Αφηρημένο

Ιστορικό

Η οξειδοαναγωγική-σιωπηλή βιταμίνη Ε αναλογική α- τοκοφερόλη ηλεκτρική (α-TOS) βρέθηκε να συνεργάζονται συνεργικά με βιταμίνη Κ3 (VK3) συν ασκορβικό οξύ (ΑΑ) στην επαγωγή των καρκινικών κυττάρων-εκλεκτική απόπτωση μέσω μιας κασπάσης-ανεξάρτητο μονοπάτι. Εδώ ερευνήσαμε το μοριακό μηχανισμό (ες) πίσω από το θάνατο κυττάρων που προκαλείται σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη από α-TOS, VK3 και ΑΑ, και την πιθανή χρήση των στοχευμένων συνδυασμού φαρμάκων στη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Μεθοδολογία /Principal ευρήματα

Η γενιά των ROS, κυτταρική απόκριση στο οξειδωτικό στρες, και αυτοφαγία ερευνήθηκαν σε καρκινικά κύτταρα προστάτη PC3 με τη χρήση ναρκωτικών σε υπο-τοξικές δόσεις. Αξιολογήσαμε αν παράγοντας που επάγει την απόπτωση PARP1 μεσολάβηση (ΟΕΕ) απελευθέρωσης παίζει ένα ρόλο στην απόπτωση που επάγεται από τον συνδυασμό των παραγόντων. Στη συνέχεια, η επίδραση του συνδυασμού α-TOS, VK3 και ΑΑ στην αύξηση του όγκου εξετάστηκε σε γυμνά ποντίκια. VK3 συν ΑΑ προκαλούμενη νωρίς σχηματισμό ROS που σχετίζεται με την επαγωγή της αυτοφαγία σε απόκριση προς οξειδωτικό στρες, το οποίο μειώθηκε κατά α-TOS, την πρόληψη του σχηματισμού αυτοφαγοσώματα. α-TOS που προκαλείται από μιτοχονδριακό αποσταθεροποίησης που οδηγεί στην απελευθέρωση του ΟΕΕ. Η μετατόπιση του ΟΕΕ από μιτοχόνδρια προς τον πυρήνα, λόγω της συνδυαστικής θεραπείας, προκαλείται από την ενεργοποίηση PARP1. Η αναστολή του ΟΕΕ, καθώς και των PARP1 εξασθενημένο αποτελεσματικά την απόπτωση που προκλήθηκε από το συνδυασμό των φαρμάκων. Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ποντικού καρκίνου του προστάτη, ο συνδυασμός α-TOS, VK3 και ΑΑ ήταν περισσότερο αποτελεσματική στην καταστολή του όγκου από ό, τι όταν τα φάρμακα δόθηκαν χωριστά, χωρίς επιβλαβείς παρενέργειες.

Συμπεράσματα /Σημασία

α-TOS, ένα μιτοχόνδρια στόχευση αποπτωτικό παράγοντα, διακόπτες σε υπο-αποπτωτική δόσεις από autophagy εξαρτώμενη επιβίωση των καρκινικών κυττάρων στη διάλυση τους προωθώντας την επαγωγή απόπτωσης. Δεδομένου του ζοφερή πρόγνωση για τους ασθενείς με καρκίνο, η διαπίστωση αυτή είναι πιθανή κλινική σημασία

Παράθεση:. Tomasetti M, L Nocchi, Neuzil J, Goodwin J, Nguyen Μ, Dong L, et al. (2012) Άλφα-τοκοφερόλη Ηλεκτρικό Αναστέλλει αυτοφαγικά επιβίωσης του καρκίνου του προστάτη κυττάρων που επάγεται από βιταμίνη Κ3 και ασκορβικό να προκαλεί κυτταρικό θάνατο. PLoS ONE 7 (12): e52263. doi: 10.1371 /journal.pone.0052263

Επιμέλεια: Kamyar Afarinkia, Πανεπιστήμιο του Μπράντφορντ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 26 του Ιουνίου 2012? Αποδεκτές: 12 του Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 Δεκεμβρίου 2012 |

Copyright: © 2012 Tomasetti et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση από το Ίδρυμα Καρκίνου του προστάτη της Αυστραλίας για να JN, και το συμπληρωματικό μέρος από τη χρηματοδότηση της έρευνας του Πολυτεχνείου του Marche. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα μιτοχόνδρια έχουν προκύψει πρόσφατα ως ενδιαφέρουσα στόχοι για φάρμακα κατά του καρκίνου [1] – [3]. Η βιταμίνη Κ3 (VK3), μια συνθετική μορφή της βιταμίνης Κ, επιδεικνύει κυτταροτοξική δραστικότητα σε καρκινικά κύτταρα προκαλώντας μιτοχόνδρια εξαρτώμενη βλάβη μέσω της ποδηλασίας οξειδοαναγωγής, καθώς και την επιλεκτική αναστολή DNA πολυμεράση-γ, το ένζυμο κλειδί της αντιγραφής του mtDNA [3], [4]. Να ενισχύει αντικαρκινικό αποτέλεσμα της, VK3 έχει συνδυαστεί με το οξειδοαναγωγικό ενεργό ασκορβικό οξύ (ΑΑ). Το υπεροξείδιο του υδρογόνου που παράγεται από το συνδυασμό VK3-ΑΑ έχει αναφερθεί ότι επάγει κυτταρικό θάνατο σε διάφορους τύπους καρκίνου [5], [6].

VK3-AA-επαγόμενη οξειδωτικό στρες θα μπορούσε να είναι διαφορετική σε κύτταρο όγκου και φυσιολογικών μεταβολισμό των κυττάρων, και μπορεί να επιτρέψει χειρισμός για τη βελτίωση της θεραπείας του καρκίνου. Ωστόσο, απαντώντας σε οξειδωτικό στρες τα κύτταρα ενεργοποιούν μονοπάτια που προωθούν την επιβίωση και την προσαρμογή τους [7]. Ένας τέτοιος μηχανισμός στρες απόκριση είναι autophagy [8], [9]. ROS μπορεί να προκαλέσει την αυτοφαγία, το οποίο μπορεί να συμβάλει στην κασπάση-ανεξάρτητο θάνατο κυττάρου ή, αντίθετα, μπορεί να προωθήσει autophagy έναν προστατευτικό ρόλο έναντι ROS μεσολάβηση θάνατο [10], [11]. Ως εκ τούτου, η ανακάλυψη των μορίων που ρυθμίζουν autophagy μπορεί να είναι μεγάλης σημασίας στην ανάπτυξη φαρμάκων για τη θεραπεία του καρκίνου.

Πρόσφατα, υπο-θανατηφόρες συγκεντρώσεις του VK3 και ΑΑ, μαζί με μια υπο-αποπτωτική δόση α-τοκοφερόλη ηλεκτρική (α-TOS), έχουν δειχθεί να επάγουν αποτελεσματικά τον κυτταρικό θάνατο του καρκίνου του προστάτη η οποία χαρακτηρίζεται από κατακερματισμό του DNA, λυσοσωμιακό /μιτοχονδριακή διαταραχή, κυτόχρωμα

γ

απελευθέρωσης, ενώ στερούνται την ενεργοποίηση της κασπάσης [12]. Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι κασπάσης-ανεξάρτητες οδούς διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στο θάνατο του καρκίνου, και ο παράγοντας που επάγει την απόπτωση (ΟΕΕ), αναδύεται ως κεντρικό μεσολαβητής αυτής της διαδικασίας [13] – [16]. Ανάλογα με αυτήν την προϋπόθεση, η ενεργοποίηση του ενζύμου πολυ επιδιόρθωσης του DNA (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης-1 (PARP1) έχει αναφερθεί ως βασικό για την αποδέσμευση των ΟΕΕ μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει Ca

2+ εισροή στο κυτοσόλιο [17] – [20].

Χρησιμοποιώντας υπο-τοξικές δόσεις α-TOS με υπο-τοξικές συγκεντρώσεις VK3 + ΑΑ προηγουμένως εντοπιστεί [12], αξιολογήσαμε την επίδραση της α-TOS σε ROS μεσολάβηση αυτοφαγία προκλήθηκε από VK3 και ΑΑ. Ο μηχανισμός (ες) που συμμετέχουν στην κυτταρικό θάνατο που επάγεται από τον συνδυασμό παράγοντα ερευνήθηκε επίσης. Αναφέρουμε ότι VK3 συν ΑΑ προκαλούμενη νωρίς σχηματισμό ROS που σχετίζεται με την επαγωγή της αυτοφαγία σε απόκριση προς οξειδωτικό στρες. Αναστολή της αυτοφαγία αποκάλυψε τον προστατευτικό ρόλο των VK3 + AA που προκαλείται από αυτοφαγία στα κύτταρα PC3. α-TOS βρέθηκε να μειώσει VK3 + AA που προκαλείται από το σχηματισμό ROS την κατάργηση της ROS προκαλεί σχηματισμό αυτοφαγοσώματα. Ωστόσο, ROS παράγονται ήταν επαρκής για να επάγει ενεργοποίηση PARP1, που έχει σαν αποτέλεσμα την απελευθέρωση του παράγοντα ΟΕΕ προ-αποπτωτικά, προωθώντας κυτταρικό θάνατο που εκδηλώνεται με χαρακτηριστικά απόπτωσης περιλαμβάνουν συμπύκνωση χρωματίνης. Η κλινική σημασία αυτής της έρευνας παρέχεται από σημαντική καταστολή του καρκίνου σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με το συνδυασμό των τριών παραγόντων.

Αποτελέσματα

α-TOS αναστέλλει αυτοφαγία προκλήθηκε από ROS που παράγονται σε απόκριση VK3 και θεραπεία AA

έχει αναφερθεί ότι υπο-τοξικές δόσεις του συνδυασμού του VK3 (3 μΜ) με ΑΑ (0.4 mM) είχε σαν αποτέλεσμα ενδοκυτταρική παραγωγή των ROS, αλλά τα κύτταρα πέθαναν μόνο με την παρουσία του α -Tos (30 μΜ) [12]. Για να διευκρινιστεί ο ρόλος του οξειδωτικού στρες στην θεραπεία συνδυασμού, το σχηματισμό ROS και κυτταρικές αποκρίσεις σε οξειδωτικό στρες (autophagy) αξιολογήθηκαν πάροδο του χρόνου. Κατεργασία PC3 κυττάρων με VK3 και ΑΑ είχε ως αποτέλεσμα το σχηματισμό μορίων υπεροξειδίου που σχετίζονται με μέσα σε 30 λεπτά, μετά την οποία η ROS που συνδέεται φθορίζον σήμα επέστρεψε στο βασικό επίπεδο της. Ενώ α-TOS μόνη προκάλεσε μια καθυστερημένη σχηματισμό μορίων υπεροξειδίου που σχετίζονται, η οποία παρατηρήθηκε μετά από 120 λεπτά επώασης, μείωσε την πρώιμη αύξηση των επιπέδων τους σε απόκριση προς την θεραπεία των κυττάρων με VK3 και ΑΑ και μόνο (Εικ. 1Α, αριστερό πάνελ). Για να διερευνηθεί αν τα μιτοχόνδρια είναι η κύρια πηγή παραγωγής ROS, τα επίπεδα του υπεροξειδίου αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας dihydroetidium (DHE). Κατά την αλληλεπίδραση με δισμουτάση, DHE αποδίδει βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr) που συσσωρεύεται στον πυρήνα και δίδει ερυθρό φθορισμό [21]. Σύκο. 1Α (δεξί πάνελ) έγγραφα αυξήσει τα επίπεδα υπεροξειδίου εντός 20-60 λεπτών από αγωγή των κυττάρων με VK3 και ΑΑ η οποία μειώθηκε σε παρουσία α-TOS. Η πυρηνική χρώση EtBr DHE προερχόμενου ανιχνεύθηκε συναρτήσει του χρόνου χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού, και δείχνει ότι κατά την κατεργασία με VK3 και ΑΑ, τα αποπτωτικά φλύκταινες που περιέχουν πυρηνικά συστατικά που σχηματίζεται στην επιφάνεια του κυττάρου μετά 60-120 λεπτά? 36-46% των κυττάρων ήταν EtBr-αρνητικά (χλωμό κύτταρα), ως συνέπεια της χρωματίνης απώλεια. Μειωμένος αριθμός των κυττάρων με πυρηνική φλύκταινες (18% του ωχρού κυττάρων) παρατηρήθηκε σε παρατεταμένη επώαση. Τα κύτταρα ανακτήθηκαν μετά από 180 λεπτά επώασης, δείχνοντας έτσι μια αναστρέψιμη διαδικασία. Η παρουσία του α-TOS ανέστειλε σημαντικά την «ανάκτηση» των κυστών, όπως αποδεικνύεται από την αύξηση του ωχρού κυττάρων (66%), την προώθηση κύτταρα θάνατο (Σχ. 1Β).

(Α) κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με α-TOS (30 μΜ), VK3 και ΑΑ (3 μΜ VK3, 0.4 mM ΑΑ) και αξιολογούνται για παραγωγή ROS χρησιμοποιώντας DCF (ένας δείκτης υπεροξειδίου του υδρογόνου) ή διυδροεργοταμίνη (ένας δείκτης υπεροξειδίου), που εκφράζεται ως μέση ένταση φθορισμού. Τα κύτταρα αξιολογήθηκαν για την αύξηση της φθορισμού χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. (Β) Η μικροσκοπική οπτικοποίηση των PC3 κυττάρων DHE-βάφτηκαν ακόλουθες επεξεργασίες φαρμάκου συναρτήσει του χρόνου. Κατά την αλληλεπίδραση με δισμουτάση, διυδροεργοταμίνης (στικτή μπλε) αποδίδει βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr) που συσσωρεύεται στον πυρήνα και δίνει κόκκινο φθορισμό (άνω πάνελ). Οι πυρηνικές κύστες που περιέχουν κατεστραμμένα χρωματίνης μείωση χρώση των πυρηνικών EtBr (χλωμό κύτταρα). Κυτταρομετρία ροής ποσοτικοποίηση των ασθενώς κυττάρων (EtBr-αρνητικά κύτταρα, κάτω πάνελ) πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα PC3 αντιμετωπίζονται όπως υποδεικνύεται. Τα δεδομένα που δείχνονται είναι μέσες τιμές ± S.D. (N = 3), οι εικόνες μικροσκόπιο είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Μεγέθυνση 600 ×, μπαρ κλίμακας = 10 μm.

Η

Αφού τεκμηριωμένο ότι η προκαλούμενη από φαρμακευτική θεραπεία γενιά των ROS, εξετάσαμε την επόμενη επίδρασή τους στην αυτοφαγία στα κύτταρα PC3 με την αξιολόγηση του προτύπου έκφρασης των μικροσωληνίσκων -associated πρωτεΐνη-1 (LC3), μέσω ηλεκτρονικής μικροσκοπίας μετάδοσης (ΤΕΜ), και μέσω του σχηματισμού των όξινων κενοτοπιώδους οργανιδίων [22]. LC3 υπάρχει σε δύο μορφές, LC3-Ι (18-kDa) και LC3-ΙΙ (16-kDa), με το τελευταίο να είναι δεσμευμένη σε μεμβράνη και αυξήθηκαν κατά τη διάρκεια autophagy από μετατροπή της πρώην [23]. PC3 κύτταρα επεξεργασμένα με VK3 και ΑΑ παρουσίασαν υψηλότερο επίπεδο της πρωτεΐνης LC3-ΙΙ στο 60-120 min μετά τη θεραπεία, η οποία ανεστάλη υπό την παρουσία α-TOS (Εικ. 2Α). ΤΕΜ διεξήχθη σε κύτταρα PC3 εξής διάφορους συνδυασμούς θεραπείας. Έλεγχος και α-TOS-κατεργασμένα κύτταρα χαρακτήρισε μιτοχόνδρια με σαφώς καθορισμένες ακρολοφίες, ακέραια διπλή μεμβράνη, ομοιογενές πυκνότητα και κυλινδρικό σχήμα. Η εμφάνιση ενός μεγάλου αριθμού αυτοφαγοσώματα με μια δομή διπλής μεμβράνης στο κυτταρόπλασμα παρατηρήθηκε με ΤΕΜ μετά από 120 λεπτά θεραπείας με VK3 + ΑΑ, με μικρή επίδραση στην μιτοχονδριακή μορφολογία. Σε αντίθεση, όταν VK3 και ΑΑ συνενώθηκαν με α-TOS, προεξέχων ανώμαλη μιτοχόνδρια με αποδιοργανωμένη ακρολοφίες, μειωμένη πυκνότητα ηλεκτρονίων και αύξηση του μικρού άξονα συνεπής με μιτοχονδριακή διόγκωση παρατηρήθηκαν, ενώ ο σχηματισμός του αυτοφαγοσώματα δεν ανιχνεύθηκε (Εικ. 2Β). Η πρόσληψη του κόκκινου φθορισμού AO υποστηρίζει περαιτέρω το ανασταλτικό αποτέλεσμα του α-TOS στην VK3 + ΑΑ προκαλούμενη αυτοφαγία (Σχ. 2C).

(Α) κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τα φάρμακα όπως ενδείκνυται και η επίπεδο της πρωτεΐνης LC3-ΙΙ κανονικοποιηθεί προς-ακτίνη εκφράστηκε ως μέση τιμή ± SD της LC3-II /LC3-I πυκνότητας αναλογία. (Β) κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τα φάρμακα, όπως υποδεικνύεται για 2 ώρες και αξιολογήθηκε για μορφολογία με ΤΕΜ. Μεγέθυνση 4.000 ×, γραμμή κλίμακας = 0.5 μm (άνω εικόνες), μεγέθυνση 9.000 ×, bar = 0,5 μm? Ν = πυρήνα, m = μιτοχόνδρια, a = αυτοφαγοσώματα. (C) κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται, και ο σχηματισμός του ΑΟ-συσσώρευση όξινες φυσαλιδώδους οργανίδια (πορτοκαλί-ερυθρός φθορισμός) ανιχνεύθηκε μέσω κυτταρομετρίας ροής. (D) κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται παρουσία ή απουσία αναστολέων αυτοφαγία (3MA και CQ), και η βιωσιμότητα των κυττάρων assed μετά από 24 ώρες επώασης. (Ε) Ο σχηματισμός αυτοφαγοσώματα σε κύτταρα ελέγχου (1) και με την παρουσία 3MA (2) και CQ (3) αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western ως έκφραση της LC3-ΙΙ μετά από 2 ώρες από φαρμακευτικές αγωγές. Τα δεδομένα εκφράζονται ως αλλαγή σε σχέση με μη επεξεργασμένο μάρτυρα, και είναι μέσες τιμές ± S.D. (N = 3), οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt?. 0.05, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

Στη συνέχεια ρωτήσαμε αν αυτοφαγία επηρεάζει τον κυτταρικό θάνατο. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, αυτοφαγία κατεστάλη με την 3MA αναστολέα φαρμακολογική (πρώιμη αναστολή φάση) και CQ (αναστολή όψιμη φάση). PC3 κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με α-TOS ή VK3 + ΑΑ και α-TOS + VK3 + ΑΑ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2D, η αναστολή της πρόωρης αυτοφαγικά διαδικασία μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε VK3 + ΑΑ-κατεργασμένα κύτταρα σε μια έκταση συγκρίσιμη με ό, τι παρατηρείται όταν α-TOS συνδυάστηκε με VK3 + ΑΑ. Αυτό το αποτέλεσμα δεν βρέθηκε όταν το κλείδωμα το τελευταίο βήμα του μονοπατιού αυτοφαγικά. Ο σχηματισμός του αυτοφαγοσώματα απουσία ή παρουσία των αναστολέων αυτοφαγικά 3MA και CQ αξιολογήθηκε ως έκφραση της LC3-ΙΙ μετά φαρμακευτικές αγωγές (2 ώρες). Η έκφραση μίγμα VK3 + ΑΑ προκαλούμενη LC3-ΙΙ που ανεστάλη παρουσία 3MA αλλά όχι CQ (Σχ. 2Ε). Αυτό δείχνει ότι αυτοφαγία είναι μια προστατευτική απόκριση σε VK3 + ΑΑ-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, και η αναστολή της αυτοφαγία στο πρώιμο στάδιο είναι μια στρατηγική για την πρόκληση κυτταρικού θανάτου.

Μηχανισμός α-TOS, VK3 και AA- που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο

Για να διερευνήσουν τον μηχανισμό (ες) που συμμετέχουν σε κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από το συνδυασμό α-TOS με VK3 + AA, αξιολογήσαμε το ρόλο του ΟΕΕ. Υπο-κυτταρική κλασματοποίηση έδειξε ότι μόνο όταν α-TOS (30 μΜ) σε συνδυασμό με VK3 (3 μΜ) και ΑΑ (0,4 mM), ΟΕΕ αναδιανέμονταν από μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα (Εικ. 3Α). Για να ελεγχθεί αν ΟΕΕ ανακατανομή εμπλέκεται σε κυτταρικό θάνατο που επάγεται από τον συνδυασμό των τριών παραγόντων, η πρωτεΐνη σίγησε και η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, siRNA που στοχεύει ΟΕΕ σιγήσει αποτελεσματικά την έκφραση ΟΕΕ που, με τη σειρά του, εξασθενημένο κυτταρικό θάνατο που επάγεται από τον συνδυασμό του α-TOS, VK3 και ΑΑ. Η αποτελεσματικότητα του ΟΕΕ siRNA τεκμηριώνεται στο Σχ. 3C.

Πίνακας (Α) δείχνει εικόνες μικροσκόπιο φθορισμού του ΟΕΕ μετατόπιση προς τον πυρήνα μετά από 180 λεπτά θεραπείας με A-TOS (30 μΜ), VK3 και ΑΑ (3 μΜ VK3, 0.4 mM ΑΑ) μόνη ή σε συνδυασμός (αριστερό πάνελ). Η πυρηνική μετατόπιση του ΟΕΕ αποδεικνύεται από παρόμοια κατανομή του κόκκινου (ΟΕΕ-TRITC) και το μπλε σήμα (πυρήνα)? μεγέθυνση 600 ×, γραμμή κλίμακας = 10 μm. Ο δεξιός πίνακας δείχνει ανάλυση κηλίδος western του ΟΕΕ μετατόπιση σε κυτταρικά κλάσματα. Οργανίδιο (org), κυτταρόπλασμα (κυτταρο) και πυρηνικών (νουκλεοτίδιο) κλάσματα ελήφθησαν από τα κύτταρα PC3 αγωγή με φάρμακα όπως παραπάνω και το επίπεδο του ΟΕΕ αξιολογούνται. Κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με NS siRNA ή ΟΕΕ siRNA, και αξιολογούνται για το επίπεδο της πρωτεΐνης ΟΕΕ (C). Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως παραπάνω για 24 ώρες επώασης και αξιολογήθηκαν για βιωσιμότητα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ (Β). Τα δεδομένα που δείχνονται είναι μέσες τιμές ± S.D. (N = 3), οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Το σύμβολο «*» δηλώνει στατιστικά διαφορετικά αποτελέσματα για ΟΕΕ siRNA- και NS siRNA επιμολυσμένα κύτταρα με p & lt?. 0.05

Η

Για να προσδιοριστεί η άμεση σχέση μεταξύ της αυξημένης ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS και ΟΕΕ μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από την συνδυαστική θεραπεία, τα κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε προ-επεξεργασία με το αντιοξειδωτικό NAC, το οποίο αποτελεσματικά μπλοκάρει κυτταροπλασματική και πυρηνική μετατόπιση του ΟΕΕ που επάγονται από τους τρεις παράγοντες, υποδεικνύοντας τον ρόλο των ROS (Σχ. 4Α, Β). Η αναστολή της ΟΕΕ πυρηνική μετατόπιση συνδέθηκε με κατάργηση του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από τα ναρκωτικά (Σχ. 4 C, D). Επιπλέον, για να ελεγχθεί αν η εκ νέου διανομή του ΟΕΕ συμβαίνει είναι μια κασπάσης-ανεξάρτητο τρόπο, τα κύτταρα εκτέθηκαν στους τρεις παράγοντες στην παρουσία του αναστολέα παν-κασπάσης z-VAD-fmk, οι οποίοι ούτε μπλοκάρει ΟΕΕ μετατόπιση ούτε ασκείται οποιαδήποτε προστατευτική επίδραση έναντι της συνδυαστικής θεραπείας (Εικ. 4 Α-Δ).

Πίνακας (α) έγγραφα ΟΕΕ-TRITC ορατά με μικροσκόπιο φθορισμού, μεγέθυνση 600 ×, κλίμακα bar = 10 μm. (Αριστερό πάνελ) και τη δυτική εικόνες blot (δεξί πάνελ) του ΟΕΕ μετατόπιση στο κυτοσόλιο και πυρήνα after180 min κατεργασία με ένα-TOS (30 μΜ), VK3 και ΑΑ (3 μΜ VK3, 0.4 mM ΑΑ) σε απουσία ή παρουσία του NAC (10 mM) ή Ζ-VAD-fmk (10 μΜ). Η πυκνότητα ΟΕΕ ζώνη ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα-ακτίνη ή λαμίνη, και εκφράζεται ως μέση ± δ.ϋ. ΟΕΕ

κυτταρο-ΟΕΕ

nucl /ΟΕΕ

org δείκτη πυκνότητας. (ΣΙ). Κυτταροτοξική επίδραση της συνδυαστικής θεραπείας σε κύτταρα PC3 εν απουσία ή παρουσία NAC (10 mM) και z-VAD-fmk (10 μΜ) αξιολογήθηκε ως η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από 24 ώρες από την έκθεση των κυττάρων στα φάρμακα (C), και μικρογραφίες αντίθεσης φάσης του κυτταρικού αγωγή αντίστοιχα απεικονίζεται (D)? μεγέθυνση 200 ×, γραμμή κλίμακας = 100 μm. Τα δεδομένα που δείχνονται είναι μέσες τιμές ± S.D. (N = 3), οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Το σύμβολο «*» δηλώνει στατιστικά διαφορετικά αποτελέσματα για το μη επεξεργασμένο

vs αντιμετωπίζονται

PC3 κυττάρων απουσία ή παρουσία NAC ή-ίτηκ με p & lt?. 0.05

Η

Έχει προηγουμένως ανέφεραν ότι ROS μεσολάβηση βλάβη του DNA πυροδοτεί την ενεργοποίηση του PARP1 και μετέπειτα θάνατο του κυττάρου [24]. ενεργοποίηση PARP1 δημιουργεί το πολυμερές PAR στον πυρήνα και μετατοπίζονται προς τα μιτοχόνδρια να μεσολαβήσει απελευθέρωση ΟΕΕ [20]. Για να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ του ΟΕΕ και PARP1, αξιολογήσαμε την απελευθέρωση ΟΕΕ και τη δραστηριότητα PARP1 στα κύτταρα PC3 μετά από έκθεση σε α-TOS, VK3 και ΑΑ σε διαφορετικά χρονικά σημεία. ΟΕΕ μετατόπιση προς κυτόπλασμα ήταν ανιχνεύσιμη εντός 5 έως 60 λεπτών της συνδυαστικής θεραπείας των κυττάρων, και κυτταροπλασματική απελευθέρωση των ΟΕΕ ήταν ταυτόχρονη με την ενεργοποίηση PARP1. Σε αντίθεση, η μετατόπιση του ΟΕΕ στον πυρήνα είχε καθυστερήσει κατά τουλάχιστον 60 λεπτά (εικ. 5Α, Β). Αναστολή της PARP1 από 3ΑΒΑ εξασθενημένο τόσο πυρηνική μετατόπιση ΟΕΕ (Εικ. 5C, D) και την επαγωγή κυτταρικού θανάτου (Εικ. 6 E, F).

Πίνακας Α δείχνει κινητική της απελευθέρωσης και του πίνακα Β δραστηριότητα ΟΕΕ των PARP1 σε PC3 κύτταρα που εκτίθενται σε α-TOS (30 μΜ), VK3 (3 μΜ) και ΑΑ (0.4 mM). Πίνακας Γ δείχνει μικρογραφίες φθορισμού χρησιμοποιώντας PARP1-FITC και ΟΕΕ-TRITC (μεγέθυνση 600 ×, γραμμή κλίμακας = 10 μm) (αριστερή πλευρά), και τη δυτική εικόνες κηλίδα (δεξί πάνελ) της PARP1 και ΟΕΕ μετατόπιση στον πυρήνα μετά από 180 λεπτά θεραπείας με Α-TOS + VK3 + ΑΑ απουσία ή παρουσία 3ΑΒΑ (2 mM). (Δ) Η πυκνότητα ΟΕΕ μπάντα ομαλοποιήθηκε σε Α-ακτίνης ή lamin και εκφράζονται ως μέση τιμή ± Τ.Α. του ΟΕΕ

κυτταρο-ΟΕΕ

nucl /ΟΕΕ

org δείκτη πυκνότητας. (Ε) κυτταροτοξική δράση της συνδυαστικής θεραπείας σε κύτταρα PC3 εν απουσία ή παρουσία 3ΑΒΑ αξιολογήθηκε ως η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από 24 ώρες από την έκθεση των κυττάρων στα φάρμακα. Πίνακας F δείχνει μικρογραφίες αντίθεσης φάσης των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με τα τρία φάρμακα, με ή χωρίς 3ΑΒΑ? μεγέθυνση 200 ×, γραμμή κλίμακας = 100 μm. Τα δεδομένα που δείχνονται είναι μέσες τιμές ± S.D. (N = 3), οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Το σύμβολο «*» δείχνει στατιστικώς διαφορετικά αποτελέσματα για το μη επεξεργασμένο vs αντιμετωπίζονται PC3 κυττάρων απουσία ή παρουσία 3-ΑΒΑ με ρ & lt? 0,05

Η

Η θεραπεία με α-TOS + VK3 + ΑΑ καταστέλλει την εξέλιξη του όγκου.

για να εκτιμηθεί η αντικαρκινική επίδραση των τριών φαρμάκων, Balb-c γυμνά ποντίκια με ξενομοσχεύματα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το στόμα υπο-τοξικές δόσεις VK3 (3 mg /kg), ΑΑ (400 mg /kg), και με α-TOS (15 mg /kg) που παραδίδονται ενδοπεριτοναϊκώς, και με τους συνδυασμούς VK3 + ΑΑ, ή α-TOS + VK3 + ΑΑ. Μία σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου παρατηρήθηκε στην ομάδα VK3 συν θεραπεία ΑΑ? Αυτή η επίδραση ήταν σημαντικά βελτιωμένη σε παρατεταμένους χρόνους της θεραπείας, όταν οι δύο παράγοντες συνδυάστηκαν με α-TOS (Σχ. 6Α). Η συνδυαστική θεραπεία με τα τρία φάρμακα που επάγεται DNA σχηματισμός θραύση κλώνου (TUNEL θετικότητα), που αντιστοιχεί σε αποπτωτική διεργασία, η οποία σχετίζεται με την πυρηνική μετατόπιση ΟΕΕ (Εικ. 6Β). Μεγαλύτερη περιοχές θανάτου των καρκινικών κυττάρων βρέθηκαν σε ποντίκια που εκτέθηκαν σε τρι-συνδυαστική θεραπεία σε σχέση με το μη επεξεργασμένο ποντίκια (85 ± 16 × 10

3 μm

2

vs

238 ± 45 × 10

3 μm

2, αντίστοιχα,

σ

& lt? 0,05). Αυτή η θεραπεία φάνηκε να ασκήσει ανιχνεύσιμη πλευρά τοξικότητα, αφού οι ποντικοί δεν έδειξαν καμία απώλεια βάρους, καθώς και κανένα σημάδι κυτταροτοξικότητα στο νεφρό και το ήπαρ, όπως ανιχνεύεται από ιστολογική αξιολόγηση και με βιοχημικές αναλύσεις (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Balb-c γυμνά ποντίκια με ξενομοσχεύματα κύτταρα προερχόμενα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με από του στόματος χορήγηση VK3 (3 mg /kg) andAA (400 mg /kg), και ενδοπεριτοναϊκή ένεση ενός-TOS (15 mg /kg) μόνο του ή σε συνδυασμός, όπως αναφέρεται, 5-φορές την εβδομάδα, και ο όγκος του όγκου (mm

3) ποσοτικοποιήθηκε με δαγκάνες. (Β), τμήματα του όγκου παραφίνη-ενσωματωμένες φορμόλη-σταθερό (5 μm) επιθεωρήθηκαν για ΤΟΥΝΕΛ θετικότητα (πράσινα σημεία στίξης κύτταρα) (μεγέθυνση 200 ×, γραμμή κλίμακας = 100 μm) και ανοσο-χρώση με αντι-ΟΕΕ IgG (λευκά βέλη υποδεικνύεται πυρηνική μετατόπιση της ΟΕΕ-TRITC και πυκνωτική πυρήνες ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ϋΑΡΙ)? μεγέθυνση 400 ×, γραμμή κλίμακας = 50 μm. Δεδομένα του όγκου του όγκου είναι μέσες ± SEM (n = 8), δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ποντικών ελέγχου και μονά ποντίκια αγωγή με φάρμακο, ενώ βρέθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ ποντικών ελέγχου και VK3 + ζώα ΑΑ-αγωγή τις ημέρες 22-31 ( p = 0,034) και α-TOS + VK3 + ζώα AA-αγωγή κατά τις ημέρες 43-49 (p = 0,043).

η

Συζήτηση

από του στόματος χορήγηση της ΑΑ και VK3 χρησιμοποιήθηκε στη θεραπεία των ασθενών με καρκίνο του προστάτη [25]. Αυτή η προσέγγιση ήταν επωφελής όταν ο συνδυασμός του φαρμάκου συν-χορηγείται με γνωστούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [26]. Συνεπώς, η συγχορήγηση του υπο-θανατηφόρων δόσεων του ΑΑ + VK3 (οξειδοαναγωγής ενεργό σύστημα) με το οξειδοαναγωγικό-σιωπηλή α-TOS οδήγησε σε αποτελεσματική

in vitro

κυτταρικό θάνατο. Ο συνδυασμός των VK3 + ΑΑ δείχθηκε ότι προάγουν συνεργικά την παραγωγή του υπεροξειδίου του υδρογόνου στο εξωκυτταρικό περιβάλλον [12], [27].

Σε συμφωνία με τις προηγούμενες παρατηρήσεις, βρήκαμε ότι ο συνδυασμός του VK3 + ΑΑ προκαλείται γρήγορα γενεά τόσο υπεροξειδίου του υδρογόνου (DCF φθορισμός) και υπεροξειδίου (φθορισμός DHE), κορυφώθηκε σε 10-20 λεπτά και 30-60 λεπτά από έκθεση των κυττάρων στα δύο φάρμακα (

cf

Σχ. 1Α). Σε απάντηση σε αυτό το οξειδωτικό στρες, τα κύτταρα ενεργοποιούνται το αυτοφαγικά οδό. Αυτό αποδεικνύεται από το σχηματισμό της πυρηνικής φλυκταινών και αυτοφαγικά κυστίδια (όξινο κενοτοπιώδη οργανίδια), καθώς και αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης LC3-ΙΙ (

cf

Σχ. 2Α-C). Ωστόσο, μετά από 180 λεπτά αυτής της θεραπείας, τα κύτταρα που ανακτήθηκαν εντελώς. Αυτό φαίνεται από DHE οξείδωση που προκαλείται από EtBr πυρηνική χρώση, η οποία τεκμηριώνει ότι η αύξηση του δείκτη του χλωμό κυττάρων που παρατηρείται μετά από 60 λεπτά της θεραπείας με VK3 + AA σημαντικά μειωμένη για παρατεταμένες χρονικές περιόδους (

cf

Εικ. 1Β). Η 3MA αναστολέα αυτοφαγία (πρόωρη αυτοφαγικά διαδικασία) πυροδοτεί την VK3 + AA-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο δεικνύοντας ότι αυτοφαγία είναι ένας προστατευτικός μηχανισμός στο πλαίσιο των κυττάρων PC3 (

cf

Σχ. 2D). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η πρώιμη οξειδωτικό στρες οδηγεί σε μια προσαρμοστική απόκριση των καρκινικών κυττάρων που επιτρέπει την ανάκτησή τους από την προσβολή. Από την άλλη πλευρά, υπο-αποπτωτική δόσεις α-TOS προκάλεσε μείωση στο σχηματισμό ROS πυροδοτείται από VK3 + ΑΑ (

cf

Σχ. 1Α). Μπορούμε να υποθέσουμε ότι η υδρόλυση του α-TOS από εστεράσες σε κύτταρα οδηγεί σε παραγωγή του α-τοκοφερόλη (α-ΤΟΗ), η οποία δρα ως σαρωτής ROS [28]. Όπως διαπιστώθηκε προηγουμένως [29], παρατηρήσαμε ότι η ROS παράγονται σε απόκριση α-TOS αποτελούνται κυρίως από τα είδη υπεροξειδίου που σχετίζονται, αλλά όχι υπεροξειδίου. Σε αντίθεση, α-TOS αναφέρθηκε ότι επάγει παραγωγή υπεροξειδίου μέσω αλληλεπίδρασης με σύμπλεγμα ΙΙ της μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας [30]. Δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι σε πειραματικές συνθήκες μας, οι υπο-δόσεις τοξικές ofα-TOS οδηγήσει στη δημιουργία μικρών ποσοτήτων υπεροξειδίου, η οποία μπορεί να dismutated γρήγορα και να ξεφύγουν από την ανίχνευση.

Όχι σχηματισμό αυτοφαγοσώματα ή αλλοιωθεί η μορφολογία του οργανίδια παρατηρήθηκε σε α-TOS- και VK3 + ΑΑ κατεργασμένων κυττάρων (

cf

Σχ. 2Α-C). Αυτό συνδέει την μείωση της «προσαρμοστικής» στρες νωρίς οξείδωση με την πρόληψη της αυτοφαγικά διαδικασία που προκαλείται από το συνδυασμό του και μόνο VK3 + ΑΑ, και επιβεβαιώνεται περαιτέρω από ΤΕΜ, αποκαλύπτοντας την απουσία αυτοφαγοσώματα σε κύτταρα αντιμετωπίζονται από το συνδυασμό των τριών φάρμακα (

cf

Εικ. 2Β). Η αναστολή της επαγόμενης autophagy byα-TOS προωθείται εμφάνιση αυξημένου υποσύνολο χλωμό κυττάρων, σχηματισμός φλυκταινών και πυρηνικών μιτοχονδριακή διόγκωση με αποδιοργανωμένη ακρολοφίες και μειωμένη πυκνότητα ηλεκτρονίων, όλα τα χαρακτηριστικά του κυτταρικού θανάτου. Ως εκ τούτου, η συμπερίληψη του α-TOS στη συνδυαστική θεραπεία των κυττάρων PC3 αναστέλλει οι μηχανισμοί προσαρμοστικής και της επιβίωσης που οδηγεί στην επαγωγή του θανάτου τους.

Επαγωγή autophagy έχει αναφερθεί ότι προάγουν την επιβίωση των κυττάρων όγκου, με τον τρόπο αυτό να αντικρούσει ή περιορίζοντας την αποτελεσματικότητα της επαγωγής κυτταρικού θανάτου με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, θέτοντας σε κίνδυνο το αποτέλεσμα της θεραπείας του καρκίνου [31]. Σε συμφωνία με αυτήν την έννοια, τα στοιχεία μας δείχνουν έναν προστατευτικό ρόλο της αυτοφαγία κατά την έκθεση των κυττάρων PC3 με VK3 και ΑΑ. Βρήκαμε ότι τα επεξεργασμένα κύτταρα, τα οποία παρουσίασαν μορφολογία θυμίζει (αυτοφαγικά) κυτταρικό θάνατο, σε μεγάλο βαθμό ανακτηθεί, και μόνο ένα μικρό κλάσμα των κυττάρων με διαταράσσεται μιτοχονδριακό δυναμικό trans-μεμβράνης ήταν πέρα ​​από τη διάσωση και πέθανε κάτω από αυτές τις συνθήκες.

διαπιστώθηκε προηγουμένως ότι η απόπτωση έχει καθυστερήσει σε κύτταρα που στερούνται των πρωτεϊνών Bax και Bak που απαιτούνται για μιτοχονδριακή διαπερατοποίηση της εξωτερικής μεμβράνης (ΜΟΜΡ), που είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου και αποτελεί προϋπόθεση για την κυτταρική να διασχίσει το «σημείο όχι επιστροφής »[32]. Βρέθηκε ότι α-TOS επάγει μετατόπιση του Bax στα μιτοχόνδρια σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [33] – [36]. Μια άλλη έκθεση τεκμηριώνονται α-TOS να προκαλέσει μιτοχονδριακή απόπτωση που αφορούν τον άξονα FoxO1-Noxa-Bak [37], [38]. Ένας ΟΕΕ μεσολάβηση κασπάσης-ανεξάρτητο ενδογενή οδό μέσω Bak έχει περιγραφεί προηγουμένως [39]. Το ΟΕΕ διαλυτό τεμάχιο απελευθερώνεται από τα μιτοχόνδρια κατά διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης μέσω Bax /Bak πόρους [40]. Δείχνουμε ότι ΟΕΕ απελευθέρωση από μιτοχόνδρια είναι αναγκαία για τον κυτταρικό θάνατο που επάγεται από την συνδυαστική θεραπεία του καρκίνου του προστάτη κυττάρων με α-TOS + VK3 + ΑΑ σε υπο-τοξικές δόσεις των μεμονωμένων παραγόντων. Φίμωση της πρωτεΐνης ΟΕΕ από siRNA εξασθενεί σημαντικά το θάνατο των κυττάρων PC3 που προκαλείται από τη συνδυαστική θεραπεία (

cf

Εικ. 3).

παραγωγή ROS διαδραματίζει καίριο ρόλο στην απελευθέρωση του ΟΕΕ και η επακόλουθη προώθηση του κυτταρικού θανάτου. Έχουμε τεκμηριώσει ότι αυτή η προϋπόθεση ισχύει και για το σύστημά μας, που δείχνουν ότι η ROS οδοκαθαριστής NAC καταργηθεί εντελώς το θάνατο των κυττάρων PC3 εκτίθενται στο συνδυασμό των α-TOS + VK3 + AA (

cf

Εικ. 4). Εμείς περαιτέρω τεκμηρίωση ότι η ενεργοποίηση ROS-εξαρτώμενη PARP1 σχετίζεται με την απελευθέρωση του ΟΕΕ από μιτοχόνδρια στον πυρήνα (

cf

Εικ. 5). Σε απόκριση σε βλάβη του DNA, PARP1 καταλύει την σύνθεση και μεταφορά των μονάδων PAR με τις πρωτεΐνες δέκτη, σύμφωνα με την οποία διαμορφώνει τις δραστηριότητές τους και ρυθμίζουν την επιδιόρθωση του DNA [41], [42]. Ωστόσο, η υπερβολική βλάβη του DNA ενεργοποιεί μια μοναδική PARP1 που εξαρτάται από το πρόγραμμα κυτταρικού θανάτου, η οποία είναι κασπάσης-ανεξάρτητη, αλλά εξαρτάται από την ΟΕΕ [43]. Ακόμη και αν σε μικρότερο βαθμό σε σχέση με VK3 + ΑΑ, ο συνδυασμός α-TOS + VK3 + ΑΑ προκαλούμενη νωρίς σχηματισμό ROS, η οποία προηγουμένως βρέθηκε να επάγει πρώιμη βλάβη του DNA [12]. Το ROS προκαλούμενη βλάβη του DNA προκάλεσε μια ισχυρή αύξηση της δραστηριότητας PARP1, η οποία είχε ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση του ΟΕΕ από μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα, και περαιτέρω προς τον πυρήνα. Έτσι, όπως Sa συνέπεια της ενεργοποίησης PARP1, η πρωτεΐνη ΟΕΕ μετατοπίζεται από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, με αποτέλεσμα την επαγωγή της χρωματίνης συμπύκνωση με επακόλουθη κυτταρικό θάνατο (

cf

Σχ. 5).

άλλοι έχουν παρατηρήσει ότι οι υψηλές δόσεις της ΑΑ που προκαλείται από αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, η οποία δεν είχε ανακάμψει και δεσμεύτηκαν να πεθάνουν [10], [44]. Διαφορετικές δόσεις των φαρμάκων ασκούν διαφορετικές επιδράσεις επί των κυττάρων με την παραγωγή ποικίλες ποσότητες των ROS. Με βάση την προσβολή ROS, τα κύτταρα διαφορετικά ανταποκρίνονται με την επαγωγή της επιβίωσης τους ή προγράμματος θάνατο. Εδώ, υπο-τοξικές δόσεις VK3 + ΑΑ προκαλούμενη προσβολή ROS δεν είναι σε θέση να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο, αλλά προκαλεί βλάβη των κυτταρικών οργανιδίων με επακόλουθη ενεργοποίηση της διαδικασίας αυτοφαγικά επιβίωση. Η παρουσία του α-TOS μείωσε την VK3 + ΑΑ προκαλούμενη από οξειδωτική προσβολή, αναστέλλοντας έτσι την απόκριση κυτταρικής επιβίωσης. Ωστόσο, η ROS σχηματίστηκαν επαρκής για να επάγει ενεργοποίηση PARP1 αποτέλεσμα την απελευθέρωση ΟΕΕ και την επακόλουθη κυτταρικό θάνατο.

Λαμβάνοντας υπόψη την πιθανή αντικαρκινική δράση των τριών παραγόντων, η επίδραση του συνδυασμού α-TOS + VK3 + ΑΑ στην αύξηση του όγκου εξετάστηκε σε γυμνά ποντίκια. Από του στόματος χορήγηση του μίγματος VK3 + ΑΑ μειώνεται σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου κατά τις ημέρες 22-31 (p = 0.034). Δεν TUNEL θετικότητα βρέθηκε σε τμήματα των όγκων VK3 + ΑΑ-θεραπεία, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μείωση του μεγέθους του όγκου που προκαλείται από VK3 + ΑΑ οφειλόταν στην αναστολή ανάπτυξης όγκου και όχι τον κυτταρικό θάνατο (

cf

Σχήμα 6Α). Αυτό επιβεβαιώνεται από το γεγονός ότι σε παρατεταμένο χρόνο της έκθεσης στο φάρμακο (ημέρες 35-49) οι όγκοι άρχισαν εκ νέου να αυξάνεται. Η θεραπεία με α-TOS + VK3 + ΑΑ ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου (ημέρα 43-49, p = 0.04), επάγοντας ευρείες περιοχές του κυτταρικού θανάτου που σχετίζεται με ΟΕΕ πυρηνική μετατόπιση σε σύγκριση με τα ζώα ελέγχου και εκείνα που έλαβαν θεραπεία με τα μεμονωμένα φάρμακα (

cf

Σχ. 6Α, Β). Συγκεκριμένα, η αντικαρκινική δράση της α-TOS + VK3 + συνδυασμός ΑΑ συνδέθηκε χωρίς σημάδια δευτερεύουσας επιβλαβή αποτελέσματα. Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν την

in vitro

δεδομένα που δείχνουν ότι α-TOS αναστέλλει την ανάκτηση των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση μετά την αγωγή ΑΑ VK3 +, επάγει αποτελεσματική κυτταρικό θάνατο σε παρατεταμένους χρόνους έκθεσης σε συνδυασμό των τριών παραγόντων.

Συμπεράσματα

Πολλοί παράγοντες, όπως η αγγείωση του όγκου και η πρόσληψη των καρκινικών κυττάρων επηρεάζουν ναρκωτικών συγκεντρώσεις κατά μάζα του όγκου. Ως εκ τούτου, στο επίπεδο του όγκου, τα φάρμακα κατά του καρκίνου θα μπορούσε να μην είναι στο επίπεδο θανάτωσης ακόμη και όταν χορηγείται σε υψηλές συγκεντρώσεις. Έτσι, αντί να προκαλεί κυτταρικό θάνατο, χαμηλά επίπεδα αντικαρκινικών φαρμάκων θα μπορούσε να προκαλέσει μια προσαρμοστική απόκριση οδηγώντας τα καρκινικά κύτταρα να πολλαπλασιάζονται. Εδώ, βρήκαμε ότι η προσαρμοστική κυτταρική απόκριση σε οξειδωτικό στρες που προκαλείται από την οξειδοαναγωγική-ενεργό σύστημα VK3 + ΑΑ ξεπεραστεί από ένα συνδυασμό με την οξειδοαναγωγική-σιωπηλή παράγοντα α-TOS, η οποία προκάλεσε ένα διακόπτη από αυτοφαγικά επιβίωση στον κυτταρικό θάνατο (Σχ . 7). Δεδομένου ότι τα επίπεδα της αντι-καρκινικών παραγόντων ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσης του ορού, της φαρμακοκινητικής τους δεν αξιολογήθηκε, ως εκ τούτου, η αποτελεσματική συγκέντρωση των παραγόντων που θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε κλινικές ρυθμίσεις δεν είναι επακριβώς γνωστά. Στην κλινική πρακτική, χαμηλές δόσεις ΑΑ και VK3 μπορεί να επιτευχθεί εύκολα με χορήγηση από το στόμα. Από α-TOS μετατρέπει εντελώς αναποτελεσματική στην α-τοκοφερόλη μετά από του στόματος εφαρμογή, ενδοφλέβια ή διαδερμική χορήγηση αντιπροσωπεύει μία εύλογη τρόπος για να επιτευχθεί φαρμακολογικά επίπεδα του και το αντικαρκινικό αποτέλεσμα. Παρά τις κλινικές μέσα διοίκησης, η οποία είναι ακόμη να ελεγχθεί, η έκθεση αυτή καταδεικνύει τη δυνητική χρήση των στοχευμένων συνδυασμός φαρμάκων για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Ο συνδυασμός ΑΑ VK3 + προκαλεί σχηματισμό ROS (i), για να