Αφηρημένο

καρκίνο των ωοθηκών Clear κύτταρο είναι ένα επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών histotype που είναι λιγότερο ανταποκρίνεται στη χημειοθεραπεία και φέρει χειρότερη πρόγνωση από ορώδες και ενδομητριοειδές histotypes. Παρά το γεγονός αυτό, οι ασθενείς με αυτούς τους όγκους αντιμετωπίζεται με παρόμοιο τρόπο όπως όλους τους άλλους καρκίνους των ωοθηκών. Προηγούμενο γονιδιωματική ανάλυση υπέδειξε ότι η σαφής καρκίνοι αντιπροσωπεύουν ένα μοναδικό υπότυπο του όγκου. Εδώ δημιουργήθηκε το πρώτο ολόκληρη γονιδιωματικής έκφρασης προφίλ χρησιμοποιώντας επιθηλιακά συνιστώσα σαφές καρκίνων των ωοθηκών κυττάρων και τη φυσιολογική δείγματα επιφάνεια των ωοθηκών απομονωθεί από τη σύλληψη λέιζερ μικροδιατομής. Όλες οι συστοιχίες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας BRB ArrayTools και λογισμικού PathwayStudio για τον εντοπισμό των μονοπατιών σηματοδότησης. Πανομοιότυπες οδούς επικυρωθεί χρησιμοποιώντας ορώδες, σαφείς κυτταρικές σειρές καρκινικών κυττάρων και της τεχνολογίας RNAi.

In vivo

επικυρώσεις εκτελείται χρησιμοποιώντας ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού και λιποσωματική έγκλειστα siRNA. Ασθενής που προέρχεται σαφής κυττάρων και ορώδες όγκοι ωοθηκών μεταμοσχεύθηκαν κάτω από τη νεφρική κάψα του NOD-SCID για την αξιολόγηση του θεραπευτικού δυναμικού του ταυτοποιημένου οδού. Εντοπίσαμε μεγάλες ενεργοποιούνται μονοπάτια, με σαφή κύτταρα που αφορούν στην υποξική την ανάπτυξη των κυττάρων, την αγγειογένεση, και του μεταβολισμού της γλυκόζης που δεν συναντάται σε άλλες histotypes. Νοκ ντάουν των βασικών γονιδίων σε αυτά τα μονοπάτια ευαισθητοποιηθεί σαφές κυττάρων των ωοθηκών καρκινικές κυτταρικές σειρές σε υποξία /στέρηση γλυκόζης.

In vivo πειράματα χρησιμοποιώντας

όγκους που προέρχονται ασθενή να αποδείξει ότι η σαφής όγκους των κυττάρων είναι εξαιρετικά ευαίσθητη στη θεραπεία της αγγειογένεσης (δηλαδή sunitinib) σε σύγκριση με ορώδες όγκους. Εμείς δημιούργησε ένα ειδικό histotype, γονίδιο υπογραφή που σχετίζεται με καρκίνο των ωοθηκών σαφείς κύτταρο το οποίο αναγνωρίζει σημαντικό ενεργοποιημένες πορείες κρίσιμη για κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικών τους. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν μια λογική βάση για μια ριζικά διαφορετική μεταχείριση για τους ασθενείς των ωοθηκών διαυγοκυτταρικό

Παράθεση:. Stany MP, Vathipadiekal V, Ozbun L, Πέτρα RL, Mok SC, Xue H, et al. (2011) Προσδιορισμός των νέων θεραπευτικών στόχων σε μικροτομή Clear κυττάρων των ωοθηκών. PLoS ONE 6 (7): e21121. doi: 10.1371 /journal.pone.0021121

Συντάκτης: Τσαντ Creighton, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Φλεβάρη, 2011? Αποδεκτές: 19η Μάη 2011? Δημοσιεύθηκε: 6, Ιουλίου, 2011

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου των Εθνικών Ινστιτούτων της Υγείας (MJB) και OvCaRe (μια πρωτοβουλία του Βανκούβερ Γενικό Νοσοκομείο και το Πανεπιστήμιο της BC Ιδρύματος Νοσοκομείου και του Ιδρύματος π.Χ. Καρκίνο) (YZW), το Ίδρυμα π.Χ. Καρκίνου και η Pfizer Καναδά (Ερευνητής-ξεκίνησε έργου, ΣΕΛ και YZW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Pfizer Καναδά είναι μια εταιρεία της υγειονομικής περίθαλψης. ΣΕΛ και YZW έλαβε Ερευνητής-ξεκίνησε η χρηματοδότηση του έργου από την Pfizer Καναδά. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Clear κυττάρων του καρκίνου των ωοθηκών (CCOC) περιγράφηκε αρχικά ως ovarii mesonephroma το 1939 από Schiller λόγω παρόμοια εμφάνιση της σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα [1]. Περαιτέρω μελέτες από τότε, έχει στοιχεία που αποδεικνύουν ότι αυτοί οι όγκοι είναι ωοθήκης προέλευσης [2], [3], [4], [5], [6] CCOC αντιπροσωπεύει 4-14% του συνόλου των επιθηλιακών καρκίνων των ωοθηκών και την κλινική συμπεριφορά του διαφέρει από εκείνη των άλλων επιθηλιακών histotypes [4], [6], [7]. Οι ασθενείς με σταδίου Ι CCOC έχουν κίνδυνο 27% της υποτροπής [8] με τα ποσοστά πενταετούς επιβίωσης για 60% σε σύγκριση με το 80%, για ορώδες όγκους [8]. Οι ασθενείς με νόσο προχωρημένο στάδιο έχουν επίσης μια χειρότερη πρόγνωση σε σύγκριση με τους ασθενείς με προχωρημένο στάδιο καρκίνου ορώδες [8] των ωοθηκών. Αυτό πιθανότατα αντανακλά χαμηλότερο ρυθμό CCOC της απάντησης με την παραδοσιακή χημειοθεραπεία πλατίνα /ταξάνη που βασίζεται, φέρεται να είναι μεταξύ 11-45% κατά τη διάρκεια της θεραπείας πρώτης γραμμής [8], [9]. ασθενείς CCOC έχουν επίσης υψηλότερα ποσοστά θρομβοεμβολικών επεισοδίων σε σύγκριση με τους ασθενείς με άλλες επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών histotypes [10].

κύτταρα Ιστολογικά, CCOC είναι «σαφής», λόγω της υψηλής κυτταροπλασματική συγκέντρωση γλυκογόνου που είναι ένα κατασκεύασμα της H Ε χρώση [11], [12]. CCOC έχει βρεθεί να έχουν υπερδομικές ομοιότητα να διώξει καρκίνωμα του κόλπου και του ενδομητρίου. Αυτό λεπτήν ομοιότητα μεταφέρει σε γενετική ομοιότητα, καθώς και. Zorn et al. βρέθηκε παρόμοια προφίλ γονιδιακής έκφρασης του διαυγοκυτταρικό όγκων των ωοθηκών, ενδομητρίου, και του νεφρού με τη χρήση μίας συστοιχίας 11000 probeset [13]. Αυτή η γενετική επικάλυψη, ωστόσο, δεν επεκτείνεται στη σύγκριση των ορώδες και ενδομητριοειδές histotypes των ωοθηκών και του ενδομητρίου προέλευσης. Ένα άλλο προφίλ γονιδιακής έκφρασης των CCOC χρησιμοποιώντας ένα σύνολο σειρά 7129 καθετήρα απέδειξε να είναι πολύ διαφορετική από τις άλλες histotypes [14]. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι υπάρχουν παρόμοια μονοπάτια που οδηγούν σε σαφή κύτταρο histotype ανεξαρτήτως του οργάνου προέλευσης.

Σε αυτή τη μελέτη, παρουσιάζουμε τα αποτελέσματα του πρώτου ολόκληρο το προφίλ έκφρασης του γονιδιώματος του μικροτομή δείγματα CCOC. Γονιδιακή οντολογία και πορεία ανάλυσης εντοπίζονται σημαντικές ενεργοποιηθεί οδών που εμπλέκονται στην υποξική την ανάπτυξη των κυττάρων, την αγγειογένεση, και το μεταβολισμό της γλυκόζης. Υποθέσαμε ότι αυτές οι πορείες μπορεί να παρέχει ένα μηχανισμό για την επιθετική κλινική φύση της CCOC. Έχουμε αποδείξει ότι η σαφής καρκινικές κυτταρικές γραμμές κυττάρων επιβιώνουν καλύτερα από ορώδες κυτταρικές σειρές υπό υποξία και συνθήκες γλυκόζη στερούνται και αυτό οφείλεται εν μέρει σε αυτά τα ενεργοποιημένα οδούς που περιλαμβάνουν HIF1 α και ενολάσης.

In vivo πειράματα χρησιμοποιώντας

προέρχεται ασθενή ιστών καταδεικνύουν ότι η σαφής ξενομοσχεύματα κυττάρων όγκου είναι εξαιρετικά ευαίσθητη στη θεραπεία της αγγειογένεσης (sunitinib) σε σύγκριση με ορώδες όγκους. Η συνδυασμένη θεραπεία του sunitinib και του RNAi για την HIF1α και ενολάση επιδεικνύει συνεργική αντι δραστηριότητα του όγκου. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν μια λογική βάση για τη συγκεκριμένη θεραπεία σε αυτούς τους ασθενείς.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

δείγματα ιστών Ο καρκίνος των ωοθηκών ελήφθησαν με ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση από ασθενείς που υποβάλλονται σε διμερείς salpingoophorectomy στο Βανκούβερ Γενικό Νοσοκομείο μετά από ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο της βρετανικής Κλινική Διοικητικού συμβουλίου Δεοντολογίας Columbia Έρευνας του Καναδά. Δείγματα που χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία προφίλ συλλέχθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα έχουν εγκριθεί από τα θεσμικά συμβούλια αναθεώρηση του Νοσοκομείου Brigham and Women της (Boston, MA, USA) και ελήφθησαν με ενημέρωσε τη γραπτή συγκατάθεση των ασθενών. φροντίδα των ζώων και τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές και την έγκριση από το Πανεπιστήμιο της Βρετανικής Κολομβίας – Διοικητικό British Columbia Cancer Agency του Δεοντολογίας Έρευνας (UBC BCCA REB) (αριθμός: H04-60131) και MD Anderson Cancer Κέντρο Θεσμικών φροντίδα των ζώων και τη χρήση Επιτροπή, USA (Αριθμός IACUC: 12-02-18233).

δείγματα ιστών, μικροδιατομής, απομόνωση RNA και ενίσχυση

Δέκα σαφές κυττάρων δείγματα καρκίνου των ωοθηκών ελήφθησαν από τις πρωτογενείς όγκους είχαν λάβει προηγούμενη θεραπεία ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών στο νοσοκομείο Brigham και Γυναικών (Boston, MA). Ένα σύνολο 10 κανονική επιφάνεια επιθήλιο των ωοθηκών (ΟΣΕ) cytobrushing δείγματα ελήφθη επίσης από τις φυσιολογικές ωοθήκες των ασθενών κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης για καλοήθη ενδείξεις. Κατεψυγμένες τομές (7 μm) τοποθετήθηκαν επάνω σε πλάκες FRAME (Leica, Wetzlar, Γερμανία), που καθορίζεται σε 70% αλκοόλη για 30 δευτερόλεπτα, χρωματίστηκαν με 1% πράσινο μεθύλιο, ξεπλύθηκαν σε απιονισμένο νερό, και ξηραίνεται στον αέρα. Μικροανατομίας διεξήχθη χρησιμοποιώντας MD LMD μικροσκόπιο microdissecting λέιζερ (Leica). Κύτταρα όγκου (~5,000) αποκόπηκαν για κάθε περίπτωση. RNA απομονώθηκε, εκχυλίστηκε και καθαρίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Προκειμένου να δημιουργήσει επαρκή cRNA για ανάλυση μικροσυστοιχιών, ένα πρωτόκολλο ενίσχυσης των δύο κύκλων (Affymetrix) χρησιμοποιήθηκε η οποία έχει περιγραφεί στο παρελθόν [16].

μικροσυστοιχιών ανάλυση

Όλα τα δεδομένα πίνακας είναι Ελάχιστες πληροφορίες περίπου ένα πείραμα μικροσυστοιχιών (MIAME) συμβατό και η ανεπεξέργαστα δεδομένα έχει κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων συμβατή MIAME (GEO, Αριθμός προσχώρησης: GSE29450)

κανονικοποίηση δεδομένων

Παγκόσμια κανονικοποίηση σε μια τιμή-στόχο της. 500 εφαρμόστηκε σε όλες τις 20 από τις συστοιχίες υπό εξέταση χρήση Gene Chip Λογισμικό Λειτουργικό (Affymetrix). Κανονικοποιημένα δεδομένα που αποστέλλονται στη βάση δεδομένων μικροσυστοιχιών Ανάλυση του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου (MADB) για τον έλεγχο τον έλεγχο της ποιότητας και την ταξινόμηση πριν από την κατάντη αναλύσεις (https://nciarray.nci.nih.gov/index.shtml). Βιομετρικά Research Branch (BRB) ArrayTools έκδοση 3.2.2 λογισμικό που αναπτύχθηκε από τους Drs. Richard Simon και η Amy Peng Lam της Βιομετρικά Έρευνας Υποκατάστημα του Εθνικού Ινστιτούτου για τον Καρκίνο χρησιμοποιήθηκε για να φιλτράρουν και να ολοκληρώσει τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων πίνακα. BRB-ArrayTools είναι ένα πολυλειτουργικό πρόσθετο του Excel που περιέχει βοηθητικά προγράμματα για την επεξεργασία και την ανάλυση δεδομένων μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας το R 2.0.1 περιβάλλον (R Ανάπτυξης πυρήνα της ομάδας, 2004). ελέγχου υβριδισμού σετ καθετήρα και σύνολα ανιχνευτή βαθμολογήθηκε ως απούσα σε α1 = 0,05 ή περιθωριακή (Μ) σε α2 = 0.065 αποκλείστηκαν. Επιπλέον, μόνο οι μεταγραφές που υπάρχουν στο μεγαλύτερο από το 50% των συστοιχιών και εμφανίζοντας μια διακύμανση στην κορυφή 50ο εκατοστημόριο αξιολογήθηκαν.

σύγκριση Class, το γονίδιο της οντολογίας και της οδού ανάλυση.

πολυμεταβλητή δοκιμή μετάθεση σε BRB ArrayTools χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά. Μια λίστα των probesets περιέχουν 1:200) χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των μικροαγγείων. Όλα τα τμήματα του ιστού χρωματίσθηκαν ελαφρά με 5% (w /v) Harris αιματοξυλίνη (Η &? Ε). τμήματα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία παράλληλα με κουνέλι μη-άνοση IgG (Dako, Carpinteria, CA) χρησιμοποιήθηκαν στις ίδιες συγκεντρώσεις όπως τα πρωτεύοντα αντισώματα. πυκνότητα μικροαγγείων, δηλαδή, ο αριθμός των αιμοφόρων αγγείων ανά × 400 μικροσκοπικό πεδίο, προσδιορίστηκε μέσω μικροσκοπική ανάλυση του von Willebrand με παράγοντα VIII χρώση τομών ιστού.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο ± SEM ANOVA για να συγκριθούν πολλαπλές ομάδα μέσες τιμές. στατιστικές Shaffer και έλεγχος τ χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση κάθε διαφορά μεταξύ δύο ομάδων. Σύγκριση του ποσοστού των κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου εκτελέσθηκε με αμφίδρομη ΑΝΟνΑ με χρήση Prism 4.02 Software (Graph Pad). Οι τιμές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε Ρ & lt? 0,05, εκτός από την ανάλυση μικροσυστοιχιών, όπου σημαντικότητας ορίστηκε στο p & lt? 0.001

Αποτελέσματα

Όλη προφίλ έκφρασης του γονιδιώματος του μικροτομή CCOC προσδιορίζει διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων

Τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης του RNA που απομονώθηκε από το επιθηλιακό συστατικό της 10ης διαυγοκυτταρικό ωοθηκών δειγμάτων καρκίνου απομονώθηκε με σύλληψη λέιζερ μικροδιατομής συγκρίθηκαν με παρομοίως απομονώνεται RNA από 10 δείγματα φυσιολογικού επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών χρησιμοποιώντας Affymetrix U133 συν 2 συστοιχίες. Μετά την εξομάλυνση και την αρχική ανάλυση, 16.013 ενημερωτικά probesets περάσει τα κριτήρια φιλτραρίσματος. Χρησιμοποιώντας μια πολυμεταβλητή δοκιμή μετάθεση παρέχοντας 95% εμπιστοσύνη ότι ο αριθμός των ψευδών ευρημάτων δεν υπερβαίνει το 10%, 3.288 probesets για 2.559 γονίδια βρέθηκαν να ρυθμίζονται διαφορικά, που ορίζεται από ένα 1.5-πλάσια ή μεγαλύτερη διαφορά σε έκφραση με στατιστική σημασία ρ & lt ? 0.001. Γραφική αναπαράσταση του παρόντος διαφορική γονιδιακή έκφραση μπορεί να φανεί στο Σχήμα 1α. Για την επικύρωση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών, 12 γονίδια που εκφράστηκαν διαφορικά επιλέχθηκαν τυχαία για ανάλυση qRT-PCR. Δέκα από τα 12 γονίδια διαφορικά εκφραζόμενα σε qRT-PCR, που αντιστοιχούν σε συνολικό ποσοστό επικύρωσης μικροσυστοιχιών του 83% (Σχήμα 1 b, c και τον Πίνακα S1).

(α) Γραφική αναπαράσταση του πλήρους προφίλ έκφρασης γονιδιώματος του σαφές κυττάρων καρκίνου των ωοθηκών δείγματος (CCOC) και ωοθηκών επιθήλιο επιφανειών (ΟΣΕ). (Β) και (γ) Σύγκριση των δεδομένων qRT-PCR και τα δεδομένα μικροσυστοιχιών των έξι υπερεκφράζεται και τέσσερα υποεκφράζονται γονίδια που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση επικύρωσης (δ) Pathway διαφορικώς ρυθμισμένων γονιδίων που εντοπίζονται στην σαφή κύτταρο μικροσυστοιχιών καρκίνο των ωοθηκών. Γονίδια περιλαμβάνονται στην ανάλυση έπρεπε να έχουν μια πτυχή ≥1.5 αλλαγή. Πολλαπλά σετ καθετήρα τέθηκαν στον μέσο όρο για κάθε γονίδιο.

Κόκκινο

, γονίδιο ρυθμίζεται προς τα πάνω.

Μπλε

, γονίδιο ρυθμίζεται προς τα κάτω.

Η

Αναγνώριση των ενεργοποιημένων οδών σε CCOC

Για τον εντοπισμό ενεργοποιούνται μονοπάτια υπάρχουν εντός CCOC, λειτουργικές κατηγορίες των διαφορικά εκφρασμένων γονίδια ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση γονιδίων οντολογίας (GO). Στατιστικά σημαντικές κατηγορίες επιδεικνύουν μεγάλο αριθμό γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των υδατανθράκων, ο μεταβολισμός της γλυκόζης, γλυκόλυση, και την ανάπτυξη των αιμοφόρων αγγείων (Πίνακας 1). Οι 3.288 probesets και των συναφών δεδομένων σε σχέση με την έκφρασή τους σε σύγκριση με τον ΟΣΕ εισήχθησαν PathwayStudio 6.0 του λογισμικού. Οδών που εμπλέκονται στην αγγειογένεση, πήξη, το μεταβολισμό της γλυκόζης, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και κυτταρική κινητικότητα ήταν εμφανής (Σχήμα 1δ). Για παράδειγμα, HSPCA, η οποία έχει αποδειχθεί να σταθεροποιήσει HIF1α (27), βρέθηκε να είναι υπερ-εκφράζεται.