Αφηρημένο

Long μη-κωδικοποίησης RNAs (lncRNAs) παίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορες βιολογικές διαδικασίες, όπως η μεταγραφική ρύθμιση, την ανάπτυξη των κυττάρων και ογκογένεση. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το αν lncRNA-GAS5 (διακοπή της ανάπτυξης ειδικών 5) ρυθμίζει την εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ότι η έκφραση GAS5 συνήθως ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης και των ανθρώπινων δειγμάτων. Εξόντωση GAS5 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης, ενώ αναγκαστική έκφραση GAS5 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Δείξαμε επίσης ότι knockdown του GAS5 αυξάνει CDK6 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Όπως ήταν αναμενόμενο, η αναστολή GAS5 προκαλεί μια σημαντική μείωση στην G0 /G1 φάση και μια προφανής αύξηση στην S φάση. Αποκτήστε-of-λειτουργίας και μελέτες απώλειας λειτουργίας έδειξε ότι GAS5 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης, τουλάχιστον εν μέρει, με τη ρύθμιση της έκφρασης CDK6.

Συμπεράσματα

μειωτικά GAS5 προωθεί κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης πολλαπλασιασμό, εν μέρει με τη ρύθμιση CDK6, και έτσι μπορεί να είναι χρήσιμη στην ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπευτικών στρατηγικών κατά του καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Liu Ζ, Wang W, Jiang J, Bao Ε, Xu D, Zeng Υ, et al. (2013) Ελάττωση της GAS5 Προωθεί τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εν μέρει με τη ρύθμιση CDK6. PLoS ONE 8 (9): e73991. doi: 10.1371 /journal.pone.0073991

Επιμέλεια: Αντωνία Βλάχου, Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών, Ελλάδα |

Ελήφθη: 10η Απριλίου, 2013? Αποδεκτές: 25 του Ιουλίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 17 του Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το βραβείο Αριθμός XBR 2011038 από τη Σαγκάη Δημοτικό Γραφείο Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του Ανθρώπου της ουροδόχου κύστης είναι η τέταρτη πιο κοινή κακοήθεια στους άνδρες και η δέκατη πιο συχνή στις γυναίκες [1], [2]. Ο πιο κοινός ιστολογικού τύπου του καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι ουροθηλιακό καρκίνωμα (UC), η οποία είναι μη επεμβατική θηλώδεις όγκους που συνήθως επαναλαμβάνονται αλλά σπανίως προόδου [3]. Σε γενικές γραμμές, η θεραπεία για αυτούς τους ασθενείς είναι ενδοσκοπική εκτομή [4], [5]. Επιθετικοί όγκοι της ουροδόχου κύστης είναι πιο επιθετικοί, και οι ασθενείς με μυϊκή επεμβατική UC συνήθως αντιμετωπίζονται με ριζική κυστεκτομή. Ωστόσο το ήμισυ των ασθενών με διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης αναπτύσσουν μετέπειτα μεταστατική νόσο, ακόμη και μετά από ριζική χειρουργική επέμβαση των πρωτοπαθών όγκων [6]. Οι πρόοδοι στην αποτελεσματική θεραπεία για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι περιορισμένες διότι οι παθολογικές μηχανισμοί που προκαλούν όγκου δεν είναι γνωστές. Ως εκ τούτου, αποκαλύπτοντας την μοριακός μηχανισμός για την ογκογένεση κύστη είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη αποτελεσματικής θεραπείας.

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η μακρά μη-κωδικοποίησης RNAs (lncRNAs) παίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορες βιολογικές διεργασίες, όπως μεταγραφική ρύθμιση, κυτταρική ανάπτυξη και ογκογένεση [7], [8]. προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι Η19 αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και της ουροδόχου κύστης μετάσταση [9], [10]. Ρυθμισμένη προς τα πάνω Η19 συμβάλλει στην κύστη ανάπτυξη του καρκίνου με τη ρύθμιση της έκφρασης ID2. Αυξορρυθμίζεται Η19 αυξάνει επίσης τη μετάσταση των κυττάρων του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, με την συμμετοχή ΕΖΗ2 και την αναστολή της έκφρασης Ε-cad. Η Hotair (για αντιπληροφοριακό RNA ΗΟΧ διαγονιδιακές) επίπεδο αυξάνεται σε πρωτογενείς όγκους και ρυθμίζει την εξέλιξη του καρκίνου του [11]. Η υπερέκφραση του θερμού αέρα σε επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα οδηγεί σε αλλαγμένη ιστόνης Η3 λυσίνη 27 μεθυλίωσης και προάγει τον καρκίνο της μετάστασης [12]. Θερμού αέρα είναι ένα κρίσιμο στοιχείο για τη μεταστατική εξέλιξη συσχετίζοντας με τα μέλη του συγκροτήματος PRC2 (SUZ12, ΕΖΗ2 και H3K27me3) [13], [14]. LncRNA-MEG3 (μητρικά εκφραζόμενο γονίδιο 3) συνδέεται επίσης με την ογκογένεση και την εξέλιξη του μηνιγγίωμα [7]. MEG3 δεν εκφράζεται στην πλειοψηφία των ανθρωπίνων μηνιγγιώματα ή τα μηνιγγίωμα ανθρώπινες κυτταρικές σειρές [7]. Re-έκφραση του MEG3 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών σε μαλακό άγαρ με επαγωγή συσσώρευση της πρωτεΐνης ρ53 και τη ρύθμιση επιλεκτικά την έκφραση του γονιδίου-στόχου p53 [15]. GAS5 είναι ένα πρόσφατα εντοπιστεί μη κωδικοποίησης RNA το οποίο συνδέεται με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. GAS5 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην κανονική διακοπή της ανάπτυξης και στις δύο Τ-κυτταρικές γραμμές και μη μετασχηματισμένα λεμφοκύτταρα [16]. Η υπερέκφραση του GAS5 μειώνει το ρυθμό εξέλιξης μέσω του κύκλου κυττάρου, ενώ ρύθμιση προς τα κάτω του GAS5 αναστέλλει την απόπτωση και διατηρεί μια πιο γρήγορη κυτταρικού κύκλου. Mourtada-M

κ.ά.

απέδειξαν ότι τα επίπεδα μεταγραφής GAS5 μειώθηκαν σημαντικά σε δείγματα καρκίνου του μαστού σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς παρακείμενα επιθηλιακών μαστού [17]. Η υπερέκφραση του GAS5 επάγει διακοπή αύξησης και απόπτωση ανεξάρτητα από άλλα ερεθίσματα. Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί για GAS5 ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων παραμένουν ασαφείς.

Με βάση αυτά τα ευρήματα, εξετάσαμε αν GAS5 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του κυτταρικού κύκλου και στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρο. Βρήκαμε ότι η έκφραση GAS5 μειώνεται σημαντικά σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Εξόντωση GAS5 προκαλεί μια σημαντική μείωση στην G0 /G1 φάση και προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης, τουλάχιστον εν μέρει, με τη ρύθμιση της έκφρασης CDK6.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ιστών και κυτταρικών σειρών

Ανθρώπινοι ιστοί ουροδόχου κύστης ελήφθησαν με τη γραπτή συγκατάθεση από το Νοσοκομείο την πρώτη Λαϊκής συνδεδεμένες με την Ιατρική Σχολή του Shanghai Jiaotong Πανεπιστήμιο. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Ιατρικής Σχολής της Σαγκάης Jiaotong Πανεπιστήμιο. 28 δείγματα ιστού καρκίνου της ουροδόχου κύστης και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους συλλέχθηκαν μεταξύ 02/2011 και 12/2012 (Πίνακας 1).

Η

καρκινικά κύτταρα ανθρώπινης κύστεως (Τ24, DSH1, RT112, RT4, KU7 και κύτταρα 253J) λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA,) με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS?. Gibco)

Πραγματικό Αντίδραση αλυσίδας πολυμεράσης -Time (PCR)

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από ιστούς ή κύτταρα καρκίνου της ουροδόχου κύστης με χρήση αντιδραστηρίου ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA), και οι αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τυχαίων εκκινητών και μία Μ- kit MLV ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο πρωτόκολλο από το SYBR Green PCR kit (Toyobo, Osaka, Japan) επί της Applied Biosystems 7300 σύστημα Real Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως αναφορές για lncRNAs. τιμές ΔCt ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη επίπεδα. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν.

ανάλυση Western Blot ανάλυση

Western blot για την αξιολόγηση CDK6 και την έκφραση β-ακτίνης διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Οι αντι-CDK6 πρωτογενή αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). β-ακτίνης πρωτογενή αντισώματα αγοράστηκαν από Sigma (MO, USA).

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

κύτταρα RT4 (1~2 × 10

5) που έλαβαν θεραπεία με GAS5-siRNA ή CDK6 -siRNA απλώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά από 48-ωρών επώαση, οι καλλιέργειες επωάστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο για 30 λεπτά στο σκοτάδι. Οι καλλιέργειες συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για κυτταρικό κύκλο χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής (FACSCalibur, Βϋ Biosciences) μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Οι καλλιέργειες επίσης χρωματίστηκαν με ανεξίνη V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη, και το κύτταρο απόπτωση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής.

Η υπερέκφραση και μικρό παρεμβαλλόμενο RNA

Για να εκφραστεί GAS5, πλασμίδιο pcDNA-GAS5 κατασκευάστηκε εισάγοντας ένα

ΚρηΙ-XhoI

θραύσμα που περιέχει το cDNA GAS5 στις ίδιες θέσεις σε pcDNA3.1. Το γονίδιο GAS5 ενισχύθηκε από cDNA που παρασκευάστηκε από κύτταρα Τ24 με PCR χρησιμοποιώντας τον προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές: ggggtaccTTTCGAGGTAGGAGTCGAC και ccgctcgagGGATTGCAAAAATTTATTAAAATTG. pcDNA-GAS5 επιμολύνθηκε σε κύστη κυτταρική σειρά καρκίνου χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Για την αναστολή της ενδογενούς GAS5 και έκφραση CDK6, 2 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μία πλάκα έξι φρεατίων μορφομετατράπηκαν με 50 ηΜ siRNA υποδεικνύεται ή αρνητικό μάρτυρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. Στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν με siRNA για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. Τρεις διαφορετικές GAS5-siRNAs (αλληλουχία αναφοράς NR_002578) σχεδιάστηκαν από Ambion (Ambion, Austin, ΤΧ). Η CDK6-siRNAs που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν μίγματα τριών siRNAs και αγοράστηκαν από την Ambion.

Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 kit (Dojindo Laboratories , Kumamoto, Japan). κύτταρα RT4 απλώθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων εις τριπλούν σε περίπου 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης. κύτταρα RT4 μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με pcDNA-GAS5 ή GAS5-siRNA, και οι αριθμοί των κυττάρων ανά φρεάτιο μετρήθηκαν με την απορρόφηση (450 nm) της μειωμένης WST-8 (2- (2-μεθοξυ-4-νιτροφαινυλ) -3- (4-νιτροφαινυλ) -5- (2,4-isulfophenyl) -2Η-τετραζόλιο, μονονάτριο άλας) στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία.

RNA ανοσοκαταβύθιση και RNA Pulldown

RNA ανοσοκαταβύθισης (RIP ) ή RNA Pulldown διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Εν συντομία, για δοκιμασία αναπτυσσόμενο RNA, επισημασμένο με βιοτίνη RNAs ήταν

in vitro

μεταγράφεται με την RNA Labeling Βιοτίνη Mix (Roche Diagnostic, Indianapolis, USA) και Τ7 RNA πολυμεράση (Roche). Κυττάρων πυρηνικό εκχύλισμα (2 μg) αναμίχθηκε με βιοτινυλιωμένο RNA (100 pmol). Τα πλυμένα σφαιρίδια αγαρόζης στρεπταβιδίνης (100 μΙ) προστέθηκαν σε κάθε αντίδραση σύνδεσης και κατόπιν επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν σύντομα τρεις φορές και βράζεται σε ρυθμιστικό SDS, και η ανακτηθείσα πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με πρότυπη τεχνική στυπώματος western.

Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για CDK6 RIP αγοράστηκαν από Abcam (Abcam, Cambridge, ΜΑ). Οι συγκαθίζησης RNAs ανιχνεύθηκαν με αντίστροφη μεταγραφή PCR. Ολικά RNAs και οι έλεγχοι δοκιμάστηκαν επίσης να αποδείξει ότι οι ανιχνεύονται σήματα ήταν από RNA που δεσμεύεται ειδικά με CDK6.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική σύγκριση μεταξύ 2 ομάδων διεξήχθη χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο

t

-τεστ. Όλες οι ομάδες συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), ακολουθούμενη από Tukey post hoc δοκιμασία κατά περίπτωση. Η διαφορά κρίθηκε στατιστικά σημαντική σε

σ

& lt? 0,05. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπική deviateon από τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα.

Αποτελέσματα

GAS5 επίπεδο είναι σημαντικά προς τα κάτω σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι GAS5 ελέγχει κυττάρων απόπτωση και ρυθμίζεται μειωτικά στον καρκίνο του μαστού [17]. Προκειμένου να διερευνηθεί κατά πόσον GAS5 ρυθμίζει ογκογένεση της ουροδόχου κύστης, εξετάσαμε πρώτα το επίπεδο έκφρασης GAS5 στην ουροδόχο κύστη τους ιστούς του καρκίνου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Σχήμα 1Α έδειξε ότι η έκφραση GAS5 αξιοσημείωτα προς τα κάτω σε 82% ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με παρακείμενες ελέγχους. Για να επιβεβαιωθεί η εγκυρότητα της μείωσης GAS5, ένα τμήμα του RNA που χρησιμοποιείται για την PCR πραγματικού χρόνου υποβλήθηκε σε ανάλυση στύπωσης Northern. Συνεπής με τις ανωτέρω διαπιστώσεις, GAS5 μειώθηκε στους περισσότερους ιστούς του καρκίνου της ουροδόχου κύστης (Εικόνα 1Β). Στη συνέχεια εξετάστηκε το επίπεδο έκφρασης του GAS5 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές της ουροδόχου κύστης (Τ24, DSH1, RT112, RT4, 253J, και KU7). Σε σύγκριση με το φυσιολογικό κύτταρο urothelia, η έκφραση GAS5 μειώνεται σημαντικά σε αυτούς καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1 C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι προς τα κάτω ρύθμιση GAS5 μπορεί να σχετίζεται με την πρόοδο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

(Α) Ανάλυση του επιπέδου έκφρασης GAS5 διεξήχθη σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης ή δίπλα ελέγχου (n = 28). Ολικό RNA υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο RT-PCR για την ανάλυση των τιμών CT του καρκίνου της ουροδόχου κύστης ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνης σε κάθε δείγμα. Οι κανονικοποιημένες τιμές (ΔCt) από όλους τους ιστούς στη συνέχεια σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό, σε κάθε ομάδα (ΔΔCT). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως Log10 (2

-ΔΔCt). (Β) RNA του 1-7 # χρησιμοποιείται στο (Α) προσδιορίστηκε με ανάλυση στυπώματος Northern όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. επίπεδα (C) GAS5 αξιολογήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Κανονική urothelial κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. *

σ

& lt?.

0.05

Η

GAS5 Αναστέλλει ουροδόχου κύστης κυτταρικού πολλαπλασιασμού

in vitro

Η

Για τη διερεύνηση της βιολογικής ρόλος της GAS5 στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης, αναλύθηκαν ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με GAS5 ή GAS5-siRNA. θεραπεία GAS5-siRNA αναστέλλει σημαντικά την έκφραση GAS5, και GAS5 knockdown αυξήσεις του πολλαπλασιασμού των κυττάρων RT4 (Σχήμα 2Α και Β). Με αντίθετο, θεραπεία pcDNA-GAS5 ρυθμίζει προς τα πάνω έκφραση GAS5, και καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων RT4 (Σχήμα 2C και D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι μειωτικά GAS5 σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης συμβάλλει στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

(Α) κύτταρα RT4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GAS5-siRNA, και το επίπεδο έκφρασης GAS5 προσδιορίστηκε μετά από 48 ώρες με πραγματικού χρόνου PCR. (Β) κύτταρα RT4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GAS5-siRNA, και στις υποδεικνυόμενες χρονικές στιγμές, οι αριθμοί των κυττάρων ανά φρεάτιο μετρήθηκαν με την απορρόφηση (450 nm) της μειωμένης WST-8. (C) τα κύτταρα RT4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με pcDNA-GAS5, και το επίπεδο έκφρασης GAS5 αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. (D) κύτταρα RT4 παροδικά υπερεκφράζεται με GAS5, και οι αριθμοί των κυττάρων ανά φρεάτιο μετρήθηκαν με την απορρόφηση (450 nm) της μειωμένης WST-8. Τα αποτελέσματα δείχνουν δεδομένα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα, που εκφράζεται ως μέση ± SD. *

P

& lt?

0.05

Η

GAS5 ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση CDK6

in vitro

Η

Στη συνέχεια διερευνήθηκε η. πιθανοί μηχανισμοί που GAS5 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων ουροδόχου κύστης. Πραγματοποιήσαμε μια pull-down ανάλυση RNA για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών που σχετίζονται με GAS5 (Εικόνα 3Α). Ανάλυση μάζης φασματομετρίας της πρωτεϊνικής ταινίας ειδικά για GAS5 αποκάλυψε ότι εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 6 (CDK6) συνδέεται ειδικά με GAS5 (Πίνακας 2). CDK6 ελέγχει τον κυτταρικό κύκλο, και απορύθμιση της CDK6 σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [19]. Για να επικυρώσετε περαιτέρω τη συσχέτιση μεταξύ της GAS5 και CDK6, είμαστε δίπλα εκτελείται μια δοκιμασία RIP με ένα αντίσωμα ενάντια CDK6 για RT4 κυτταρικά εκχυλίσματα. Σταθερά, παρατηρήσαμε σημαντικά υψηλότερο επίπεδο εμπλουτισμού του GAS5 με το αντίσωμα CDK6 σε σύγκριση με το μη ειδικό IgG αντίσωμα ελέγχου (Εικόνα 3Β). Εξόντωση GAS5 αυξάνει σημαντικά CDK6 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3C και D), αλλά προς τα κάτω ρύθμιση GAS5 δεν αλλάζουν το επίπεδο έκφρασης CDK2 και CDK4 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, η υπερέκφραση του GAS5 αναστέλλει αξιοσημείωτα την έκφραση CDK6 σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου της ουροδόχου κύστης (Σχήμα 3Ε).

In vivo

, μια σημαντική αρνητική συσχέτιση παρατηρείται επίσης μεταξύ των επιπέδων GAS5 και τα επίπεδα CDK6 σε καρκινικούς ιστούς (

r

2 = 0.168,

p =

0.013, Εικόνα 3F). Έχουμε ερευνήσει περαιτέρω το ρόλο της GAS5 στη ρύθμιση της κυτταρικής απόπτωσης και του κυτταρικού κύκλου. Το Σχήμα 4Α έδειξαν ότι η θεραπεία GAS5-siRNA αναστέλλει τον κυτταρικό αποπτωτικά. Στη συνέχεια, η GAS5 ή CDK6 καταρριφθεί και κυτταρικού κύκλου αναλύεται με κυτταρομετρία ροής. Σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA, GAS5 μειορρύθμιση εμφανίζει ένα μειωμένο ποσοστό των κυττάρων σε Ο0 /Ο1 φάση και περισσότερα κύτταρα σε φάση S (Σχήμα 4Β). Η ποσοτική ανάλυση αποκαλύπτει επίσης μια σημαντική μείωση στον πληθυσμό των κυττάρων σε G0 /G1 φάση σε κύτταρα μορφομετατραπέντα με GAS5-siRNA (Σχήμα 4Β). Πιο σημαντικό, knockdown του CDK6 από ειδικές siRNAs μειώνει το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S σε GAS5-siRNA επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα S1, Σχήμα 4Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι GAS5 ρυθμίζει καρκίνου της ουροδόχου κύστης του κυτταρικού κύκλου, τουλάχιστον εν μέρει, από τη ρύθμιση της CDK6.

(Α) Βιοτινυλιωμένο GAS5 ή ελέγχου επωάστηκαν με πυρηνικά εκχυλίσματα (κύτταρα RT4), στοχευμένες με χάντρες στρεπταβιδίνης και συνδεδεμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε μία πηκτή. Silver χρώση του πηκτώματος SDS-PAGE που περιέχει ποσότητες δειγμάτων που προέρχονται από πρωτεΐνες τραβιέται κάτω από GAS5. (Β) RIP πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση CDK6 αντίσωμα να ανοσοκαθιζάνει RNA και έναν εκκινητή για την ανίχνευση GAS5 RNA. (C) Ανάλυση του επιπέδου CDK6 mRNA διεξήχθη σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης μετά την αγωγή GAS5-siRNA. ανάλυση (Δ) Western στύπωμα επίπεδο πρωτεΐνης CDK6 διεξήχθη σε καρκινικά κύτταρα κύστης που έλαβαν θεραπεία με GAS5-siRNA. (Ε) Ανάλυση του επιπέδου CDK6 mRNA διεξήχθη σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστεως μετά GAS5 υπερέκφραση. Τα αποτελέσματα δείχνουν δεδομένα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα, που εκφράζεται ως μέση ± SD. *

P

& lt?

0.05

. (F) αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων GAS5 και τα επίπεδα CDK6 σε 16 δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης (

r

2 = 0.168,

p = 0,013

).

Η

έκφραση (Α) GAS5 αναστάλθηκε από ειδικές siRNAs σε RT4, και η κυτταρική απόπτωση αναλύθηκε με κυτταρόμετρο ροής 48 ώρες αργότερα. (Β) κύτταρα RT4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GAS5-siRNA ή CDK6-siRNA. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, οι σχετικοί αριθμοί των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο καθορίστηκε με ανάλυση FACS. Τα δεδομένα είναι από ένα από τα τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα ιστογράμματα αναλύθηκαν και το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου φαίνεται. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD για τρία πειράματα.

Η

GAS5 Μειώσεις καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικού πολλαπλασιασμού με τη ρύθμιση CDK6

μειωτικά GAS5 αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης, και μια σημαντική αρνητική συσχέτιση παρατηρείται μεταξύ του GAS5 και CDK6. Ως εκ τούτου, πιστεύεται ότι ο ρόλος της GAS5 στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης προκαλείται με ρύθμιση της έκφρασης CDK6. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, knockdown του CDK6 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων RT4 (Σχήμα 5Α). Επιπλέον, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων RT4 καταστέλλεται μερικώς από CDK6 knockdown σε GAS5-siRNA-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 5Α). Σε κύτταρα GAS5 υπερεκφράζουν, αναγκαστική έκφραση των αποτελεσμάτων CDK6 σε ένα ανακαινισμένο κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχήμα 5Β). Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώνουν ότι GAS5 μειώνει την πρόοδο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, τουλάχιστον εν μέρει, με τη ρύθμιση της έκφρασης CDK6.

(Α) κύτταρα RT4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GAS5-siRNA και CDK6-siRNA, και οι αριθμοί των κυττάρων ανά φρεάτιο ήταν μετρήθηκε με την απορρόφηση (450 nm) της μειωμένης WST-8. *

σ

& lt?

0.05

. (Β) κύτταρα RT4 υπερεκφράστηκαν με GAS5 και CDK6, και τον αριθμό των κυττάρων ανά φρεάτιο μετρήθηκαν με την απορρόφηση (450 nm) της μειωμένης WST-8. *

σ

& lt?

0.05

Η

Συζήτηση

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η ανθρώπινη μεταγραφικό είναι πιο περίπλοκη από ό, τι μια συλλογή με πρωτεΐνη. κωδικοποίηση γονίδια? που δείχνει εκτεταμένη μη-κωδικοποίησης RNA (ncRNA) έκφραση [20] αντινόημα και, [21], [22]. Αν και αρχικά υποστήριξε ότι είναι ψευδή μεταγραφικό θόρυβο, νέα στοιχεία δείχνουν ότι ncRNAs (όπως microRNAs και lncRNAs) συμμετέχουν στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, την ανάπτυξη των κυττάρων και των ανθρώπινων ασθενειών [23], [24]. Οι πρόσφατες μελέτες έχουν αρχίσει να ξετυλίξουν τη σημασία τους στην ογκογένεση. Για παράδειγμα, το επίπεδο lncRNA-H19 είναι αξιοσημείωτα αυξημένα σε έναν μεγάλο αριθμό ανθρώπινων καρκίνων [25], [26], και Η19 υπερέκφραση προσδίδει ένα πλεονέκτημα ανάπτυξης σε καρκινικά κύτταρα [27].

GAS5 είναι ένα πρόσφατα ταυτοποιημένο lncRNA εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου [16], [28]. Mourtada-M

κ.ά.

έδειξε ότι GAS5 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην κανονική διακοπή της ανάπτυξης και στις δύο Τ-κυτταρικές γραμμές και μη μετασχηματισμένα λεμφοκύτταρα [16]. GAS5 υπερέκφραση οδηγεί σε τόσο μια αύξηση στην απόπτωση και μείωση του ρυθμού εξέλιξης μέσω του κύκλου κυττάρου, ενώ GAS5 knockdown αναστέλλει την απόπτωση και διατηρεί μια πιο γρήγορη κυτταρικού κύκλου, υποδεικνύοντας ότι η έκφραση GAS5 είναι απαραίτητη για φυσιολογική διακοπή της ανάπτυξης σε Τ-κυττάρων γραμμές και ανθρώπινα περιφερικά Τ-αιμοκύτταρα [16]. επίπεδα GAS5 επίσης σημαντικά μειωμένες σε δείγματα καρκίνου του μαστού [17]. Με βάση αυτά τα ευρήματα, εμείς εικάζουν εάν η έκφραση του GAS5 είναι ανώμαλη και απορυθμισμένη GAS5 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε προσδιορίσει ότι η έκφραση GAS5 συνήθως ρυθμίζεται προς τα κάτω στα περισσότερα δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές κύστης. αναστολή GAS5 συμβάλλει στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης, ενώ η υπερέκφραση του GAS5 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι GAS5 δεσμεύεται στον τομέα δέσμευσης ϋΝΑ του υποδοχέα γλυκοκορτικοειδούς (GR), ενεργώντας ως δόλωμα στοιχείο γλυκοκορτικοειδούς απόκρισης (GRE), με αποτέλεσμα να ανταγωνίζονται DNA GREs για δέσμευση στον GR. Έτσι GAS5 είναι ένα «riborepressor» του GR, επηρεάζοντας την κυτταρική επιβίωση και μεταβολικές δραστηριότητες κατά ασιτία διαμορφώνοντας τη μεταγραφική δραστηριότητα της GR [29]. Εδώ πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία pull-down RNA να διερευνήσει τις δυνατότητες του μηχανισμού GAS5 στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης. Τα δεδομένα μας αποκάλυψαν ότι GAS5 μπορούσε να συνδυάσει με την εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 6 (CDK6) και περαιτέρω καταστέλλουν την έκφραση του CDK6. Ως εκ τούτου, προς τα κάτω ρύθμιση του GAS5 αυξάνει την έκφραση CDK6 σε καρκινικά κύτταρα κύστης. αναστολή GAS5 προκαλεί μια σημαντική μείωση στην G0 /G1 φάση και μια αύξηση στην φάση S με CDK6-εξαρτώμενο τρόπο. Κέρδος-of-λειτουργίας και μελέτες απώλειας λειτουργίας επιβεβαίωσε ότι GAS5 ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης, εν μέρει με ρύθμιση της έκφρασης CDK6.

ανάπτυξη και εξέλιξη του όγκου έχουν δειχθεί ότι εξαρτώνται από την κυτταρική συσσώρευση διαφόρων επιγενετικών και γενετικών γεγονότων, καθώς και οι μεταβολές στο μηχανισμό κυτταρικού κύκλου στο G1 /S σημείου ελέγχου [30]. Η μετάπτωση φάσης G1 /S ρυθμίζεται κυρίως από κυκλίνες τύπου D (D1, D2, D3 ή) σε σύμπλοκο με κυκλίνες /CDK6, και Ε-τύπου CDK4 (Ε1, ή Ε2) σε σύμπλεγμα με CDK2 [30]. CDK6 είναι έδειξε ότι υπερεκφράζεται σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης [31], και η έννοια έχει προκύψει ότι η φωσφορυλίωση Rb με CDK4 /6 δεν οδηγεί μόνο σε κρίσιμες E2F εξαρτώμενη μεταγραφή των βασικών ενζύμων του κυτταρικού κύκλου και ρυθμιστές, αλλά και για τη συναρμολόγηση της προ-αντιγραφής συγκρότημα στη φάση G1 [31]. Ως εκ τούτου, GAS5 μονοπάτι /CDK6 μπορεί να παίζει έναν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξης και της εξέλιξης του καρκίνου.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι προς τα κάτω ρύθμιση του GAS5 αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης, τουλάχιστον εν μέρει, από ρυθμίζουν CDK6. Τα ευρήματά μας συμβάλλει στην καλύτερη κατανόηση της σημασίας των απορρύθμισης του lncRNAs στην εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και παρέχει ένα σκεπτικό για την πιθανή ανάπτυξη στοχευμένων προσεγγίσεων lncRNA που βασίζονται για τη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

ανάλυση Western blot του επιπέδου πρωτεΐνης CDK6 διεξήχθη σε καρκινικά κύτταρα κύστης που έλαβαν θεραπεία με CDK6-siRNA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0073991.s001

(TIF)