFP ως δέκτης για τη μεταφορά ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET). Ο συνδέτης περιέχει τόσο αλληλουχίες κασπάσης 3 και κασπάση 8 αναγνώριση, DEVD και IETD αντίστοιχα, τα οποία αναμένεται να είναι ευαίσθητος σε φάρμακα λειτουργούν

μέσω

είτε ενδογενούς ή εξωγενούς οδούς απόπτωσης. Κατά την ενεργοποίηση της κασπάσης ακόλουθη φαρμακευτική αγωγή, ο συνδέτης που συνδέει ΚΑΠ και YFP θα διασπάται και στη συνέχεια θα αποδώσει ένα απώλεια του σήματος κυψελοειδούς FRET. Αυτή η μεθοδολογία επιτρέπει την ισχυρή βιοαισθητήρα FRET υπηρετούν ως δείκτης της απόπτωσης (Εικόνα 1Α). Η κυτταρική γραμμή ΜΒ231 επιλέχθηκε ως υπόστρωμα κύτταρο επειδή έχει αποδειχθεί ότι είναι πλήρως ευαίσθητα σε μία ποικιλία κυτταροτοξικών παραγόντων, που συνεπάγεται τη λειτουργική ακεραιότητα του μηχανήματος απόπτωσης [3], [18]. Μία τέτοια κυτταρική πλατφόρμα αναμένεται να είναι χρήσιμα για την ανάλυση της δραστικότητας των διαφόρων φαρμάκων κατά του καρκίνου.

(Α) Σχηματική άποψη του προσδιορισμού FRET. Ο ανιχνευτής FRET, CFP-συνδέτη-YFP, εκφράζεται ως μια πρωτεΐνη σύντηξης που περιέχει ΚΑΠ και YFP συνδέονται μέσω ενός πεπτιδίου αλληλουχία 16 αμινοξέων: GSGDEVDGGIETDGSG. Η συνδετική περιοχή περιέχει αλληλουχίες αναγνώρισης για κασπάσης 3 (DEVD) και κασπάσης 8 (IETD), η οποία μπορεί να διασπαστεί εκλεκτικά από τα αντίστοιχα ένζυμα κατά την επαγωγή των εγγενών ή /και εξωγενείς οδούς απόπτωσης. (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης ανιχνευτή ΚΑΠ-συνδέτη-YFP FRET σταθερά εκφράζονται σε ΜΒ231 κύτταρα. (C) Τα κύτταρα που εκφράζουν CFP-ανιχνευτή συνδέτη-YFP FRET παρήγαγε μια σημαντική και σταθερό σήμα FRET, τα κύτταρα επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS για 0-24 ώρες. (Δ) Η CFP-ανιχνευτής συνδέτη-YFP FRET ανοσοκαθαρίστηκε από κυτταρικό λύμα MB231_CFP-YFP και οπτικοποιήθηκαν με SDS-PAGE και χρώση Coomassie Blue (κορυφή) ή με ανάλυση ανοσοστυπώματος (κάτω). (Ε) Οι αλλαγές στην FRET παρακολουθήθηκαν όταν 100 ηΜ καθαρίστηκε CFP-πρωτεΐνη συνδέτη-YFP επωάστηκε με 100 ηΜ ανασυνδυασμένη δραστική κασπάση 3 (C3), κασπάσης 8 (C8), ή κασπάσης 2 (C2) για 3 ώρες. pvalues ​​προσδιορίστηκαν με τη χρήση t-test του Student.

Η

Εμείς επιβεβαίωσε την πρώτη έκφραση του CFP-ανιχνευτή συνδετήρας-YFP FRET με ανάλυση ανοσοαποτύπωσης, χρησιμοποιώντας ένα πρωτογενές αντίσωμα που αναγνωρίζει ΚΑΠ και YFP. Μια ισχυρή μπάντα ειδικά ανέπαφη πρωτεΐνη CFP-συνδέτη-YFP (αναμενόμενο μοριακό βάρος 55 kDa) παρατηρήθηκε στο προϊόν λύσης των κυττάρων MB231_CFP-YFP αλλά όχι γονικών κυττάρων (Σχήμα 1Β). Στη συνέχεια θα εξεταστεί αν τα κύτταρα MB231_CFP-YFP θα μπορούσε να παρέχει ένα λογικό σήμα FRET. Προκειμένου να εξαλειφθούν συμπέρασμα από τα συστατικά μέσα, μέσα κυτταρικής καλλιέργειας αναρροφήθηκε από τα κύτταρα MB231_CFP-YFP προσκολλάται σε 96 φρεατίων. ρυθμιστικό διάλυμα PBS προστέθηκε σε κάθε σήμα καλά και η FRET υπολογίστηκε με λήψη της αναλογίας μεταξύ εκπομπή φθορισμού δέκτη (530 ± 5 nm) και εκπομπή φθορισμού δότη (486 ± 5 nm) όταν τα δείγματα ήταν ενθουσιασμένοι στα 425 ± 10 nm χρησιμοποιώντας ένα φθορισμού ανάγνωσης πλάκας. Πράγματι, υπό αυτές τις συνθήκες ανιχνεύθηκε ένα σημαντικό σήμα FRET για τα κύτταρα MB231_CFP- YFP (Σχήμα 1C). Αξίζει να σημειωθεί ότι, ο ανιχνευτής FRET βρέθηκε να είναι σταθερός σε κύτταρα βυθισμένος σε ρυθμιστικό PBS για μέχρι 24 ώρες (Εικόνα 1 C). Ως μάρτυρας, μη-επιμολυσμένα μητρικά κύτταρα ΜΒ231 προσδιορίστηκαν παράλληλα οι οποίες δεν παράγουν καμία σημαντική σήμα φθορισμού πάνω από το θόρυβο υποβάθρου όταν διεγείρεται στα 425 ± 10 nm.

Ανοσοκαταβύθιση του καθετήρα ΚΑΠ-σύνδεσμος-YFP FRET διεξήχθη σε επιβεβαιώνουν την επιλεκτικότητα της για κασπάσης 3 και κασπάσης 8 διάσπασης. CFP-ανιχνευτή συνδέτη-YFP FRET καθαρίστηκε από προϊόν λύσης κυττάρου χρησιμοποιώντας αντι-CFP /YFP αντίσωμα συζευγμένο με σφαιρίδια sepharose. Δεσμευμένου ανιχνευτή FRET εκλούστηκε χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό Τρις που περιέχει 1 Μ NaCl. Απομονωμένα FRET διερευνητή χαρακτηρίστηκε χρησιμοποιώντας SDS-PAGE με χρώση Coomassie blue (Σχήμα 1 D, άνω μέρος) και ανάλυση ανοσοκηλίδας (Σχήμα 1D, κάτω). Για να αξιολογηθεί η ειδικότητα της κασπάσης, το καθαρισμένο FRET διερευνητή επωάστηκε με ανασυνδυασμένες μορφές της δραστικής κασπάσης 3, κασπάσης 8, κασπάσης ή 2. Αλλαγές σε FRET παρακολουθήθηκαν (Σχήμα 1 Ε). Όπως αναμενόταν η διάσπαση του ανιχνευτή FRET ήταν ειδική για κασπάσης 3 και κασπάση 8, και οδήγησε σε μια σημαντική ελάττωση του σήματος FRET. Σταθερά, η διάσπαση του ανιχνευτή FRET καταργήθηκε πλήρως, όταν το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε με τον αναστολέα κασπάσης-τηγάνι (Ζ-VAD). Αντιθέτως, σχεδόν καμία διάσπαση του ανιχνευτή FRET ανιχνεύθηκε όταν ανιχνευτής CFP-συνδέτη-YFP FRET επωάστηκε με κασπάση 2.

Αξιολόγηση του βιοαισθητήρα FRET για χρήση στις δοκιμές δραστικότητας για τον υποδοχέα θανάτου στοχευμένες θεραπείες του καρκίνου

με τον σταθερώς επιμολυσμένα ανιχνευτή FRET, ελέγξαμε πρώτα την καταλληλότητά του για τη μέτρηση της ισχύος μιας κατηγορίας πρωτεϊνών που επάγουν απόπτωση με στοχοθέτηση των υποδοχέων θανάτου (ΑΔ). Αυτές περιλάμβαναν ανασυνδυασμένο ανθρώπινο TNF που σχετίζονται με την απόπτωση που επάγει συνδέτη (TRAIL) και αγωνιστικά αντισώματα για DR5, τα οποία είναι υπό ανάπτυξη σε πολλαπλές κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία του καρκίνου. Τα προϊόντα αυτά λειτουργούν μέσω DR4 και /ή DR5 που εκφράζεται στην επιφάνεια των κυττάρων στόχων. Μόλις ενεργοποιηθεί, η ενδοκυτταρική περιοχή θανάτου διευκολύνει τη συναρμολόγηση των προ-κασπάσης 8/10 και έναν προσαρμογέα πρωτεΐνη FADD σε ένα θάνατο επάγει σύμπλεγμα σηματοδότησης (DISC), οδηγώντας σε μία διαδοχική ενεργοποίηση της κασπάσης 8 και κασπάσης 3. Έτσι, οι παράγοντες αυτοί χρησιμεύουν ως άριστη ανιχνευτές για να δοκιμαστεί η μηχανική FRET βιοαισθητήρα. Όπως φαίνεται προηγουμένως για τα γονικά κύτταρα ΜΒ231 [18], τα κύτταρα MB231_CFP-YFP διατήρησε μια παρόμοια επιδεκτικότητα σε TRAIL και αντι-DR5 αντίσωμα. Αυτό δείχθηκε πρώτα με προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας ΜΤΤ με βάση όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του TRAIL ή αντι-DR5 αντίσωμα. Μια παρόμοια καμπύλη δόσης-απόκρισης και ΕΚ

50 τιμή ελήφθη και για τα δύο κύτταρα και τα κύτταρα parental_MB231 MB231_CFP-YFP όταν θεραπεύτηκαν με TRAIL ή αντι-DR5 αντίσωμα (Σχήμα 2Α και Πίνακας 1). Όταν αναλύθηκαν για επαγωγή απόπτωσης, και οι δύο κυτταρικές σειρές παρουσίασαν παρόμοια δοσοεξαρτώμενη αύξηση σε αποπτωτικά κύτταρα μετά από θεραπεία με TRAIL ή αντίσωμα αντι-DR5 (Σχήμα 2Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η επιμόλυνση της FRET βιοαισθητήρα δεν είχε καμία επίδραση στην κυτταρική απόκριση προς DR-στοχευμένες θεραπείες. Η σταθερή κυτταρική γραμμή MB231_CFP-YFP φάνηκε να διατηρήσει ανέπαφη μηχανήματα απόπτωση, υποστηρίζοντας έτσι την χρήση του ως υπόστρωμα κυττάρου για τη δοκιμή της κυτταροτοξικότητα των αντικαρκινικών φαρμάκων.

(Α) Η γονική ΜΒ231 (γεμάτα μαύρο) και MB231_CFP-YFP ( ανοίξει σαφής) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TRAIL (0-100 ng /ml) για 2.5 ώρες ή αντίσωμα αντι-DR5 (0-200 μg /ml) για 20 ώρες, στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο Α και αναλύθηκαν για απόπτωση με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με Annexin-V-APC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). ρ-τιμές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student. ΕΚ

50 τιμές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μη γραμμική προσαρμογή καμπύλης, όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Για κάθε

50 τιμή ΕΚ, 95% διαστήματα εμπιστοσύνης αντανακλά την στατιστική ακρίβεια αναφέρονται στον Πίνακα 1.

Η

Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η διάσπαση του ανιχνευτή FRET σε απόκριση σε θεραπεία με TRAIL ή αντίσωμα αντι-DR5. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα MB231_CFP-YFP υποβλήθηκαν σε αγωγή με TRAIL και αντίσωμα αντι-DR5. ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως απεκάλυψε μία συσχέτιση μεταξύ της ενεργοποίησης κασπάσης και διάσπαση του ανιχνευτή ΚΑΠ-συνδέτη-YFP FRET σε όλα τα επίπεδα δόσης (Σχήμα 3Α και 3Β).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με (Α) 0-300 ng /ml TRAIL για 2,5 ώρες ή (Β) 0-50 μg /ml αντι-DR5 αντίσωμα επί 20 ώρες. Τα προκύπτοντα κύτταρα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για κασπάση 3 (C3), κασπάσης 8 (C8), και CFP /YFP.

Η

Για την μέτρηση FRET, τα κύτταρα MB231_CFP-YFP καλλιεργήθηκαν σε 96 φρεατίων όλη τη νύκτα σε DMEM μέσα ενημέρωσης. μέσο καλλιέργειας κυττάρων απομακρύνθηκε και ρυθμιστικό διάλυμα PBS που περιείχε διάφορες συγκεντρώσεις του TRAIL ή αντι-DR5 αντίσωμα προστέθηκε σε προσκολλημένα κύτταρα για 2.5 ώρες και 20 ώρες αντίστοιχα. Στους χρόνους που υποδεικνύονται, FRET σήματα μετρήθηκαν απευθείας σε μεμονωμένα δείγματα με μια ρύθμιση διέγερσης 425 ± 10 nm και εκπομπή ρυθμίσεις του 530 ± 5 nm για YFP και 486 ± 5 nm για ΚΑΠ χρησιμοποιώντας ένα αναγνώστη πλάκας φθορισμού. Μία εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στη FRET ταυτίστηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του TRAIL και αντι-DR5 αντίσωμα (Σχήμα 4Α και 4Β). FRET οι τιμές ομαλοποιήθηκαν και συναρτήσει της λογαριθμική τιμή του TRAIL και αντι-DR5 συγκέντρωση αντισώματος σε γραμμομοριακή χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism (Σχήμα 4Α και 4Β), αποδίδοντας ΕΚ

50 τιμές μετά από μη γραμμική προσαρμογή καμπύλης στην εξίσωση 2 (Πίνακας 1). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η δοκιμασία FRET παράγεται ΕΚ

50 τιμές που είναι συνεπείς με αυτές από τις συμβατικές δοκιμασίες (ΜΤΤ, κυτταρομετρία ροής, και η ανάλυση ανοσοαποτύπωσης). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν τη χρήση της δοκιμασίας FRET βασίζεται σε κύτταρα για την ανάλυση της βιοδραστικότητας του DR-στοχευμένων θεραπειών. Συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιήθηκε επίσης για να αξιολογηθεί η αλλαγή στον κυτταρικό FRET όταν τα κύτταρα MB231_CFP-YFP υποβλήθηκαν σε αγωγή με TRAIL (Σχήμα 4C). Μια έντονη στροφή από YFP εκπομπών δέκτη (κίτρινο) στην εκπομπή του δότη ΚΑΠ (κυανό) μπορεί να παρατηρηθεί για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αυξανόμενη συγκέντρωση του TRAIL με μια ρύθμιση διέγερση = 458 nm. Κύτταρα

MB231_CFP-YFP υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ( Α) 0-300 ng /ml TRAIL για 2.5 ώρες και (Β) 0-100 μg /ml αντι-DR5 αντίσωμα επί 20 ώρες. FRET υπολογίστηκε και αντιπροσωπεύεται χρησιμοποιώντας γραφικές παραστάσεις γραμμή στην αριστερή πλευρά του πίνακα. ΕΚ

50 τιμές προσδιορίστηκαν με μη-γραμμική καμπύλη τοποθέτηση σε κανονικοποιημένες τιμές FRET παρίστανται γραφικώς έναντι των τιμών log του TRAIL και η συγκέντρωση αντισώματος αντι-DR5 σε μοριακές (δεξιά πλευρά του πίνακα). εικόνων (C) συνεστιακή μικροσκοπία δείχνει τις αλλαγές στην FRET σε κύτταρα MB231_CFP-YFP σε επεξεργασία με 0-25 ng /ml TRAIL για 2.5 ώρες. Μια έντονη στροφή από YFP εκπομπών δέκτη (κίτρινο) στην εκπομπή του δότη ΚΑΠ (κυανό) μπορεί να παρατηρηθεί για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αυξανόμενη συγκέντρωση του TRAIL, με διέγερση ρύθμιση = 458 nm. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε όπως στο Σχ. 1 και 2.

Η

Εφαρμογή της δοκιμασίας FRET βασίζεται σε κύτταρα για την εκτίμηση της βιοδραστικότητας του χημειοθεραπειών καρκίνου του

Ζητήσαμε εάν ο καθετήρας μηχανικής FRET θα μπορούσαν να προσαρμοστούν για την ανάλυση φάρμακα μικρών μορίων, ότι λειτουργούν μέσω της διαφοροποίησης των εγγενών οδών σηματοδότησης απόπτωση. Πολλοί κλασική φάρμακα χημειοθεραπείας εμπίπτουν στην κατηγορία αυτή. Δοκιμάσαμε πρώτα σταυροσπορίνη και καμπτοθεκίνη, καθώς και οι δύο είναι γνωστό ότι είναι ισχυροί επαγωγείς απόπτωσης σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων [7], [26]. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα MB231_CFP-YFP υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σταυροσπορίνη ή καμπτοθεκίνη. Μία εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στην FRET παρατηρήθηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του κάθε παράγοντα (Σχήμα 5Α). Μη γραμμική προσαρμογή καμπύλης που παράγεται ΕΚ

50 αξίες που, κυρίως, είναι συγκρίσιμα με εκείνα που λαμβάνονται με ανάλυση ΜΤΤ (Σχήμα 5Β, Πίνακας 1). Έχουμε επεκταθεί η μελέτη να περιλαμβάνουν διάφορα άλλα φάρμακα χημειοθεραπείας, συμπεριλαμβανομένου ετοποσίδη, κομπακτίνη, 5-FU, και ταξόλη. Αυτά τα φάρμακα λειτουργούν μέσω γονοτοξική και κυτταροσκελετικών στρες και να οδηγήσει σε επακόλουθη αναστολή της ανάπτυξης ή /και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, ανάλογα με τις πειραματικές συνθήκες και τα στοχευόμενα κύτταρα [5] – [7]. Σταθερά, εντοπίστηκαν αλλαγές σήμα παρατηρήσιμα FRET όταν τα κύτταρα MB231_CFP-YFP υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κάθε παράγοντα χημειοθεραπείας (Σχήμα 5C). Ωστόσο, η ικανότητά τους στην επαγωγή της κασπάσης 3/8 εξαρτώμενη απόπτωση φάνηκε να είναι πολύ χαμηλότερη από εκείνη του TRAIL ή αντι-DR5 αντίσωμα, απαιτώντας τόσο υψηλή συγκέντρωση (100 μg /mL) και μεγαλύτερες περιόδους επώασης (72 ώρες) σε σύγκριση με την ισχύ του TRAIL (EC50 ~0.05-0.08 ηΜ) και αντι-DR5 (EC50 ~0.24-0.80 ηΜ). Αυτά τα δεδομένα επιδεικνύουν την ικανότητα του καθετήρα κυτταρικής FRET ποσοτικοποίηση της δραστηριότητας επαγωγής απόπτωσης των δύο βιολογικών και χημειοθεραπευτικών παραγόντων. Με εξομάλυνσης πειραματικές συνθήκες, οι δοκιμασίες FRET μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να συγκρίνει άμεσα το in vitro βιοδραστικότητα των διαφόρων φαρμάκων κατά του καρκίνου.

(Α) κύτταρα MB231_CFP-YFP υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0-100 μg /ml για 20 σταυροσπορίνη h και μηδέν έως 1,7 μg καμπτοθεκίνης /ml για 72 ώρες. Δοσοεξαρτώμενες μεταβολές στις σήματα FRET προσδιορίστηκαν όπως στο Σχ. δοκιμασίας 4. (Β) ΜΤΤ χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε απόκριση σε θεραπεία του parental_MB231 (γεμάτα μαύρο) και MB231_CFP-YFP (ανοιχτό διαυγές) κυττάρων με 0-25 μg /ml σταυροσπορίνης για 20 ώρες και μηδέν έως 7,7 μg /ml camptothecin για 72 ώρες, αντίστοιχα. (C) MB231_CFP-YFP κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες (100 μg /ml) για 72 ώρες. FRET μέτρηση και ανάλυση πραγματοποιήθηκε όπως στο Σχ. 4. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε όπως στο Σχ. 1 και 2.

Η

Συζήτηση

Έχουμε αναπτύξει μια βασισμένη σε κύτταρα FRET βιοαισθητήρα για την μέτρηση της δραστικότητας της απόπτωσης επαγωγής φαρμάκων. δοκιμασία FRET μας φαίνεται να είναι ανώτερο από άλλα κοινώς χρησιμοποιούμενα προσδιορισμούς απόπτωσης δεδομένης της απλότητας, της σταθερότητας, της ευκολίας, και ευρωστία. Ελπίζουμε ότι δίνεται τα πλεονεκτήματα αυτά, η σταθερά εκφράζεται ανιχνευτή FRET μπορεί να προσαρμοστεί για χρήση σε μελλοντικές σχετικές μελέτες ανακάλυψη και ανάπτυξη φαρμάκων.

Ο στόχος της θεραπείας του καρκίνου είναι να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, μία δοκιμασία δραστικότητας θα πρέπει να σχεδιαστεί ώστε να αντικατοπτρίζει μηχανισμός του φαρμάκου της δράσης δηλ επαγωγή απόπτωσης ή άλλες μορφές κυτταρικού θανάτου. Η απόπτωση είναι μια κοινή μορφή κυτταρικού θανάτου που σχετίζεται με τη θεραπεία του καρκίνου και

in vitro

και

in vivo

. Αρκετές μέθοδοι είναι διαθέσιμες για την ανίχνευση και τη μέτρηση της απόπτωσης, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρομετρίας ροής, μικροσκοπία, ανοσοαποτύπωση, και προσδιορισμούς που βασίζονται σε υπόστρωμα κασπάσης [14], [27] – [29]. Αυτές οι μεθοδολογίες είναι ισχυρά εργαλεία έρευνας στη μελέτη της απόπτωσης, αλλά κάθε μέθοδος σχετίζεται με εγγενείς περιορισμούς, που περιλαμβάνουν αλλά δεν περιορίζονται σε αδυναμία να βελτιστοποιηθεί με τρόπο υψηλής απόδοσης, η μεταβλητότητα που σχετίζεται με κυτταρική διαπερατότητα των υλικών που απαιτούνται για ένα σήμα ανάγνωσης, απαίτηση του κυττάρου λύση, και η υψηλή στάθμη θορύβου [17]. Εξαιτίας αυτών των περιορισμών, υπάρχει ακόμη ανάγκη για ένα τυποποιημένο και ισχυρή δοκιμασία απόπτωσης. Αν και αρκετές ομάδες έχουν αναφέρει κυτταρική έκφραση μιας πρωτεΐνης σύντηξης GFP-based που μπορεί να ενεργεί σαν ένα υπόστρωμα κασπάσης και ανιχνεύει αλλαγές στην κυτταρική FRET κατά την επαγωγή της απόπτωσης, μεθόδους ανίχνευσης σε αυτές τις περιπτώσεις στηρίχθηκε κυρίως στην συνεστιακή μικροσκοπία και κυτταρομετρία ροής [15], [ ,,,0],30] – [33]. Ενώ παρέχει πολύτιμες πληροφορίες αυτή η διαδικασία λειτουργίας δεν είναι ιδανικό για μια στιβαρή και υψηλής ανάλυσης δραστικότητας απόδοσης. Αξίζει να σημειωθεί ότι υπάρχουν αραιές παραδείγματα αναφέρονται οι οποίες χρησιμοποιούν μια μορφή πλάκας throughput [34], [35]. δοκιμασία FRET μας βασίζεται σε κύτταρα επιτρέπει μια άνευ προηγουμένου ανίχνευση τόσο της δραστηριότητας κασπάσης 3 και κασπάση 8 σε μορφή μικροπλακιδίων χρησιμοποιώντας μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού. Αυτός ο συνδυασμός της κασπάσης επιτρέπει τον χαρακτηρισμό του κάθε παράγοντα που μπορεί να επάγει την απόπτωση μέσω ενδογενούς ή εξωγενούς μονοπατιού ή και τα δύο. Επίσης η μεθοδολογία μας έχει μοναδικά προσαρμοσμένα για την εξάλειψη φόντο αυτόματη φθορισμός που συνδέεται με μέσα κυτταρικής καλλιέργειας? Αυτό βοηθά στην επίτευξη μιας βελτιωμένης λόγο σήματος προς θόρυβο και αποφεύγει υψηλά αφαιρέσεις φόντο που μπορεί να περιπλέξει υπολογισμούς FRET. Επιπλέον, το έργο μας έχει αυστηρά επικεντρωθεί σχετικά με την καταλληλότητα της ανάλυσης που περιγράφεται στο να λειτουργήσει ως δοκιμή ισχύος για πολύπλοκα πρωτεϊνικά φάρμακα που στοχεύουν τους υποδοχείς θανάτου, ενώ άλλες εργασίες έχουν επικεντρωθεί κυρίως στις μικρές ανακάλυψη μόριο του φαρμάκου.

Ένας περιορισμός μας δοκιμασία σχετικά με τη διαθεσιμότητα του μοριακού στόχου (ων) στα κύτταρα MDA-MB-231 για ένα συγκεκριμένο μόριο φαρμάκου.