Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (CSC) έχουν εγείρει μεγάλο ενθουσιασμό κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας και είναι πολλά υποσχόμενη στόχοι για μια αποτελεσματική θεραπεία των όγκων χωρίς υποτροπές και μεταστάσεις. Μεταξύ των διαφόρων μεθόδων που δίνουν τη δυνατότητα να εμπλουτίσουν τις καρκινικές κυτταρικές σειρές στην CSC, tumorspheres πολιτισμός έχει χρησιμοποιηθεί κατά κύριο λόγο. Στην έκθεση αυτή, επιχειρήσαμε να δημιουργήσει tumorspheres από διάφορα ποντικού και ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές: Β16-Ρ10, ΗΤ-29, MCF-7 και MDA-MB-231 κύτταρα. Tumorspheres ελήφθησαν με μεταβλητή αποτελεσματικότητας από όλες τις κυτταρικές σειρές εκτός από MDA-MB-231 κύτταρα. Στη συνέχεια, μελετήσαμε αρκετά χαρακτηριστικά CSC και στις δύο tumorspheres και προσκολλημένες καλλιέργειες της Β16-F10, ΗΤ-29 και MCF-7 κύτταρα. Απροσδόκητα, tumorspheres σχηματισμού κύτταρα ήταν λιγότερο κλωνογονική και, στην περίπτωση των Β16-Ρ10, λιγότερο πολλαπλασιαστική από προσκολλημένα κύτταρα. Επιπλέον, δεν παρατηρήσαμε καμία εμπλουτισμό του πληθυσμού έκφραση δεικτών επιφανείας CSC στην tumorspheres από κύτταρα (CD133, CD44 και δείκτες CD24) ή MCF-7 (CD44 και CD24 δείκτες) Β16-F10. Αντίθετα, tumorspheres κουλτούρα της ΗΤ-29 κύτταρα φαίνεται να εμπλουτίσουν σε κύτταρα που εκφράζουν παχέος εντέρου δείκτες CSC,

δηλ.

Πρωτεΐνες CD133 και CD44. Για την κυτταρική γραμμή Β16-Ρ10, όταν 1 000 κύτταρα ενέθηκαν σε συγγενή ποντίκια C57BL /6, tumorspheres σχηματισμού κύτταρα εμφάνισαν σημαντικά μικρότερη ογκογόνο δυναμικό από προσκολλημένα κύτταρα. Τέλος, tumorspheres καλλιέργεια κυττάρων Β16-Ρ10 προκάλεσε μια ρύθμιση προς τα κάτω της βιμεντίνης που θα μπορούσε να εξηγήσει, τουλάχιστον εν μέρει, το κατώτερο ογκογονικότητα των κυττάρων tumorspheres μορφοποίησης. Όλα αυτά τα αποτελέσματα, μαζί με τη βιβλιογραφία, δείχνουν ότι tumorspheres καλλιέργεια των κυτταρικών σειρών καρκίνου μπορεί να προκαλέσει έναν εμπλουτισμό σε CSC, αλλά σε μια κυτταρική γραμμή-εξαρτώμενο τρόπο. Εν κατακλείδι, εκτεταμένο χαρακτηρισμό των ιδιοτήτων CSC σε tumorspheres προέρχεται από οποιοδήποτε καρκίνο κυτταρική σειρά ή ιστό του καρκίνου πρέπει να γίνεται έτσι ώστε να εξασφαλιστεί ότι τα παραγόμενα tumorspheres πραγματικά εμπλουτισμένα σε CSC

Παράθεση:. Calvet CY, André FM, Mir LM (2014) Ο Πολιτισμός του καρκίνου κυτταρικών γραμμών ως Tumorspheres δεν Συστηματική Αποτέλεσμα σε καρκινικά βλαστικά Εμπλουτισμός κυττάρων. PLoS ONE 9 (2): e89644. doi: 10.1371 /journal.pone.0089644

Επιμέλεια: Anita Β Hjelmeland, Cleveland Clinic, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2, Απριλίου, 2013? Αποδεκτές: 24η Ιανουαρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 24 Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Calvet et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα ήταν διεξάγεται στο πεδίο της EBAM Ευρωπαϊκής Associated Laboratory. Το έργο αυτό ήταν εν μέρει χρηματοδοτήθηκε από την Agence Nationale de la Recherche (IPSIOAT) και το Département du Val-de-Marne μέσω του προγράμματος TELVAC. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (CSC), ένα υποπληθυσμό των καρκινικών κυττάρων, έχουν προκαλέσει ένα τεράστιο ενδιαφέρον στην επιστημονική κοινότητα για τις δύο τελευταίες δεκαετίες. Έχουν πράγματι υπάρχουν υπόνοιες ότι είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση, την αντίσταση προς θεραπεία και έτσι υποτροπές [1].

μερίδιο CSC πολλά χαρακτηριστικά με φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα όπως ικανότητα διαφοροποίησης, αυτο-ανανέωση και η σχετική ληθάργου υποδηλώνοντας ότι θα μπορούσαν ενδεχομένως να προέρχονται από τα κανονικά αντίστοιχά τους μέσω μιας συσσώρευσης μετασχηματισμού μεταλλάξεων, είτε γενετική είτε επιγενετικό [2] – [4]. CSC είναι πατρικά κύτταρα τα οποία μπορούν να αυτο-ανανέωση ή διαφοροποιούνται σε ετερογενή καταγωγές που θα αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος του όγκου. Σε αντίθεση με το μοντέλο κλωνική εξέλιξη του πολλαπλασιασμού του καρκίνου, το μοντέλο CSC αναφέρει ότι όλα τα καρκινικά κύτταρα δεν είναι ογκογονικά εξίσου όταν εγχύονται

in vivo

[1], [5]. Δεκαπέντε χρόνια πριν, Bonnet και Dick έδειξε για πρώτη φορά ότι το CD34

+ CD38

– CSC απομονωθεί από την οξεία μυελογενή λευχαιμία ήταν σε θέση να ανακεφαλαιώσω την ετερογένεια του αρχικού όγκου μέσω σειριακής μεταμοσχεύσεις σε μοντέλα ξένου μοσχεύματος, σε αντίθεση με CD34

-CD38

+ κύτταρα [6]. Από τότε, το μοντέλο CSC χρησιμοποιήθηκε για να εξηγήσει όχι μόνο τη διάδοση της λευχαιμίας, αλλά και στερεών καρκίνων, όπως του μαστού, του στομάχου, του παχέος εντέρου, του προστάτη, των ωοθηκών, του ήπατος, του παγκρέατος, των πνευμόνων, καρκινώματα του εγκεφάλου και του θυρεοειδούς, του μελανώματος, οστεοσάρκωμα και σάρκωμα Ewing [7].

CSC οθόνη μια αντίσταση προς την χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία. Η ικανότητά τους να ξεφύγουν από την κυτταροτοξικότητα των συμβατικών αντικαρκινικών θεραπειών και την αναγέννηση του όγκου στο τέλος των θεραπειών οφείλεται σε διάφορους μηχανισμούς: λήθαργο, έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, αντλίες εκροής φαρμάκου, υψηλής απόδοσης μεταβολισμό και ένα χαμηλό επίπεδο αντιδρώντος οξυγόνου είδη [1], [8], [9].

Επιπλέον, όπως για φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων, η κόγχη CSC έχει αποδειχθεί να διαδραματίζουν ενεργό ρόλο στη διατήρηση του βλαστική ικανότητα ιδιότητες, καθώς και στην αποδιαφοροποίηση μη CSC μέσω ενός μετάβαση επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά (ΕΜΤ) [10]. Αυτό το φαινόμενο, που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στη μεταστατική διαδικασία, μπορεί επίσης να εξηγήσει την προέλευση των CSC ως τα κύτταρα αυτά μοιράζονται τα περισσότερα από τις ιδιότητές τους με τα κύτταρα μετα-EMT, συμπεριλαμβανομένης της υψηλής εισβολή και την ικανότητα της μετανάστευσης, και η αυξημένη έκφραση δεικτών μεσεγχυματικών (

π.χ.

vimentin). Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα αναγκάζονται να υποστούν EMT έχουν αυξημένη πιθανότητα ογκογένεσης και εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα των δεικτών CSC [8], [10] – [12]

Λίγες μέθοδοι είναι σήμερα διαθέσιμα για την απομόνωση CSC.. Καλλιεργώντας τα κύτταρα σε αγκυροβόλιο-ανεξάρτητο τρόπο, μέσα σε ένα μέσο χωρίς ορό εμπλουτισμένο σε παράγοντες ανάπτυξης, χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά για να διαδώσει ανθρώπινα μαστικά επιθηλιακά κύτταρα σε μια αδιαφοροποίητη κατάσταση [13]. Ponti και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι αυτή η μέθοδος ήταν επίσης αποτελεσματική στη διατήρηση του μαστού CSC στον πολιτισμό [14]. Υπό αυτές τις συνθήκες, τα κύτταρα μεγάλωσε ως πολυκύτταρους τρισδιάστατο κλώνους ονομάζεται «tumorspheres». Αυτή η τεχνική αποδείξει την αποτελεσματικότητά της στον εμπλουτισμό και τη διατήρηση της CSC από διάφορες κυτταρικές σειρές [15].

Στην εργασία αυτή, επιδιώξαμε να αξιολογήσει την ικανότητα της τεχνικής tumorspheres πολιτισμό για να εμπλουτίσουν αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές στην CSC. Πράγματι, είναι μεγάλη πρακτική ενδιαφέροντος για την ανακάλυψη φαρμάκων και για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των θεραπειών για να συνεργαστεί με καρκινικές κυτταρικές σειρές εμπλουτισμένο σε CSC οι οποίες θεωρούνται ως εκείνο που θα πρέπει να στοχεύει για τη θεραπεία όγκων σε μακροπρόθεσμη βάση χωρίς υποτροπή.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα ζωικά πειράματα διεξήχθησαν σε αυστηρή συμμόρφωση με τις δεοντολογικές κατευθυντήριες γραμμές που εκδίδονται από την Ευρωπαϊκή Επιτροπή (οδηγία 86/609 /CCE). Το Πανεπιστήμιο Paris-Sud Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων # 26, που έχει καταχωρηθεί από το γαλλικό Υπουργείο Ερευνών, ειδικά εγκριθεί το πρωτόκολλο (πρωτόκολλο αριθμό καταχώρισης # 2012_007).

προσκολλημένα Cell Culture

Β16-F10 ποντικών μελάνωμα, ΗΤ-29 ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του κόλου, MCF-7 και MDA-MB-231 κυτταρικές σειρές ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος μαστού καλλιεργήθηκαν σε DMEM, 5Α του McCoy, ΜΕΜ ή RPMI 1640, αντιστοίχως. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 1% glutamax, 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS), 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (PS), όλα αγοράστηκαν από τεχνολογίες Ζωής (Cergy Pontoise, France). διαλύματος ινσουλίνης (Sigma, St Quentin Fallavier, France) σε /mL τελική συγκέντρωση 10 μg χρησιμοποιήθηκε ειδικά για καλλιέργεια κυττάρων MCF-7. Τα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν σε 37 ° C σε ατμόσφαιρα υγρασίας 95% που περιέχει 5% CO

2 και περάστηκαν επάνω συρροή (σε μια, 1:08, 1:06 ή 1:04 αραίωση 1:10, αντίστοιχα) χρησιμοποιώντας ένα TrypLE διαλύματος (τεχνολογίες ζωής). Τα κύτταρα μυκόπλασμα-ελεύθερο και συνήθως ελέγχεται με το Ένα στολίδι Βήμα κιτ ανίχνευσης Venor Mycoplasma αγοράζονται από Biovalley (Marne-la-Vallée, Γαλλία).

Tumorspheres Πολιτισμού

10 000 βιώσιμα κύτταρα μεταφέρονται σε μια εξαιρετικά χαμηλή φιάλη προσκόλληση Τ75 (Corning, Avon, Γαλλία) σε 10 mL μέσου CSC αποτελείται σε DMEM /F12 μέσο συν glutamax (τεχνολογίες Life), 4 μg /mL ηπαρίνη (Sigma), 2% συμπλήρωμα Β27 (Life τεχνολογίες), 20 ng /mL επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF, Peprotech, Neuilly-sur-Seine, Γαλλία), 20 ng /ml βασικό αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (FGF-b, Peprotech) και 1% PS. Φρέσκο ​​EGF, FGF-b και ηπαρίνη προστέθηκαν στο μέσο κάθε 3 ημέρες. Tumorspheres αφέθηκαν να αναπτυχθούν επί 4 ημέρες (Β16-F10) ή 7 ημέρες (ΗΤ-29 και MCF-7). Για διαστάσεως, tumorspheres πρώτα σε φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 200 g, το ίζημα μετά επαναιωρήθηκε ήπια σε 500 μι Accutase (τεχνολογίες ζωής) πριν να επωάζεται για 5 λεπτά στους 37 ° C. Μετά την προσθήκη 2 mL DMEM /F12, tumorspheres διαχωρίστηκαν με ήπια πιπέτα και μεταφέρεται απευθείας πίσω στο προϋποθέσεις tumorspheres καλλιέργειας όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Αποδοτικότητα Tumorsphere σχηματίζουν Δοκιμασία

ARIAIII διαλογέα κυττάρων (βιοεπιστήμες BD , USA) χρησιμοποιήθηκε για να μεταφέρει με ακρίβεια 1 μονό βιώσιμων κυττάρων (

δηλαδή

ιωδιούχο προπίδιο-αρνητική κυτταρική) σε κάθε φρεάτιο ενός πλακιδίου 96 φρεατίων εξαιρετικά χαμηλής προσκόλλησης (Corning) που περιέχει 100 μΐ μέσου CSC. Φρέσκο ​​EGF, FGF-b και ηπαρίνης προστέθηκαν κάθε 3 ημέρες. Αυτό το πείραμα διεξήχθη για να εκτιμηθεί η ικανότητα tumorsphere σχηματισμό κυττάρων που προέρχονται από προσκολλημένες καλλιέργειες ή από προηγουμένως σχηματίζονται πρωτογενή ή δευτερογενή tumorspheres. Μετά από 10 ημέρες καλλιέργειας, ο αριθμός των φρεάτων που περιέχουν ένα tumorsphere μεγαλύτερο από 50 μm προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης.

κλωνογονική δοκιμασία

ARIAIII διαλογέα κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για τη μεταφορά με ακρίβεια 200 βιώσιμα κύτταρα (

δηλαδή

ιωδιούχο προπίδιο-αρνητικά κύτταρα), διαχωρίστηκαν από μία εβδομάδων tumorspheres ή από προσκολλημένα μονοστιβάδες καλλιέργειας, σε κάθε φρεάτιο μιας κανονικής προσκόλλησης 6-φρεατίων που περιέχουν DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% PS. Μετά από 5 ημέρες καλλιέργειας για Β16-Ρ10 και 10 ημέρες για τα ΗΤ-29 και MCF-7, μέσο απορρίφθηκε, τα κύτταρα πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και σταθεροποιήθηκαν και κηλιδώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει 20% αιθανόλη, 3,7% φορμαλδεΰδη και 0,2% κρυσταλλικό ιώδες. Κλωνογονικότητας υπολογίστηκε ως ο αριθμός των αποικιών που σχηματίστηκαν σε σχέση με τον αριθμό των αποικιών που σχηματίστηκαν από προσκολλημένα κύτταρα.

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

ARIAIII διαλογέα κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για τη μεταφορά 1 000 Β16-Ρ10 βιώσιμα κύτταρα (

δηλαδή

ιωδιούχο προπίδιο-αρνητικά κύτταρα), διαχωρίστηκαν από μία εβδομάδων tumorspheres ή από προσκολλημένη μονοστιβάδες, σε κάθε φρεάτιο μιας κανονικής πλάκα που περιέχει DMEM προσκόλληση 96-φρεατίων που έχει συμπληρωθεί με 10% FBS και 1% PS. Η πλάκα τοποθετήθηκε σε ένα σύστημα απεικόνισης IncuCyte ™ FLR (Essen Biosciences, Welwyn Garden City, Ηνωμένο Βασίλειο) μέσα σε μία κανονική συσκευή επώασης κυτταρικής καλλιέργειας (37 ° C, 95% υγρασία, 5% CO

2). Τέσσερις διαφορετικές περιοχές ανά φρεάτιο παρακολουθήθηκαν (μεγέθυνση 10x, αντίθεσης φάσης) με το IncuCyte ™ κάθε 4 ώρες κατά τη διάρκεια μιας εβδομάδας. Ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε με το λογισμικό IncuCyte ™ και ο χρόνος διπλασιασμού προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο γραμμικής παλινδρόμησης.

ανοσοχρώση Δοκιμασία

50 000 βιώσιμων κυττάρων Β16-Ρ10 (trypan blue test αποκλεισμού) διαχωριστεί από το ένα -Εβδομάδα-old tumorspheres ή από επεξεργασία με θρυψίνη προσκολλημένα μονοστιβάδες επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C στο σκοτάδι με 0,5 μg του αρουραίου αντι-ποντικού μονοκλωνικά CD133-APC, CD44-FITC ή CD24-ΡΕ αντισώματα (eBiosciences, Παρίσι, Γαλλία) σε 100 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος που αποτελείται σε PBS που περιέχει 3% αλβουμίνη βόειου ορού (Sigma). Η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε επίσης για ΗΤ-29, MCF-7 και κυτταρικές γραμμές MDA-MB-231 χρησιμοποιώντας ποντικού αντι-ανθρώπινου μονοκλωνικού CD133-APC, CD44-ΡΕ, CD44-APC ή CD24-FITC αντισώματα (Miltenyi Biotec, Παρίσι, Γαλλία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλένονται και αναλύονται με μια ροή Accuri C6 κυτταρομετρίας (βιοεπιστήμες BD, ΗΠΑ).

Side Δοκιμασία Πληθυσμός

Ένα μόνο κυτταρικό εναιώρημα 1,10

6 Β16-Ρ10 κύτταρα /mL σε ένα μέσο DMEM /F12 άνευ ορού παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας διίσταται μία εβδομάδων tumorspheres ή προσκολλημένων μονοστιβάδων. Αυτό το κυτταρικό αιώρημα επωάστηκε με 5 μg /mL Hoechst 33342 (Sigma) για 90 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι. Ένα αρνητικό κυτταρικό εναιώρημα ελέγχου εκτίθενται σε Hoescht 33342 και 50 μΜ βεραπαμίλη (Sigma) επωάστηκε παράλληλα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και επαναιωρήθηκαν σε ένα διάλυμα ϋΜΕΜ /F12 άνευ ορού που περιέχει 5 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου (Sigma) για τον αποκλεισμό των νεκρών κυττάρων. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής LSR II (BD Biosciences).

Ποσοτική Αντίστροφη Μεταγραφή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-qPCR)

TRIzol® αντιδραστήριο (τεχνολογίες Life) χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση ολικού RNA από Β16-Ρ10 προσκολλημένα κύτταρα ή tumorspheres σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 1 μα RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (τεχνολογίες Life). Ενίσχυση και ανίχνευση με SYBR Green πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Βήμα One Plus Real Time PCR System (Applied Biosystems, France) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. γονίδιο housekeeping 18S χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν σε 10 μΜ το καθένα:

E-cadherin:

μπροστά 5′-GAGCCTGAGTCCTGCAGTCC-3 ‘, αντίστροφη: 5′-TGTATTGCTGCTTGGCCTCA-3’

vimentin:

μπροστά 5′-CACCCTGCAGTCATTCAGACA-3 ‘, αντίστροφη: 5′-GATTCCACTTTCCGTTCAAGGT-3’

Snai1:

μπροστά 5′-GGAAGCCCAACTATAGCGAGC-3 ‘, αντίστροφη : 5’-CAGTTGAAGATCTTCCGCGAC-3 ‘

18S:

μπροστά 5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′, αντίστροφη: 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3 ‘

Δοκιμασία ογκογονικότητα

100 μL DMEM /F12 που περιέχει 300, 1 000, 3 000, 10 000, 30 000 και 100 000 βιώσιμων κυττάρων (trypan blue test αποκλεισμού) από διαχωρίστηκαν tumorspheres Β16-Ρ10 ενέθηκαν σε αμφότερες τις πλευρές του 6-to -8-εβδομάδων C57BL /6 ποντίκια (Harlan, Gannat, Γαλλία) σε δύο διαφορετικές θέσεις. Η ομάδα 1 000 κύτταρα εγχέονται-ποντικούς αποτελείται 6 ποντίκια και οι άλλες ομάδες περιελάμβανε 3 ποντικούς η κάθε μία. Οι ομάδες ελέγχου ενέθηκαν με τους ίδιους αριθμούς κυττάρων που προέρχονται από καλλιέργειες προσκολλημένα Β16-Ρ10 και επαναιωρήθηκαν σε 100 μL DMEM. Οι ποντικοί ελέγχθηκαν δύο έως τρεις φορές την εβδομάδα κατά τη διάρκεια των 50 ημερών. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν το συντομότερο οι όγκοι έφθασαν τα 2 000 mm

3 ή έγιναν νεκρωτικές με σκοπό την ελαχιστοποίηση της ταλαιπωρίας των ζώων.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις.

τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μη παραμετρική δοκιμασία Mann-Whitney-Wilcoxon, τεστ Kruskall-Wallis με διόρθωση Dunn ή δοκιμή χ2 και p & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Β16-Ρ10, ΗΤ-29 και MCF-7 κύτταρα είναι ικανά να σχηματίσουν Tumorspheres

Β16-Ρ10, ΗΤ-29, MCF-7 και MDA-MB-231 κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε αγκυροβόλιο τρόπο ανεξάρτητο , πράγμα που σημαίνει σε ένα μη-προσκολλημένα υπόστρωμα σε μέσο άνευ ορού που περιέχει παράγοντες ανάπτυξης με στόχο να διατηρηθεί πλειοδυναμία (

δηλαδή

FGF-b και EGF). Μετά από 4 ημέρες σε καλλιέργεια για κύτταρα Β16-Ρ10 και 7 ημέρες για την ΗΤ-29 και τα κύτταρα MCF-7, tumorspheres από περίπου 100 μm σε διάμετρο παρατηρήθηκαν (Σχήμα 1) και διαχωρίστηκαν για υποκαλλιέργεια. Αντιθέτως, MDA-MB-231 δεν κατόρθωσε να σχηματίσει tumorspheres, ακόμα και μετά από περισσότερο από 10 ημέρες.

(Α) Β16-Ρ10, (Β) ΗΤ-29 και (C) MCF-7 tumorspheres. Tumorspheres σχηματίστηκαν μετά από 4 έως 7 ημέρες καλλιέργειας σε μέσο άνευ ορού που περιέχει FGF-b και EGF επί εξαιρετικά χαμηλής υπόστρωμα προσκόλληση. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 100 μm.

Η tumorspheres

Β16-F10 ήταν σε θέση να καλλιεργηθούν ως tumorspheres για μεγάλα περάσματα (πάνω από 20 περάσματα). Περίπου το 20% των κυττάρων Β16-Ρ10 ήταν σε θέση να σχηματίσει ένα tumorsphere και το ποσοστό αυτό παρέμεινε σχετικά σταθερή τουλάχιστον τα τρία πρώτα περάσματα (Σχήμα 2). Παρόμοια ποσοστά ελήφθησαν για την αποτελεσματικότητα MCF-7 σχηματισμό tumorspheres. Όσον αφορά την κυτταρική γραμμή ΗΤ-29, το 80% των προσκολλημένων κυττάρων ήσαν σε θέση να σχηματίσουν πρωτογενή tumorspheres ενώ παρατηρήθηκε μία μείωση σε περίπου 50% των κυττάρων για τον σχηματισμό δευτερογενή ή τριτογενή tumorspheres. Ωστόσο, αυτές οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές.

Αποδόσεις σχηματισμό

Tumorspheres ήταν άκρως κυτταρική σειρά που εξαρτάται. Τ1: πρωτοβάθμια, T2: δευτεροβάθμια, T3:. Τριτογενή

Η

την ικανότητα να σχηματίζουν προσκολλημένα Αποικίες μειώνεται μετά από μία εβδομάδα Πολιτισμού ως Tumorspheres

Ένα-εβδομάδων tumorspheres που προέρχονται από Β16-Ρ10, ΗΤ-29 ή MCF-7 κύτταρα διαχωρίστηκαν, μεταφέρθηκε πίσω προσκολλημένα συνθήκες και αποδοτικότητες σχηματισμού αποικιών τους σε σύγκριση με εκείνη των προσκολλημένων κυττάρων. Κλωνογονικότητας του tumorspheres σχηματίζουν κύτταρα που προέρχονται από τις τρεις κυτταρικές σειρές ήταν σημαντικά μειωμένη, ήτοι μια πτώση 20-έως-30% σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα (Σχήμα 3, πλαίσιο Α). Επιπλέον, το 30% έως 80% των αποικιών που προέρχονται από προσκολλημένα Β16-Ρ10 κύτταρα tumorspheres σχηματισμού ήταν εμφανώς λιγότερο πυκνά από αυτά που προκύπτουν από προσκολλημένα κύτταρα (Σχήμα 3, πάνελ Β και C). Αυτό υποδηλώνει ότι τα κύτταρα tumorspheres σχηματισμού υποβλήθηκαν σε προσαρμογή ή μια επιλογή στην καλλιέργεια σε εναιώρημα, με αποτέλεσμα ένα πιο αδύναμο ικανότητα να αποδίδουν στο υπόστρωμα. Καμία τέτοια αλλαγή σε αποικίες μορφολογία παρατηρήθηκε στην περίπτωση των κυτταρικών γραμμών ΗΤ-29 και MCF-7.

(Α) Tumorspheres σχηματισμού κύτταρα που παράγονται περίπου 20 έως 30% λιγότερο από ό, τι οι αποικίες προσκολλημένα κύτταρα, ανάλογα με το η κυτταρική σειρά θεωρείται (*** p & lt? 0,001 για Β16-F10 και ΗΤ-29 κύτταρα, ** p & lt? 0.01 για τα κύτταρα MCF-7). (Β) κύτταρα προσκολλημένα Β16-Ρ10 πάντοτε σχηματίζεται στρογγυλό σχήμα και συσκευάζονται αποικίες ενώ tumorspheres σχηματισμού (C) Β16-Ρ10 κύτταρα σχηματίζονται επίσης ένα μεταβλητό αριθμό κακώς πυκνές αποικίες, που κυμαίνονται από 30% έως και 80% του συνολικού αριθμού των αποικίες. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 200 μm.

Η Tumorspheres σχηματίζουν

Β16-Ρ10 κύτταρα αναπτύσσονται πιο αργά σε προσκολλημένα συνθήκες από προσκολλημένα ομολόγους τους

Β16-F10 προσκολλημένη και tumorspheres που σχηματίζουν τα κύτταρα (τόσο από πρωτογενή και δευτερογενή tumorspheres) καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες προσκολλημένα για μία εβδομάδα και ο πολλαπλασιασμός τους ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο συμβολή Incucyte ™. χρόνος διπλασιασμού του Β16-Ρ10 κύτταρα από δευτερεύον tumorspheres ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των προσκολλημένων ομολόγους κυττάρων τους (Σχήμα 4) υποδηλώνοντας πάλι ότι τα κύτταρα tumorspheres σχηματισμού υποβλήθηκε σε προσαρμογή στην καλλιέργεια σε εναιώρημα, με αποτέλεσμα ένα πιο αδύναμο πολλαπλασιασμό υπό προσκολλημένα συνθήκες.

στιγμή της Β16-F10 κύτταρα από δευτερεύον tumorspheres διπλασιασμός ήταν σημαντικά υψηλότερο από εκείνο των προσκολλημένων κυττάρων. Ns: δεν είναι στατιστικά σημαντική, * για την p & lt? 0,05

Η

Tumorspheres Πολιτισμός επηρεάζει την έκφραση της CSC Μαρκαδόροι σε μια κυτταρική σειρά-εξαρτώμενο τρόπο

Ανοσοβαφή είναι επίσης μια κλασική μέθοδο για την αναγνώριση. CSC [1], [15]. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα από tumorspheres προσφυόμενο μονοστιβάδες ανοσοχρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα που αναγνωρίζουν τα πιο κοινά επιφανειακούς δείκτες CSC,

δηλ.

CD133, CD44 και CD24 πρωτεΐνες (Πίνακας 1). Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, CD133, CD44 και CD24 χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό του πληθυσμού CSC στην κυτταρική γραμμή Β16-F10 [16], ενώ μόνο CD133 και CD44 αναγνωρίζονται ως αξιόπιστα δείκτες για HT-29 CSC [17]. Όσον αφορά κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού, όπως MCF-7 και MDA-MB-231, ένα CD44

+ CD24

-. Προφίλ περιγράφηκε για CSC [18], [19]

Η

σε προσκολλημένων μονοστιβάδες, σχεδόν όλα τα κύτταρα Β16-Ρ10 εξέφρασαν CD44 ενώ οι πρωτεΐνες CD133 και CD24 βρέθηκαν σε λιγότερο από το 1% των κυττάρων. Ωστόσο, τα ποσοστά αυτά παρέμειναν αμετάβλητα μετά την καλλιέργεια των κυττάρων όπως tumorspheres για έως 23 περάσματα. Αν και CSC μπορεί επίσης να χαρακτηριστεί ως πλευρά πληθυσμός μπορεί να εκρέει Hoechst 33342, χάρη στην μεμβράνη ABC μεταφορείς [15], [20], καμία πλευρά πληθυσμός ανιχνεύθηκε σε είτε Β16-Ρ10 προσκολλημένα ή κύτταρα tumorspheres σχηματίζουν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Όσον αφορά το ΗΤ-29 κυτταρικής γραμμής, μια αύξηση κατά 15% του CD133

+ CD44

+ κυττάρων ανιχνεύθηκε σε tumorspheres (49,6% των κυττάρων) σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα (34,3% των κυττάρων) , υπαινίχθηκε προς εμπλουτισμό σε CSC. Ωστόσο, η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική λόγω της υψηλής τυπικές αποκλίσεις

Η MCF-7 κύτταρα περιείχε περίπου 50% CD44

+ CD24

-. Κύτταρα του προσκολλημένο πληθυσμό. Αυτό το ποσοστό μειώνεται στους 33,1% όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν ως tumorspheres, αν και αυτή η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Στην περίπτωση των κυττάρων MDA-MB-231, τα οποία δεν ήταν αποτελεσματική καθόλου στη διαμόρφωση tumorspheres, περισσότερο από το 99% του πληθυσμού προσκολλημένων κυττάρων ήταν CD44

+ CD24

-.

Tumorspheres Πολιτισμού Β16-F10 Μειώνει την έκφραση της βιμεντίνης και E-cadherin

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, αρκετοί συγγραφείς ανέφεραν ότι η CSC διαθέτουν τα χαρακτηριστικά των κυττάρων μετά την EMT, συμπεριλαμβανομένης και της προς τα κάτω ρύθμιση των επιθηλιακών δεικτών (

π.χ.

Ε-καδερίνη) και η αυξητική ρύθμιση των δεικτών μεσεγχυματικών (

π.χ.

βιμεντίνη και Snai1) [8], [11]. Μια ανάλυση RT-qPCR διεξήχθη με σκοπό τη σύγκριση της έκφρασης Ε-καδερίνης, βιμεντίνη και Snai1 στις δύο Β16-Ρ10 προσκολλημένα κύτταρα και tumorspheres. Τόσο έκφραση Ε-καδερίνης και του γονιδίου βιμεντίνης ήταν σημαντικά μειωμένη όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν ως tumorspheres. Διαπιστώσαμε 50% λιγότερη Ε-καδερίνης mRNA (Σχήμα 5, πλαίσιο Α) και 80% λιγότερη βιμεντίνη mRNA σε tumorspheres ό, τι σε προσκολλημένα κύτταρα (Σχήμα 5, πλαίσιο Β). Snai1 mRNA δεν ανιχνεύθηκε σε συνθήκες είτε κυτταρικής καλλιέργειας.

Τόσο βιμεντίνη (Α) και Ε-καδερίνης (Β) κάτω-ρυθμίζονται tumorspheres. *** Για την P & lt?. 0.001

Η

Β16-F10 Tumorspheres σχηματίζουν κύτταρα είναι λιγότερο Ογκογονικά από προσκολλημένα κύτταρα σε ένα μοντέλο ποντικού Συγγενικοί

Το χρυσό πρότυπο μέθοδο για την αξιολόγηση της παρουσίας των CSC συνίσταται στην έγχυση ενός CSC εμπλουτισμένος πληθυσμός σε ποντίκια και παρατηρώντας υψηλότερα όγκου λαμβάνουν ποσοστά σε σύγκριση με ποντίκια που ενέθηκαν με μη CSC εμπλουτισμένα κύτταρα [1], [15]. C57BL /6 ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως είτε με 300, 1 000, 3 000, 10 000, 30 000 και 100 000 κύτταρα Β16-Ρ10 που ήταν προσκολλημένα κύτταρα για μία ομάδα και tumorspheres σχηματισμού κυττάρων για την δεύτερη ομάδα. Οι όγκοι ανιχνεύθηκαν όταν τουλάχιστον 1 000 κύτταρα είχαν εγχυθεί. Όταν αυτός ο αριθμός των κυττάρων που εγχύθηκαν, κύτταρα tumorspheres σχηματισμού ήταν σημαντικά λιγότερο ογκογόνα από προσκολλημένα αντίστοιχά τους (Σχήμα 6, πάνελ Β). Ωστόσο, σε οποιαδήποτε από τις υψηλότερες ποσότητες με ένεση κυττάρων, δεν παρατηρήθηκε καμία σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων (Σχήμα 6, πάνελ Α και Β).

(Α) ένεση 300, 3 000 ή 30 000 κύτταρα . (Β) Ένεση του 1 000, 10 000 ή 100 000 κύτταρα. Όταν 1 000 κύτταρα ενέθηκαν σε ποντίκια, τα κύτταρα tumorspheres σχηματισμού ήταν σημαντικά λιγότερο ογκογόνα από προσκολλημένα αντίστοιχά τους. Adh: προσκολλημένα κύτταρα, Sph: tumorspheres σχηματισμού κυττάρων. Ns:. Δεν είναι σημαντική, * για την p & lt? 0,05

Η

Συζήτηση

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (CSC) είναι σήμερα μελετηθεί εκτενώς από τότε που υποτίθεται να ξεκινήσει και να στηρίξει την ανάπτυξη του όγκου και επιπλέον είναι πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για υποτροπή του όγκου [1].

Tumorspheres καλλιέργειας έχει αναφερθεί να εμπλουτίσουν αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές, όπως του μαστού, του ήπατος, του παχέος εντέρου και του καρκίνου κυτταρικές γραμμές ωοθηκών σε CSC [15]. Σε αυτή την εργασία, θα δοκιμαστεί ο εμπλουτισμός CSC από tumorspheres κουλτούρα της Β16-Ρ10 κύτταρα μελανώματος ποντικού, ΗΤ-29 ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου, και MCF-7 και MDA ΜΒ-231-ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος του μαστού.

Όπως σε αντίθεση με ό, τι Zhong

et al.

παρατηρηθεί [21], το πείραμά μας έδειξε ότι τα κύτταρα Β16-F10 πολλαπλασιάστηκαν εύκολα σε αναστολή ως tumorspheres κατά τη διάρκεια 3 μήνες τουλάχιστον. Τα ποσοστά tumorspheres σχηματισμού του Β16-Ρ10 και MCF-7 κύτταρα παρέμεινε σταθερή κατά τη διάρκεια των πρώτων τριών διόδων, το οποίο είναι ένα αποδεκτό σήμα κατατεθέν της CSC αυτο-ανανέωση. ΗΤ-29 κύτταρα που παράγονται επίσης tumorspheres αν και ο ρυθμός σχηματισμού έτειναν να μειώνονται μετά την πρώτη δίοδο. Αντιθέτως, ο tumorspheres καλλιέργεια των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα παρέμειναν ανεπιτυχείς. Αυτή η παρατήρηση ήταν σύμφωνη με αυτό που ορισμένοι συγγραφείς αναφερθεί [22], [23], αν και άλλοι έδειξαν αυτή η κυτταρική σειρά ήταν πράγματι σε θέση να σχηματίσουν tumorspheres [24], [25]. Υποθέσαμε ότι η εξαφάνιση της ικανότητας σχηματισμού tumorspheres των κυττάρων μας MDA-MB-231 θα μπορούσε να προκύψει από το γεγονός ότι αυτά τα κύτταρα είχαν περάστηκαν πολλές φορές πριν τα πειράματα μας. Πράγματι, αυτή η συνέπεια της διόδου κύτταρο σχετικά με τα ποσοστά σχηματισμού tumorspheres έχει προηγουμένως αποδειχθεί [26]. Ως εκ τούτου, περαιτέρω χαρακτηρισμούς έγιναν έτσι ώστε να ολοκληρώσει τις ιδιότητες βλαστική ικανότητα των Β16-F10, ΗΤ-29 και MCF-7 tumorspheres.

Η έννοια CSC αναφέρει ότι η ανάπτυξη του όγκου οδηγείται από τα καρκινικά κύτταρα με βλαστική ικανότητα χαρακτηριστικά που έχουν αποκτήσει ένα πολλαπλασιαστικό δυναμικό και κλωνογενοποιήσεως διαμεσολαβείται από την ικανότητα αυτο-ανανέωσης. Σε συμφωνία με αυτή την υπόθεση, πολλές εκθέσεις αναφέρουν ότι η υποτιθέμενη CSC διαθέτουν ενισχυμένη κλωνογενοποιήσεως [27] – [31] και πολλαπλασιάζονται πιο γρήγορα [29] – [31] από τους μη-CSC. Ωστόσο, η μελέτη μας έδειξε ότι τα κύτταρα Β16-Ρ10 tumorspheres σχηματισμού ήταν λιγότερο πολλαπλασιαστική από προσκολλημένα κύτταρα σε προσκολλημένα συνθήκες. Επιπλέον, Β16-Ρ10, ΗΤ-29 και MCF-7 κύτταρα επέδειξαν μία χαμηλότερη κλωνογόνο δυναμικό όταν καλλιεργούνται ως tumorspheres. Υποθέσαμε ότι tumorspheres σχηματίζουν κύτταρα προσαρμοσμένα στην κουλτούρα στην ανάρτηση, με αποτέλεσμα σε ασθενέστερη ικανότητα να αποδίδουν (και αναπτύσσονται σε) μια τακτική προσκολλημένη υπόστρωμα. Αυτό αποκλείει κατά κάποιο τρόπο από την περιγραφή ενός εμπλουτισμού CSC στα tumorspheres.

Ερευνήσαμε περαιτέρω βλαστική ικανότητα χαρακτηριστικά χρησιμοποιώντας την κλασική βιοδεικτών που αναφέρθηκαν για την αναγνώριση CSC [1], [15]. Dou και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι Β16-F10 CD133

+ Τα CD44

+ CD24

+ κύτταρα εμπλουτισμένα σε CSC [16]. Ως εκ τούτου, σε σύγκριση με το ποσοστό του CD133

+, CD44

+ και CD24

+ κυττάρων σε tumorspheres Β16-F10 και προσκολλημένα κύτταρα, αλλά δεν είχαμε παρατηρήσει καμία διαφορά. Κατά συνέπεια, ακόμη και αν Hoechst 33342 εκροής-ικανά κύτταρα έχουν επίσης δειχθεί στην βιβλιογραφία για να εμπλουτιστεί σε υποθετική CSC [15], [20], κανένα τέτοιο κυτταρικό πληθυσμό ανιχνεύθηκε σε δύο tumorspheres και προσκολλημένα κύτταρα Β16-Ρ10. Αυτό υποδηλώνει ότι η δοκιμασία πλευρά πληθυσμός δεν έχει σημασία για την ανίχνευση της CSC σε όλους τους τύπους κυττάρων.

Όσον αφορά το HT-29 κυτταρική γραμμή, το ένα τρίτο του πληθυσμού είχε το προφίλ του παχέος εντέρου CSC,

δηλαδή

. ήταν CD133

+ CD44

+ κύτταρα [17], [32], και το ποσοστό αυτό αυξήθηκε μέχρι 50% όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν ως tumorspheres. Ωστόσο, λόγω της υψηλής τυπικές αποκλίσεις σε αυτή τη δοκιμασία μαζί με τις παρατηρήσεις της μειωμένης ικανότητας κλωνισμού και μειωμένη ικανότητα σχηματισμού tumorspheres μετά το πρώτο πέρασμα, δεν θα μπορούσαμε να συμπεράνουμε σε εμπλουτισμό CSC.

Σας ποσοτικά επίσης το CD44

+ CD24

– του μαστού CSC πληθυσμού [33] και στις δύο MCF-7 και MDA-MB-231 κύτταρα. Ο πρώην κυτταρική γραμμή εμφανίζεται μια μείωση 17% σε CD44

+ CD24

– κυτταρικού πληθυσμού στο tumorspheres, με συνέπεια την χαμηλότερη κλωνογόνο δυναμικό που παρατηρείται όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν ως τέτοια. Παραδόξως, σχεδόν όλα τα MDA-MB-231 προσκολλημένα κύτταρα CD44

+ CD24

-, αν και δεν είχαμε λάβει καμία tumorsphere από αυτή την κυτταρική γραμμή

Όλα αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι ο σχηματισμός της tumorspheres. δεν συσχετίζεται πάντα με εμπλουτισμό σε περιγράφηκε προηγουμένως δείκτες CSC και επίσης ότι το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν αυτούς τους δείκτες CSC δεν προβλέπει τη δυνατότητα σχηματισμού tumorspheres, τουλάχιστον στο πλαίσιο των καρκινικών κυτταρικών σειρών που μελετήθηκαν στην παρούσα έκθεση.

Πιο εντυπωσιακά, η ογκογόνο δυναμικό των κυττάρων Β16-Ρ10 tumorspheres σχηματισμού ήταν χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων προσκολλημένων Β16-Ρ10, επιβεβαιώνοντας όλα τα

in vitro

δεδομένα πήραμε. Πολύ πρόσφατα, Κογιούρα και τους συναδέλφους που δημοσιεύθηκε παρόμοια ευρήματα [34]. Ωστόσο, δεδομένου ότι tumorspheres βρέθηκαν επίσης να είναι πιο αποτελεσματική στην έναρξη όγκους από προσκολλημένων μονοστιβάδων στην περίπτωση αρκετών άλλων καρκινικών κυτταρικών σειρών [35] – [38], το γεγονός αυτό δείχνει ότι η επίδραση του tumorspheres καλλιέργειας επί ογκογονικότητα εξαρτάται έντονα από τη μελετήθηκε κύτταρο . γραμμή

Ένας αυξανόμενος αριθμός συγγραφείς αναφέρουν ότι η CSC παρούσα μετα-EMT κύτταρα χαρακτηριστικά [8], [10] – [12]. Η έκφραση των τριών γονιδίων ΕΜΤ σχετίζονται (που κωδικοποιεί για το E-cadherin, Snai1 και βιμεντίνη) αξιολογήθηκε σε tumorspheres Β16-Ρ10 χρησιμοποιώντας ανάλυση RT-qPCR. Ε-καδερίνη ενέχεται σε αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων σαν επιθηλιακά και ρυθμίζεται προς τα κάτω από Snai1. Βιμεντίνης είναι ένα ενδιάμεσο νήμα που εκφράζεται σε μεσεγχυματικά κύτταρα. Τα δύο κύρια χαρακτηριστικά της EMT είναι μια προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης Ε-καδερίνης και μια προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης βιμεντίνης [39] – [42]. Σε δοκιμασίες ογκογονικότητας, αυτό οδηγεί σε μια αυξημένη απορρόφηση του όγκου. Στη μελέτη μας επί των κυττάρων Β16-F10, βιμεντίνη επίπεδο mRNA μειώθηκε δραματικά σε tumorspheres, υποστηρίζοντας το γεγονός ότι παρουσίασε μια μικρότερη ογκογενετικότητας σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα. Ωστόσο, το επίπεδο του mRNA Ε-καδερίνης ήταν επίσης χαμηλότερη σε tumorspheres και, αναπάντεχα, δεν είχαμε ανιχνεύσει Snai1 mRNA το οποίο πυροδοτεί την προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης διάρκεια ΕΜΤ [8]. Αυτό δείχνει ότι μια άλλη οδός μπορεί να εμπλέκεται σε tumorspheres σχηματισμού κυττάρων, έτσι ώστε να αποτραπεί η έκφραση της Ε-καδερίνης. Ο συνδυασμός της μειωμένης έκφρασης της Ε-καδερίνης, προωθώντας έτσι EMT, μαζί με την μειωμένη έκφραση του βιμεντίνης, προωθώντας μια μεσεγχυματικά-to-επιθηλιακά μετάβασης (ΜΕΤ), μπορεί να εξηγήσει την μικρή διαφορά των ογκογονικότητας μεταξύ tumorspheres και προσκολλημένα κύτταρα. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι tumorspheres καλλιέργεια κυττάρων Β16-F10 επηρεάζει πράγματι την έκφραση της EMT που σχετίζονται με τα γονίδια, αλλά μένει να διευκρινιστεί αν τα κύτταρα σε tumorspheres παρουσιάζουν τα χαρακτηριστικά της EMT ή ΚΟΑ.

Κατ ‘αρχάς, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι ισχυρή έκφραση των δεικτών επιφανείας CSC δεν είναι προγνωστική του σχηματισμού tumorspheres, όπως φαίνεται για MDA-MB-231 κύτταρα.

Δεύτερον, τα αποτελέσματά μας να μας οδηγήσει στο συμπέρασμα ότι tumorspheres πολιτισμός δεν είναι μια αποτελεσματική μέθοδος για να εμπλουτίσουν Β16-F10 ποντικού μελανώματος και MCF-7 ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος μαστού σε CSC. Όσον αφορά την κυτταρική γραμμή ΗΤ-29, τα αποτελέσματα ήταν λιγότερο σαφής και δεν μπορούν να εξαχθούν συμπεράσματα. Λαμβάνοντας υπόψη τη μελέτη μας και τους άλλους που ανέφεραν αύξηση της CSC χαρακτηριστικά σε tumorspheres πολιτισμούς, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η μέθοδος αυτή φαίνεται να εμπλουτίσουν το CSC σε μια κυτταρική γραμμή-εξαρτώμενο τρόπο, ανεξάρτητα από το είδος ή τα είδη καρκίνου θεωρούνται. Παρά το γεγονός ότι τα συμπεράσματά μας εξάγονται μόνο από κυτταρικές γραμμές καρκίνου, tumorspheres παράγεται από πρωτογενείς ανθρώπινους όγκους (γλοιώματα) έχουν επίσης αναφερθεί ότι είναι δύσκολο να υποκαλλιέργεια με αυξημένη διαφοροποίηση και απόπτωση σε σύγκριση με προσκολλημένα καλλιέργεια CSC για φιάλες λαμινίνη επικαλυμμένη [43].

για να συνοψίσουμε, ο σχηματισμός της tumorspheres δεν προβλέπουν πάντα εμπλουτισμό της CSC και ως εκ τούτου δεν μπορεί να θεωρηθεί ως μια καθολική μέθοδο για την CSC εμπλουτισμό σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ένα εκτεταμένο χαρακτηρισμό για CSC υπογραφή στα κύτταρα tumorspheres που σχηματίζουν είναι κυρίως υποχρεωτική πριν από τη σύναψη για την επίτευξη του εμπλουτισμού CSC.

Έξω από το πλαίσιο του εμπλουτισμού CSC, η γενιά των tumorspheres παραμένει μια ενδιαφέρουσα και χρήσιμη τεχνική.