έχουν

Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) έχουν προταθεί για να παίξουν ζωτικό ρόλο στη ρύθμιση της εξέλιξης του όγκου και την εισβολή. Ωστόσο, η έκφραση του miR-339-5p σε καρκίνο του παχέος εντέρου και τα αποτελέσματά της δεν είναι γνωστές. Εδώ, αναφέρουμε ότι miR-339-5p είναι ένας καταστολέας όγκων με τη ρύθμιση της έκφρασης PRL-1. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι μειωτικά miR-339-5p επίπεδα του παχέος καρκινικούς ιστούς και ιδιαίτερα επεμβατική κυτταρικές σειρές CRC. Επιπλέον, η ενίσχυση της έκφρασης του miR-339-5p ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων CRC, τη μετανάστευση και την εισβολή in vitro και κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου in vivo. Στη συνέχεια προβλήθηκε και προσδιόρισε μια νέα miR-339-5p στόχο, φωσφατάσες της αναγέννησης του ήπατος-1 1 (PRL-1), και επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με δοκιμασία λουσιφεράσης. Η υπερέκφραση του miR-339-5p θα μειώσει επίσης την έκφραση του PRL-1 mRNA και πρωτεΐνης. Η μειωμένη έκφραση PRL-1 συνδέθηκε με χαμηλή έκφραση του φωσφορυλιωμένου-εξωκυτταρικό σήμα-regulatedkinase1 /2 (ρ-ERK1 /2). Αντιστρόφως, μείωση του miR-339-5p από τους αναστολείς σε κύτταρα διεγερμένα αυτά φαινοτύπους. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miR-339-5p λειτουργεί ως ογκοκατασταλτικό και παίζει ένα ρόλο στην αναστολή της ανάπτυξης και της μετάστασης των κυττάρων του CRC μέσω στόχευσης PRL-1 και ρυθμίζουν ρ-ERK1 /2 .Οι ευρήματα υποδεικνύουν ότι miR-339- 5P μπορεί να είναι χρήσιμη ως ένα νέο πιθανό θεραπευτικό στόχο για CRC

Παράθεση:. Zhou C, Liu G, Wang L, Lu Υ, Yuan L, Zheng L, et al. (2013) MiR-339-5p ρυθμίζει την ανάπτυξη, αποικία Σχηματισμός και μετάσταση των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου από Στόχευση PRL-1. PLoS ONE 8 (5): e63142. doi: 10.1371 /journal.pone.0063142

Επιμέλεια: Antonio Moschetta, Πανεπιστήμιο του Μπάρι & amp? Consorzio Mario Negri Sud, Ιταλία

Ελήφθη: 3 Δεκεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 29, Μάρτη του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 16, 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίζεται από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αριθ 30871156, 81272758 Όχι), Επιστήμης και Τεχνολογίας του έργου της επαρχίας Γκουανγκντόνγκ (2009B030803041) και του Ιδρύματος Επιστήμης Φυσικής της επαρχίας Γκουανγκντόνγκ (Όχι 8151051501000057). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι authers έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι μία από τις πιο διαδεδομένες καρκινώματα σε ολόκληρο τον κόσμο. Κάθε χρόνο, περισσότεροι από 1 εκατομμύριο άτομα θα αναπτύξει καρκίνο του παχέος εντέρου, και η θνησιμότητα λόγω της νόσου είναι σχεδόν 33% στον ανεπτυγμένο κόσμο [1]. Για πολλές δεκαετίες, το βάθος της εξέλιξης του όγκου και της μετανάστευσης έχει αναγνωριστεί ως μείζον προγνωστικούς παράγοντες σε ασθενείς με CRC [2]. Η εξέλιξη της ασθένειας αυτής υφίσταται πολλές δεκαετίες και περιλαμβάνει πολλαπλών σταδίων γενετικά γεγονότα [3]. Οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν τη διαδικασία αυτή ακόμα δεν μπορεί να τεκμηριωθεί [4]. Με την ανάπτυξη της προηγμένης γονιδιωματικής τεχνολογίας, ένα πρόσφατα ανακαλύφθηκε κατηγορία των μη-κωδικοποίησης μικρά RNA, ονομάζεται miRNAs, έχουν προσελκύσει τεράστιο ενδιαφέρον στην έρευνα για τον καρκίνο του παχέος εντέρου [5].

Τα microRNAs (miRNAs) είναι 20-22 νουκλεοτιδίων σύντομο μονόκλωνο RNA που μη κωδικοποιητική που ρυθμίζουν διάφορες κυτταρικές διαδικασίες σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο [6]. MiRNAs έχουν επιπτώσεις στις κρίσιμο γονίδιο που ελέγχει την κυτταρική ανάπτυξη, διαφοροποίηση, πολλαπλασιασμό, απόπτωση και το μεταβολισμό [7] – [9]. Ταχέως αναδυόμενες αποδείξεις έχουν δείξει πιθανούς ρόλους των miRNAs στην παθογένεση και εξέλιξη του καρκίνου [10]. Η διαφορική έκφραση των miRNAs μεταξύ ιστού του όγκου και του φυσιολογικού ιστού σε διάφορους τύπους καρκίνου πρότεινε miRNAs μπορούν να δράσουν ως ογκογονίδια και κατασταλτικά του όγκου [11] – [12]. Για παράδειγμα, το πρώτο σχετίζεται με τον καρκίνο του γονιδίου-στόχου του miR-21 προάγει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή στοχεύοντας το ΡΤΕΝ σε ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνο και TPM1 στον καρκίνο του μαστού [13], [14]. Από την άλλη πλευρά, η απώλεια της miR-143 παρατηρείται στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, ενώ η αυξημένη έκφραση του miR-143 που επάγεται καταστολή της ανάπτυξης σε καρκινικά κύτταρα κύστης μέσω μειορρύθμιση της έκφρασης Erk5 στο μεταφραστικό επίπεδο [15]. Πρόσφατα, με την ανάπτυξη προηγμένων miRNA σειριακή ανάλυση έκφρασης γονιδίου (Mirage), κρίσιμη miRNAs τοπίο έκφρασης σε καρκίνο του παχέος εντέρου έχει καλώς τεκμηριωθεί [16]. Υπερεκφράζεται miRNAs όπως miR-20, miR-21, miR-17-5p, miR-181β και miR-200c έχουν εμπλακεί σε παχέος αδενωμάτων και καρκινωμάτων [17], [18]. Τα χαμηλότερα επίπεδα των miRNAs συμπεριλαμβανομένων των miR-34a, miR-126, miR-143, miR-145 και miR-133b επιβεβαίωσε επίσης σε καρκίνους του παχέος εντέρου [19] – [22]. Πρόσφατα, ένα microRNA συστοιχίες να συγκρίνουν τα προφίλ microRNA στα δείγματα CRC ιστό των ασθενών νωρίς και μη έγκαιρη επανάληψη ανέφεραν ότι τα κάτω ρύθμιση του miR-339-5p έκφραση συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση για την κλινική τους ασθενείς με καρκίνο παχέος εντέρου στο στάδιο II [23]. Ωστόσο, μέχρι τώρα, λειτουργικά στοιχεία miR-339-5p στον καρκίνο του παχέος εντέρου δεν έχει τεκμηριωθεί καλά και τους ρόλους τους στην παχέος εξέλιξη του καρκίνου παραμένει ασαφής.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε το ρόλο του miR-339 -5p σε ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος παχέος εντέρου. Εξετάσαμε το επίπεδο έκφρασης του miR-339-5p σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου και καρκινικούς ιστούς, και δοκιμάζεται επιπτώσεις του στην ανάπτυξη των κυττάρων, τη διανομή του κυτταρικού κύκλου, και τον σχηματισμό αποικίας και την ικανότητα εισβολής in vitro. Εμείς χορηγείται miR-339-5p προάγγελος ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου καρκίνου του παχέος εντέρου ποντικών και απέδειξαν επίσης ότι θα μπορούσε να καταστείλει την ανάπτυξη όγκων του παχέος εντέρου in vivo. Επιπλέον, παρέχουμε υποκείμενος μηχανισμός που miR-339-5p μπορεί να αναστέλλει την ανθρώπινη πολλαπλασιασμό CRC και εισβολής με στόχο την ογκογονίδιο PRL-1. PRL-1 ταυτοποιήθηκε ως ένα μέλος της οικογένειας αποτελείται από τρία στενά συνδεδεμένα μόρια (PRL-1, PRL-2, και PRL-3), τα οποία αποτελούν μία νέα κατηγορία πρωτείνης αρχάριος-sine φωσφατάση (PTP). Οι ΡΡί είναι μεταξύ του μικρότερου του ΡΤΡ, έχοντας μοριακές μάζες 20-22 kDa και αποτελούνται κυρίως από ένα καταλυτικό τομέα. Σημαντικά στοιχεία από κυτταρική σειρά ποντικού και μελέτες δείχνουν ότι τα γονίδια αυτά προάγουν τον σχηματισμό όγκου, εισβολή, και μετάσταση [24], [25]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-339-5p μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου, που ρυθμίζουν τη διατήρηση και την εξέλιξη των καρκίνων.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

Δείγματα παχέος καρκινικό ιστό και συμφωνημένα κανονικό βλεννογόνο του κόλου 30 ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου συνελέγησαν από φρέσκα χειρουργικά δείγματα, καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω ανάλυση. Όλοι οι ιστοί είχαν ιστολογικά επιβεβαιωμένο ότι είναι ένα αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου. Παθολογική επαλήθευση και την ταξινόμηση έγιναν με βάση το σύστημα της Διεθνούς Καρκίνου Ένωσης κατά. Το ερευνητικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας σε Nanfang Νοσοκομείο, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς για τη χρήση των ιστών τους.

καλλιέργειας κυττάρων

Ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα 293FT και έξι ανθρώπινα του παχέος κυτταρικές γραμμές καρκινώματος HCT116, ΗΤ29, LS174T, SW480, SW620 και LOVO με διαφορετικές ικανότητες μεταστατικό ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Hyclone, Logan, Utah, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Gibco-BRL, Invitrogen, Paisley, UK). Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή 5% CO2.

Κατασκευή του προ-miR-339 που υπερεκφράζουν κατασκευάσματα και καθιέρωση σταθερών κλώνου

Ο φορέας pLVTHM που περιέχει ένα αποσταθεροποιηθεί Πράσινη Φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) παραλλαγή (διατηρείται στο εργαστήριο μας) χρησιμοποιήθηκε σαν ένα υπερ-έκφραση σύστημα miR-339-5p. Το DNA που κωδικοποιεί προ-miR-339 ενισχύθηκε με PCR από ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA χρησιμοποιώντας εναύσματα (5 ‘CGACGCGTCGCGCCATTGCCACGGCACCAT) και το αντίστροφο εκκινητές (5’ CCATCGATGGGGCAGAAGACCCACGCATACGAGT), πέψη με

ΜΙυΙ

και

ClaI

και συνδέθηκε με pLVTHM. Τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με άμεση αλληλούχιση του DNA. Lentivirus παράχθηκε με συν επιμόλυνση του παραπάνω κατασκευάσματος με συσκευασία

πλασμίδια psPAX

2 και pMD2.G χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σε κύτταρα HEK293FT. Μετά από 48 ώρες καλλιέργειας, το υπερκείμενο συλλέχθηκε και καταψύχεται στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. SW620 κύτταρα υπέστησαν μεταγωγή με υπερκείμενο φορέα και στη συνέχεια FACS-ταξινομημένο για πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP). Επιβεβαίωση σταθερή επιμόλυνση των πλασμιδίων ελήφθη χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία microRNA qRT-PCR.

μιμείται microRNA, siRNA παροδική επιμόλυνση

microRNA μιμούνται, αναστολέας miR-339-5p και ο αρνητικός μάρτυρας αγοράστηκαν από GenePharma (Σανγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε 50% συρροή και επιμολύνθηκαν με 200 ηΜ microRNA μιμούνται ή αναστολέα miR-339-5p (5′-CGUGAGCUCCUGGAGGACAGGGA-3 ‘) ή αναστολέα-αρνητικό μάρτυρα (5′- CAGUACUUUGUGUAGUACAA-3′ με Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σε Opti-ΜΕΜ (Invitrogen, Carlsbad, CA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. 24 ή 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για περαιτέρω πειράματα. microRNA μιμητικό ήταν HSA-miR-339-5p μιμείται, αίσθηση 5’-UCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACG- 3 ‘και αντι-νόημα 5′- UGAGCUCCUGGAGGACAGGGAUU-3′ και αρνητικού ελέγχου, αίσθηση 5’- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘και αντι-νόημα 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’.

εκχύλιση RNA και SYBR πράσινο ποσοτική PCR ανάλυση

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Takara, Dalian, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. για την ανίχνευση των miR-339-5p έκφραση, στέλεχος-βρόχος αντίστροφης μεταγραφής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT -PCR) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια όλα-σε-OneTM miRNA ποσοτικής RT-PCR (qRT-PCR) κιτ ανίχνευσης (GeneCopoeia, Rockville, MD) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 mg συνολικού RNA που περιέχουν μικρές RNA που εξάγεται από δείγματα ιστών για πρώτη φορά πολυαδενυλιωμένα με πολυ (Α) πολυμεράση και στη συνέχεια μεταγράφεται ανάστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας ένα μείγμα προσαρμογέα ολιγο-άΤ που παρέχονται στο κιτ. Ώριμη miR-339-5p έκφραση σε κύτταρα και ιστούς ανιχνεύθηκε με χρήση του κιτ φουρκέτας-it TM miRNAs qPCR (GeneCopoeia, Rockville, MD). Η έκφραση της U6 χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος. Η αντίδραση PCR για την ενίσχυση του miR-339-5p διεξήχθη στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 20 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 20 δευτερόλεπτα και 72 ° C 10 δευτ. Για PRL-1 ανίχνευση mRNA, αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συστήματος αντίστροφης μεταγραφάσης (Takara, Dalian, Κίνα). PRL-1 έκφραση μετρήθηκε με SYBR πράσινο δοκιμασία qPCR (Takara, Dalian, Κίνα). Οι αλληλουχίες των εκκινητών PRL-1 ήταν: (προς τα εμπρός) 5’GACCTGGATGGGGTAAACCT3 »και (πίσω) 5 ‘TGTGACTTCCACAGGAGCTG3», οι ακολουθίες GAPDH έναυσμα ήταν: (προς τα εμπρός) 5’ACCCACTCCTCCACCTTTG3 »και (πίσω) 5’ CACCACCCTGTTGCTGTAG3». SYBR PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα ΑΒΙ PRISM 7500 Fast Real-time σύστημα PCR (Applied Biosystems). Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν. Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση 2

-ΔΔCT μέθοδο.

CCK-8 πολλαπλασιασμό των κυττάρων δοκιμασία

ποσοστά πολλαπλασιασμό των κυττάρων μετρήθηκαν με τη χρήση κυττάρων Μετρώντας Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Ιαπωνία). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση με ένα miR-339-5p αναστολέα ή ένας έλεγχος miRNA, κύτταρα HCT116 σπάρθηκαν σε 1 × 10

3 ανά φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων. Η δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού διεξήχθη τις ημέρες 1, 2, 3 και 4. 10 μΐ CCK-8 αντιδραστήριο προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, στη συνέχεια η πλάκα επωάστηκε για 2 ώρες στους 37 ° C. Πριν από το τελικό σημείο της επώασης, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο μικροπλάκας Vmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν. Ενώ SW620 σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων στα 3 χ 10

3cells ανά φρεάτιο, και το ίδιο πείραμα εκτελέστηκαν τις ημέρες 1, 2, 3, 4, 5, 6 και 7. Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν 3 φορές ανεξάρτητα. Τα δεδομένα χαράσσονται ως μέσο ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα.

ανάλυση κυτταρικού κύκλου

1 × 10

6 κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν επί μία νύκτα με στους 4 ° C σε 70% αιθανόλης. Μετά τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, το DNA τους χρωματίστηκε με την ανίχνευση του κυτταρικού κύκλου Kit (KeyGen, Nanjin, Κίνα). Τα δείγματα ποσοτικά με κυτταρομετρία ροής (Becton Dickinson, NJ, USA) και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με το λογισμικό ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ΜΕ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή ..

Plate κλώνου σχηματισμός δοκιμασία

κάθε φρεάτιο μιας πλάκας καλλιέργειας των 6-φρεατίων σπάρθηκαν με 2 χ 10

2 κύτταρα και κάθε ομάδα περιείχε τρία πηγάδια. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 14 ημέρες, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και βάφτηκαν με διάλυμα Giemsa. Ο αριθμός των αποικιών που περιέχουν ≥50 κύτταρα μετρήθηκε υπό μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας τον τύπο:. Αποδοτικότητα σχηματισμού κλώνου πλάκα = (αριθμός των αποικιών /αριθμός κυττάρων εμβολιάστηκε) × 100%

κυττάρων εισβολής και δοκιμασία μετανάστευσης

Η ικανότητα των κυττάρων εισβολή και τη μετανάστευση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας Transwell ένθετα με 8 μm πόρους (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Για την ανίχνευση εισβολής, 2 × 10

5 κύτταρα σε μέσο ελεύθερο ορού προστέθηκαν σε κάθε άνω διαμέρισμα του θαλάμου προ-επικαλυμμένα με μήτρα matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). 600 μΐ 10% μέσου FBS προστέθηκε στην συμφωνημένα κάτω θάλαμο. Κάθε ομάδα κυττάρων τοποθετήθηκε σε 3 διπλές κοιλότητες. Μετά από επώαση για 48 ώρες, μη επεμβατική κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια της μεμβράνης transwell με μια μπατονέτα, και τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει μέσω της μεμβράνης και να κολλήσει με την κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη, βάφτηκαν με Giemsa και φωτογραφήθηκε κάτω από το μικροσκόπιο. Για δοκιμασία μετανάστευσης, οι διαδικασίες ήταν παρόμοιες, εκτός του ότι 2 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν στην κορυφή του θαλάμου χωρίς προ-επικαλυμμένη μήτρα matrigel. Τέλος, τα κύτταρα στο κάτω διαμέρισμα του θαλάμου που είχαν εισβάλει στην βασική πλευρά της μεμβράνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός σε 5 τυχαία οπτικά πεδία (Χ 200).

απομόνωσης πρωτεϊνών και κηλίδωση Western

Για τις αναλύσεις η έκφραση της πρωτεΐνης, τυπική δυτική blottings πραγματοποιήθηκαν. Καλλιεργημένα ή επιμολυσμένα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και λύθηκαν σε πάγο σε ρυθμιστικό RIPA με 1% PMSF (KeyGen, Nanjin, Κίνα). προϊόντα λύσης πρωτεΐνης αναλύθηκαν σε 10% γέλη SDS πολυακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF και αποκλείστηκαν σε 0.1% Tween 20 και 5% πρωτεΐνες αποβουτυρωμένο γάλα σε Tris αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα. Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με αντι-PRL-1 μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (1:800, Proteintech Corporation, USA) και κουνελιού αντι-ERK1 /2, φωσφο-Erk1 /2 (ρ-ERK1 /2) μονοκλωνικό αντίσωμα (1:1000, Bioworld Corporation, USA), αντι-β-τουμπουλίνης αντίσωμα κουνελιού (1:2000, Epitomics Corporation, USA) για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Η μεμβράνη πλύθηκε και οπτικοποιήθηκε με υπεροξειδάση (HRP) – συζευγμένο δευτερεύοντα αντισώματα για 1 ώρα. Σήματα ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (KeyGen, Nanjin, Κίνα)

λουσιφεράσης δημοσιογράφος δοκιμασία

Πρόβλεψη θέσεις πρόσδεσης miR-339-5p πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού TargetScan (http:. //Www. targetscan.org). Ένα θραύσμα 3’UTR της PRL-1 που περιέχει το υποτιθέμενο miR-339-5p θέση σύνδεσης ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ακόλουθους εκκινητές: WT-PRL-1 (εμπρός) 5 ‘CCGGCTCGAGATCTCCCACATTCATACC 3’, WT-PRL-1 (αντίστροφο) 5 ‘TAAGCGGCCGCTTCATTAGCAGAAACCC 3’ και προστίθενται στο

XOL Ι

και

NotI

θέσεις περιορισμού, αμέσως προς τα κάτω του γονιδίου της λουσιφεράσης στον psiCHECK ™ -2 φορέα (Promega, Madison, WI) Μια psiCHECK -2 κατασκεύασμα που περιέχει 3’UTR της PRL-1 με μια μεταλλαγμένη αλληλουχία σπόρο του miR-339-5p επίσης παράγεται χρησιμοποιώντας τους εκκινητές: mut-PRL-1 (μπροστά) 5 ‘GTCAAAGGGGCCTGAGAAAAGAATG 3’, mut-PRL-1 (αντίστροφη ) 5 ‘TAAGTTGCACCTCAGAGTGCAAACA 3’. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση DNA. Τα κύτταρα ΗΕΚ-293FT και τα κύτταρα HCT116 σπάρθηκαν σε πλάκες 48 φρεατίων (2 χ 10

3 βιώσιμα κύτταρα ανά φρεάτιο). Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με psiCHECK ™ -2-PRL-1 3’UTR και psiCHECK ™ -2-mut-PRL-1 3’UTR σε συνδυασμό με ολιγονουκλεοτίδιο ελέγχου (τελική συγκέντρωση 80 ηΜ) ή μιμητικό (80 ηΜ) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το Luciferase Assay System Διπλή Reporter (Promega). δραστηριότητα λουσιφεράσης Firefly ομαλοποιήθηκε με renilla δραστηριότητας λουσιφεράσης για κάθε επιμολυσμένα καλά. Όλα τα πειράματα επιμόλυνσης πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκε 3 φορές ανεξάρτητα.

In vivo δοκιμασία ανάπτυξης όγκου

ηλικίας 4 έως 6 εβδομάδων αθυμικά γυμνά ποντίκια (Southern Medical Πειραματικό Κέντρο Ζώων, ανά) χρησιμοποιήθηκαν για εμφύτευση του όγκου. Όλα τα πειράματα σε ζώα αυστηρά τους κανονισμούς για τη διαχείριση των υποθέσεων Σχετικά με πειραματόζωα, η κινεζική εθνική κατευθυντήρια γραμμή για πειράματα σε ζώα, που εκδόθηκε το 1988. Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα ζώα και τη φροντίδα τους σε αυτή τη μελέτη εγκρίθηκαν και εκτελούνται από το Southern Medical University Θεσμικών Animal Care και Επιτροπή Χρήσης (Αριθμός άδειας: SCXK GUANGDONG 2.011 με 0.015). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό μέσο χωρίς ορό, και εναιωρούνται εκ νέου με 200 μΙ μέσου χωρίς ορό. Για την αξιολόγηση της ανάπτυξης του καρκίνου in vivo, 2 × 10

6 SW620 /pLVTHM-προ-miR339 και SW620 /pLVTHM-NC κύτταρα ανεξάρτητα εγχύθηκαν υποδορίως στο πίσω μέρος του 2 γυμνών ποντικών. Μετά ανιχνεύθηκαν όγκοι, το βάρος του ποντικιού και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκαν κάθε 5 ημέρες. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με ένα παχύμετρο ως μήκος Χ πλάτος

2 × 1/2. Ο μέσος όγκος του όγκου ± SD της κάθε ομάδας υπολογίστηκε. Όλοι οι ποντικοί θανατώθηκαν 20 ημέρες μετά την εμφύτευση. Συγκομιδής όγκοι απεικονίστηκαν αμέσως μετά τη θυσία. Στη συνέχεια, αυτά που σχηματίζονται όγκοι αφαιρέθηκαν, και ιστοί όγκου αναλύθηκαν με Η &?. Ε χρώση

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα όλων των πειραμάτων εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση SD από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα . τεστ Shapiro-Wilk χρησιμοποιήθηκε για να ελέγξει τη διανομή των κλινικών δειγμάτων ». Οι διαφορές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το μη παραμετρικό Mann-Whitney test-Wilcoxon. Για in vitro και in vivo μελέτες, t-test του Student ή ανάλυση διακύμανσης χρησιμοποιήθηκαν για να συγκριθούν οι τιμές των δειγμάτων δοκιμής και ελέγχου. Τα δεδομένα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν Ρ & lt?. 0.05 (

*)

Αποτελέσματα

MiR-339-5p ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου ιστών και κυττάρων γραμμές

Για να μελετηθεί η μορφή έκφρασης του miR-339-5p, εξετάσαμε την έκφραση του mRNA miR-339-5p σε 20 κόλον καρκινικούς ιστούς και ζεύγος αντιστοίχιση παρακείμενο φυσιολογικό κολονικό ιστούς τους χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου ποσοτικής RT-PCR (qRT-PCR) . Όπως φαίνεται στο (Σχήμα 1Α), miR-339-5p συχνά ρυθμίζεται προς τα κάτω τουλάχιστον διπλάσια σε ιστούς CRC (80%) σε σύγκριση με εκείνη στα ζεύγη γειτονικών μη ογκογόνους ιστούς. Επιπλέον, ανιχνεύσαμε την έκφραση του miR-339-5p σε έξι ανθρώπινο κολονικό κυτταρικές γραμμές καρκινώματος (δηλαδή HCT116, ΗΤ29, LS174T, SW480, SW620 και LOVO) με πραγματικού χρόνου ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης-PCR (RT-PCR) και βρέθηκε ότι υπάρχουν διαφορές στα επίπεδα του miR-339-5p mRNA επίσης υπάρχουσες μεταξύ των έξι ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών κόλον. Σημαντικά, miR-339-5p ήταν προς τα κάτω σε καρκινικές κυτταρικές σειρές SW620 και LOVO με υψηλότερη μεταστατική abilitity σύγκριση με HCT116, ΗΤ29, LS174T, SW480 με χαμηλότερη κυτταρική σειρά (Εικόνα 1Β).

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-339-5p εξετάστηκαν από qRT-PCR σε 30 ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου και του ζεύγους συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό παχέος ιστούς τους. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν ως προς U6 (* Ρ & lt? 0,05). ιστούς όγκων?: Τ Ν: παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης του ώριμου miR-339-5p ανιχνεύθηκαν με qRT-PCR σε έξι ανθρώπινο κολονικό κυτταρικές γραμμές καρκινώματος. Η σχετική έκφραση του miR-339-5p ομαλοποιήθηκε με την ενδογενή U6 ελέγχου. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν. Η σχετική miR-339-5p έκφραση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου ήταν πολύ χαμηλότερη από εκείνη των τριών μη-καρκινικές του παχέος ιστούς (Ν1, Ν2, Ν3 και). (* P & lt? 0,05).

Η

Επίδραση του miR-339-5p για την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή in vitro

Για να αξιολογηθεί η επίδραση του miR-339-5p στην ανάπτυξη των κυττάρων, ιδρύσαμε ένα SW620 σταθερό κλώνο για να αποκαταστήσει την έκφραση της προ-miR-339 στο SW620 καρκινικά κύτταρα, τα οποία είχαν χαμηλή ενδογενή miR-339-5p έκφρασης (Σχήμα S1). Και ελέγξαμε ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τη διανομή του κυτταρικού κύκλου και του σχηματισμού αποικιών. Με τη χρήση qRT-PCR, βρήκαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-339-5p αυξήθηκαν έως περίπου 30 πτυχές στο SW620 /pLVTHM-προ-miR-339 σε σύγκριση με τα κύτταρα SW620 /pLVTHM-NC (Σχήμα 2Α). Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, τα αποτελέσματα της δοκιμασίας CCK8 εμφανίζεται ότι η υπερέκφραση του miR-339-5p πολλαπλασιασμός ανέστειλε κύτταρο σε κύτταρο SW620 καρκίνου του παχέος εντέρου. Επιπλέον, η δοκιμασία σχηματισμού αποικίας διεξήχθη για να αξιολογηθεί η μακροπρόθεσμη επίδραση του miR-339-5p στην κυτταρική ανάπτυξη. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, SW620 /pLVTHM-προ-miR-339 κύτταρα σχηματίζονται πολύ λιγότερες αποικίες από τα κύτταρα SW620 /pLVTHM-NC. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι αύξηση του miR-339-5p κατέστειλε τον σχηματισμό αποικίας των κυττάρων SW620 κατά 34,5% (Σχήμα 2C). Προτείναμε ότι η μειωμένη πολλαπλασιασμός σε miR-339-5p υπερεκφράζει καρκινικά κύτταρα κόλου μπορεί να σχετίζεται με αλλαγμένη την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Η ανάλυση της κατανομής του κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι miR-339-5p κύτταρα που υπερεκφράζουν SW620 είχαν arreted στη φάση G1, με αντίστοιχη μείωση του ποσοστού των φάσεων S (Σχήμα 2D). Για να διερευνηθεί εάν miR-339-5p ρυθμίζει τη μετανάστευση CRC κυττάρων και εισβολής, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία φρεατίων για να καθοριστεί εάν miR-339-5p συμμετείχε στο κίνημα του παχέος εντέρου καρκίνο καρκινώματος κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Ε, SW620 /pLVTHM-προ-miR-339 κύτταρα παρουσίασαν απομείωση των μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητα (μειωμένη κατά 49,6% και 36,5%, αντίστοιχα, P & lt? 0,05). Αντιστρόφως, μετά επιμολύνθηκαν με αναστολέα miR-339-5p, miR-339-5p επίπεδα έκφρασης μετρήθηκαν σε HCT 116 κύτταρα (Σχήμα 3Α). Αυξημένη ιδιότητες πολλαπλασιασμό των HCT116 επιμολυσμένα με τον αναστολέα miR-339-5p ανιχνεύθηκαν επίσης με CCK-8 δοκιμασίας. Και αυτά τα επιμολυσμένα κύτταρα παρουσιάζονται αυξημένες πολλαπλασιαστική δυνατότητες σε σύγκριση με αρνητικό μάρτυρα (Σχήμα 3Β). Περαιτέρω, κυτταρικού κύκλου αναλύσεις έδειξαν μείωση των κυττάρων στην G1 φάση και ο αντίστοιχος αριθμός των κυττάρων αύξηση φάσεις S και G2 (Σχήμα 3C). Αντίστοιχα, ο αριθμός των μεταναστευτικών και μεταστατικών κυττάρων HCT116 επιμολυσμένα με τον αναστολέα miR-339-5p ήταν περισσότερο από ότι με τον αναστολέα ελέγχου, δείχνοντας προωθείται μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων HCT116 κατά 72% και 55% (Σχήμα 3D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-339-5p μπορεί να ελέγχει παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιασμού και του παχέος εντέρου κινητικότητα καρκινικών κυττάρων.

(Α) Η έκφραση του miR-339-5p ήταν ανάλυση σε κύτταρα SW620 μολυνθεί με PLVTHM-NC ή pLVTHM -Προ-miR-339 από qRT-PCR (* P & lt? 0,05). (Β) Η ζωτικότητα των κυττάρων που έχουν μολυνθεί με PLVTHM-NC ή pLVTHM-προ-miR-339 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό CCK-8. Οι τιμές στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία δόθηκαν ως μέση απορρόφηση με ένα SD πέντε φρεάτια (* Ρ & lt? 0,05). (C) Επιπτώσεις του miR-339-5p σε κυτταρικό κύκλο των κυττάρων SW620. Το ποσοστό των κυττάρων στην G1, S, G2 και φάσεις φαίνεται στο αριστερό πλαίσιο. Και η στατιστική ανάλυση παρουσιάζεται επίσης στο δεξί πλαίσιο. (Δ) Οι αποικίες που σχηματίζονται από PLVTHM-NC ή pLVTHM-προ-miR-339 μολυσμένα κύτταρα SW620 δείχθηκαν 2 εβδομάδες μετά την επίστρωση. Δεξιός πίνακας έδειξε την ποσοτικοποίηση της σχετικής σχηματισμό αποικίας σε PLVTHM-NC έναντι pLVTHM-προ-miR-339-μολυσμένα κύτταρα. Οι τιμές είναι οι μέσες ± SD πειραμάτων εις τριπλούν (* Ρ & lt? 0,05). δοκιμασίας (Ε) Transwell χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων SW620 μολυνθεί με PLVTHM-NC ή pLVTHM-προ-miR-339. Εκπρόσωπος τομείς της μετανάστευσης (κορυφή) ή επεμβατικές κύτταρα (κάτω) για μεμβράνη (αριστερά) (Αρχική μεγέθυνση: × 200). Μέσος αριθμός επεμβατικών ή μετανάστευσης αριθμός κυττάρων ανά πεδίο από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± πρότυπο (* P & lt? 0,05).

Η

(Α) Η expresson του miR-339-5p έγινε ανάλυση σε κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με αναστολέας miR-339-5p ή αρνητικό έλεγχο από qRT-PCR. (* P & lt? 0,05). (Β) Η ζωτικότητα των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με τον αναστολέα miR-339-5p ή αρνητικό μάρτυρα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό CCK-8. Οι τιμές στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία δόθηκαν ως μέση απορρόφηση με ένα SD πέντε φρεάτια (* Ρ & lt? 0,05). (C) Επιπτώσεις του miR-339-5p σε κυτταρικό κύκλο των κυττάρων HCT116. Το ποσοστό των κυττάρων στην G1, S, G2 και φάσεις φαίνεται στο αριστερό πλαίσιο. Και η στατιστική ανάλυση παρουσιάζεται επίσης στο δεξί πλαίσιο. δοκιμασία (D) Transwell χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων HCT116 επιμολυσμένα με αναστολέα miR-339-5p ή αρνητικό μάρτυρα. Εκπρόσωπος τομείς της μετανάστευσης (κορυφή) ή επεμβατικές κύτταρα (κάτω) για μεμβράνη (Αρχική μεγέθυνση: × 200). Μέσος αριθμός επεμβατικών ή μετανάστευσης κυττάρων αριθμό ανά πεδίο από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± πρότυπο (* P & lt? 0,05).

Η

PRL-1 είναι ένα λειτουργικό στόχο για miR-339-5p στα κύτταρα CRC

Οι στόχοι miRNA προβλέψει ελήφθησαν από στόχοι miRBase, TargetScan Release 5.0 και PicTar, το σημείο τομής των τριών τόπων συνιστάται PRL-1 ήταν ένας μεταγενέστερος στόχος του miR-339-5p. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η πιθανή σχέση μεταξύ miR-339-5p και κατάντη γονίδιο PRL-1, μπορούμε περαιτέρω να ανιχνεύεται το επίπεδο έκφρασης PRL-1 σε πρωτογενείς ιστούς όγκου CRC στα ίδια δείγματα που αναφέρονται στο προηγούμενο πείραμα με qRT-PCR (Εικόνα S2). Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι ο ελαφρώς μειωθεί σε PRL-1 έκφραση σε δείγματα ιστών από nontumorous κόλον. Η έκφραση του PRL-1 προσδιορίστηκε περαιτέρω σε κολικό κυτταρικές γραμμές καρκινώματος HCT116, ΗΤ29, LS174T, SW480, SW620 και LOVO (Σχήμα 1Β). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε απέναντι συσχέτιση μεταξύ miR-339-5p και PRL-1 (επίπεδα mRNA) στα κύτταρα του παχέος εντέρου καρκίνωμα. Δραστικότερος επιβεβαιώνουν τη δυνατότητα κατασταλτική δράση του miR-339-5p για PRL-1, επιμολύναμε προ-miR-339 σε SW620 κύτταρα. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι miR-339-5p κατέστειλε PRL-1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε SW620 /pLVTHM-προ-miR-339 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα SW620 /pLVTHM-NC (Ρ & lt? 0,05) (4C Σχήμα 4Β, Σχ.). Αποτελούμενο με αποτέλεσμα, τόσο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης του PRL-1 ήταν πάνω ρυθμισμένα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με το miR-339-5p αναστολέα σε σύγκριση με τον αναστολέα ελέγχου (Ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 4Β, το Σχήμα 4C). Για να διευκρινιστεί αν miR-339-5p αλληλεπιδρά άμεσα με 3′-UTR περιοχή των γονιδίων στόχων (PRL-1) πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς λουσιφεράσης ανταποκριτή. Βρήκαμε ότι το miR-339-5p στοχεύει ακολουθία στο nt739-745 της PRL-1 3′-UTR. Ένα πλασμίδιο ρεπόρτερ οδηγείται από τον υποκινητή SV, συμπεριλαμβανομένου του 519 nt-άγριου-τύπου-3′-UTR του PRL-1 κλωνοποιήθηκε. Τότε θα κλωνοποιηθεί ένα άλλο κατασκεύασμα ανταποκριτή στην οποία ήταν ειδικά μεταλλαχθεί η συντηρημένη περιοχή στόχευσης του miR-339-5p μέσα nt739-745. Εμείς συνεπιμόλυνση miR-339-5p μιμείται και κατασκευάσματα αναφοράς της λουσιφεράσης που περιέχει άγριου τύπου (Σχήμα 4D) ή μεταλλαγμένο (Σχήμα 4D) PRL-1 3′-UTR. Η δραστικότητα λουσιφεράσης δραματικά μειώθηκαν κατά περίπου 50% παρουσία του miR-339-5p σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο miRNA του (Σχήμα 4Ε). Σε αντίθεση, miR-339-5p δεν μετέβαλε δραστικότητα της μεταλλαγμένης PRL-1 ανταποκριτού λουσιφεράσης (Σχήμα 4Ε), υποδεικνύοντας miR-339-5p δρουν ειδικά στα άγριου τύπου PRL-1 3′-UTR. Βρήκαμε επίσης ότι η αναστολή του miR-339-5p απορυθμίζεται την έκφραση PRL-1 και βελτίωσε τις p-Erk1 2 επίπεδα /. Ενώ αποκατάσταση της έκφρασης του miR-339-5p μπορεί να αναστέλλει την έκφραση του PRL-1 και ρ-Erk1 /2 (Σχήμα 5).

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης του PRL-1 ανιχνεύτηκαν με qRT-PCR σε έξι ανθρώπινο κολονικό κυτταρικές γραμμές καρκινώματος. Η σχετική έκφραση του PRL-1 κανονικοποιήθηκε προς το ενδογενές GAPDH ελέγχου. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν (* Ρ & lt? 0,05). (Β) Η έκφραση του PRL-1 ήταν ανάλυση σε κύτταρα μολυσμένα με SW620 PLVTHM-NC ή pLVTHM-προ-miR-339 με qRT-PCR (* Ρ & lt? 0,05) (αριστερά). Η έκφραση του PRL-1 ήταν ανάλυση σε κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με αναστολέα miR-339-5p ή αρνητικό μάρτυρα με qRT-PCR (* Ρ & lt? 0,05) (δεξιά). (Γ) Τα επίπεδα έκφρασης PRL-1 ανιχνεύτηκαν χρησιμοποιώντας Western blot. (Δ) Μια σχηματική απεικόνιση της βάσης φλούδι μεταξύ miR-339-5p και την 3’UTR της PRL-1. Υποκατάσταση επτά διαδοχικές βάσεις (GTCAAAG να ACAGGGA) στο 3’UTR του PRL-1 για το κατασκεύασμα μεταλλάγματος ανταποκριτή παρουσιάζεται επίσης. (Ε) Ανάλυση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης. 293 κύτταρα και κύτταρα HCT116 συν-επιμολύνθηκαν με psiCHECK ™ -2 λουσιφεράσης πλασμίδιο αναφοράς που περιέχει είτε άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο PRL-1 3′-UTR (υποδεικνύεται ως WT ή MUT επί του Χ-άξονα), και είτε το miR-339-5p μιμείται ή μιμείται NC. Η δράση φωτοφεράσης προσδιορίστηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla κάθε δείγματος ομαλοποιήθηκε με δραστικότητα λουσιφεράσης Firefly. Ο Υ-άξονας αντιπροσωπεύει τη σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα (* Ρ & lt? 0,05).

Η

(Α) Τα επίπεδα πρωτεΐνης του Erk1 /2 και φωσφόρου Erk1 /2 ανιχνεύθηκαν με Western Blot μετά την επιμόλυνση για 48 ώρες. β-tublin χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

MiR-339-5p αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου in vivo

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το ρόλο του miR-339-5p στην ανάπτυξη του όγκου σε vivo, SW620 /pLVTHM-προ-miR-339 κύτταρα ή SW620 κύτταρα /pLVTHM ενέθηκαν υποδορίως στον κενό γυμνών ποντικών, αντίστοιχα, σε γυμνά ποντίκια. Ο ρυθμός ανάπτυξης όγκου των /pLVTHM-προ-miR-339 κύτταρα SW620 ήταν βραδύτερη από εκείνη των κυττάρων SW620 /pLVTHM (Σχήμα 6Α). 3 εβδομάδες μετά την ένεση. SW620 /pLVTHM-προ-miR-339 κύτταρα σχηματίζονται μικρότερους όγκους από τα κύτταρα SW620 /pLVTHM-NC in vivo και μέσο όγκο τους ήταν ~36.9% της ομάδας ελέγχου την ημέρα 20 (Ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 6Β, το Σχήμα 6C). Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες της H & amp? Οι Ε χρώση των πρωτογενών ιστών του καρκίνου προχώρησε. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν miR-339-5p έχει δυνατότητες ως νέου καταστολέας των όγκων που μπορεί να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου (Σχήμα 6D).

(Α) Σε όλες, 2 × 10

6 SW620 /pLVTHM-NC και τα κύτταρα SW620 /pLVTHM-προ-miR339 έγιναν ανεξάρτητα εγχέεται στο πίσω μέρος του 2 γυμνών ποντικών. Τα μεγέθη των όγκων μετρήθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία μέχρι την ημέρα 20, όταν σκοτώθηκαν ποντίκια. Το μέσο μέγεθος των όγκων ανά ζώο απεικονίστηκε γραφικά (* Ρ & lt? 0,05). (Β) Οι εξωτερικές εικόνες σε ολόκληρο το σώμα του SW620 /pLVTHM -ΝΟ και SW620 /pLVTHM-προ-miR-339 κύτταρα ποντικιών και καρκίνους ελήφθησαν 20 ημέρες μετά την ένεση. (C) η αναγέννηση του υποδόριου όγκου από SW620 /pLVTHM-NC και τα κύτταρα SW620 /pLVTHM-προ-miR-339. (Δ) Εκπρόσωπος φωτογραφίες του H & amp? Οι Ε χρώση των πρωτογενών ιστών καρκίνου εμφανίζονται (μεγέθυνση, χ 200)

Η

Συζήτηση

Συσσωρευμένα μελέτες έχουν αποκαλύψει microRNAs μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη του όγκου, εισβολή. , αγγειογένεση και μετάσταση σε αιματολογικές malignances και συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων του ορθοκολικού καρκίνου. Σε μια πρόσφατη μελέτη, έχει αναφερθεί ότι το miR-339-5p μπορεί να είναι ασυνήθιστα κάτω-ρυθμίζονται σε ιστό καρκίνο του παχέος εντέρου με τη χρήση νέων εργαλείων διαλογής microRNA. Ωστόσο, λίγες μελέτες είναι διαθέσιμες σχετικά με τις λειτουργίες του σε καρκίνο του παχέος εντέρου.