Αφηρημένο

Ιστορικό

σε πολλαπλά ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα είναι δύσκολο να εξαλειφθεί για την αναποτελεσματικότητα των συμβατικών αντικαρκινικών φαρμάκων. Εκτός από τη διαφυγή των κυτταροτοξικών επιδράσεων της χημειοθεραπείας, παρακάμπτουν επίσης τα προ-ανοσογόνος αποτελέσματα που προκαλούνται από τα αντικαρκινικά φάρμακα: πράγματι δεν είναι καλά αναγνωρισμένο από δενδριτικά κύτταρα ξενιστές και δεν προκαλούν διαρκή ανοσία κατά του όγκου. Δεν έχει ακόμα διερευνηθεί αν πολυανθεκτικής κύτταρα έχουν διαφορετική ικανότητα να επάγει ανοσοκαταστολή από νόσο ευαίσθητη αυτά. Έχουμε ασχοληθεί με το θέμα στο ανθρώπινο και ποντικού χημειοευαίσθητων και πολυανθεκτικά καρκίνο ανθεκτικά κύτταρα.

Αποτελέσματα

Βρήκαμε ότι η δραστηριότητα και η έκφραση των ινδολοαμίνης 2,3-διοξυγενάσης 1 (IDO1), το οποίο καταλύει την μετατροπή της τρυπτοφάνης στην ανοσοκατασταλτική μεταβολίτη κυνουρενίνης, ήταν υψηλότερη σε όλα τα ανθεκτικά κύτταρα πολυφαρμάκου αναλύονται και ότι η αναστολή IDO1 μείωσε την ανάπτυξη των όγκων ανθεκτικών στα φάρμακα σε ζώα ανοσοϊκανά. Σε χημειοθεραπεία κύτταρα η βασική δραστηριότητα της JAK1 /STAT1 και σηματοδότηση JAK1 /STAT3 ήταν υψηλότερη, ο αναστολέας STAT3 PIAS3 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω, και η αυτοκρινής παραγωγή του STAT3-στόχου και IDO1-επαγωγείς κυτταροκινών IL-6, IL-4, IL- 1β, IL-13, ΤΝΡ-α και CD40L, αυξήθηκε. Η διακοπή της σηματοδότησης JAK /STAT μείωσε τη δραστηριότητα IDO1 και ανέστρεψε τις κυνουρενίνης που προκαλείται από προ-ανοσοκατασταλτική δράση, όπως αποκαλύφθηκε από την επαναφορά πολλαπλασιασμό των Τ-λεμφοκυττάρων στην χημειοθεραπεία κύτταρα STAT-σιγήσει.

Συμπεράσματα

η εργασία μας δείχνει ότι πολυανθεκτικής κύτταρα έχουν μια ισχυρότερη ανοσοκατασταλτική στάση από χημειοευαίσθητων κύτταρα, λόγω της συστατική ενεργοποίηση του άξονα JAK /STAT /IDO1, έτσι προκύπτει χημειοθεραπεία και το ανοσοποιητικό-υπεκφυγές. Διαταράσσοντας αυτό άξονα μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας, ανοσοθεραπεία πρωτόκολλα έναντι ανθεκτικών όγκων

Παράθεση:. Campia Ι, Buondonno Ι, Καστέλλα Β, Rolando Β, Kopecka J, Gazzano E, et al. (2015) Μια Αυτοκρινές κυτοκίνης /JAK /STAT-Σηματοδοσίας Προκαλεί κυνουρενίνης Σύνθεση σε πολυανθεκτικής σε φάρμακα ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 10 (5): e0126159. doi: 10.1371 /journal.pone.0126159

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Μιχαήλ Platten, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Χαϊδελβέργης, Γερμανία

Ελήφθη: 27 Οκτωβρίου του 2014? Αποδεκτές: 29 Μάρτη του 2015? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2015

Copyright: © 2015 Campia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Ένωση ιταλική Έρευνας για τον Καρκίνο (AIRC? χορηγήσει MFAG 11475? www.airc.it), το Υπουργείο του Πανεπιστημίου του ιταλικού και Έρευνας ( «Future στο ερευνητικό πρόγραμμα» FIRB 2012, να χορηγήσει RBFR12SOQ1? www.istruzione.it). JK είναι υπότροφος του Ιδρύματος ιταλική Έρευνας για τον Καρκίνο (FIRC? Www.fondazionefirc.it). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η επίτευξη μια καλή αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας και προκαλώντας μια διαρκή αντικαρκινική ανοσολογική απόκριση είναι οι κύριες προκλήσεις της chemoimmunotherapy. Χημειοαντίσταση, ιδίως η ταυτόχρονη αντίσταση προς διαφορετικές χημειοθεραπευτικούς παράγοντες γνωστοί ως πολυφαρμακευτική αντίσταση (MDR), είναι ένα από τα μεγαλύτερα προβλήματα που αντιμετωπίζουν οι χημειοθεραπεία [1]. MDR μπορεί να είναι παρόντες κατά τη διάγνωση ή που προκαλείται από την επιλεκτική πίεση της χημειοθεραπείας? συχνά επικαλείται την υπερέκφραση της δέσμευσης ΑΤΡ κασέτας (ABC) μεταφορείς υπεύθυνη για την εκροή του φαρμάκου αντικαρκινικών, όπως Ρ-γλυκοπρωτεΐνη (Pgp), που σχετίζονται με MDR πρωτεΐνες (MRPs) και πρωτεΐνη αντοχής στον καρκίνο του μαστού (BCRP). Μαζί, εκρέει δύο κλασικών χημειοθεραπευτικών παραγόντων (π.χ. ανθρακυκλίνες, ταξάνες, Vinca αλκαλοειδή, επιποδοφυλλοτοξίνες, τοποτεκάνη, μεθοτρεξάτη) και νέα στοχευμένα φάρμακα (π.χ. imatinib, το dasatinib, η λαπατινίμπη, gefitinib, sorafenib, ερλοτινίμπη), περιορίζοντας κυτταροτοξικά αποτελέσματα τους [2].

Ειδικά χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, όπως ανθρακυκλίνες και οξαλιπλατίνη, επίσης επάγουν προ-ανοσογόνος επιδράσεις, με διέγερση της μετατόπισης επί της μεμβράνης του πλάσματος ειδικού «τρώνε me» σήματα, όπως και η καλρετικουλίνη συνοδός, η οποία ενεργοποιεί το κύτταρο όγκου φαγοκυττάρωση και την επακόλουθη ενεργοποίηση των αντικαρκινικών CD8

+ Τ-λεμφοκυττάρων [3]. Αυτός ο μηχανισμός δεν λειτουργεί σε κύτταρα που υπερεκφράζουν Pgp [4-6], τα οποία προκύπτουν συγχρόνως χημείο- και ανοσο-ανθεκτικά.

Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να αποφύγει την ανοσοεπιτήρηση ξενιστή με καταστολή της δραστηριότητας του ξενιστή ανοσοποιητικό σύστημα. Μια πληθώρα μηχανισμών μεσολαβούν την προκαλούμενη από όγκο ανοσοκαταστολή, συμπεριλαμβανομένων των τροποποιήσεων σε επιφανειακά αντιγόνα του όγκου? απελευθέρωση των ανοσοκατασταλτικών κυτοκινών στο μικροπεριβάλλον του όγκου? επέκταση των Τ-βοηθητικών 2 λεμφοκύτταρα, Τ-ρυθμιστικά κύτταρα (Treg), μυελοειδή προέρχονται κατασταλτικά κύτταρα και τύπου 2 όγκων που σχετίζονται μακροφάγα, τα οποία ευνοούν την ανάπτυξη του όγκου και να βλάπτουν τη δραστικότητα των πληθυσμών κατά του όγκου, όπως τα Τ-βοηθητικά 1 λεμφοκύτταρα , CD8

+ Τ-λεμφοκύτταρα, τύπος 1-σχετίζεται με όγκο μακροφάγων, των φυσικών φονικών κυττάρων [7].

Ένα από τα ισχυρότερα μεσολαβητές της προκαλούμενης από όγκο ανοσοκαταστολή είναι κυνουρενίνης, το προϊόν του καταβολισμού τρυπτοφάνης μέσω τρυπτοφάνη διοξυγενάση (TDO) [8] και ινδολοαμίνης ένζυμα 2,3-διοξυγενάσης (IDO1 και IDO2) [9], οι οποίες προκαλούνται από ιντερφερόνη γ (IFN-γ) [10, 11], το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) [12 ] και σιδήρου [13]. Τρυπτοφάνη είναι ένα απαραίτητο αμινοξύ για τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των CD8

+ και CD4

+ Τ-λεμφοκύτταρα? Επιπλέον, η αυξημένη αναλογία κυνουρενίνης /τρυπτοφάνης διακυβεύει σοβαρά την αποτελεσματικότητα της κυτταρικής ανοσίας του ξενιστή, επειδή κυνουρενίνης αναστέλλει την ενεργοποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων [7, 14]. IDO1 εκφράζεται σε δενδριτικά κύτταρα όγκου-διηθητικά [15] και σε στρωματικά κύτταρα του όγκου [16], και έχει βρεθεί εκφράζουν συντακτικά ή πάνω ρυθμισμένα σε διάφορα κύτταρα όγκου [14, 17]. Μία αυξημένη αναλογία κυνουρενίνης ορού /τρυπτοφάνη έχει συσχετιστεί με μια ταχύτερη εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα [18] και της θετικότητας IDO σε δείγματα όγκων συνήθως συνδέεται με κακή κλινική πρόγνωση [19-21]. IDO1 υπερέκφραση υποστηρίζει την ανάπτυξη του όγκου και της εξέλιξης των καρκίνων του πνεύμονα [22], που οδηγεί σε υποθέτουν ότι κυνουρενίνης, εκτός ανοσοκατασταλτικές δράσεις της, μπορεί να ενισχύσει άμεσα την ανάπτυξη του όγκου.

προηγουμένως αποδειχθεί ότι ανθεκτικά σε πολλά φάρμακα τα κύτταρα είναι ανθεκτικά σε η ανοσογονική θάνατος λειτουργεί με δενδριτικά κύτταρα με τη μεσολάβηση της φαγοκυττάρωσης [4-6]. Δεν έχει διερευνηθεί κατά πόσο ανθεκτικά σε πολλά φάρμακα κύτταρα διαφέρουν από χημειοευαίσθητων αυτές επίσης για την ικανότητα να επάγουν ανοσοκαταστολή: βρήκαμε ότι πολλαπλά φάρμακα ανθεκτικά κύτταρα είχαν basally υψηλότερη παραγωγή του ανοσοκατασταλτικού μεταβολίτη κυνουρενίνης από χημειοευαίσθητων κύτταρα και διερευνήθηκε η μοριακή βάση αυτού του φαινοτύπου.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά

Η plasticware για καλλιέργειες κυττάρων ήταν από Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Τα αντιδραστήρια ηλεκτροφόρησης λήφθηκαν από Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Η ανθρώπινη ανασυνδυασμένη ΙΡΝ-γ ελήφθη από R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ). 5-Br-brassinin ήταν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη των κυτταρολυμάτων αξιολογήθηκε με το κιτ BCA από την Sigma Chemicals Co (St. Louis, ΜΟ). Όταν δεν ορίζεται διαφορετικά, όλα τα άλλα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από στοκ διαλύματα Sigma Chemicals Co. 3 mmol /L σιδήρου νιτριλοτριοξεικό (FeNTA) παρασκευάστηκαν με ανάμιξη 1 όγκο 6 mmol /L νιτριλοτριοξικό οξύ σε 1 eq /L ΝαΟΗ, και 1 όγκο 6 mmol /L ΡεΟ

3 σε 1 eq /L HCl? το ρΗ ρυθμίστηκε σε ουδετερότητα με ΝβΟΗ.

Cells

Τα ανθρώπινα χημειοευαίσθητων μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα καρκίνου του Α549 αγοράστηκαν από Istituto Zooprofilattico Sperimentale «Bruno Umbertini» (Brescia, Ιταλία). Τα ανθρώπινα χημειοευαίσθητων κύτταρα καρκίνου του κόλου ΗΤ29, τα ανθρώπινα χημειοευαίσθητων χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας Κ562, τα ανθρώπινα χημειοευαίσθητων κύτταρα μεσοθηλιακών Met5A και το μυϊκό ιδιοσυστατικά χημειοθεραπεία μαστικά κύτταρα JC ήταν από την ATCC (Manassas, VA) το ανθεκτικό υποσειρές Α549 /dx, ΗΤ29 /dx, Κ562 /dx παράχθηκαν στο εργαστήριο μας με την καλλιέργεια των προαναφερθέντων γονικών κυττάρων σε ένα μέσο που περιέχει αυξανόμενες συγκεντρώσεις δοξορουβικίνης, που χρησιμοποιείται ως επαγωγέας MDR, όπως αναφέρθηκε νωρίτερα [4]. Η ανθρώπινα κύτταρα συστατικά χημειοθεραπεία κακόηθες μεσοθηλίωμα (HMM) συλλέχθηκαν, μετά από ενημέρωση γραπτή συγκατάθεση των ασθενών, από τη βιολογική Τράπεζα της κακόηθες μεσοθηλίωμα (δ.δ. Antonio e Biagio Νοσοκομείο, Αλεξάνδρεια, Ιταλία), όπου διεξήχθη η ιστολογική χαρακτηρισμό [23]. Το πειραματικό πρωτόκολλο (κωδικός: TASK3) εγκρίθηκε στις 09/11/2011 από την Επιτροπή Βιοηθικής ( «Comitato Etico Interaziendale») του δ.δ. Antonio e Biagio Νοσοκομείο, Αλεξάνδρεια, Ιταλία. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στο αντίστοιχο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% ν /ν ορό εμβρύου μόσχου (FBS), 1% ν /ν πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη, 1% ν /ν ί-γλουταμίνη και διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C και 5% CO

2

μέτρηση κυνουρενίνης

Η δραστικότητα IDO προσδιορίστηκε σύμφωνα με [24], με μικρές τροποποιήσεις:. 200 μι υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας προστέθηκαν σε 100 μι 30% β /ο τριχλωροοξικό οξύ (TCA) και επωάζονται για 30 λεπτά στους 50 ° C για να υδρολυθεί Ν-formylkynurenine να κυνουρενίνης. Μετά από φυγοκέντρηση στα 10.000 xg για 10 λεπτά, 100 μι του υπερκειμένου μεταφέρθηκαν σε πλάκα 96-φρεατίων, αναμειγνύονται με 100 μι 2% w /v ρ-διμεθυλαμινο βενζαλδεΰδης σε 99,8% ν /ν οξικό οξύ, και επωάστηκαν για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου. Κυνουρενίνης ανιχνεύθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 490 nm, χρησιμοποιώντας ένα ΗΤ Synergy Multi-Detection Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT). Η απορρόφηση του μέσου καλλιέργειας μόνο του θεωρήθηκε ως τυφλό και αφαιρέθηκε από τις τιμές που λαμβάνονται με την παρουσία των κυττάρων. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως nmol κυνουρενίνης mg κύτταρο /πρωτεΐνες, σύμφωνα με μια καμπύλη τιτλοδότησης που είχαν οριστεί προηγουμένως. επίπεδα κυνουρενίνης στα υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας μετρήθηκαν εν παραλλήλω με υψηλής πίεσης υγρή χρωματογραφία (HPLC), όπως αναφέρεται στο [25], με μικρές τροποποιήσεις: 400 μL από υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας προστέθηκαν σε 100 μι 30% w /v TCA , επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 50 ° C και φυγοκεντρήθηκε στα 15.000 xg για 10 λεπτά. Το διαυγές υπερκείμενο διηθήθηκε μέσω φίλτρων 0,45 μm PTFE (Alltech, Nicholasville, ΚΥ) και αναλύθηκαν με ένα σύστημα Agilent LC (Palo Alto, CA), εξοπλισμένο με απαερωτή κενού (G1322A), τεταρτοταγή αντλία (G1311A), οδηγίες έγχυσης (Rheodyne , Cotati, CA) και πολλαπλές ανιχνευτή μήκους κύματος (G1365A) ενσωματώνονται στο σύστημα HP1200. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν και επεξεργασία με το λογισμικό Agilent ChemStation. Ο όγκος έγχυσης ήταν 20 μλ. Μια στήλη Agilent Eclipse XDB-C18 (125 mm Χ 4,0 mm, που 5μm) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση στους 30 ° C. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός διεξήχθη χρησιμοποιώντας την κινητή φάση που αποτελείται από ρυθμιστικό διάλυμα 15 mmol /L οξικό (ρΗ 4.0) και ακετονιτρίλιο (90:10, ν /ν) με ένα ρυθμό ροής 0,8 mL /min. Το έκλουσμα παρακολουθήθηκε στα 365 nm, αναφορά κατά μήκος κύματος 700 nm. Τα δείγματα βαθμονόμησης παρασκευάστηκαν με προσθήκη πρότυπα κυνουρενίνης (Sigma Chemical Co.) σε συγκέντρωση της τάξης από 0,50 έως 50 μmol /L στο μέσο καλλιέργειας. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως nmol κυνουρενίνης /mg πρωτεΐνες του κυττάρου.

συστοιχίες qRT-PCR και PCR

Το συνολικό RNA εκχυλίσθηκε και μεταγράφηκε ανάστροφα με τη χρήση του cDNA iScript Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories ). Η qRT-PCR εκτελέστηκε με το iTaq καθολική SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories). Το ίδιο παρασκεύασμα cDNA χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση του γονιδίου ενδιαφέροντος και το γονίδιο καθαριότητας

β-ακτίνης

. Οι αλληλουχίες εκκινητών, έχουν σχεδιαστεί με το λογισμικό qPrimerDepot (https://primerdepot.nci.nih.gov/), ήταν: για το

IDO1

: 5′-CAGGCAGATGTTTAGCAATGA -3 ‘? 5’-GATGAAGAAGTGGGCTTTGC -3 ‘? για

β-ακτίνης

: 5′-GCTATCCAGGCTGTGCTATC-3 ‘? 5’- TGTCACGCACGATTTCC-3 ‘. Το ποσό των

IDO1

mRNA ήταν κανονικοποιημένα σε σχέση με το ποσό των

β-ακτίνης

mRNA, επιλέχθηκε ως το γονίδιο καθαριότητας, και εκφράστηκε ως

IDO1

/

β- ακτίνη

αναλογία, με τη χρήση της Bio-Rad Gene Expression Λογισμικό η ποσοτικοποίηση (Bio-Rad Laboratories). Οι συστοιχίες PCR εκτελέστηκαν σε 1 μα cDNA, χρησιμοποιώντας το ανθρώπινο JAK /STAT μονοπάτι σηματοδότησης RT² Profiler PCR Array και το ανθρώπινο IL-6 /STAT3 μονοπάτι σηματοδότησης Plus RT² Profiler PCR Array (Qiagen, Hilden, Γερμανία), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη RT² Profiler PCR Array Ανάλυση Δεδομένων (Qiagen).

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (125 mmol /L Tris-HCl, 750 mmol /L NaCl, 1% ν /ν ΝΡ40, 10% ν /ν γλυκερόλη, 50 mmol /L MgCl

2, 5 mmol /L EDTA, 25 mmol /L NaF, 1 mmol /L NaVO

4 , 10 μg /ml λευπεπτίνη, 10 μg /mL πεπστατίνη, 10 μg /mL απροτινίνη, 1 mmol /L φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο? ρΗ 7.5), επεξεργασία με υπερήχους και φυγοκεντρήθηκε σε 13.000 xg για 10 λεπτά στους 4 ° C. 20 μg των πρωτεϊνών από κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western και διερευνήθηκαν με τα ακόλουθα αντισώματα έναντι: IDO1 (κουνελιού πολυκλωνικό, αραιωμένο 1: 2000, AG-25A-0029, Adipogen, San Diego, CA)? IDO2 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, σε αραίωση 1: 500, SAB3701447, Sigma Chemical Co.)? TDO (κουνελιού πολυκλωνικό, αραιωμένο 1: 1000, SAB2102400, Sigma Chemical Co.)? φωσφο (Tyr 1022/1023) -JAK1 (πολυκλωνικό κουνέλι, αραιωμένο 1: 1000, # 3331, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ)? JAK1 (κουνελιού πολυκλωνικό, αραιωμένο 1: 1000, # 3344, Cell Signaling Technology)? φωσφο (Tyr701) -STAT1 (κουνέλι πολυκλωνικό, αραιωμένο 1: 1000, # 9167, Cell Signaling Technology)? STAT1 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, σε αραίωση 1: 1000, κλώνος 15H3, Thermo Scientific, Rockford, IL)? φωσφο (Tyr705) -STAT3 (κουνέλι πολυκλωνικό, αραιωμένο 1: 2000, # 9145, Cell Signaling Technology)? STAT3 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, σε αραίωση 1: 5000, κλώνος 9D8, Thermo Scientific)? PGP (πολυκλωνικό κουνελιού, αραιωμένο 1: 250, SC-8313, Santa Cruz Biotechnology Inc.)? MRP1 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, σε αραίωση 1: 100, ab32574, Abcam, Cambridge, UK)? MRP2 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, σε αραίωση 1: 100, ab3373, Abcam)? MRP3 (κατσίκα πολυκλωνικά, αραιωμένο 1: 250, SC-5776, Santa Cruz Biotechnology Inc.)? MRP4 (κατσίκα πολυκλωνικό, αραιωμένο 1: 250, ab77184, Abcam)? MRP5 (κατσίκα πολυκλωνικά, αραιωμένο 1: 250, SC-5781, Santa Cruz Biotechnology Inc.)? BCRP (πολυκλωνικό κουνελιού, αραιωμένο 1: 500, SC-25882, Santa Cruz Biotechnology Inc.)? β-τουμπουλίνης (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, σε αραίωση 1: 500, SC-5274, Santa Cruz Biotechnology Inc.), που ακολουθείται από ένα δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Bio-Rad Laboratories). Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Bio-Rad Laboratories). Πυρηνικά εκχυλίσματα που παρασκευάζονται με την πυρηνική Απόσπασμα Kit (Active Motif, Rixensart, Βέλγιο)? 10 μg πυρηνικών πρωτεϊνών αναλύθηκαν με SDS-PAGE και ανιχνεύθηκαν με τα ακόλουθα αντισώματα έναντι: PIAS1 (μονοκλωνικό κουνέλι, αραιωμένο 1: 1000, ab109388, Abcam)? PIAS3 (κουνελιού πολυκλωνικό, αραιωμένο 1: 1000, ab22856, Abcam)? φωσφο (Tyr701) -STAT1? STAT1? φωσφο (Tyr705) -STAT3? STAT3? ΤΑΤΑ δεσμευτική πρωτεΐνη (ΤΒΡ? Κουνελιού πολυκλωνικό, αραιωμένο 1,500, sc-273, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Για να αποκλειστεί κάθε κυτοσολικά μόλυνση των πυρηνικών εκχυλισμάτων, διαπιστώσαμε ότι β-τουμπουλίνης ήταν μη ανιχνεύσιμη στο πυρηνικό δείγματα (δεν φαίνεται).

In Vivo

Ανάπτυξης Όγκου

1 Χ 10

5 ανθρώπινα Α549, Α549 /dx, ΗΤ29, ΗΤ29 /dx κύτταρα σε 20 μΐ μέσου καλλιέργειας, αναμιγνύεται με 20 μΙ Cultrex ΒΜΕ (Trevigen, Gaithersburg, MD), εμφυτεύθηκαν υποδορίως στο δεξιό πλευρό του 6-8 εβδομάδων παλιά γυναικεία γυμνά ποντίκια BALB /c, το οποίο στεγάζεται κάτω από σκοτεινό κύκλο 12 ώρες φως /, με το φαγητό και το ποτό παρέχεται

κατά βούληση

. 1 x 10

5 ποντικού χημειοθεραπεία κύτταρα JC, συγγενή με τα ποντίκια BALB /c [26], εμφυτεύθηκαν σε ανοσοϊκανά ζώα. Σε μία δεύτερη πειραματική σειρά, όταν Α549 /dx, ΗΤ29 /dx και JC όγκοι έφθασαν τον όγκο των 100 mm

3, τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες: «Control» ομάδα (που έλαβαν θεραπεία με 100 μL αλατούχου διαλύματος

per os

, 5 ημέρες /εβδομάδα για τρεις εβδομάδες)? ομάδα «Brassinin» (επεξεργασία με 400 mg /kg του αναστολέα IDO1 5-Br-brassinin

per os

, 5 ημέρες /εβδομάδα για τρεις εβδομάδες), όπως περιγράφεται στο [27]. Και στις δύο πειραματικές σειρές, η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο καθημερινά και υπολογίστηκε σύμφωνα με την εξίσωση (LXW

2) /2, όπου L = μήκος όγκου και W = πλάτος του όγκου. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία την ημέρα 21. Οι πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Βιοηθικής ( «Comitato di Etico Ateneo») του Πανεπιστημίου του Τορίνο, στην Ιταλία.

κυτοκίνης

παραγωγής

Η παραγωγή των κυτοκινών μετρήθηκε στο υπερκείμενο της κυτταρικής καλλιέργειας χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα εμπορικά κιτ: ανθρώπινης ιντερλευκίνης-6 (IL-6) Duo Set κιτ ανάπτυξης (R &? D Systems), ανθρώπινη ιντερλευκίνη-4 (IL-4) Duoset κιτ ανάπτυξης (R &? D Systems ), Human IL1-βήτα (IL-1β) λευκόχρυσος κιτ ELISA (eBioscience, San Diego, CA), ανθρώπινη ιντερλευκίνη-13 (IL-13) ELISA Development Kit (Peprotech, London, UK), ανθρώπινο διαλυτό CD40 Ligand (sCD40L) Development Kit ELISA (Peprotech), ανθρώπινα παράγοντα νέκρωσης όγκων α (TNF-α) Kit Duoset Ανάπτυξης (R &? D Systems), ΙΡΝ-γ Kit Ανάπτυξης Ανθρώπινου Duoset (R &? D Systems). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ng /mg κύτταρο πρωτεΐνες ή pg /mg κυτταρικών πρωτεϊνών, σύμφωνα με την καμπύλη βαθμονόμησης της κάθε κιτ.

Κυττάρων φίμωση

200.000 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 400 nmol /L 19 -25 νουκλεοτιδίου μη στόχευση κωδικοποιημένο siRNAs (Control siRNA-Α, Santa Cruz Biotechnology Inc.), με STAT1- ή STAT3-ειδική πισίνα siRNAs (Santa Cruz Biotechnology Inc.), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να επαληθευτεί η αποτελεσματικότητα αποσιώπησης, τα κύτταρα λύθηκαν και ελέγχονται για την έκφραση των STAT1 και STAT3 με κηλίδωση Western, όπως περιγράφεται ανωτέρω.

ανοσολογικές δοκιμασίες

1 Χ 10

6 /mL του ανθρώπινου μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC), που απομονώθηκε από φλεγμονώδεις πλακούντες από υγιείς δότες (Τράπεζα αίματος, AOU Città della Salute e della Scienza di Torino Νοσοκομείο, Τορίνο, Ιταλία) με φυγοκέντρηση σε διαβάθμιση πυκνότητας Ficoll-Hypaque, υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αντι CD3 (ΟΚΤ3, BioLegend, San Diego, CA) και αντι-CD28 (BioLegend) αντισωμάτων, για την επαγωγή της ειδικής πολλαπλασιασμό των Τ-λεμφοκυττάρων, και συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα-στόχους (προηγουμένως ακτινοβοληθεί με 30 Gy για 15 λεπτά) για 72 ώρες σε μία αναλογία τελεστή /στόχου 10: 1. Η επέκταση των Τ-λεμφοκυττάρων, ο μόνος πληθυσμός PBMC σε θέση να πολλαπλασιάζονται σε αυτές τις πειραματικές συνθήκες, αξιολογήθηκε με προσθήκη 1 μθί [

3Η] θυμιδίνης (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ) 18 ώρες πριν από το τέλος των συν-καλλιέργειες , τότε συλλογή των πλακών και την καταμέτρηση της ραδιενέργειας. Για την ανάλυση του φαινοτύπου των λεμφοκυττάρων μετά την επώαση με κύτταρα όγκου, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) που περιέχει 5% ν /ν FBS. Ένα 3- και 4-χρώμα ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με τα κατάλληλα συνδυασμούς φλουορεσκεΐνη isothiocyanate-, r-Phycoerythrin-, tricolor-, peridinin πρωτεΐνη χλωροφύλλης συμπλόκου ή αλλοφυκοκυανίνη-συζευγμένα αντισώματα για CD3, CD4, CD8, CD25 (όλα από Miltenyi Biotech, Μπέργκις Γκλάντμπαχ, Γερμανία), και CD127 (BioLegend). έλεγχοι ισοτύπου έτρεξαν για κάθε δείγμα. Τα δείγματα αναγνώσθηκαν με μία ροή FACS Calibur κυτταρόμετρο εξοπλισμένη με ένα λογισμικό CELLQuestPro (Becton Dickinson). Η χρήση των PBMC από υγιείς δότες και τα πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Βιοηθικής ( «Comitato Etico Interaziendale») του A.O.U. Città della Salute e della Scienza di Torino Νοσοκομείο, Τορίνο, Ιταλία.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Το ουδέτερο κόκκινο βαφή διεξήχθη για να μετρηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων, όπως αναφέρεται λεπτομερώς στο παρελθόν [28]. Η απορρόφηση στα 540 nm διαβάστηκε χρησιμοποιώντας ένα Synergy ΗΤ Multi-Detection Microplate Reader. Η απορρόφηση των μη επεξεργασμένων κυττάρων θεωρήθηκε ως 100% βιωσιμότητα? Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα.

νιτρώδες μέτρηση

Το επίπεδο του νιτρώδους, ένα σταθερό παράγωγο του ΝΟ, στα υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας μετρήθηκε με την μέθοδο Griess [ ,,,0],29]. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως nmol νιτρώδες /mg πρωτεΐνες του κυττάρου.

σίδερο

μέτρηση

100 Χ 10

6 κύτταρα πλύθηκαν με PBS, αποκολλήθηκαν με θρυψίνη /EDTA, φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 xg για 2 λεπτά, επαναιωρήθηκαν σε 1 mL PBS και κατεργασία με υπερήχους. Το ενδοκυτταρικό σίδηρο μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα AAnalyst 200 Φασματόμετρο Απορρόφησης Ατομικής (PerkinElmer). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ng /ml εναιώρημα κυττάρων σιδήρου.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα σε μορφή κειμένου και στοιχεία που παρέχονται ως μέσοι ± SD. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA). Ένα

σ

& lt? 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

σύνθεση κυνουρενίνης είναι υψηλότερη σε κύτταρα ανθεκτικά σε πολλά φάρμακα και διαμορφώνεται από 5-Br-brassinin, μεθυλο-DL-τρυπτοφάνη και η ιντερφερόνη-γ

Αναλύσαμε πρώτα την παραγωγή κυνουρενίνης σε ένα πάνελ χημειοευαίσθητων και ανθεκτικά σε πολλαπλά φάρμακα καρκινικά κύτταρα, που δείχνει ένα διαφορετικό πρότυπο από ABC μεταφορέων (S1 Εικ): ΗΤ29, Α549, Κ562, Met5A ήταν ανθρώπινα χημειοευαίσθητων κύτταρα? ΗΤ29 /dx, Α549 /dx και Κ562 /dx ήταν μοντέλα των κεκτημένων MDR? ΗΜΜ και JC ήταν ανθρώπου και ποντικού ιδιοσυστατικά χημειοθεραπεία κύτταρα, αντίστοιχα. Τα πολλαπλά φάρμακα ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές είχαν υψηλότερα επίπεδα-ανιχνεύονται κυνουρενίνης με HPLC (S2 Εικ) και φασματοφωτομετρική δοκιμασία (Σχήμα 1Α) -και αυξημένα επίπεδα IDO1 πρωτεΐνης σε σύγκριση με νόσο ευαίσθητη κυττάρων (Σχήμα 1Β). IDO2 ανιχνεύθηκε σε μεταβλητά ποσά σε νόσο ευαίσθητη και χημειοθεραπεία κύτταρα? TDO ανιχνεύθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν, εκτός από κύτταρα Α549 /dx (Σχήμα 1Β).

IDO1

mRNA οδήγησε επίσης υψηλότερη σε πολλαπλά φάρμακα κύτταρα ανθεκτικά σε σχέση με νόσο ευαίσθητη αυτά (Σχήμα 1C).

Ανθρώπινο χημειοευαίσθητων κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα Α549 και χημειοθεραπεία κύτταρα Α549 /dx, τα ανθρώπινα χημειοευαίσθητων παχέος εντέρου κύτταρα καρκίνου ΗΤ29 και χημειοθεραπεία ΗΤ29 /dx κύτταρα, τα ανθρώπινα χημειοευαίσθητων κύτταρα χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας Κ562 και Κ562 χημειοθεραπεία /κύτταρα dx, τα ανθρώπινα κύτταρα χημειοευαίσθητων μεσοθηλιακών Met5A και ανθρώπινα χημειοθεραπεία κακοήθων κυττάρων μεσοθηλίωμα ΗΜΜ, χημειοθεραπεία μαστικά κύτταρα ποντικού JC υποβάλλονται στις ακόλουθες έρευνες. A. Τα επίπεδα κυνουρενίνης στα υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας μετρήθηκαν φασματοφωτομετρικά. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD (η = 4). * P & lt? 0.05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001: χημειοθεραπεία κυττάρων (MDR-θετική) σε σχέση με τις αντίστοιχες χημειοευαίσθητων (MDR-αρνητικά) κύτταρα. ανάλυση κηλίδος Β Western των IDO1, IDO2 και έκφραση TDO. Η έκφραση β-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος της ίσης φόρτωσης πρωτεΐνης. Το ποσοστό αυτό είναι αντιπροσωπευτικό από 3 πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα. C. Το επίπεδο έκφρασης του

IDO1

mRNA μετρήθηκε με qRT-PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD (η = 4). * P & lt? 0.01, ** p & lt? 0.002:. Χημειοθεραπεία κυττάρων (MDR-θετική) σε σχέση με τις αντίστοιχες χημειοευαίσθητων (MDR-αρνητικά) κύτταρα

Η

Ανθρώπινο χημειοθεραπεία Α549 /dx κυττάρων και ΗΤ29 /dx κυττάρων αυξήθηκε ταχύτερα από ό, τι τα χημειοευαίσθητων Α549 και ΗΤ29 κύτταρα εμφυτεύθηκαν σε ποντίκια γυμνά ποντίκια BALB /c (σχήμα 2Α). Τα χημειοθεραπεία κύτταρα JC ποντικού είχε το υψηλότερο ποσοστό ανάπτυξης (Σχήμα 2Α). Είναι ενδιαφέρον ότι η IDO1 αναστολέας της 5-Br-brassinin [27] δεν αναστέλλουν την ανάπτυξη των Α549 /dx και ΗΤ29 /dx όγκους, εμφυτεύονται σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς, αλλά μείωσε σημαντικά την εξέλιξη του JC όγκων, εμφυτεύονται σε ζώα ανοσοεπαρκείς (Σχήμα 2Β ). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η δραστηριότητα IDO μπορούν να υποστηρίξουν την ταχεία αύξηση των χημειοθεραπεία όγκων σε οικοδεσπότες ανοσοεπαρκών.

Α. 1 x 10

5 ανθρώπινη Α549, Α549 /dx, ΗΤ29, ΗΤ29 /dx κύτταρα εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε ηλικίας 6-8 εβδομάδων ποντικών γυναικείο γυμνό BALB /c, 1 x 10

κύτταρα JC 5 ποντικών εμφυτεύθηκαν σε ανοσοεπαρκείς BALB /c ποντίκια. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθούνταν καθημερινά με μέτρηση της δαγκάνας. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD από 10 ποντίκια /ομάδα. * P & lt? 0.02, ** p & lt? 0.005, *** p & lt? 0.001: Α549 /dx ή ΗΤ29 /dx κυττάρων έναντι Α549 ή ΗΤ29 κύτταρα, κατά τα αντίστοιχα χρονικά σημεία. B. Τα ζώα που φέρουν Α549 /dx-, ΗΤ29 /dx-, JC-όγκους τυχαιοποιήθηκαν σε δύο ομάδες όταν οι όγκοι έφθασαν τον όγκο των 100 mm

3: ομάδα «ελέγχου» (επεξεργασία με 100 μι αλατούχου διαλύματος

per os

, 5 ημέρες /εβδομάδα για τρεις εβδομάδες? CTRL)? ομάδα «Brassinin» (θεραπεία με 400 mg /kg του IDO1 αναστολέας της 5-Br-brassinin

per os

, 5 ημέρες /εβδομάδα για τρεις εβδομάδες? BRA). Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθούνταν καθημερινά με μέτρηση της δαγκάνας. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD από 6 ποντίκια /ομάδα. ** P & lt? 0.005:. BRA-ομάδα έναντι CTRL-ομάδα, στα αντίστοιχα χρονικά σημεία

Η

Είμαστε δίπλα διερευνηθεί η αιτία της διαφοράς στην παραγωγή κυνουρενίνης μεταξύ χημειοευαίσθητων και χημειοθεραπεία κύτταρα. Για λόγους απλότητας, εστιάσαμε στην Α549 και Α549 /dx κύτταρα ως υποδείγματα χημειοευαίσθητων και πολυφαρμάκου ανθεκτικά κύτταρα, αντίστοιχα, δεδομένου ότι σε αυτά τα κύτταρα, η διαφορά στα επίπεδα έκφρασης κυνουρενίνης και IDO1 ήταν πολύ εμφανής. Επειδή η μέτρηση HPLC και η φασματοφωτομετρική δοκιμασία έδωσε επιτιθέμενες αποτελέσματα για Α549 και Α549 /dx (S2 Εικ και το Σχήμα 1Α), χρησιμοποιήσαμε την τελευταία δοκιμασία ως αξιόπιστη μέθοδος για την αξιολόγηση των διαφορών στα επίπεδα κυνουρενίνης μεταξύ αυτών των δύο κυτταρικών σειρών.

Αναλύσαμε κατά πόσον τα επίπεδα κυνουρενίνης μεταβάλλεται διαφορετικά σε απόκριση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα-στην οποία ανθεκτικά σε πολλά φάρμακα κύτταρα είναι insensitive-, να IDO1 ενεργοποιητές, όπως ΝΟ, σίδηρο και ΙΡΝ-γ, και να IDO1 αναστολείς, όπως 5- br-brassinin και μεθυλο-DL-τρυπτοφάνης [30].

δοξορουβικίνη, σισπλατίνη, γεμσιταβίνη και μιτοξαντρόνη, χρησιμοποιούνται σε συγκεντρώσεις που μειώνεται στο 50%, η βιωσιμότητα των ευαίσθητων κυττάρων Α549 χωρίς να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των ανθεκτικών Α549 /dx κύτταρα (Εικ S3A), δεν άλλαξε τα επίπεδα κυνουρενίνης, η οποία παρέμεινε σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα Α549 /dx ό, τι σε κύτταρα Α549, είτε με την απουσία ή την παρουσία των χημειοθεραπευτικών παραγόντων (S3b Εικ). Ομοίως, η ΝΟ δότες S-νιτροζογλουταθειόνη και S-νιτροζο-Ν-ακετυλοπενικιλλαμίνη, η οποία αύξησε τα επίπεδα του ΝΟ σε νόσο ευαίσθητη και πολυφαρμάκου ανθεκτικών κυττάρων (S4A Σχήμα), δεν τροποποίησε τη σύνθεση κυνουρενίνης σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα σε δύο πληθυσμούς κυττάρων (S4B Σύκο). Για να ρυθμίζουν το ενδοκυτταρικό σίδηρο, υποβάλλαμε σε αγωγή Α549 και Α549 /dx κυττάρων με το διαπερατό κύτταρο ένωση σιδήρου απελευθέρωσης FeNTA και με την desferroxamine χηλικοποιητή του σιδήρου, τα οποία αντίστοιχα αυξάνεται και μειώνεται το ποσό της κυτταρικής σιδήρου (S5A Εικ): και πάλι, ούτε FeNTA ούτε desferroxamine μεταβάλλεται η παραγωγή κυνουρενίνης (S5B Σχήμα).

ΙΡΝ-γ αύξησε τα επίπεδα κυνουρενίνης σε αμφότερες νόσο ευαίσθητη και πολυφαρμάκου ανθεκτικά κύτταρα, αλλά η έκταση της εν λόγω αύξησης ήταν μεγαλύτερη σε κύτταρα Α549 /dx (Σχήμα 3Α). Η επίδραση της ΙΡΝ-γ, η οποία μειώθηκε από τους αναστολείς μεθυλ-DL-τρυπτοφάνη και 5-Br-brassinin (Σχήμα 3Α), συνδέθηκε με την αύξηση του

IDO1

mRNA (Σχήμα 3Β) και πρωτεΐνης ( Σχήμα 3C). Επίσης σε αυτή την περίπτωση, η αύξηση που προκαλείται από ΙΡΝ-γ ήταν εντονότερη σε Α549 /dx ό, τι σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 3Β και 3C), υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα ανθεκτικά σε πολλά φάρμακα ήταν ανταποκρίνονται περισσότερο στην κυτοκίνη. Παρόμοιες επιδράσεις της ΙΡΝ-γ, μεθυλο-DL-τρυπτοφάνη και 5-Br-brassinin ανιχνεύθηκαν σε ΗΤ29 και ΗΤ29 /dx κύτταρα, Κ562 και κυττάρων /dx Κ562, Met5A και κυττάρων ΗΜΜ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α549 και Α549 /dx κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες σε φρέσκο ​​μέσο (CTRL) ή σε μέσο που περιέχει το IDO1 αναστολείς μεθυλ-DL-τρυπτοφάνη (1 mmol /L, mTrp) ή 5-Br-brassinin (100 μmol /L, BRA), και το IDO1 επαγωγέα της IFN-γ (100 ng /mL, ΙΡΝγ), μόνα τους ή σε συνδυασμό. A. Τα επίπεδα κυνουρενίνης στα υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας μετρήθηκαν φασματοφωτομετρικά. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD (η = 4). * P & lt? 0.01: έναντι Α549 κύτταρα CTRL? Οοο p & lt? 0.001: έναντι Α549 /dx CTRL?

◊◊ p & lt? 0.005: ΙΡΝ-γ + mTrp επεξεργασμένο, ΙΡΝ-γ + BRA επεξεργασμένου Α549 και Α549 /dx κύτταρα έναντι των αντίστοιχων κύτταρα επεξεργασμένα με ΙΡΝ-γ μόνο. B. Το επίπεδο έκφρασης του

IDO1

mRNA μετρήθηκε με qRT-PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD (η = 4). *** P & lt? 0.001: έναντι Α549 κύτταρα CTRL? Οοο p & lt? 0.001: έναντι Α549 /dx κύτταρα CTRL. Η ανάλυση στυπώματος Western Γ έκφρασης IDO1. Η έκφραση β-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος της ίσης φόρτωσης πρωτεΐνης. Το ποσοστό αυτό είναι αντιπροσωπευτικό από 3 πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

ανθεκτικών κυττάρων σε πολλαπλά φάρμακα έχουν υψηλότερη δραστικότητα της JAK σηματοδότησης /STAT και αυξημένη αυτοκρινή παραγωγή του STAT3 που εξαρτώνται από κυτοκίνες από κύτταρα χημειοευαίσθητων

από IFN-γ ενεργοποιεί το JAK /STAT1-3 σηματοδότηση [31], και STAT1 και STAT3 είναι ισχυροί ενεργοποιητές της μεταγραφής του

IDO1

γονιδίων σε περισσότερα κύτταρα των θηλαστικών [32, 33], αναλύσαμε τα επίπεδα έκφρασης των βασικών γονιδίων των JAK οδού /STAT με PCR διαλογή υψηλής απόδοσης. Όπως φαίνεται στο S1 πίνακα και το Σχ 4Α, κύτταρα Α549 /dx δεν διέφερε από Α549 κύτταρα για την έκφραση του

JAK1-2-3

, αλλά επέδειξαν υψηλότερη έκφραση του

STAT1

και

STAT3

. Σύμφωνα με αυτή την τάση, την κλασική STAT1- και γονίδια STAT3-στόχο (

A2m

,

BCL2L1

,

CDKN1A

,

CRP

,

CXCL9

,

FAS

,

IRF1

,

JunB

,

ΜΜΡ3

,

MYC

,

NOS2

,

SOCS1

) ήταν επάνω-ρυθμίζονται στα ανθεκτικά κύτταρα σε πολλαπλά φάρμακα (S1 πίνακα). Στη Δυτική κηλίδωση επικύρωσης, βρήκαμε παρόμοια επίπεδα ολικής πρωτεΐνης JAK1 σε κυτταρικές κυτταρολύματα Α549 και Α549 /κυττάρων dx σύνολο, αλλά τα υψηλότερα επίπεδα του ενεργού τυροσίνης-φωσφορυλιωμένη JAK1 στα ανθεκτικά κύτταρα σε πολλαπλά φάρμακα (Σχήμα 4Β). Τα ποσά των STAT1, φωσφο (Tyr701) -STAT1, STAT3, φωσφο (Tyr705) -STAT3 ήταν επίσης υψηλότερο στους χημειοθεραπεία κύτταρα (Σχήμα 4Β). Το επίπεδο του mRNA της PIAS1 αναστολέα STAT1 δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ Α549 και Α549 /κυττάρων dx (S1 Πίνακα και Σχήμα 4Α), και το επίπεδο της πρωτεΐνης PIAS1 ήταν η ίδια στα πυρηνικά εκχυλίσματα (σχήμα 4C). Αντίθετα, η πυρηνική ποσότητα του αναστολέα PIAS3 STAT3 ήταν χαμηλότερη σε Α549 κύτταρα /dx (Σχήμα 4C)? Αυτό ήταν σύμφωνη με το χαμηλότερο επίπεδο του

PIAS3

mRNA (S2 Πίνακας). Είναι ενδιαφέρον, STAT1, φωσφο (Tyr701) -STAT1, STAT3, φωσφο (Tyr705) -STAT3 ήταν όλα περισσότερο μετατοπίζεται στον πυρήνα κυττάρων ανθεκτικών σε πολλαπλά φάρμακα (σχήμα 4Γ). Αυτό το πρότυπο, το οποίο είναι πιθανό να οφείλεται στην υψηλότερη ποσότητα και φωσφορυλίωση STAT1 /STAT3 και στην κατώτερη έκφραση του PIAS3, μας οδήγησε στο να υποθέσει ότι STAT1- και, ειδικότερα, τα γονίδια STAT3-στόχος θα πρέπει να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε ανθεκτικά σε πολλά φάρμακα κύτταρα.

Α. Το cDNA από Α549 και Α549 κύτταρα /dx αναλύθηκε με PCR συστοιχία ειδικό για σηματοδότηση JAK /STAT, όπως αναφέρθηκε υπό Υλικά και μέθοδοι. Η αναδίπλωση ρύθμιση των 83 γονιδίων που αναλύθηκαν, εκφράζονται σε λογαριθμική κλίμακα, αντιπροσωπεύεται σε μια χρωματομετρική κλίμακα. Ο αριθμός είναι ο μέσος όρος 4 πειραμάτων. B. Τα κύτταρα λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western για φωσφο (Tyr 1022/1023) -JAK1, JAK1, φωσφο (Tyr701) -STAT1, STAT1, φωσφο (Tyr705) -STAT3, STAT3. * P & lt? * P & lt? * P & lt? * P & lt? * P & lt? 0.05, ** p & lt? * P & lt? * P & lt?