Αφηρημένο

Αν και CD133 έχει αναφερθεί ότι είναι μια πολλά υποσχόμενη παχέος εντέρου δείκτη του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων, η βιολογικές λειτουργίες του CD133

+ παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα παραμένουν αμφιλεγόμενα. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τις βιολογικές διαφορές μεταξύ CD133

+ και CD133

– καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα, με ιδιαίτερη έμφαση στις αλληλεπιδράσεις τους με τον καρκίνο που σχετίζεται με ινοβλάστες, ιδιαίτερα CD10

+ ινοβλάστες. Χρησιμοποιήσαμε 19 πρωτογενείς κόλου καρκινικούς ιστούς, 30 πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών που προέρχονται από κόλον καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου 6. Εμείς απομονωθεί CD133

+ και CD133

– υποπληθυσμών από τους ιστούς του καρκίνου του παχέος εντέρου και καλλιεργημένα κύτταρα.

In vitro

αναλύσεις αποκάλυψαν ότι οι δύο πληθυσμοί έδειξαν παρόμοιες βιολογικές συμπεριφορές στον πολλαπλασιασμό και τηςχημειοευαισθησίας τους.

In vivo

αναλύσεις αποκάλυψαν ότι CD133

+ κύτταρα έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη αύξηση του όγκου των CD133

– κυττάρων (

P

= 0,007). Επιπλέον, σε συνκαλλιέργειες με πρωτογενείς ινοβλάστες που προέρχονται από ιστούς του καρκίνου του παχέος εντέρου, CD133

+ κύτταρα εμφάνισαν σημαντικά περισσότερο επεμβατικές συμπεριφορές από CD133

– κυττάρων (

P

& lt? 0.001), ειδικά σε συνκαλλιέργειες με CD10

+ ινοβλάστες (

P

& lt? 0,0001). Περαιτέρω

in vivo

αναλύσεις αποκάλυψαν ότι CD10

+ ινοβλάστες ενίσχυσε την ανάπτυξη του όγκου του CD133

+ κύτταρα σημαντικά περισσότερο από ό, τι CD10

– ινοβλάστες (

P

& lt? 0,05) . Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η

in vitro

επεμβατική ιδιότητες και

in vivo

ανάπτυξης του όγκου του CD133

+ κύτταρα καρκίνου κόλου ενισχύονται με την παρουσία ειδικών σχετίζονται με τον καρκίνο ινοβλάστες, CD10

+ ινοβλάστες, που υποδηλώνει ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ αυτών των ειδικών κυτταρικών πληθυσμών έχουν σημαντικούς ρόλους στην εξέλιξη του καρκίνου. Ως εκ τούτου, αυτές οι ειδικές αλληλεπιδράσεις μπορεί να είναι πολλά υποσχόμενη στόχοι για νέες θεραπείες του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Cui L, Ohuchida K, Mizumoto K, Moriyama T, Onimaru Μ, Nakata K, et al. (2010) μελλοντικά Απομονωμένες σχετίζονται με τον καρκίνο CD10

+ ινοβλάστες έχουν ισχυρότερη Αλληλεπιδράσεις με CD133

+ Καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα από ό, τι με CD133

– καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 5 (8): e12121. doi: 10.1371 /journal.pone.0012121

Επιμέλεια: Ειρήνη Oi Lin Ng, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 8 Μάρτη 2010? Αποδεκτές: 15 Ιουλίου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 12 Αυγούστου 2010

Copyright: © 2010 Cui et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται σε μέρει από μια Grant-in-Aid από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας, και μια επιχορήγηση από το Ίδρυμα Takeda Επιστήμη, την ιαπωνική Society of Gastroenterology, το Ίδρυμα Uehara Memorial, και του Ιδρύματος Nakajima. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τον δυτικό κόσμο και την επίπτωση της αυξάνεται στις χώρες της Ασίας, ως αποτέλεσμα των αλλαγών προς μια δυτικού τύπου διατροφή [1]. Πρόσφατα, η έννοια των καρκινικών βλαστοκυττάρων (ΚΕΠ) έχει επικεντρωθεί πάνω στην βιολογία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Καρκίνο του παχέος εντέρου εμφανίζει αισθητή βαθμό μορφολογικές και λειτουργικές ετερογένεια στα κύτταρα του. Μεταξύ αυτών των κυτταρικών πληθυσμών, έχουν ΚΕΠ ειδικότερα έχουν αναφερθεί ότι κατέχουν ογκογόνο και ανθεκτικούς στη θεραπεία δραστηριότητες [2]. Κατά συνέπεια, η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός των ΚΕΠ του παχέος εντέρου μπορεί να βοηθήσει προς την ανάπτυξη νέων διαγνωστικών και θεραπευτικών διαδικασιών [3].

Ανθρώπινο προμινίνη-1 (PROM1, CD133) είναι ένας 5-διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη 865 αμινοξέων με ένα συνολικό μοριακό βάρος 120 kDa. Αρχικά περιγράφηκε ως μια ειδική επιφάνεια αντιγόνο των ανθρώπινων αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων [4], [5] και ένα δείκτη για τα κύτταρα ποντικού νευροεπιθηλιακών και διάφορα άλλα εμβρυϊκά επιθηλιακά κύτταρα [6]. Αν και οι βιολογικές λειτουργίες του CD133 παραμένουν άγνωστοι [7], CD133 μόνο του ή σε συνδυασμό με άλλους δείκτες επί του παρόντος χρησιμοποιείται για την απομόνωση βλαστικών κυττάρων από πολυάριθμους ιστούς [4], [5], καθώς επίσης και ο προστάτης [8], το ήπαρ [9 ] και το πάγκρεας [10], [11]. Πρόσφατα, CD133 αναφέρθηκε ότι είναι ένας δείκτης CSC σε καρκίνο του παχέος εντέρου [3], [12]. ΙΕΤΑ et al. [13] περαιτέρω ανέφερε ότι CD133

+ κύτταρα που προέρχονται από κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου εμφανίζουν υψηλότερα ογκογόνο δυναμικό από CD133

– κύτταρα. Ωστόσο, Shmelkov et al. [14] έδειξαν ότι CD133 εκφράζεται ευρέως από ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα πρωτοπαθούς καρκίνου του παχέος εντέρου, και ότι και οι δύο CD133

+ και CD133

– μεταστατικού όγκου υποπληθυσμοί είναι ικανά μακροχρόνιας ογκογένεση

in vivo

. Ως εκ τούτου, οι συνέπειες της CD133 ως δείκτη CSC παραμένουν αμφιλεγόμενα.

Έχει προταθεί ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και των γύρω στρωματικών ινοβλαστών έχουν κρίσιμους ρόλους στην εισβολή και μετάσταση όγκου [15], [16]. Αν και οι όγκοι χύμα γνωστό ότι αποτελείται από ετερογενή καρκινικών κυττάρων με διαφορετικές δραστηριότητες πολλαπλασιασμό, εισβολή και μετάσταση, δεν υπάρχουν αναφορές με επίκεντρο την ετερογένεια του καρκίνου που σχετίζεται με ινοβλάστες. Στις περισσότερες προηγούμενες μελέτες [17], [18], [19], [20], μόνο δύο ή τρεις πρωτογενείς καλλιέργειες καρκίνου που σχετίζεται με ινοβλάστες έχουν χρησιμοποιηθεί για τις έρευνες. Ως εκ τούτου, για την καλύτερη κατανόηση του καρκίνου αλληλεπιδράσεις κυττάρου κύτταρο-στρωματικών, είναι σημαντικό να επικεντρωθεί στην ετερογένεια του καρκίνου που σχετίζεται με ινοβλάστες, παρόμοια με την ετερογένεια των καρκινικών κυττάρων, όπως ΚΕΠ.

Στην παρούσα μελέτη , διερευνήσαμε τις βιολογικές επιπτώσεις της CD133

+ καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα αναλύοντας την έκφραση CD133 σε ανθρώπινα πρωτογενή παχύ έντερο καρκινικούς ιστούς και την αξιολόγηση των βιολογικών συμπεριφορές των CD133

+ και CD133

– κύτταρα που προέρχονται από τον καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές

in vitro

και

in vivo

. Βρήκαμε σημαντικές διαφορές στην ικανότητα εισβολής μεταξύ αυτών των δύο πληθυσμών σε συνκαλλιέργειες με πρωτογενείς ινοβλάστες που προέρχονται από ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου, ιδιαίτερα σε συνκαλλιέργειες με ινοβλάστες θετικά για CD10, έναν μεταλλοενδοπεπτιδάσης μεμβράνη. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι CD133

+ κύτταρα καρκίνου κόλου είναι περισσότερο διεισδυτικά σε παρουσία ειδικών σχετίζονται με τον καρκίνο ινοβλάστες, ειδικά CD10

+ ινοβλάστες, και ότι αυτοί οι κυτταρικοί πληθυσμοί μπορεί να είναι πολλά υποσχόμενη στόχοι για την αναστολή της μετάστασης και όγκων υποτροπή.

Αποτελέσματα

έκφραση CD133 σε χειρουργικά καρκινικούς ιστούς πρωτογενούς παχέος εντέρου

Μέχρι σήμερα, ασυνεπή δεδομένα έχουν αναφερθεί σχετικά με το CD133

+ και CD133

– πληθυσμοί κυττάρων σε πρωτογενείς ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου [3], [14]. Ερευνήσαμε τα ποσοστά του CD133

+ και CD133

– κυτταρικών πληθυσμών στην πρωτοβάθμια ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου με κυτταρομετρία ροής. Χρησιμοποιήσαμε 26 πρωταρχικό του παχέος εντέρου καρκινικούς ιστούς και 24 φυσιολογικούς ιστούς επιθηλιακά του παχέος εντέρου από 26 ασθενείς. Αναλύσαμε το CD133

+ πληθυσμούς σε αυτούς τους ιστούς του παχέος εντέρου μετά την αφαίρεση των

+ και CD31

+ κύτταρα CD45. Όλα τα δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου που περιέχονται τόσο CD133

+ και CD133

– κυττάρων (Πίνακας 1? CD133

+ κύτταρα: 2-54%). Διαπιστώσαμε επίσης CD133

+ κυττάρων σε 0-5% σε φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου. Να αξιολογήσει τις κλινικές επιπτώσεις της έκφρασης CD133, ερευνήσαμε τις συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης CD133 και των κλινικοπαθολογοανατομικές ευρήματα, όπως είναι ο βαθμός του όγκου, ταξινόμησης Dukes, μετάσταση λεμφαδένων, λεμφική εισβολή και φλεβική εισβολή (Πίνακας 2). Βρήκαμε σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης CD133 και ταξινόμησης Dukes (

P

= 0,010) και μεταξύ της έκφρασης CD133 και μετάσταση στους λεμφαδένες (

P

= 0,023).

Η

συγκρίσεις των κακοήθων συμπεριφορές μεταξύ των ταξινομημένων CD133

+ και CD133

– άνω και κάτω τελεία καρκινικά κύτταρα

Χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής, εξετάσαμε την παρουσία του CD133

+ πληθυσμούς σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου 6 . Βρήκαμε ότι όλες οι κυτταρικές σειρές κατείχαν CD133

+ κύτταρα (6-91%? Σχήμα 1Α). Ειδικότερα, εντοπίσαμε δύο διακριτές πληθυσμούς, ένα αποτελείται από μόνο CD133

+ κύτταρα και το άλλο αποτελείται από μόνο CD133

– κύτταρα, σε κύτταρα DLD-1, ενώ οι άλλες κυτταρικές σειρές φαίνεται να διαθέτουν ένα πληθυσμό που αποτελείται από τόσο CD133

+ και CD133

– κύτταρα. Εμείς διαλεγμένα κύτταρα DLD-1 με βάση την έκφραση CD133 και reanalyses έδειξαν αποτελεσματική επιλογή (CD133

+: 98%? CD133

-: 100%? Εικόνα 1Β). Στη συνέχεια, ερευνήσαμε τις χρονο-εξαρτώμενες μεταβολές στην έκφραση CD133 σε αδιαχώριστα DLD-1 γονικών κυττάρων και διαλογή CD133

+ και CD133

– κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, ταξινομημένα CD133

+ κύτταρα έδειξαν σημαντική χρονο-εξαρτώμενες μεταβολές στο CD133

+ και CD133

– πληθυσμούς κατά τη διάρκεια της μακράς του χρόνου πολιτισμού, ενώ τα ποσοστά του CD133

+ και CD133

– πληθυσμοί δεν άλλαξε στα μητρικά κύτταρα και να ταξινομηθούν CD133

– κύτταρα. Στη συνέχεια, να συγκρίνουν τις βιολογικές συμπεριφορές των ταξινομημένων CD133

+ και CD133

– κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε DLD-1 και HCT116 κύτταρα και διερευνήθηκε πολλαπλασιασμό των κυττάρων τους, την ικανότητα σχηματισμού αποικιών και χημειοαντίσταση με 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) και δοξορουβικίνη (ϋΟΧ). Εμείς δεν βρήκε σημαντικές διαφορές σε αυτές τις κυτταρικές συμπεριφορές μεταξύ CD133

+ και CD133

– κυττάρων (σχήματα S1, S2, S3, S4)

(Α) CD133

+ πληθυσμούς σε ένα. πάνελ καρκινικών κυτταρικών σειρών ανθρώπινου κόλον. Η κυτταρομετρία ροής αναλύσεις διεξήχθησαν για να διερευνηθεί η CD133

+ πληθυσμούς σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου 6. (Β) Ανάλυση της CD133

+ πληθυσμού σε γονικά κύτταρα DLD-1 και reanalyses των ταξινομημένων CD133

+ κύτταρα (98%) και CD133

– κύτταρα (100%) (άνω πάνελ). Οι χρονο-εξαρτώμενες μεταβολές στο CD133

+ πληθυσμούς σε μη ταξινομημένα γονική και ταξινομημένο CD133

+ και CD133

– Τα κύτταρα DLD-1 επίσης δείξει (κάτω πίνακας). Η ταξινομημένη CD133

+ κύτταρα παρουσιάζουν σημαντικό χρονικό διάστημα που εξαρτάται από τις αλλαγές στο CD133

+ και CD133

– πληθυσμούς κατά τη διάρκεια της μακράς του χρόνου πολιτισμού, ενώ τα ποσοστά του CD133

+ και CD133

– πληθυσμοί δεν αλλάζουν στα μητρικά κύτταρα και να ταξινομηθούν CD133

– κύτταρα. (Γ) Η ανάπτυξη του όγκου εκτιμήθηκε σε 1 μήνα μετά την ένεση των 5 × 10

6 CD133

+ ή CD133

– κυττάρων DLD-1 σε 6 ποντίκια SCID, αντίστοιχα. Οι αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες εμφανίζονται στο επάνω πάνελ (αριστερά: CD133

– που προέρχεται από κύτταρα του όγκου? δεξιά: CD133

+ καρκινικών κυττάρων που προέρχονται). μπαρ Κλίμακα = 1 εκατοστό. Το CD133

+ όγκους των κυττάρων που προέρχονται είναι σημαντικά μεγαλύτερο από το CD133

– όγκους των κυττάρων που προέρχονται από (

P

= 0,007? Κάτω πίνακα). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD

Η

Για την αξιολόγηση της ογκογόνο δυναμικό και

in vivo

ανάπτυξη του όγκου του CD133

+ και CD133

-. DLD-1 κύτταρα, που μεταμοσχεύονται τους αριθμούς σειράς του CD133

+ και CD133

– κυττάρων σε σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια ποντικούς (SCID). Αν και υπήρχε μια τάση προς την έγκαιρη ανίχνευση του σχηματισμού όγκων σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με CD133

+ κυττάρων σε σύγκριση με ποντίκια που ενέθηκαν με CD133

– κύτταρα, οι διαφορές δεν ήταν σημαντικές (Πίνακας 3). Σε 10 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση, έγχυση άνω των 5 × 10

6 CD133

+ ή CD133

– κύτταρα που παράγονται ορατές οι όγκοι σε όλα τα ποντίκια. Ωστόσο, όταν συγκρίθηκαν τα μεγέθη του όγκου, το CD133

+ όγκους των κυττάρων που προέρχονται ήταν σημαντικά μεγαλύτερο από το CD133

– οι όγκοι των κυττάρων που προέρχονται από. (

P

= 0,007? Σχήμα 1C)

ινοβλάστες του καρκίνου που σχετίζονται με την ενίσχυση της εισβολής του CD133

+ κύτταρα πιο αποτελεσματικά από ό, τι εκείνη του CD133

– κύτταρα

Για να φωτιστούν οι παράγοντες που προκαλούν τις διαφορές στο

in vivo

ανάπτυξη του όγκου μεταξύ CD133

+ και CD133

– κυττάρων, ερευνήσαμε τα αποτελέσματα των συγκαλλιεργειών με καρκίνο που σχετίζεται με ινοβλάστες για την εισβολής των κυττάρων αυτών. Βρήκαμε ότι δεν υπήρχε διαφορά στην εισβολής μεταξύ CD133

+ και CD133

– κυττάρων όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν μόνο του (Εικόνα 2Α). Αντίθετα, όταν τα κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με τον καρκίνο που σχετίζεται ινοβλάστες, CD133

+ κύτταρα έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη ικανότητα εισβολής από CD133

– κυττάρων και των γονικών κυττάρων (

P

& lt? 0,001 για δύο? Εικόνα 2Α). Εξετάσαμε τις επιδράσεις του 12 πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών για την διεισδυτικότητα του CD133

+ κύτταρα, και βρήκαν ότι οι επιδράσεις των συνκαλλιεργημένα κυττάρων επί CD133

+ κυττάρων εισβολή κυμαινόταν από 0,88 φορές έως 1,76 φορές (Πίνακας 4 ).

(Α) εισβάλλοντας κύτταρα μετρήθηκαν μετά από 48 ώρες της μονοκαλλιέργειας ή συγκαλλιέργειας με καρκίνο που σχετίζεται ινοβλάστες (f11). CD133

+ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με καρκίνο που σχετίζεται με ινοβλάστες παρουσιάζουν σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι εισβολής CD133

– κύτταρα και γονικών κυττάρων (

P

& lt? 0.001). Ράβδοι κλίμακας = 100 μm. (Β) Τα ποσοστά της CD10

+ κυτταρικό πληθυσμό και τις δραστηριότητες αυτών των κυττάρων να επάγουν την εισβολή του καρκίνου του παχέος εντέρου συνκαλλιεργημένα κύτταρα διερευνήθηκε σε 12 πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών. Υπάρχει σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ της βελτίωσης της CD133

+ κυττάρων εισβολής και το ποσοστό των CD10

+ κυτταρικό πληθυσμό (

P

& lt? 0,0001). (Γ) Η κυτταρομετρία ροής αναλύσεις διεξήχθησαν για να διερευνηθεί η CD10

+ πληθυσμούς σε πρωτογενείς κόλον καρκινικούς ιστούς. Υπάρχει μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ των ποσοστών του CD133

+ και CD10

+ πληθυσμούς σε ιστούς του καρκίνου του παχέος εντέρου (

P

= 0,015).

Η

οι συσχετίσεις μεταξύ των ποσοστών των πληθυσμών κυτταρικής επιφάνειας δείκτη θετικών στον καρκίνο που σχετίζεται με ινοβλάστες και την ενίσχυσή τους από εισβολή καρκίνου του

Για να χαρακτηριστούν οι πρωτογενείς καλλιέργειες καρκίνου που σχετίζεται με ινοβλάστες, εξετάσαμε τις εκφράσεις της επιφάνειας στρωματικών κυττάρων που σχετίζονται με δείκτες CD10, CD105, CD44 και CD54 σε 32 πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών με κυτταρομετρία ροής (Πίνακας 4). Στη συνέχεια διερευνήθηκαν οι συσχετίσεις μεταξύ της βελτίωσης της CD133

+ κυττάρων εισβολής και τα ποσοστά των θετικών πληθυσμών για αυτούς τους δείκτες επιφάνειας. Βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της βελτίωσης της CD133

+ κυττάρων εισβολής και το ποσοστό των CD10

+ πληθυσμού (

P

& lt? 0,0001? Ρ = 0,928? Σχήμα 2Β? Πίνακας 5). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 4, το ποσοστό του CD10

+ πληθυσμό σε πρωτογενείς καλλιέργειες καρκίνου που σχετίζεται με ινοβλάστες καθιερώθηκαν από όγκους κόλον κυμαίνονταν από 0,39% έως 73,33%. Βρήκαμε επίσης μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των ποσοστών των CD10

+ και CD105

+ πληθυσμούς (

P

& lt? 0,0001? Πίνακας 5), καθώς και μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της βελτίωσης του CD133

+ εισβολής των κυττάρων και το ποσοστό του CD105

+ πληθυσμού (

P

= 0,0268? Πίνακας 5).

η

στη συνέχεια, μελετήσαμε την έκφραση CD10 σε χειρουργικά πρωτεύοντες ιστούς και διαπίστωσε ότι 0,4 έως 25% των κυττάρων που προέρχονται από ιστούς καρκίνου του κόλου ήταν CD10

+ (Πίνακας 1). Στη συνέχεια εξέτασε τις συσχετίσεις μεταξύ του ποσοστού των CD10

+ πληθυσμού και των κλινικοπαθολογοανατομικές ευρήματα. Βρήκαμε τάσεις προς θετικές συσχετίσεις μεταξύ του ποσοστού του CD10

+ πληθυσμού και ταξινόμηση Dukes και μεταξύ του ποσοστού του CD10

+ πληθυσμού και μετάσταση λεμφαδένα, αν και δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Πίνακας 2). Ερευνήσαμε επίσης τις συσχετίσεις μεταξύ των δεικτών κυτταρικής επιφάνειας στους ίδιους τους ασθενείς και διαπίστωσαν σημαντική συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού του CD133

+ και CD10

+ πληθυσμούς (

P

= 0,015? Ρ = 0.4063 ?. Σχήμα 2C)

CD10

+ ινοβλάστες ενισχύσει τις

in vitro

εισβολή και

in vivo

ανάπτυξη του όγκου του CD133

+ καρκινικά κύτταρα

Για να διερευνήσει τις λειτουργικές διαφορές μεταξύ CD10

+ και CD10

– ινοβλάστες, ταξινομήσαμε CD10

+ και CD10

– ινοβλάστες (Σχήμα 3Α) από πρωτογενείς καλλιέργειες καρκίνου που σχετίζονται με ινοβλάστες. Τα επίπεδα του

CD10

mRNA σε αυτούς τους δύο πληθυσμούς ήταν σύμφωνα με τα επίπεδα έκφρασης CD10 κυτταρικής επιφάνειας πρωτεΐνη (Σχήμα 3Α). Χρησιμοποιώντας αυτά τα δύο πληθυσμούς των ινοβλαστών, ερευνήσαμε τις επιπτώσεις τους στην εισβολής του CD133

+ και CD133

– τα καρκινικά κύτταρα. CD10

+ ινοβλάστες ενίσχυσε την εισβολής του CD133

+ καρκινικά κύτταρα σημαντικά περισσότερο από ό, τι CD10

– ινοβλάστες (

P

& lt? 0,0001? Κύτταρα HCT116, Εικόνα 3Β? DLD-1 κύτταρα, Εικόνα 3C). CD10

+ ινοβλάστες επίσης ελαφρώς ενισχυμένη η εισβολής του CD133

– τα καρκινικά κύτταρα περισσότερο από CD10

– ινοβλάστες, αλλά πολύ λιγότερο από ό, τι η επίδρασή τους στην εισβολής του CD133

+ καρκινικά κύτταρα (

P

& lt? 0.001? Σχήμα 3C). Για την αξιολόγηση των επιπτώσεων της CD10

+ και CD10

– ινοβλάστες στο

in vivo

ανάπτυξη του όγκου, εμείς cotransplanted CD133

+ ή CD133

– HCT116 καρκινικά κύτταρα και CD10

+ ή CD10

– ινοβλάστες σε SCID ποντίκια. CD10

+ ινοβλάστες ενίσχυσε την ανάπτυξη του όγκου του CD133

+ καρκινικά κύτταρα σημαντικά περισσότερο από ό, τι CD10

– ινοβλάστες (

P

& lt? 0,05? Εικόνα 3D)

(. Α) Η ανάλυση των πρωτογενών καλλιεργειών του καρκίνου του παχέος εντέρου που σχετίζεται με ινοβλάστες (αριστερό πάνελ) και reanalyses των ταξινομημένο CD10

+ κύτταρα (μέση άνω τμήμα) και CD10

– κύτταρα (μέση κάτω πίνακα). Η

CD10

επίπεδα mRNA στην ταξινομημένη CD10

+ και CD10

– ινοβλάστες μετρήθηκαν με qRT-PCR (δεξιά πλευρά). (Β, Γ) Η εισβολής του CD133

+ και CD133

– καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν με CD10

+ ή CD10

– ινοβλάστες αξιολογήθηκε. Αντιπροσωπευτικά εικόνες εμφανίζονται (Β, κύτταρα HCT116? C, τα κύτταρα DLD-1). Ράβδοι κλίμακας = 100 μm. CD10

+ ινοβλάστες ενίσχυση της εισβολής του CD133

+ καρκινικά κύτταρα σημαντικά περισσότερο από ό, τι CD10

– ινοβλάστες (

P

& lt? 0,0001). (Δ) Τα αποτελέσματα της CD10

+ και CD10

– ινοβλάστες στο

in vivo

ανάπτυξη του όγκου αξιολογήθηκαν στις 4 εβδομάδες μετά cotransplantation της CD133

+ ή CD133

– καρκίνου HCT116 κύτταρα και CD10

+ ή CD10

– ινοβλάστες σε ποντικούς SCID (

n

= 6 για κάθε ομάδα). Οι αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες εμφανίζονται (άνω πάνελ). μπαρ Κλίμακα = 1 εκατοστό. CD10

+ ινοβλάστες να ενισχύσει την ανάπτυξη του όγκου του CD133

+ καρκίνο HCT116 κύτταρα σημαντικά περισσότερο από ό, τι CD10

– ινοβλάστες (

P

& lt? 0,05? Κάτω πίνακα). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± SD.

Η

Επίδραση του CD10 νοκ ντάουν στον CD10

+ ινοβλάστες για την εισβολή των συνκαλλιεργημένα καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα

Για να εξεταστεί εάν η πρωτεΐνη CD10 σε ινοβλάστες συμβάλλει λειτουργικά στην η ενίσχυση της εισβολής συνκαλλιεργημένα καρκινικών κυττάρων, ινοβλάστες επιμολυσμένα με

CD10

-targeting μικρό RNAs παρεμβολής (siRNAs) (siRNA-1 και siRNA-2) ή siRNA ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν για προσδιορισμούς εισβολής. Και οι δύο το

CD10

-targeting siRNA που ανέστειλε το 90% των

CD10

έκφραση του mRNA. Νοκ ντάουν της έκφρασης CD10 σε CD10

+ ινοβλάστες μειωθεί εντυπωσιακά το εισβολής των συνκαλλιεργημένα CD133

+ καρκίνο HCT116 κύτταρα (

P

& lt? 0.001? Σχήμα 4), αλλά είχαν περιορισμένη επίδραση στην εισβολής του CD133 .

– καρκινικά κύτταρα

Νοκ ντάουν της έκφρασης CD10 σε CD10

+ ινοβλάστες μειώνει θεαματικά την ικανότητα εισβολής των συνκαλλιεργημένα CD133

+ καρκίνο HCT116 κύτταρα (

P

& lt? 0.001) , αλλά έχει περιορισμένη επίδραση στην ικανότητα εισβολής των CD133

– τα καρκινικά κύτταρα. Οι αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες (άνω πάνελ) και γραφήματα (κάτω πίνακας) εμφανίζεται. Ράβδοι κλίμακας = 100 μm

Η

Διαφορικές προφίλ έκφρασης του CD10

+ και CD10

-. Ινοβλάστες

Για να φωτιστούν τα βασικά μόρια που εμπλέκονται στην CD10

+ ινοβλαστών μεσολάβηση ενίσχυση της

in vitro

καρκίνο του παχέος εντέρου εισβολή και

in vivo

ανάπτυξη του όγκου του CD133

+ κυττάρων, εκτελέσαμε μικροσυστοιχιών αναλύσεις χρησιμοποιώντας CD10

+ και CD10

– πρωτογενείς-καλλιεργημένες ινοβλάστες που προέρχονται από όγκους του παχέος εντέρου. Συγκρίσεις των δεδομένων μικροσυστοιχιών μεταξύ CD10

+ και CD10

– πρωτογενείς-καλλιεργημένους ινοβλάστες εντοπίστηκαν 20 γονίδια που απορυθμίζεται από & gt? 2-φορές σε CD10

+ ινοβλάστες (Πίνακας S1). Να επικυρώσει αυτά τα δεδομένα μικροσυστοιχιών, qRT-PCR. Έχουμε επιλέξει

ALDH1A1

,

GPNMB

,

ΜΜΡ3

και

IGFBP2

από τα γονίδια που παρατίθενται στον Πίνακα S1 επειδή αυτά τα γονίδια έχουν αναφερθεί ότι εμπλέκονται σε καρκινικών κυττάρων του κόλου εισβολή και βλαστικών κυττάρων αναφέρθηκε επίσης για να εκφράσει ΑΙ_ϋΗ1 [21], [22], [23], [24], [25]. Τα επικυρωμένα στοιχεία ήταν σύμφωνα με τα δεδομένα μικροσυστοιχιών (Σχήμα S5).

Για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα των

CD10

νοκ ντάουν για τις εκφράσεις των τεσσάρων γονιδίων εισβολή που σχετίζονται με (

ΜΜΡ3

,

ALDH1A1

,

GPNMB

και

IGFBP2

) σε CD10

+ ινοβλάστες, CD10 sup> + ινοβλάστες

CD10

αξιολογήθηκαν -targeting ή ελέγχου siRNAs, και οι εκφράσεις των τεσσάρων γονιδίων εισβολή που σχετίζονται. Δεν υπήρξαν σημαντικές αλλαγές στις εκφράσεις αυτών των τεσσάρων γονιδίων (Σχήμα S6).

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη,

in vitro

πειράματά μας αποκάλυψαν ότι CD10

+ ινοβλάστες που προέρχονται από ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου ενίσχυσε σημαντικά την εισβολή του CD133

+ παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με το CD10

– ινοβλάστες. Βρήκαμε επίσης ότι η εξουδετέρωση του CD10 στα CD10

+ ινοβλαστών μειώνεται μερικώς το εισβολής των συνκαλλιεργημένα CD133

+ κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. Επιπλέον, μας

in vivo

αναλύσεις απέδειξαν ότι cotransplantation του CD10

+ ινοβλάστες αύξησε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου του CD133

+ παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με cotransplantation των CD10

– ινοβλάστες. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ένα συγκεκριμένο υποσύνολο του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων, CD133

+ κύτταρα, έχει σημαντικές αλληλεπιδράσεις με ένα συγκεκριμένο υποσύνολο του καρκίνου που σχετίζεται με ινοβλάστες, CD10

+ ινοβλάστες. Αυτή είναι η πρώτη έκθεση για να περιγράψει καρκινικό κύτταρο-στρωματικών αλληλεπιδράσεων κυττάρου μεταξύ προοπτικά ταξινομημένο συγκεκριμένα υποσύνολα κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου και του καρκίνου που σχετίζεται με ινοβλάστες.

έχουν ΚΕΠ απομονωθεί από καρκίνο του παχέος εντέρου, με βάση την έκφρασή τους του κυττάρου δείκτη επιφανείας CD133 [3], [12], [26]. Αν και αρκετοί ερευνητές έχουν δημοσιευθεί πρόσφατα αναφορές για CD133

+ κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [3], [12], [26], υπήρχαν ασυνεπή δεδομένα σχετικά με την ικανότητα των όγκων-έναρξη του CD133

+ κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ογκογόνο δυναμικό τόσο CD133

+ και CD133

– άνω και κάτω τελεία καρκινικά κύτταρα, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της Shmelkow et al. [14]. Επιπλέον, δεν διαπίστωσε σημαντικές διαφορές μεταξύ αυτών των δύο κυτταρικών πληθυσμών στη τους

in vitro

κυτταρικό πολλαπλασιασμό, σχηματισμό αποικίας και χημειοαντίσταση. Ωστόσο, η παρούσα

in vivo

αναλύσεις αποκάλυψαν ότι CD133

+ κύτταρα δημιουργούνται σημαντικά μεγαλύτερους όγκους από CD133

– κύτταρα. Για να κατανοήσουμε τις επιπτώσεις των αντιφατικά αποτελέσματα μεταξύ του

in vitro

και

in vivo πειράματα

, εστιάσαμε για τον καρκίνο αλληλεπιδράσεις κυττάρου κύτταρο-στρωματικά, τα οποία είναι γνωστό ότι έχουν κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου [ ,,,0],27]. Σε συγκαλλιέργειες με αρκετές πρωτογενείς καλλιέργειες καρκίνου που σχετίζεται με ινοβλάστες, η διεισδυτικότητα του CD133

+ κόλον καρκινικά κύτταρα ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με εκείνη του CD133

– κύτταρα, ενώ πρωτογενείς καλλιέργειες άλλων σχετίζονται με τον καρκίνο ινοβλάστες δεν φαίνεται να έχουν τέτοια δυνατότητα να ενισχύσει την ικανότητα εισβολής των καρκινικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, χαρακτηριζόμενη από αυτές τις πρωτογενείς καλλιέργειες καρκίνου που σχετίζονται με ινοβλάστες, και βρήκαν ότι CD10

+ ινοβλάστες έπαιξε σημαντικό ρόλο στην ενίσχυση της CD133

+ καρκινικών κυττάρων διεισδυτικότητα σε

in vitro

και

in vivo πειράματα

στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε CD133

+ και CD133

– κύτταρα που απομονώνονται από καλλιεργημένα κυτταρικές σειρές επειδή δεν ήταν δυνατό να λάβουν επαναλήψιμα αποτελέσματα για τις δοκιμασίες ογκογονικότητας και πειράματα συγκαλλιέργειας όταν χρησιμοποιείται CD133

+ και CD133

– κύτταρα που απομονώθηκαν από όγκους των ασθενών σε μια προκαταρκτική μελέτη. Ωστόσο, είναι σημαντικό να διερευνήσει τις βιολογικές συμπεριφορές των CD133

+ και CD133

– υποπληθυσμών που απομονώθηκε από όγκους ασθενών. Ως εκ τούτου, απαιτούνται περαιτέρω εξετάσεις που απαιτούνται για να αποσαφηνιστεί η σχέση μεταξύ της πρωτοπαθούς όγκου που προέρχονται CD133

+ καρκινικά κύτταρα και CD10

+ ινοβλάστες. Ωστόσο, πρέπει να βελτιώσουμε τις μεθόδους μας για πρωτογενείς καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων πριν μπορέσει να γίνει τέτοιες εξετάσεις. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε υποδόρια μοντέλα στην παρούσα μελέτη, λόγω των δυσκολιών που ανέκυψαν κατά την εκτίμηση του μεγέθους του όγκου σε ορθοτοπική μοντέλα. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη τη σημασία του μικροπεριβάλλοντος ιστού, μελέτες που χρησιμοποιούν ορθοτοπική μοντέλα θα πρέπει να πραγματοποιηθεί ως το επόμενο βήμα.

CD10 είναι μια 90-100-kDa στην κυτταρική επιφάνεια εξαρτώμενη από ψευδάργυρο μεταλλοπρωτεάση που εκφράζεται ευρέως από τα κύτταρα διάφορους ιστούς, όπως λεμφοειδή προγονικά κύτταρα, μυοεπιθηλιακά κύτταρα και στρωματικά κύτταρα του φυσιολογικού μυελού των οστών και του ενδομητρίου [28], [29], [30], [31]. Επιπλέον, CD10 αναφέρθηκε ότι είναι ένας δείκτης για την κατηγοριοποίηση οξείες λευχαιμίες και λεμφώματα επιμέρους ταξινόμηση κακοήθη [32]. Πρόσφατες ανοσοϊστοχημικές μελέτες αποκάλυψαν ότι η συχνότητα της έκφρασης στρωματικών θετικών CD10 σε όγκους συσχετίστηκε σημαντικά με την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνους του μαστού [18], καθώς και η εισβολή και η μετάσταση των γαστρικών καρκίνων [19]. Ogawa et al. [31] εκτέλεσε μια ανοσοϊστοχημική μελέτη του καρκίνου του παχέος εντέρου και ανέφεραν ότι η έκφραση του CD10 σε στρωματικά κύτταρα ήταν πιο συχνά ανιχνεύθηκε σε επεμβατικές όγκους από ό, τι σε μη επεμβατικές όγκους. Τα πορίσματα αυτών των προηγούμενων ανοσοϊστοχημικές μελέτες είναι συνεπείς με αυτές της παρούσας λειτουργική μελέτη μας.

Τα παρόντα αποτελέσματα έδειξαν ότι η εξουδετέρωση της έκφρασης CD10 σε CD10

+ ινοβλάστες εν μέρει, αλλά σημαντικά, μείωσε την επεμβατική ικανότητα της συνκαλλιεργημένα CD133

+ κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. δεδομένα μικροσυστοιχιών μας εντόπισε αρκετά γονίδια που εμπλέκονται στην εισβολή των καρκινικών κυττάρων, αλλά knockdown της έκφρασης CD10 δεν επηρέασε τις εκφράσεις αυτών των γονιδίων. Τα δεδομένα μπορεί να υποδηλώνουν ότι CD10

+ ινοβλάστες έχουν τόσο CD10-εξαρτώμενη και CD10-ανεξάρτητους μηχανισμούς για την προώθηση της εισβολής των συνκαλλιεργημένα CD133

+ καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, αν και απαιτούνται περαιτέρω εξετάσεις που απαιτούνται για τη διαλεύκανση των λεπτομερών μηχανισμών αυτών των αλληλεπιδράσεων.

Εν κατακλείδι, οι παρούσες λειτουργικές αναλύσεις δείχνουν ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ CD133

+ παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα και τον καρκίνο που σχετίζεται με CD10

+ ινοβλάστες έχουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις μπορεί να είναι πολλά υποσχόμενη στόχοι για τις θεραπείες του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Kyushu (αριθμός έγκρισης, 19 -13) και διεξάγονται σύμφωνα με τις Ηθικές οδηγίες για Ανθρώπινου Γονιδιώματος /Gene Έρευνας ψηφίστηκε από την ιαπωνική κυβέρνηση. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση υπέγραψε συγκατάθεση για την έγκριση της χρήσης των ιστών τους για ερευνητικούς σκοπούς απροσδιόριστη. Για όλα τα πειράματα που αφορούν τα ποντίκια, τα ζώα στεγάζονται σε γραφεία στρωτής ροής κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνου σε εγκαταστάσεις εγκεκριμένες από το Πανεπιστήμιο Kyushu (αριθμός έγκρισης, A020-018-0).

Τα κύτταρα και τα αντιδραστήρια

Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου (DLD-1, RCM1 και Colo201) αγοράστηκαν από την ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources (Osaka, Japan). Οι κυτταρικές γραμμές LOVO και ΟοΙο205 αποκτήθηκαν από RIKEN (Tsukuba, Japan) και η HCT116 κυτταρική γραμμή ελήφθη από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Δημιουργήσαμε 32 πρωτογενείς καλλιέργειες με καρκίνο του κόλον που σχετίζεται ινοβλάστες που προέρχονται από εκτομή όγκων του παχέος εντέρου από 26 ασθενείς όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με στρεπτομυκίνη (100 μg /ml), πενικιλλίνη (100 U /ml) και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) στους 37 ° C σε υγροποιημένο περιβάλλον 90% αέρα και 10% CO

2. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS. Όλα τα δείγματα ιστού ελήφθησαν κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης στο Τμήμα Χειρουργικής Ι, Kyushu University Hospital (Fukuoka, Japan). Οι έμπειροι παθολόγους διεξαγωγή εξετάσεων ιστολογική όλων των ιστών που γειτνιάζουν με τα δείγματα.

5-FU και DOX ευγενικά παρέχεται από την Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan) και Nippon Roche Κ.Κ. (Kamakura, Japan), αντιστοίχως.

Η κυτταρομετρία ροής

Τα δείγματα ιστού πλύθηκαν εκτεταμένα με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), τεμαχίστηκαν σε περίπου 1 mm

3 κύβους χρησιμοποιώντας ψαλίδι και διαχωρίστηκαν σε μεμονωμένα κύτταρα με πέψη με κολλαγενάση (Wako Pure Chemical Industries). Τα διαχωρισμένα κύτταρα διήλθαν μέσω ενός φίλτρου. Πρωτογενή κύτταρα που προέρχονται από τις εκτομή ιστούς και διαχωριζόμενα κύτταρα DLD-1 αιωρήθηκαν σε παγωμένο 1% FBS σε PBS σε 1 × 10

6 κύτταρα /100 μΙ. Κάθε εναιώρημα επωάστηκε με ένα αντίσωμα σε πάγο για 40 λεπτά. Τα επισημασμένα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ροής EPICS ALTRA κυτταρόμετρο (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA) εξοπλισμένο με δύο λέιζερ που παρέχονται μήκη κύματος διέγερσης των 488 nm για την ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), φυκοερυθρίνη (ΡΕ) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) σήματα και 635 nm για τα (APC) σήματα αλλοφυκοκυανίνη. Οι προκύπτουσες εκπομπές φθορισμού συλλέχθηκαν με τη χρήση σετ φίλτρων διέλευσης ζώνης στα 525 ± 15 nm για FITC, 575 ± 10 nm για PE, 610 ± 12 nm για PI και 675 ± 25 nm για την APC. EXPO32 λογισμικό κυτταρομετρίας ροής (Beckman Coulter Inc.) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των σημάτων φθορισμού και να ρυθμίσετε τις λογικές ηλεκτρονική-gating παραμέτρους. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για τις αναλύσεις FACS που παρατίθενται στον Πίνακα S2.

qRT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από καλλιεργημένα ή /και ταξινομημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα υψηλής καθαρότητας κιτ απομόνωσης RNA (Roche Diagnostics , Mannheim, Germany) με ϋΝάση Ι (Roche Diagnostics) θεραπεία, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σχεδιάσαμε ειδικούς εκκινητές (Πίνακας S3) και εκτελείται BLAST ψάχνει να εξασφαλίσει τις ιδιαιτερότητες αυτών των εκκινητών. One-βήμα qRT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας QuantiTect SYBR Green Reverse Transcription-PCR Kit (Qiagen ΚΚ, Tokyo, Japan) και ένα Chromo4 Real-Time Σύστημα Ανίχνευσης PCR (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],34]. Κάθε δείγμα εις τριπλούν και η έκφραση του κάθε γονιδίου παρουσιάστηκε ως ο λόγος μεταξύ της έκφρασης του κάθε γονιδίου στόχου mRNA και ότι του

18S rRNA

.

CD10

siRNAs

Αναστολή

CD10

γονιδιακή έκφραση επιτεύχθηκε με παρεμβολή RNA με siRNAs έναντι

CD10

(siRNA-1: με νόημα, 5′-GGUUGAAUUUCACAAAUGATT-3 ‘, αντινόημα, 5’-UCAUUUGUGAAAUUCAACCAG-3 ‘? siRNA-2: sense, 5′-GUGUGGUGUGGAACCUAUATT-3′, αντινόημα, 5’-UAUAGGUUCCACACCACACCT-3 ‘? Qiagen, Poison Κέντρο πληροφοριών Mainz, Germany) όπως περιγράφεται προηγουμένως [35].