Αφηρημένο

καρκίνωμα του στόματος πλακωδών κυττάρων (OSCC) των ασθενών διαγιγνώσκεται σε προχωρημένα στάδια έχουν περιορισμένες επιλογές χημειοθεραπευτικά υπογραμμίζοντας την μεγάλη ανάγκη για την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών παραγόντων για πιο αποτελεσματική διαχείριση της νόσου. Επιδιώξαμε να διερευνηθεί η αντικαρκινική δυναμικό των Apaziquone, [EOquin, USAN, Ε09, 3-υδροξυ-5- αζιριδινυλ-1-μεθυλο-2 (1Η-ινδολο-4,7-διόνη) -προπ-β-εν-α- ολ], ένα προ-φάρμακο που ανήκει σε μία κατηγορία αντικαρκινικών παραγόντων ονομάζεται βιοαναγωγικά αλκυλιωτικούς παράγοντες, για OSCC. επεξεργασία Apaziquone πολλαπλασιασμό ανέστειλε κυττάρων και επαγόμενη απόπτωση στα κύτταρα OSCC

in vitro

. αντιμετωπίζονται Apaziquone κύτταρα OSCC έδειξαν αυξημένη ενεργοποίηση της κασπάσης 9 και κασπάσης 3, και πολυ (ADP ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) διάσπαση υποδηλώνοντας επαγωγή απόπτωσης από apaziquone σε στοματική καρκινικά κύτταρα. Σημαντικά, η θεραπεία apaziquone μείωσε σημαντικά το στόμα όγκο ξενομοσχεύματος όγκου σε ανοσοκατεσταλμένους NOD /SCID ποντίκια /Crl χωρίς να προκαλεί εμφανή τοξικότητα σε κανονικούς ιστούς. Εν κατακλείδι, μας

in vitro

και

in vivo

μελέτες εντοπίζονται και να αποδείξει την προ-κλινική αποτελεσματικότητα της Apaziquone, ως μια πιθανή νέα αντικαρκινικά θεραπευτικά υποψήφιος για στοματική διαχείριση του καρκίνου.

Παράθεση: Srivastava G, Somasundaram RT, Walfish PG, Ralhan Ε (2015) αντικαρκινική δράση Apaziquone στην Προφορική καρκινικά κύτταρα και μοντέλο ξενομοσχεύματος: Συνέπειες για τον καρκίνο του στόματος θεραπεία. PLoS ONE 10 (7): e0133735. doi: 10.1371 /journal.pone.0133735

Επιμέλεια: Πέι-Yi Chu, Ιατρική Σχολή, Fu Jen Καθολικό Πανεπιστήμιο, Ταϊβάν

Ελήφθη: 6 του Φεβρουαρίου του 2015? Αποδεκτές: 30 του Ιούνη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 24 Ιουλίου 2015

Copyright: © 2015 Srivastava et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η οικονομική στήριξη του έργου αυτού δόθηκε από Spectrum Pharmaceuticals Inc. (Irvine, CA). Οι χρηματοδότες ενέκρινε το σχεδιασμό της μελέτης, αλλά δεν είχε κανένα ρόλο στη συλλογή και ανάλυση δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγγραφείς εκφράζουν την ευγνωμοσύνη αναγνωρίζουν τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας για καρέκλα σε προχωρημένο καρκίνο του Diagnostics (RR), και ο Άλεξ και η Simona Shnaider πρόεδρος στον καρκίνο του θυρεοειδούς (PGW)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. PGW και RR είναι μέτοχοι σε Proteocyte Diagnostics Inc. Επιπλέον, η χρηματοδοτική στήριξη του έργου αυτού δόθηκε από Spectrum Pharmaceuticals Inc. (Irvine, CA). Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Στοματική ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (OSCC) περιλαμβάνουν ένα μεγάλο ποσοστό του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου λογιστικών για την κατ ‘εκτίμηση 263.000 νέες περιπτώσεις και περίπου 127.000 θανάτους παγκοσμίως κάθε χρόνο [1]. Πρώιμου σταδίου (I και II) ασθενείς OSCC αντιμετωπίζονται με χειρουργική επέμβαση ή /και ακτινοθεραπεία, και να έχουν τα ποσοστά πενταετούς επιβίωσης 70% – 90% [2-4]. Ωστόσο, τα δύο τρίτα των ασθενών που πάσχουν από OSCC τοπική-περιοχική προχωρημένη νόσο (στάδιο III και IV) κατά τη στιγμή της διάγνωσης. υπάρχει ανεπαρκής δεδομένα από τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες για να καθορίσουν την βέλτιστη στρατηγική για τους ασθενείς με τα στάδια III και IV OSCC. Οι ασθενείς με προχωρημένο ή υποτροπή της νόσου έχουν περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές και κακή πρόγνωση (5-ετή επιβίωση & lt? 50%) [5]. Πρωτοβάθμια χειρουργική επέμβαση και οριστική θεραπεία ακτινοβολίας είναι οι επιλογές για τους ασθενείς OSCC? τόσο χειρουργική επέμβαση και η ακτινοθεραπεία μπορεί να έχει βαθιά επίδραση στην ποιότητα ζωής των επιζώντων [6, 7].

Τα τελευταία χρόνια, η εφαρμογή των ταυτόχρονων χημειο-ακτινοβολία έχει αναδειχθεί ως μια ελκυστική εναλλακτική λύση στις παραδοσιακές χειρουργική αντιμετώπιση της προηγμένη OSCC [8-10]. Αξίζει να σημειωθεί ότι η χημειοθεραπεία έχει εξελιχθεί από την παρηγορητική φροντίδα σε ένα κεντρικό συστατικό της θεραπευτικής αγωγής για τοπικά προχωρημένο OSCC. Σισπλατίνη, καρβοπλατίνη, μεθοτρεξάτη και ταξάνες είναι ενεργοί ως απλούς παράγοντες ή σε συνδυασμό με υποτροπιάζοντα ή μεταστατικό OSCC [3, 11-14]. Ωστόσο, περιοριστικές της δόσης τοξικότητες σε ασθενείς με καρκίνο περιορίζουν την κλινική τους χρησιμότητα. Προς το παρόν, δεν υπάρχει καθιερωμένο σχήμα χημειοθεραπείας δεύτερης γραμμής για τη θεραπεία του υποτροπιάζοντα ή μεταστατικό OSCCs. Monotargeted θεραπείες, όπως οι αναστολείς του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3), πυρηνικό παράγοντα κάππα Β (ΝΡκΒ), και θηλαστικών στόχος ραπαμυκίνης (mTOR) έδειξαν περιορισμένη αποτελεσματικότητα [15-18 ]. Έτσι υπάρχει μεγάλη ανάγκη για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων για τον καρκίνο του στόματος. Ωστόσο, η ανακάλυψη νέων ενώσεων με ισχυρή αντικαρκινική δράση είναι μια μακρά και δαπανηρή διαδικασία. Μια εναλλακτική προσέγγιση είναι η εκμετάλλευση της ήδη εγκατεστημένος φάρμακα που έχουν εγκριθεί για κλινική χρήση για άλλους καρκίνους.

Apaziquone [EOquin, USAN, Ε09, 3-υδροξυ-5- αζιριδινυλ-1-μεθυλο-2 (1Η -ινδολο-4,7-διόνη) -prop- β-εν-α-όλη] είναι ένα προ-φάρμακο που ανήκει σε μια κατηγορία παραγόντων κατά του καρκίνου που ονομάζεται βιοαναγωγικά παράγοντες alkylaing που έχει υποστεί εκτεταμένη κλινική αξιολόγηση για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [19] . Apaziquone ενεργοποιείται από διάφορα ένζυμα, το ένζυμο πιο ευρέως η έρευνα, είναι ΝΑΟ (Ρ) Η: κινόνη οξειδορεδουκτάσης 1 (NQO1) ή ϋΤ-διαφοράση, η οποία μειώνει apaziquone σε έναν παράγοντα DNA-αλκυλίωση [19]. Εδώ στην ερευνήσαμε την πιθανή αντινεοπλασματική δραστικότητα των Apaziquone στο

in vitro

και

in vivo

μοντέλα του καρκίνου του στόματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και κυτταρικές καλλιέργειες

Στοματική πλακώδες καρκίνωμα κυτταρική σειρά AMOS ΙΙΙ, έχει καθιερωθεί από το ινδοκάρυδο και συνδέονται καπνού ανθρώπινη OSCC από το εργαστήριο μας [20]. AMOS III χρησιμοποιήθηκε ως

in vitro

και

in vivo

πειραματικό μοντέλο για τον καρκίνο του στόματος σε αυτή τη μελέτη. Άλλες εγκατεστημένος OSCC κυτταρική γραμμή, SCC4, έχει χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση της ευρύτερης εφαρμογής των apaziquone για δυνητικούς στόματος θεραπεία του καρκίνου του OSCC. Μη μεταστατικό καρκίνο του στόματος κυτταρική γραμμή, SCC4, ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC). Στοματική καρκινικά κύτταρα (AMOS III /SCC4) καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagles Medium (DMEM) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 1 mmol /L Ε-γλουταμίνη, και πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (1Χ) σε υγροποιημένο επωαστή (5 % διοξείδιο του άνθρακα, 95% αέρας) στους 37 ° C όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20-22]. Τόσο οι κυτταρικές σειρές που έχουν δοκιμαστεί με χρήση ανάλυσης σύντομο διαδοχική επανάληψη πολυμορφισμό και γίνονται συνήθως πολλαπλασιάζονται στο εργαστήριο μας.

In vitro κυττάρων πολλαπλασιασμό /δοκιμασία κυτταροτοξικότητας (ΜΤΤ δοκιμασία)

Η ικανότητα του apaziquone να επάγουν κυτταροτοξικά αποτελέσματα προσδιορίστηκε με την μετατροπή του 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) προς φορμαζάνη από μιτοχονδριακές αφυδρογονάσες. Στοματική καρκινικά κύτταρα (AMOS III και SCC4) τοποθετήθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πλήρες μέσο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί μία νύκτα να προσκολληθούν και στη συνέχεια εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις των apaziquone [5 ηΜ έως 100 μΜ] για 24 έως 96 ώρες για να καθορίσει τη δόση και χρονο-εξαρτώμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με προσθήκη ΜΤΤ στα κύτταρα. Εν συντομία, το ΜΤΤ διαλύθηκε σε στείρο PBS και προστέθηκαν στα φρεάτια σε τελική συγκέντρωση 1,5 mM. Τα κύτταρα θα επωάζονται με ΜΤΤ επί 4 ώρες, μέσα απομακρύνθηκαν και οι υπόλοιποι κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε DMSO. Η απορρόφηση του διαλυτοποιημένου φορμαζάνης μετρήθηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο σάρωσης πολλαπλών φρεατίων. Το ποσοστό αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων υπολογίστηκε σε κάθε χρονικό σημείο και δόση ως εξής: (Α

έλεγχος – A

επεξεργασία /A

έλεγχος) × 100.

In vitro LD

50 μετρήσεις για apaziquone

για τον προσδιορισμό της δραστικότητας της apaziquone να προκαλούν κυτταρικό θάνατο του στόματος καρκινικών κυττάρων, LD της

50 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον καρκίνο του στόματος κύτταρα AMOS III και κύτταρα SCC4. Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του apaziquone που απαιτείται για να σκοτώσει το 50% των κυττάρων (LD

50), 5000 κύτταρα της κάθε κυτταρικής σειράς καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν σε μηδέν ιστοκαλλιέργεια φθορισμού αγωγή πλάκες των 96 φρεατίων (Βϋ Biosciences, Mississuaga, ΟΝ, Καναδάς ). Μετά από ολονύκτια επώαση, το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο που περιέχει apaziquone σε ένα εύρος συγκέντρωσης 5 ηΜ to100μM. Μετά από 48 ώρες, το Alamar Μπλε δοκιμασία εκτελέστηκε για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Για να επαληθεύσουν τα αποτελέσματα των δοκιμασιών βιωσιμότητας κυττάρου, διπλή χρώση αννεξίνης V και ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) ήταν χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση της απόπτωσης. κύτταρα AMOS III είτε σε επεξεργασία με όχημα μόνο ή apaziquone στα 500 nm για 48 ώρες. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με συζυγές αννεξίνης V-FITC και ΡΙ χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας αννεξίνης V σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Sigma, St Louis, ΜΟ) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το BD Cell Quest λογισμικό Pro. Αυτά τα αποτελέσματα περαιτέρω επαληθευτεί χρησιμοποιώντας ανάλυση Western blot για συγκεκριμένες κασπάσες και Πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) δοκιμασία.

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής

Το καλλιεργημένο μέσων από μη επεξεργασμένο, όχημα ελέγχου και κυττάρων AMOS III αγωγή apaziquone συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν για τη συλλογή μη προσκολλημένα κύτταρα. Τα προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS (ρΗ 7.4) και επεξεργασία με θρυψίνη. Και οι δύο μη-προσκολλημένα και προσκολλημένα κυτταρικών πληθυσμών ομαδοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη (-20 ° C, όλη τη νύκτα) και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει PBS (ρΗ 7.4), EDTA (0,5 mol /L, ρΗ 8,0), Triton Χ-100 (0,05%), RNase Α ( 50 μg /mL), και ΡΙ (100 μg /mL) πριν από την ανάλυση με κυτταρομετρία ροής.

δοκιμασία TUNEL

δοκιμασία TUNEL εκτελέσθηκε ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Apaziquone επεξεργασμένα και τα κύτταρα ελέγχου φορέα AMOS III συλλέχθηκαν όπως περιγράφηκε παραπάνω. Επισήμανση και δοκιμασία διεξήχθη ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν περαιτέρω χρησιμοποιώντας μικροσκοπία σάρωσης συνεστιακού λέιζερ.

In vivo

αντικαρκινική δραστικότητα του Apaziquone στο μοντέλο ξενομοσχεύματος ανθρώπινου καρκινώματος πλακωδών κυττάρων του στόματος

αυτή η

in vivo

μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας ζώων του Mount Sinai Hospital πριν από την έναρξη και ζώων φροντίδα έγινε σύμφωνα με το Τορόντο κέντρο της Phenogenomics (TCP) κατευθυντήριες γραμμές για να εξετάσει το την καλή διαβίωση των ζώων και την ελαχιστοποίηση του κινδύνου. Μία προκλινική μελέτη διεξήχθη για να συγκριθεί η αποτελεσματικότητα διαφόρων συγκεντρώσεων apaziquone και ελέγχου του οχήματος σε ένα ζωικό μοντέλο της ανθρώπινης στοματικής SCC. Η πιο αποτελεσματική συγκέντρωση προκαθορισμένο /δόση apaziquone ελήφθη εμπρός για

in vivo

δοκιμές σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού καρκίνου του στόματος. Δύο μηνών αρσενικό ανοσοποιητικό-διακυβεύεται NOD /SCID /CRL # 394 ποντίκια ήταν υποδορίως (sc) εμφυτεύονται με 1 x 10

6 καρκινικών κυττάρων σε μέσο ελεύθερο ορού στην περιοχή πλευρά για τη δημιουργία όγκων, σε συμμόρφωση με τις οδηγίες φροντίδας των θεσμικών ζώων . Όταν οι όγκοι έφθασαν σε μέγεθος περίπου 100-200 mm

3, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες (n = 6 /ομάδα) ανάλογα με τον όγκο του όγκου και τα σωματικά βάρη για τις ακόλουθες επεξεργασίες: το μη επεξεργασμένο μάρτυρα φορέα (0,1% DMSO -Ν = 6) και apaziquone σκέλος θεραπείας της μελέτης (n = 6). Στο σκέλος apaziquone της μελέτης, τα ποντίκια που φέρουν τους όγκους έλαβαν ενδοπεριτοναϊκή ενσταλάξεις apaziquone στα 0,1 mg /kg σωματικού βάρους ή ελέγχου του οχήματος κατά 0,1% DMSO 8 εβδομάδες μετά την εμφύτευση του όγκου. Η φαρμακευτική θεραπεία συνεχίστηκε για 6 εβδομάδες. Tumor συχνότητα, τον όγκο του όγκου, το βάρος και τη γενική και μέση επιβίωση των ζώων που καταγράφηκαν. Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα για οποιαδήποτε σημάδια και τα συμπτώματα. Κατά την ολοκλήρωση της μελέτης, συλλέχθηκε αίμα από την σαφηνούς φλέβας των ποντικών για μια πλήρη ανάλυση αίματος και οργάνων δοκιμή λειτουργίας πριν από την αναισθησία. Τα ποντίκια στη συνέχεια ευθανασία με αυχενική εξάρθρωση ή και νωρίτερα εάν οι όγκοι ξεπέρασε το 20% μάζας σώματος ή /και εάν τα ποντίκια εμφάνισαν κλινικά συμπτώματα της ωχρότητα, καμπούρα, δύσπνοια και μη φυσιολογική κίνηση. Μετά ευθανασία, τα όργανα συλλέχθηκαν και αμέσως σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε. Οι όγκοι στη συνέχεια συλλέχθηκαν και μία πρόσθια-οπίσθια μέσης γραμμής πρόσωπο-cut φέτα του όγκου καθορίστηκε σε φορμαλίνη. Η περιφέρεια του όγκου και το κέντρο ήταν σε κύβους και φλας καταψύχθηκε σε υγρό άζωτο σε ξεχωριστά φιαλίδια. Κί67 ανοσοϊστοχημεία (IHC) πραγματοποιείται με τη χρησιμοποίηση τομών ιστού FFPE (πάχος 4 μm) των όγκων από ξενομοσχεύματα ομάδα ποντικών apaziquone αγωγή και τον έλεγχο του οχήματος ακολουθώντας τη διαδικασία όπως περιγράφεται από εμάς παλαιότερα [23]. Τα πλακίδια επωάστηκαν με αντι-Κί67 αντίσωμα σε αραίωση 1: 100 (Abcam, Cedarlane Labs, Burlington, ΟΝ, Καναδάς) για 1 ώρα και δευτερογενές αντίσωμα κουνελιού για 20 λεπτά, που ακολουθείται από αντιδραστήριο Vectastain Elite ABC (Vector Labs, Burlingame, CA) χρησιμοποιώντας διαμινοβενζιδίνη ως χρωμογόνο. Στις αρνητικές τομές ιστών ελέγχου, το πρωτογενές αντίσωμα αντικαταστάθηκε με ισότυπο ειδικού μη-άνοσο ποντικό /IgG κουνελιού. Οι τομές αξιολογήθηκαν με φως μικροσκοπική εξέταση. Αιματοξυλίνη & amp? Ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση πραγματοποιήθηκε επίσης σε τμήματα των όγκων ξενομοσχεύματος ποντικού εμπεδωθεί με παραφίνη

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων διεξήχθη με τη χρήση του λογισμικού SPSS 20.0 (Chicago).. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t-test ζεύγη δύο ουρά Student. Μια πιθανότητα p ≤ 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική. Αυτά

in vitro μελέτες

καθόρισε το LD

50 apaziquone που χρησιμοποιήθηκε για την καθοδήγηση της δόσης του apaziquone να χρησιμοποιηθούν στις

in vivo

μελέτες και να καθορίσει την κατάσταση του κυτταρικού θανάτου σε τον καρκίνο του στόματος κύτταρα.

Αποτελέσματα

Επίδραση των apaziquone για τον καρκίνο του στόματος κύτταρα

Οι καμπύλες δόσης-απόκρισης apaziquone στα κύτταρα AMOS III και SCC4 φαίνεται στο σχήμα 1. Η LD

50 από apaziquone σε AMOS III και SCC4 κύτταρα ήταν 500 ηΜ και 1 μΜ, αντίστοιχα (Εικόνα 1).

Alamar blue δοκιμασία εκτελέστηκε για να προσδιοριστεί η LD

50 apaziquone σε AMOS III, και SCC4 κύτταρα.

η

η ανάλυση έκφρασης των αποπτωτικών πρωτεϊνών με κηλίδωση Western

Εκχυλίσματα πρωτεϊνών από μη επεξεργασμένο και apaziquone επεξεργασμένα κύτταρα AMOS ΙΙΙ αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Western blot για PARP, κασπάση 9 και κασπάσης 3. με την αύξηση της δόσης του Apaziquone έκφραση της πλήρους μήκους κασπάση 9 πρωτεΐνη μειώθηκε και η διασπασμένη κασπάση 9 αυξήθηκε, ενώ η έκφραση της διασπασμένης ΡΑΚΡ και διασπασμένη κασπάση 3 αυξήθηκε. (Σχήμα 2Α και S1 σχήμα) και παρόμοια επίδραση της Apaziquone παρατηρήθηκε σε SCC4 κύτταρα επί αυτών των πρωτεϊνών (Σχήμα 2Β και S1 Σχήμα), επιβεβαιώνοντας την επαγωγή απόπτωσης με κατεργασία apaziquone σε αμφότερες στοματική καρκινικές κυτταρικές σειρές.

Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών σε κυτταρικά εκχυλίσματα ελεύθερα παρασκευάζονται από AMOS III και τα κύτταρα SCC4 αγωγή με διαφορετικές δόσεις του Apaziquone (250ηΜ, 500ηΜ και 1 μΜ) και μη επεξεργασμένων, καθώς και κύτταρα ελέγχου έλαβαν όχημα αναλύθηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVP, ανιχνεύθηκαν με ειδικά αντισώματα και ανιχνεύτηκαν χρησιμοποιώντας ECL. Πάνελ show-κύτταρα (Α) AMOS III και (Β) κύτταρα SCC4. Μία δοσοεξαρτώμενη αύξηση διασπασμένης ΡΑΚΡ, διασπασμένη κασπάση 9 και διασπασμένη κασπάση 3 παρατηρήθηκε και στα δύο του στόματος καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Apaziquone επάγεται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο μετρήθηκαν με τη δοκιμασία της σήραγγας

δοκιμασία σήραγγας πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα AMOS III έδειξαν αυξημένη θραύσματα DNA στα Apaziquone επεξεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με μη επεξεργασμένο μάρτυρα φορέα επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3).

Apaziquone επεξεργασμένα κύτταρα AMOS III έδειξαν αυξημένη θραύσματα του DNA σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου φορέα που απεικονίζει αυξημένη απόπτωση σε κύτταρα κατεργασμένα φάρμακο.

Apaziquone επάγεται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο μετράται με Annexin V δοκιμασία

δοκιμασία αννεξίνης V πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα κατεργασμένα apaziquone AMOS III χρησιμοποιώντας FACS έδειξε σημαντική αύξηση στην πρώιμη και όψιμη απόπτωση σε Apaziquone κατεργασμένα κύτταρα (38%) σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο (5%) και τα κύτταρα ελέγχου θεραπεία με όχημα (8%) (Σχ 4Α).

(Α) Apaziquone κατεργασμένων κυττάρων AMOS III έδειξε σημαντική αύξηση στην πρώιμη και όψιμη απόπτωση (38%) σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα (5%) και όχημα κύτταρα ελέγχου (8%) με δοκιμασία αννεξίνης V. (Β) Apaziquone επεξεργασμένων κυττάρων AMOS III παρουσιάζουν σημαντικά υψηλότερο αριθμό των κυττάρων του Υπό G

o φάση και G

φάσεις 2Μ σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα κυττάρων AMOS ΙΙΙ.

Η

Apaziquone επαγόμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο μετρήθηκε με ανάλυση του κυτταρικού κύκλου

η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των apaziquone κατεργασμένων κυττάρων AMOS III έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό κυττάρων στο Υπό G

o και G

2Μ φάσεις σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο κύτταρα ελέγχου επιβεβαιώνοντας αυξημένη απόπτωση σε κύτταρα κατεργασμένα φάρμακο (Σχήμα 4Β).

In vivo

αντικαρκινική δραστικότητα του apaziquone

Ο

in vivo αντικαρκινική

δραστικότητα του apaziquone αξιολογήθηκε σε στοματική μοντέλα ξενομοσχεύματος καρκίνου σε ανοσοκατασταλμένους αρσενικά ποντίκια NOD /SCID /CRL # 394. Δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή στο σωματικό βάρος των ποντικών στην ομάδα που θεραπεύτηκε apaziquone ή ποντίκια ελέγχου του οχήματος χωρίς θεραπεία κατά τη διάρκεια των 42 ημερών της θεραπείας (Σχήμα 5Α). Η ανάπτυξη του όγκου καθυστέρησε σημαντικά από apaziquone (δόση 0,1 mg /kg) της θεραπείας κατά τη διάρκεια αυτής της χρονικής περιόδου. Αυτή η δόση επελέγη από την πιλοτική μελέτη που διεξήχθη χρησιμοποιώντας πολλαπλές δόσεις από 0,05 mg κυμαίνεται /kg έως 0,5 mg /kg σωματικού βάρους. Στην ομάδα θεραπείας, ο μέσος όγκος του όγκου ήταν 220,05 χιλιοστά

3 (SD-19.76) σε σύγκριση με τον μέσο όγκο του όγκου των 376,18 mm3 (SD-54.08) στην ομάδα ελέγχου φορέα χωρίς θεραπεία. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι η θεραπεία apaziquone καθυστερήσει την ανάπτυξη του όγκου σημαντικά (ρ τιμή & lt? 0.001, σε συνδυασμό two-tailed t-test του Student μεταξύ των κατεργασμένων και ακατέργαστων ομάδες? Σχήμα 5Β και 5Γ).

(Α) καμία σημαντική αλλαγή στην σωματικού βάρους παρατηρήθηκε σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή apaziquone ή των ποντικών ελέγχου του οχήματος κατά τη διάρκεια της θεραπείας. (Β) Επίδραση της θεραπείας apaziquone στο μέγεθος των όγκων σε ποντίκια. Αντιπροσωπευτικά εκτομή όγκων που απεικονίζει τη διαφορά στο μέγεθος των όγκων μεταξύ apaziquone αγωγή και ποντικών χωρίς θεραπεία ομάδα ελέγχου. (C) Επίδραση της θεραπείας Apaziquone στην καθυστέρηση της ανάπτυξης του όγκου. ξενομοσχεύματα όγκου αναπτύχθηκαν στα πλευρά του NOD /SCID ποντίκια /CRL χορηγήθηκαν με apaziquone (0,1 mg /kg σωματικού βάρους) ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις την εβδομάδα για 6 εβδομάδες. θεραπεία Apaziquone καθυστέρησαν την ανάπτυξη του όγκου σημαντικά (ρ τιμή & lt? 0.001, αντιστοιχισμένο δίπλευρη έλεγχος τ) στα ποντίκια που πήραν φάρμακο ομάδα σε σύγκριση με τους ποντικούς στα μη επεξεργασμένα ομάδες ελέγχου ή ελέγχου του οχήματος. (Δ) Η επίδραση της θεραπείας Apaziquone στα νεφρά και στο ήπαρ των ποντικών. Ιστολογία του ήπατος και των νεφρών τους ιστούς που λαμβάνονται κατά τη σύναψη του

in vivo

μελέτη. Τομές ιστού βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και εοσίνη (Η &? Ε). Ι: τμήμα του ήπατος μετά την αγωγή με τον έλεγχο του οχήματος. ii: Τμήμα του ήπατος μετά την αγωγή με apaziquone. iii: Τμήμα του νεφρού μετά την κατεργασία με τον έλεγχο του οχήματος. iv: Τμήμα του νεφρού μετά τη θεραπεία με apaziquone. Αριθ oncocytic νέκρωση ή ίνωση παρατηρήθηκε σε τόσο νεφρούς και το ήπαρ μετά την θεραπεία με apaziquone. v: Ki67 ανοσοχρώση IHC χρώση για Ki67 ανεπεξέργαστων ελέγχου στόματος όγκου ενότητα ξενομοσχεύματος ιστού δείχνει υψηλή πυρηνικών και vi: ξενομοσχεύματος αντιμετωπίζονται apaziquone δείχνει σημαντικά μειωμένη χρώση Ki67 στο ξενομόσχευμα ενότητα ιστό του όγκου αντιμετωπίζονται apaziquone (αρχική μεγέθυνση χ 200)

Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία apaziquone έδειξε μόνο λίγες παρενέργειες όπως μικρή απώλεια βάρους, καμπούρα εμφάνιση, βυθισμένα μάτια και μονομερείς καταρράκτη παρατηρήθηκε σε λίγα ποντίκια. Ωστόσο, το ακαθάριστο και μικροσκοπική (H & amp? Ε χρώση) εξέταση του ήπατος δεν έδειξε εμφανή σημάδια oncocytic νέκρωση ή ίνωση σε ποντίκια στην ομάδα θεραπεία apaziquone. Ομοίως, δεν μακροσκοπικές ή μικροσκοπικές αλλοιώσεις των νεφρών παρατηρήθηκαν σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με apaziquone. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν από τον παθολογοανατόμο (Σχήμα 5D).

Η ηπατική λειτουργία και τις δοκιμές λειτουργίας των νεφρών δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ποντικών στις ομάδες apaziquone θεραπεία και τον έλεγχο του οχήματος χωρίς θεραπεία. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω δεν υπήρξε τοξικότητα στην ομάδα θεραπείας apaziquone (S1 πίνακα). Ωστόσο, η γενική εξέταση αίματος έδειξε κάποιες διαφορές στον αριθμό των λευκών αιμοσφαιρίων (WBC) και του αριθμού των ουδετερόφιλων. Οι ποντικοί στην ομάδα που έλαβε αγωγή είχε apaziquone αυξημένους αριθμούς και στα δύο WBCs (μέση απαριθμήσεις 56,1 vs. 33.4) και ουδετερόφιλα (52.2 έναντι 29.7) σε σύγκριση με τα ποντίκια στην ομάδα ελέγχου οχήματος (S2 πίνακα).

Συζήτηση

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιοριστεί η δραστικότητα κατά του όγκου των apaziquone να διερευνήσει τις δυνατότητές της ως μια αποτελεσματική εναλλακτική λύση για τις σήμερα χρησιμοποιούμενες χημειοθεραπευτικούς παράγοντες για τη διαχείριση των ασθενών OSCC. Apaziquone είναι μια ινδόλη κινόνης προ-φάρμακο που ενεργοποιείται από κυτταρικούς DT- αναγωγάσες διαφοράση σε καλά οξυγονωμένο περιοχές των όγκων, ενώ κάτω από συνθήκες υποξίας apaziquone ενεργοποιείται από αναγωγάσες Κυτόχρωμα P450 [24]. Μετατροπή apaziquone να δραστικών μεταβολιτών με τη σειρά αλκυλιώνει το γενωμικό DNA και οδηγεί σε απόπτωση /κυτταρικό θάνατο. Apaziquone έχει δειχθεί ότι είναι δραστικές έναντι διαφόρων τύπων όγκων τόσο

in vitro

και

in vivo

συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος του παχέος εντέρου, το μελάνωμα, η νεφρική και μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα και του κεντρικού νευρικού κυτταρικές σειρές καρκίνου σύστημα [19, 25]. Apaziquone έδειξε επίσης σημαντικές αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα εναντίον αρκετών ποντικού και ανθρώπου συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων των ανθεκτικών γενικά MAC όγκων του παχέος εντέρου ποντικού και στομάχου, ωοθηκών και του μαστού ξενομοσχεύματα [26]. Apaziquone έχει ευρέως ερευνηθεί έναντι καρκίνο της ουροδόχου κύστεως δεν είναι μόνο προ-κλινικά αλλά πολλαπλές κλινικές μελέτες επίσης [27]. Για τις γνώσεις μας, η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη έκθεση σχετικά με τα αντικαρκινικά αποτελέσματα της apaziquone στον καρκίνο του στόματος.

Εδώ το έχουμε αποδείξει ότι apaziquone είναι ισχυρά δραστικό έναντι του στόματος καρκινικών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αύξηση κλάσμα των κυττάρων στην υπο-G

o-φάση προτείνοντας που προκαλείται apaziquone κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα OSCC του κυτταρικού κύκλου. Επιβεβαιώσαμε την απόπτωση ως κύρια αιτία για την αύξηση του κυτταρικού θανάτου σε apaziquone επεξεργασμένα κύτταρα AMOS III OSCC χρήση του προσδιορισμού αννεξίνης V. Τα ευρήματά μας ήταν ενισχύεται περαιτέρω από τα αυξημένα επίπεδα της κατακερματισμένης PARP (ένζυμο επιδιόρθωσης του DNA), μετά τη διάσπαση της κασπάσης 9, γεγονός που υποδηλώνει την ενεργοποίηση της απόπτωσης σε apaziquone επεξεργασμένα κύτταρα OSCC.

Προς στήριξη της μας

in vitro

δεδομένα που καταδεικνύουν την αποτελεσματικότητα του apaziquone ως νέο φάρμακο για OSCC,

in vivo μελέτες

ξενομοσχεύματος ποντικού αποκάλυψε αξιοσημείωτα μειωμένη ανάπτυξη του όγκου με μικρή απώλεια βάρους σε ζώα που έλαβαν αγωγή apaziquone σε σύγκριση με την ομάδα των ζώων ελέγχου του οχήματος. Οι όγκοι που πήραν φάρμακο έδειξαν σημαντικά μειωμένη έκφραση του δείκτη πολλαπλασιασμού, Ki67, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα ελέγχου όγκων με ανοσοϊστοχημεία αποδεικνύοντας ότι η θεραπεία apaziquone μειωμένη πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

in vivo

. Επιπλέον, τα δείγματα ορών για κλινικά προφίλ χημείας, αιματολογίας και δοκιμές λειτουργίας των οργάνων των ποντικιών που αντιμετωπίστηκαν apaziquone δεν έδειξε καμία εμφανή τοξικότητα στα υπό αγωγή ζώα. Στο σύνολό τους, αυτά τα προκλινικά ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι apaziquone έχει μια θεραπευτική επίδραση στον καρκίνο του στόματος

in vivo

.

Η κλινική αξιολόγηση της apaziquone σταμάτησε από την έλλειψη αποτελεσματικότητας στις μελέτες φάσης ΙΙ [25, 28] . Κακή χορήγησης φαρμάκων στους όγκους που προκαλείται από ένα συνδυασμό ταχείας φαρμακοκινητικής εξάλειψη και την κακή διείσδυση διαμέσου ανάγγειο ιστό ήταν οι κύριοι παράγοντες υπεύθυνοι για την κακή την αποτελεσματικότητά του. Choudry et al [29] πρότειναν ότι υπάρχουν ένα υποσύνολο των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης των οποίων οι όγκοι έχουν την κατάλληλη βιοχημική μηχανήματα που απαιτούνται για την ενεργοποίηση αυτού του φαρμάκου. Δεδομένου ότι ένας σημαντικός παράγοντας στην αποτυχία apaziquone στην κλινική αποδόθηκε σε φαρμακοκινητικές εξάλειψή της ταχείας αποτέλεσμα την κακή παροχή φαρμάκου σε όγκους, ενδοκυστική χορήγηση της ΕΟ9 προτάθηκε για την παράκαμψη του προβλήματος της παροχής φαρμάκου σε όγκους. Με βάση την κατανόηση του γιατί apaziquone απέτυχαν, ένα ακόμη φάσης Ι /ΙΙ κλινική δοκιμή κατά του επιφανειακού καρκίνου της ουροδόχου κύστης, χρησιμοποιώντας ενδοκυστική χορήγηση ανατέθηκε το 2001 και χρηματοδοτείται από Spectrum Pharmaceuticals (Irvine, CA) [19]. Σημαντική δραστικότητα κατά του όγκου αναφέρθηκε στην μελέτη φάσης Ι /ΙΙ [30], και αυτό επιβεβαιώθηκε στη συνέχεια μελέτες φάσης II [31]. Puri

κ.ά.

[30] έδειξαν ότι ενδοκυστικά χορηγείται apaziquone είναι καλά ανεκτή τοπικά και συστηματικά, και έχει αφαιρετική δραστηριότητα για επιφανειακές αλλοιώσεις της κύστης καρκινικού δείκτη. Hendricksen et al., [32] έδειξαν ότι μια μόνο άμεση μετα-διουρηθρική εκτομή όγκου κύστης ενστάλαξη apaziquone ήταν καλά ανεκτή με αναμενόμενη καλό προφίλ ασφάλειας. Apaziquone και ο μεταβολίτης της EO5a δεν ανιχνεύθηκαν συστηματικά με φαρμακοκινητικές αναλύσεις [26]. Ανάλυση συγκεντρωτικών δεδομένων από δύο ξεχωριστές κλινικές μελέτες φάσης ΙΙΙ για apaziquone στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης έδειξαν σημαντική επίδραση της θεραπείας υπέρ της apaziquone στο πρωτεύον καταληκτικό σημείο του ποσοστού υποτροπής του όγκου στα 2 έτη (p-value = 0,0174) και σε ένα βασικό δευτερεύον καταληκτικό σημείο , χρόνος μέχρι την υποτροπή (p-value = 0,0076). Ωστόσο, δεν πληρούσε τον πρωταρχικό τους καταληκτικό σημείο μιας στατιστικά σημαντική διαφορά στο ποσοστό υποτροπής του όγκου στα 2 έτη μεταξύ των δύο σκελών [33]. Αυτές οι κλινικές δοκιμές χρησιμοποιώντας ενδοκυστική χορήγηση apaziquone κατευθείαν μέσα στην κύστη που υποστηρίζεται σκεπτικό μας για τη χρήση αυτού του φαρμάκου για τον καρκίνο του στόματος, επειδή στοματικής κοιλότητας είναι εύκολα προσβάσιμα για εντοπισμένη παροχή φαρμάκου και μπορεί να βελτιώσει τις φαρμακοκινητικές ιδιότητες της apaziquone για κλινική χρήση σε ασθενείς με καρκίνο του στόματος.

Loco-περιφερειακή χημειοθεραπεία αναδύεται ως ένα σημαντικό συμπλήρωμα σε χειρουργική επέμβαση και συστηματική χημειοθεραπεία σε επιλεγμένους ασθενείς με ορισμένες μορφές καρκίνου [34-37]. Σε αυτό το πλαίσιο, apaziquone έχει αναδειχθεί ως ένα τοπικά αποτελεσματικό φάρμακο σε επιφανειακό καρκίνο ουροδόχου κύστης [19]. Μας

in vitro

και

in vivo

μελέτες για apaziquone στον καρκίνο του στόματος παρέχουν προκλινικά στοιχεία για την αποτελεσματικότητά του και εγγυάται τη μελλοντική φάση Ι και φαρμακολογικές μελέτες για την υποστήριξη των δυνητικών κλινική χρήση του. Σε περίπτωση που η συστηματική χορήγηση apaziquone σε ασθενείς με καρκίνο του στόματος αποδίδει περιορισμένη αποτελεσματικότητα, μπορεί να διερευνηθεί για την τοπική-περιοχική χημειοθεραπεία ως συμπληρωματική θεραπεία στη χειρουργική επέμβαση, καθώς τα περισσότερα sites στο εσωτερικό της στοματικής κοιλότητας είναι εύκολα επιδέχονται τοπική-περιοχική εφαρμογή του φαρμάκου.

Ένας από τους περιορισμούς της μελέτης μας είναι ότι δεν έχουμε προσδιοριστεί το επίπεδο έκφρασης ή δραστηριότητας του ΝΑΟ (Ρ) η κινόνης οξειδορεδουκτάσης 1 (NQO1), επίσης γνωστή ως DT-διαφοράση 1, το ένζυμο που εμπλέκεται στο μεταβολισμό της apaziquone σε στοματική SCC κύτταρα? σε βάθος διερεύνηση των NQO1 στην OSCC και τη σημασία της για την αποτελεσματικότητα apaziquone σε ασθενείς OSCC θα διεξαχθεί σε μια μελλοντική μελέτη. Ωστόσο, η έκφραση της πρωτεΐνης NQO1 έχει αναφερθεί πρόσφατα να προβλέψει κακή πρόγνωση των μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [38].

Συμπεράσματα

Apaziquone έδειξε πολλά υποσχόμενη αντικαρκινική δράση σε καρκίνο του στόματος κυτταρικές σειρές σκοτώνει τον καρκίνο κύτταρα με απόπτωση. Περαιτέρω, apaziquone αποδεικνύεται ελπιδοφόρα αντικαρκινική δραστικότητα σε από του στόματος ξενομοσχεύματα όγκου του καρκίνου χωρίς σημαντική τοξικότητα σε κανονικούς ιστούς υπογραμμίζοντας την προ-κλινική αποτελεσματικότητα του apaziquone, ως πιθανή νέα αντικαρκινικά θεραπευτικά υποψήφιος για στοματική διαχείριση του καρκίνου.

Υποστήριξη πληροφορίες

S1 Εικ. . Western blot ανάλυση πυκνομετρίας

ιστογράμματα της δυτικής κηλίδος ανάλυση πυκνομετρίας της κασπάσης 3, κασπάση 9, διασπασμένη κασπάση 9, PARP και διασπασμένη PARP κανονικοποιημένη σε β-ακτίνης σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ελέγχους (NTC)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0133735.s001

(ΔΕΘ)

S1 πίνακα. Κλινική Χημεία προφίλ, Συκώτι & amp? εξετάσεις νεφρικής λειτουργίας

doi:. 10.1371 /journal.pone.0133735.s002

(DOCX)

S2 πίνακα. Γενική αίματος

doi:. 10.1371 /journal.pone.0133735.s003

(DOCX)