Αφηρημένο

Στόχος

Η ανάπτυξη ανθεκτικότητας θεραπείας και των δυσμενών τοξικότητα που σχετίζεται με την κλασική χημειοθεραπευτικούς παράγοντες υπογραμμίζει την ανάγκη για πιο ασφαλείς και αποτελεσματικές θεραπευτικές προσεγγίσεις. Στο παρόν, δεν εξέτασε την αποτελεσματικότητα μιας αγωγής θεραπείας συνδυασμού 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) και η κουρκουμίνη στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα (CRC).

Μέθοδοι

φυσικού τύπου κύτταρα HCT116 και HCT116 + κύτταρα CH3 (συμπληρώνεται με χρωμόσωμα 3) υποβλήθηκαν σε αγωγή με κουρκουμίνη και 5-FU σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και αξιολογούνται με προσδιορισμούς κυτταρικού πολλαπλασιασμού, χρώση ϋΑΡΙ, μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίου, ανάλυση κυτταρικού κύκλου και ανοσοαποτύπωση για το κλειδί πρωτεΐνες σηματοδότησης.

Αποτελέσματα

Ο μεμονωμένος IC

50 της κουρκουμίνης και 5-FU ήταν περίπου 20 μΜ και 5 μΜ σε κύτταρα HCT116 και 5 μΜ και 1 μΜ σε HCT116 + CH3 κύτταρα, αντιστοίχως (

p & lt? 0,05

). Προθεραπεία με κουρκουμίνη μείωσε σημαντικά την επιβίωση και στις δύο κύτταρα? HCT116 + CH3 κυττάρων ήταν σημαντικά πιο ευαίσθητα σε κατεργασία με κουρκουμίνη ή /και 5-FU από κύτταρα HCT116 άγριου τύπου. Το IC

50 τιμές για θεραπεία συνδυασμού ήταν περίπου 5 μΜ και 1 μΜ σε HCT116 και 5 μΜ και 0,1 μΜ σε HCT116 + CH3, αντίστοιχα (

p & lt? 0,05

). Η κουρκουμίνη απόπτωση που επάγεται στα δύο κύτταρα επάγοντας μιτοχονδριακή εκφύλιση και την απελευθέρωση κυτοχρώματος c. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι η αντι-πολλαπλασιαστική δράση της κουρκουμίνης και /ή προηγείται συσσώρευση κυττάρων CRC στη φάση S του κυτταρικού κύκλου και η επαγωγή απόπτωσης 5-FU ήταν. Η κουρκουμίνη ενισχύεται 5-FU-επαγόμενη έκφραση ή διάσπαση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών καθοδικά ρυθμισμένη αντι-αποπτωτικό (Bcl-XL) και πολλαπλασιαστικές (κυκλίνη D1) πρωτεΐνες (κασπάση-8, -9, -3, PARP και Bax), και . Αν και 5-FU ενεργοποιείται ΝΡ-κΒ /ΡΙ-3Κ /Src μονοπάτι σε κύτταρα CRC, αυτό κάτω ρυθμισμένα με κατεργασία κουρκουμίνης μέσω αναστολής της ενεργοποίησης της κινάσης και φωσφορυλίωση ΙκΒα ΙκΒα.

Συμπεράσματα

Συνδυάζοντας κουρκουμίνη με συμβατικούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες όπως η 5-FU θα μπορούσε να παράσχει πιο αποτελεσματικές στρατηγικές θεραπείας κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου στη χημειοθεραπεία κύτταρα. Οι μηχανισμοί που εμπλέκονται μπορεί να προκαλούνται μέσω NF-κΒ /μονοπάτια PI-3K /Src και τα προϊόντα ρυθμιζόμενων γονιδίων NF-κΒ

Παράθεση:. Shakibaei M, Mobasheri Α, Lueders C, Busch F, Shayan P, Goel Α (2013) η κουρκουμίνη ενισχύει την επίδραση του Chemotherapy έναντι κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου από την αναστολή της NF-κΒ και Src πρωτεϊνικής κινάσης μονοπάτια σηματοδότησης. PLoS ONE 8 (2): e57218. doi: 10.1371 /journal.pone.0057218

Επιμέλεια: Bharat Β Aggarwal, το Πανεπιστήμιο του Τέξας Μ D. Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 του Ιούλη του 2012? Αποδεκτές: 22 του Ιανουαρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Shakibaei et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι ένας από τους μεγαλύτερους. αιτίες θανάτου σε άνδρες και γυναίκες, και συγκαταλέγεται ανάμεσα στις τρίτη πιο κοινούς καρκίνους παγκοσμίως [1]. Ο επιπολασμός της CRC εξακολουθεί να αυξάνεται παρά ενισχυμένη μας κατανόηση της παθογένεσης της νόσου αυτής, καθώς και δημιουργία βελτιωμένων στρατηγικών διαλογής για αυτή την κακοήθεια. Έχει αναφερθεί ότι σχεδόν το 50% των ασθενών με CRC, θα αναπτύξει υποτροπιάζουσα νόσο, υποδεικνύοντας ότι σήμερα διαθέσιμα θεραπευτικά σχήματα δεν είναι σε θέση να ελέγξουν αυτή την θανατηφόρα ασθένεια και υπάρχει επιτακτική ανάγκη για βελτιωμένες [2] θεραπείες. 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) είναι μία από τις κλασικές φάρμακα που χρησιμοποιούνται ως χημειοθεραπευτικό παράγοντα κατά CRC. θεραπεία 5-FU καταστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και επάγει την απόπτωση με ενσωμάτωση των μεταβολιτών της σε DNA και RNA μέσω θυμιδυλική συνθάση. Ωστόσο, τα κέρδη από το χημειοθεραπευτικό αποτελεσματικότητα της 5-FU είναι κάπως περιορισμένη σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, κυρίως λόγω αποκτήσει προοδευτική αντίσταση των κυττάρων CRC σε 5-FU και τοξικότητα σε περιβάλλοντα υγιή κύτταρα [3], [4].

οι περισσότεροι όγκοι ενεργοποιούν τον παράγοντα μεταγραφής πυρηνικού παράγοντα-κΒ (NF-κΒ), ενώ φυσικά χημειοπροληπτικές παράγοντες που καταστέλλουν, υποδεικνύοντας μία ισχυρή σύνδεση μεταξύ της βιολογίας όγκου και τις αντικαρκινικές επιδράσεις των διαφόρων φυσικών ενώσεων [5]. Σε αντίθεση με τα υγιή κύτταρα, στην πλειονότητα των στερεών και αιμοποιητικών κυτταρικών γραμμών όγκου ΝΡ-κΒ είναι ουσιαστικά δραστική [6]. Περαιτέρω, προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες, χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και η ακτινοθεραπεία, ότι επάγει απόπτωση ενεργοποιούν επίσης ΝΡ-κΒ [7] και ως εκ τούτου μπορεί να μεσολαβεί χημειοαντίσταση και ραδιοαντοχή των καρκινικών κυττάρων [8]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αναστολή της NF-κΒ σε κύτταρα όγκου μπλοκ πολλαπλασιασμό, προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου, και οδηγεί σε απόπτωση, υποδηλώνοντας έναν κεντρικό ρόλο για τον παράγοντα αυτό μετεγγραφής σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και επιβίωση [9]. ΝΡ-κΒ παίζει ένα σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και κακοήθη μετασχηματισμό σε διαφορετικά κύτταρα, σύνδεση προς θέσεις στόχους DNA ως ομο- ή ετεροδιμερές για να επηρεάσουν κατάντη γονιδιακή έκφραση [10], [11].

CRC πιστεύεται συμβαίνουν ως συνέπεια της σταδιακής συσσώρευσης γενετικών αλλοιώσεων σε διάφορα γονίδια που οδηγούν σε ενισχυμένη γενωμική αστάθεια. Τέτοιες μεταβολές έχουν άμεση επίδραση στη μετάσταση που σχετίζεται γονίδια, ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια [12], [13]. Επιπλέον, υπάρχει αυξημένη αναγνώριση ότι εκτός γενετικά γεγονότα σε CRC, μεταβολές στην έκφραση γονιδίου μπορεί να διαμεσολαβείται από επιγενετικές μεταβολές συμπεριλαμβανομένων παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA, τροποποιήσεις των ιστονών και επαναμοντελοποίηση χρωματίνης [14], [15]. Επιπλέον, η επισκευή αναντιστοιχία σύστημα (MMR) παίζει σημαντικό ρόλο στην διόρθωση κειμένων σφάλματα σύνθεση DNA κατά την αντιγραφή των κυττάρων. Βλάβη στο MMR σύστημα προκαλεί γενετική αστάθεια, οδηγώντας σε αλλαγές στο φαινότυπο των κυττάρων, καθιστώντας το κύτταρο πιο επιρρεπή σε νεοπλασματικό μετασχηματισμό και τη διευκόλυνση της ανάπτυξης των χημειοθεραπευτικών αντίστασης. DNA MMR πρωτεΐνες, όπως hMSH2, hMSH3, hMSH6, hMLH1, hPMS2 και hMLH3 διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο τόσο σποραδική και την οικογενή ποικιλίες της ανθρώπινης CRC [16], [17], [18], [19]. Στην πραγματικότητα, η αποκατάσταση του ελαττώματος MMR με την εκ νέου έκφραση hMLH1or hMSH2 με μεταφορά του χρωμοσώματος προσδίδει αυξημένη ευαισθησία στους παράγοντες [20], [21].

CRC είναι μια ιάσιμες ασθένειες, και επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από τις περιβαλλοντικές , τον τρόπο ζωής και διατροφικών παραγόντων. Στο πλαίσιο αυτό, υπάρχει ένα αυξανόμενο σώμα της βιβλιογραφίας που υποδηλώνει ότι πολλές φυσικές ουσίες που απαντούν ως συμπληρώματα διατροφής μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου και έχει αναφερθεί ότι κατέχει κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη φαρμάκων κατά του όγκου [22], [23]. Φυσικά προϊόντα με την ικανότητα να αναστέλλουν την ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ θα μπορούσε να έχει θεραπευτικές δυνατότητες έναντι ανάπτυξης όγκου όπως CRC. Η κουρκουμίνη (diferuloylmethane) είναι η βιολογικά δραστική φυτοχημικό συστατικό που υπάρχει στο κουρκούμη μπαχαρικών (

Curcuma longa

), και έχει δειχθεί ότι είναι ένας ισχυρός αναστολέας της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ σε αρκετούς τύπους κυττάρων σε μη τοξικά συγκεντρώσεις στον άνθρωπο [ ,,,0],24]. Η ιδιότητα κατά του όγκου της κουρκουμίνης, οφείλεται εν μέρει στη σύλληψη των καρκινικών κυττάρων σε S, G2 /φάση του κυτταρικού κύκλου Μ και την επαγωγή απόπτωσης. Επιπλέον, η κουρκουμίνη αναστέλλει την ανάπτυξη του DNA MMR ελλειμματικών καρκινικά κύτταρα κόλου [25], [26]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι η κουρκουμίνη μειορυθμίζει ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένη κινάση ΡΙ-3Κ μονοπάτια /ΑΚΤ σε κύτταρα λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας Τ, η οποία καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την κασπάση-εξαρτώμενη απόπτωση [27].

Δεδομένου ότι οι ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου ανεπάρκεια επιδιόρθωσης του DNA που δεν επωφελούνται από το 5-FU με βάση χημειοθεραπεία, χρησιμοποιήσαμε ένα ζευγάρι ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές, HCT116 (MMR ανεπάρκεια, λόγω της υπερμεθυλίωση του γονιδίου MLH1) και HCT116 + CH3 (MMR-καλά, λόγω της σταθερής μεταφοράς χρωμοσώματος 3 που φέρει άγριου τύπου αντίγραφο του γονιδίου MLH1). Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να εξετάσει τη δυνατότητα χημειοευαισθητοποίηση κουρκουμίνη σε 5-FU χημειοθεραπεία με βάση το MMR ανεπάρκεια και -proficient κύτταρα CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα

Αντισώματα έναντι ΜΜΡ-9 (ΜΑΒ 911) και δραστική κασπάση-3 (AF835) ελήφθησαν από R &? D Systems, Inc., (Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Τα μονοκλωνικά αντι-PARP [πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης] (7D3-6) αντισωμάτων ηγοράσθησαν από την Becton Dickinson (Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Κυκλο-οξυγενάση-2 (160-112) αντίσωμα λήφθηκε από την Cayman Chemical (Αηη Arbor, ΜΙ, USA). Αντισώματα σε β-ακτίνη (A5316) ήταν από τη Sigma (Μόναχο, Γερμανία). Αντισώματα σε Βαχ λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αντισώματα έναντι φωσφο-ειδικό ΙκΒα (Ser-32/36), ρ65 και φωσφο-ειδικό ρ65 (Ser536) ελήφθησαν από την Cell Technology (Beverly, ΜΑ). Αντι-ΙκΒ κινάσης (αντι-ΙΚΚ) -α και (αντι-ΙΚΚ) -β αντισώματα ελήφθησαν από Imgenex (Αμβούργο, Γερμανία). Αλκαλική φωσφατάση αντι-ποντικού προβάτου και αντι-κουνελιού δευτερογενή αντισώματα συνδέονται πρόβατα για ανοσοκηλίδωση αγοράστηκαν από την Millipore (Schwalbach, Γερμανία). Όλα τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε συγκεντρώσεις και αραιώσεις συνιστάται από τον κατασκευαστή (αραιώσεις κυμαίνονταν από 1: 100 για immunomorphological πειράματα έως 1: 10.000 για ανάλυση Western blot).

Growth Media, Χημικά, και κυτοκίνες

μέσο ανάπτυξης (Ham F-12 /μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (50:50) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS), 25 μg /ml ασκορβικό οξύ, 50 IU /ml στρεπτομυκίνη, 50 IU /ml πενικιλλίνη, 2.5 μg /ml αμφοτερικίνη Β, απαραίτητα αμινοξέα και L-γλουταμίνη) ελήφθη από Seromed (Μόναχο, Γερμανία). Θρυψίνη /EDTA (ΕΚ 3.4.21.4) αγοράστηκε από την Sigma. Εροη ελήφθη από Plano (Marburg, Γερμανία). 5-FU αγοράστηκε από τη Sigma (Μόναχο, Γερμανία). Η κουρκουμίνη με καθαρότητα μεγαλύτερη από 95% αγοράστηκε από Indsaff (Punjab, Ινδία). Αυτή η εμπορική πηγή της κουρκουμίνης περιέχει τρία βασικά συστατικά: Diferuloylmethane (το πιο άφθονο και ενεργό συστατικό του turmeric) (82%) και τα παράγωγά του διμεθοξυκουρκουμίνη (15%) και bisdemethoxycurcumin (3%), που μαζί αναφέρονται ως κουρκουμινοειδή [24], [ ,,,0],28]. Η κουρκουμίνη διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ως μία συγκέντρωση αποθέματος από 5.000 μΜ και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Διαδοχικές αραιώσεις παρασκευάστηκαν σε μέσο καλλιέργειας. Μια 100 mM απόθεμα της 5-FU παρασκευάστηκε σε απόλυτη DMSO και αποθηκεύεται στους -20 ° C. Για τη θεραπεία, το διάλυμα αποθέματος 5-FU αραιώθηκε σε DMEM /F12 και προστέθηκαν σε καλλιέργειες για να επιτευχθεί η επιθυμητή συγκέντρωση. Η τελική συγκέντρωση του DMSO ήταν μικρότερη από 1% της φαρμακευτικής αγωγής. Μετά την καλλιέργεια των κυττάρων σε 70-80% συρροή, αυτά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-FU, η κουρκουμίνη ή ο συνδυασμός τους (σε κάθε περίπτωση της θεραπείας συνδυασμού, τα κύτταρα πρώτα σε προεπεξεργασία με κουρκουμίνη για 12 ώρες ή στους υποδεικνυόμενους χρόνους και μετά εκτέθηκαν σε 5-FU για 24 ώρες ή χρόνους που υποδεικνύονται).

κυτταρικές γραμμές και κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου κόλου (HCT116 άγριου τύπου) ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (Μόναχο, Γερμανία). HCT116 + CH3, η οποία έγινε MLH1-καλά από τη σταθερή επιμόλυνση του χρωμοσώματος 3 που φέρουν ένα αντίγραφο αγρίου τύπου του

hMLH1

γονίδιο παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται αρχικά [21]. Τα κύτταρα HCT116 και HCT116 + CH3 χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνηθεί η αποτελεσματικότητα της συνδυασμένης θεραπείας 5-FU και η κουρκουμίνη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας ιστού σε DMEM /F12 (4,5 g /L ϋ-γλυκόζη) συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% αντιβιοτικό /αντιμυκητιασικό σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε μια ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO2. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε τρεις ημέρες, και τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας θρυψίνη /EDTA.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Η επίδραση της 5-FU, η κουρκουμίνη και του συνδυασμού τους επί του πολλαπλασιασμού και της βιωσιμότητας των HCT116 και HCT116 + CH3 κυττάρων προσδιορίστηκε με το 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο (ΜΤΤ) πρόσληψη μέθοδο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Εν συντομία, τα κύτταρα (2.500 ανά φρεάτιο) εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις της 5-FU ή η κουρκουμίνη, το καθένα εις τριπλούν, σε μία πλάκα 96 φρεατίων για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα στους 37 ° C για τον προσδιορισμό των επιμέρους IC

50 τιμές (κυτταρική αύξηση 50% ανασταλτικές συγκεντρώσεις). Επιπλέον, σε μια άλλη σειρά πειραμάτων, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 5 μΜ κουρκουμίνη για 4 ώρες και στη συνέχεια συν-επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 και 5 μΜ) για 24 ώρες για να προσδιοριστεί η βέλτιστη δόση για τη θεραπεία συνδυασμού. διάλυμα ΜΤΤ (5 mg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και η πλάκα επωάστηκε για 2 ώρες στους 37 ° C. Το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20% SDS και 50% φορμαμίδιο διμεθυλ) προστέθηκε, και τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Η απορρόφηση του κυτταρικού εναιωρήματος μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας μικροπλάκα Αποκάλυψη αναγνώστη πολλαπλής σάρωσης 96 φρεατίων (Dynex Technologies, Chantilly, VA). Τα δεδομένα που ελήφθησαν υπολογίστηκαν και παρουσιάζονται ως ποσοστό επιβίωσης σε σχέση με μη κατεργασμένους ελέγχους. Το IC

50 ορίστηκε ως η συγκέντρωση του φαρμάκου που απαιτείται για την αναστολή HCT116 ή HCT116 + CH3 κατά 50% σε σχέση με τους μάρτυρες. IC

50 τιμές υπολογίστηκαν από την καμπύλη απόκρισης δόσης. Τα δεδομένα που προέρχονται από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές ανεξάρτητα και η στατιστική ανάλυση έγινε για να ληφθούν οι τελικές τιμές.

χρώση ϋΑΡΙ των αποπτωτικών κυττάρων

Για να εξετάσει τις αλλαγές στην αποπτωτική HCT116 και HCT116 + CH3 κύτταρα, ϋΑΡΙ (4 ‘, 6’-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο, Hoechst 33258) δοκιμασία πυρηνική χρώση διεξήχθη. Για μονοστρωματικές καλλιέργειες 1 × 10

6 κύτταρα /πλάκα σπάρθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας ιστού 35-mm. Μετά 80-90% συρροή, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης ή 5-FU (0, 1, 5, 10 και 20 μΜ) ή ένα συνδυασμό κουρκουμίνης (5 μΜ) και 5-FU (0.1, 1, 2 και 3 μΜ), υπολογίζεται από τις IC

50 τιμές, για 24 ώρες. Μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη για 30 λεπτά στους 4 ° C στο σκοτάδι. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και στη συνέχεια διάλυμα DAPI απλώθηκε πάνω από τις πλάκες που ακολουθείται από επώαση για 1 ώρα στους 4 ° C στο σκοτάδι. Σημασμένα κύτταρα πλύθηκαν επανειλημμένα με PBS για την απομάκρυνση της περίσσειας λεκέ DAPI και αξιολογείται στο μικροσκόπιο φθορισμού (Leica, Γερμανία).

ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (TEM)

HCT116 και HCT116 + CH3 καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κουρκουμίνη (20 μΜ), 5-FU (5 μΜ) ή ένας συνδυασμός και των δύο (κουρκουμίνη 5 μΜ και 5-FU 1 μΜ σε HCT116, κουρκουμίνη 5 μΜ και 5-FU 0,1 μΜ σε HCT116 + CH3) για 12 , 24, 36, 48, 60 και 72 ώρες, αντίστοιχα, για να προσδιοριστεί η βέλτιστη χρόνο που απαιτείται για την αναστολή της ανάπτυξης κατά 50% των κυττάρων. Ηλεκτρονική μικροσκοπία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [30]. Εν συντομία, οι καλλιέργειες σταθεροποιήθηκαν για 1 ώρα σε στερεωτικό Karnovsky που ακολούθησε μετά την καθήλωση στο 1% O

so που

4 λύση. Μετά από αφυδάτωση σε σειρά αλκοόλης αύξουσα, οι καλλιέργειες ενσωματωμένα σε Εροη και αποκοπής υπέρλεπτων με Reichert-Jung Ultracut Ε (Darmstadt, Γερμανία). Οι τομές σε αντίθεση με ένα μίγμα 2% οξικό ουρανύλιο /κιτρικό μόλυβδο και εξετάστηκαν με ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Zeiss, Jena, Germany).

Ποσοτικοποίηση του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου

υπέρλεπτων τμήματα του ο δείγματα παρασκευάστηκαν και αξιολογήθηκαν με ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (ΤΕΜ 10? Zeiss). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό μορφολογική αξιολογήσεις και για τον καθορισμό του χρονικού σημείου κατά το οποίο το 50% των κυττάρων έδειξαν μιτοχονδριακές μεταβολές (MC) και /ή ήταν αποπτωτικά, ο αριθμός των κυττάρων με μορφολογικά χαρακτηριστικά του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου συμπεριλαμβανομένων MC προσδιορίστηκε με βαθμολόγηση 100 κύτταρα από 20 διαφορετικά μικροσκοπικά πεδία.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής

κύτταρα HCT116 (1 × 10

6) τοποθετήθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας ιστού 60-mm και μετά από περίπου 80% των κυττάρων ήταν συρροή υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 20 μΜ κουρκουμίνη, 5 μΜ 5-FU, ή συνδυασμός τους (5 μΜ κουρκουμίνη και 1 μΜ 5-FU) επί 12 και 24 ώρες. Σε ένα ξεχωριστό πείραμα, HCT116 + CH3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ κουρκουμίνη, 1 μΜ 5-FU, ή συνδυασμός τους (5 μΜ κουρκουμίνη και 0,1 μΜ 5-FU) επί 12 και 24 ώρες. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας παγωμένης αιθανόλης 70%, πλύθηκαν 2χ με PBS και μετά επαναιωρήθηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (10 μg /ml) και ριβονουκλεάσης Α (0,1%) σε PBS για 30 λεπτά. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Φθορισμού γεγονότα από σύμπλοκα ιωδιούχο προπίδιο-DNA προσδιορίστηκαν ποσοτικά μετά από διέγερση με λέιζερ της φθορίζουσας χρωστικής από ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων διαλογέα (FACS) (Becton Dickinson, CA) με απαρίθμηση κυττάρου 10.000 κύτταρα ανά δείγμα. Τέλος, το περιεχόμενο του DNA των κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με τη χρήση Cell Quest Software (Becton Dickinson). Πειράματα και ανάλυση πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Παρασκευή πυρηνικών και κυτταροπλασματικών εκχυλισμάτων για την αξιολόγηση του ΝΡ-κΒ μετατόπιση

Τα πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Εν συντομία, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 400 μΙ υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης για 20 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν με 12.5 μΙ 10% Nonidet Ρ-40. Το ομογενοποίημα φυγοκεντρήθηκε για 1,5 λεπτά, και το υπερκείμενο (κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα) αποθηκεύθηκε κατεψυγμένο στους -70 ° C. Στη συνέχεια, 25 μΐ ρυθμιστικού παγωμένου πυρηνικής εκχύλισης προστέθηκε στα σφαιρίδια και επωάστηκαν για 30 λεπτά με διακοπτόμενη ανάμειξη. Τα εκχυλίσματα φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο (πυρηνικά εκχυλίσματα) μεταφέρθηκε σε προ-ψύξη σωλήνες για αποθήκευση στους -70 ° C.

Απομόνωση του μιτοχονδριακού εκχυλισμάτων για ανίχνευση του κυτοχρώματος c αποδέσμευσης

Τα κύτταρα πλύθηκαν σε 1 ml παγωμένο PBS και τοποθετήθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα απομόνωσης μιτοχόνδρια (0.25 Μ σακχαρόζη, 0.2 mM EDTA, και 10 mM Tris-HCl, ρΗ 7.8) για 30 λεπτά, που ακολουθείται από ομογενοποίηση χρησιμοποιώντας ένα προ-ψυγμένο γυαλί ομογενοποιητή. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 1000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C. Απομονωμένα μιτοχόνδρια επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό απομόνωσης μιτοχόνδρια που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (5 μg /ml λευπεπτίνη, 5 μg /ml πεπστατίνη, 10 μg /ml απροτινίνη, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 100 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 10 mM φθοριούχο νάτριο, και 10 mM οξείδιο της φαινύλ).

Western ανάλυση κηλίδος

για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα της κουρκουμίνης, 5-FU ή η κουρκουμίνη /5-FU στο HCT116 και HCT116 + CH3 κυττάρων, προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου, κυτταροπλασματική , μιτοχονδριακό και πυρηνικά εκχυλίσματα από καλλιέργειες μονοστιβάδας παρασκευάστηκαν και κλασματοποιείται με SDS-PAGE [29], [32]. Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης των κυτταρικών εκχυλισμάτων προσδιορίσθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας δικιγχονινικού οξέος (Uptima? Interchim, Montlucon, Γαλλία) με χρήση BSA ως ένα πρότυπο. Ίσες ποσότητες (500 ng πρωτεΐνης ανά λωρίδα) του συνόλου των πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (5%, 7,5%, 12% πηκτώματα) υπό αναγωγικές συνθήκες.

Ανοσοποιητικό

συγκρότημα δοκιμασία κινάσης

Ανοσοποιητικό σύμπλοκο δοκιμασία κινάσης διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως λεπτομερώς [33]. Εν συντομία, για να ελεγχθεί η επίδραση της κουρκουμίνης και αναστολέα ΡΙ-3Κ (βορτμαννίνη) επί 5-FU-επαγόμενη ενεργοποίηση ΙΚΚ, διεξήχθησαν ανοσοσυμπλέγματος δοκιμασίες κινάσης. Το συγκρότημα ΙΚΚ ανοσοκαταβυθίστηκε από λύματα ολόκληρων κυττάρων με αντισώματα έναντι ΙΚΚ-α και ΙΚΚ-β και στη συνέχεια επωάστηκαν με σφαιρίδια πρωτεΐνης A /G-αγαρόζης (Pierce, Γερμανία). Μετά από 2 ώρες επώαση, τα σφαιρίδια πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και επαναιωρήθηκαν σε ένα διάλυμα δοκιμασίας κινάσης που περιείχε 50 mM HEPES (ρΗ 7,4), 20 mM MgCl2, 2 mM διθειοθρεϊτόλη, 10 μΜ μη επισημασμένου ΑΤΡ και 2 mg ΙΚΚ υποστρώματος GST-ΙκΒα ( αμινοξέων 1-54) και επωάστηκαν στους 30 ° C για 30 λεπτά. Αυτό ακολουθήθηκε με βρασμό σε ρυθμιστικό δείγματος SDS-PAGE για 5 λεπτά. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας SDS-PAGE υπό αναγωγικές συνθήκες όπως περιγράφεται παραπάνω. Η φωσφορυλίωση του GST-ΙκΒα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα έναντι φωσφο-ειδικό ΙκΒα (Ser 32/36). Για να καταδειχθούν τα συνολικά ποσά των ΙΚΚ-α και ΙΚΚ-β σε κάθε δείγμα, πρωτεΐνες ολόκληρων κυττάρων διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας SDS-PAGE υπό αναγωγικές συνθήκες όπως περιγράφεται παραπάνω. Ανίχνευση ΙΚΚ-α και ΙΚΚ-β πραγματοποιήθηκε με ανοσοστύπωμα είτε με αντι-ΙΚΚ-α ή αντι-ΙΚΚ-β αντισώματα.

Στατιστική ανάλυση

Τα αριθμητικά δεδομένα εκφράζονται ως μέσες τιμές ( +/- SD) για ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Τα μέσα συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας έλεγχος τ υποθέτοντας ίσες διακυμάνσεις. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές εάν η τιμή Ρ ήταν μικρότερη από 0,05.

Αποτελέσματα

Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να διερευνήσει τον τρόπο με κουρκουμίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC και ενισχύει τις επιδράσεις του χημειοθεραπευτικό παράγοντα 5-FU σε ένα

in vitro

μοντέλο των ανθρώπινων κυττάρων CRC. Επιπλέον, εξετάσαμε το μηχανισμό (ες) με την οποία η κουρκουμίνη ενισχύει τα αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της 5-FU, ιδίως όσον αφορά τις επιπτώσεις στην NF-κΒ και της ενεργοποίησης Src, NF-κΒ-ρυθμιζόμενο γονίδιο προϊόντα, και την ανάπτυξη των κυττάρων σε κύτταρα CRC. Δύο ανθρώπινα κύτταρα CRC (HCT116 και HCT116 + CH3) χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα έρευνα.

Η κουρκουμίνη ευαισθητοποιεί HCT116 και HCT116 + CH3 κύτταρα καρκίνου κόλου σε 5-FU-θεραπεία που οδηγεί σε μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό

Τα αποτελέσματα της 5-FU ή /και η κουρκουμίνη στη βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ σε HCT116 και HCT116 + CH3 κύτταρα (Σχ. 1). Βάσει αυτών των μετρήσεων, το IC

50 τιμές (50% της κυτταρικής ανάπτυξης ανασταλτικές συγκεντρώσεις) για το άτομο και συνδυασμένων φαρμάκων HCT116 και HCT116 + CH3 βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου του κόλου προσδιορίστηκαν. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης ή 5-FU (0, 1, 5, 10, 20, 40 και 80 μΜ) και η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι (Σχήμα 1Α & amp?. 1C ). Το άτομο IC

50 της κουρκουμίνης και 5-FU ήταν περίπου 20 μΜ και 5 μΜ σε κύτταρα HCT116 και 5 μΜ και 1 μΜ σε HCT116 + CH3 κύτταρα, αντίστοιχα (

ρ & lt?

0,05). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η κουρκουμίνη και 5-FU έχουν ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα σε κύτταρα CRC και ότι αυτά τα αποτελέσματα είναι πιο έντονα σε HCT116 + CH3 παρά σε κύτταρα HCT116

Α:. Κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις κουρκουμίνη ή 5-FU (0, 1, 5, 10, 20, 40 και 80 μΜ) για 24 ώρες και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με τη χρήση της μεθόδου ΜΤΤ. Συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης και 5-FU με αποτέλεσμα 50% αναστολή ανάπτυξης υποδείχθηκαν ως μεμονωμένες IC

50 αξίες. Β: κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με κουρκουμίνη (5 μΜ για 4 ώρες), στη συνέχεια εκτέθηκαν σε 5-FU σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 και 5 μΜ) για 24 ώρες και αξιολογήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. IC

50 για 5-FU σε συνδυασμένη θεραπεία προσδιορίστηκε στο 50% αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων HCT116. Τα ίδια πειράματα που δείχνονται στο (Α) και (Β) διενεργήθηκαν σε HCT116 + CH3 κύτταρα. IC

50 τιμές για τα ενιαία (C) και θεραπεία συνδυασμού (D) υπολογίστηκαν με βάση τις μετρήσεις ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα παρέχονται ως μέσες τιμές με τυπικές αποκλίσεις από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι τιμές συγκρίθηκαν με τον έλεγχο και στατιστικώς σημαντικές τιμές με ρ & lt?. 0.05

Η

Για να εξεταστεί η επίδραση συνδυασμένης θεραπείας της κουρκουμίνης και 5-FU, HCT116 ή HCT116 + CH3 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 5 μΜ κουρκουμίνη για 4 ώρες και στη συνέχεια συν-επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 και 5 μΜ) για 24 ώρες (Εικόνα 1Β & amp?. 1D). δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη και IC

50 τιμές προσδιορίστηκαν. Είναι ενδιαφέρον, προεπεξεργασία με 5 μΜ κουρκουμίνη μείωσε IC

50 τιμές για 5-FU με 1 μΜ σε HCT116 και 0,1 μΜ σε HCT116 + CH3 (

p & lt?

0.05) κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με κουρκουμίνη ήταν πιο ευαίσθητα σε 5-FU από τα κύτταρα που έλαβαν μόνο 5-FU και η εισαγωγή του χρωμοσώματος 3 στα κύτταρα HCT116 έδειξαν αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων στην θεραπεία με 5-FU ή /και η κουρκουμίνη σε σύγκριση με τον άγριο τύπο HCT116.

Ο συνδυασμός επίδραση της κουρκουμίνης και 5-FU επί της απόπτωσης σε HCT116 και HCT116 + CH3 κύτταρα

για να καθοριστεί αν η ανασταλτική δράση της κουρκουμίνης και 5-FU σε βιωσιμότητα των κυττάρων και την ανάπτυξη των κυττάρων σχετίζεται με την επαγωγή της απόπτωσης, HCT116 και HCT116 + CH3 κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33258 (DAPI). Αυτή η μέθοδος χρώσης φθορισμού που βασίζεται αποκαλύπτει αποπτωτικά σώματα που περιέχουν πυρηνικά κατακερματισμός και η συμπύκνωση της χρωματίνης σε αποπτωτικά κύτταρα. HCT116 και HCT116 + CH3 κύτταρα εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης ή 5-FU (0, 1, 5, 10 και 20 μΜ) ή σε ένα συνδυασμό κουρκουμίνης (5 μΜ) και 5-FU (0,1, 1, 2 και 3 μΜ). Εφαρμοσμένη συγκεντρώσεις υπολογίστηκαν από την IC

50-τιμές της κουρκουμίνης και 5-FU προσδιορίζεται με προσδιορισμούς ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, ο αριθμός των αποπτωτικών πυρήνων ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα της ομάδας θεραπείας συνδυασμού. Αυτό επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα στο Σχ. 1Β & amp? 1D και αποκάλυψε ότι η κουρκουμίνη ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα HCT116 του κόλου σε 5-FU-επαγόμενη απόπτωση. Επιπλέον, η αποκατάσταση της δραστηριότητας hMLH1 στα κύτταρα HCT116, με εισαγωγή του χρωμοσώματος 3, συσχετίστηκε με αυξημένη ευαισθησία σε 5-FU και 5-FU-επαγόμενη απόπτωση.

HCT116 και HCT116 + CH3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης ή 5-FU (0, 1, 5, 10 και 20 μΜ) ή ένα συνδυασμό κουρκουμίνης (5 μΜ) και 5-FU (0,1, 1, 2 και 3 μΜ) για 24 ώρες. Καλλιέργειες μονοστιβάδας βάφτηκαν με Hoechst 33258 (DAPI) να αποκαλύψει αποπτωτικά αλλαγές στις κυτταρικούς πυρήνες.

Η

Η κουρκουμίνη ενισχύει 5-FU που προκαλείται μιτοχονδριακές αλλαγές και απόπτωση σε HCT116 και HCT116 + CH3 κύτταρα

Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, HCT116 του κόλου καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κουρκουμίνη (20 μΜ), 5-FU (5 μΜ) ή σε συνδυασμό των δύο (κουρκουμίνη 5 μΜ και 5-FU 1 μΜ) για 12, 24, 36, 48, 60 και 72 h, αντίστοιχα. Η βιωσιμότητα και μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων προσδιορίστηκαν με υπερδομικές εξέταση με μικροσκοπία ηλεκτρονίων μετάδοσης. HCT116 κύτταρα καρκίνου κόλου σε καλλιέργειες ελέγχου επέδειξε μία στρογγυλεμένη /σφαιρική μορφολογία με μικρά κυτοπλασμικές διεργασίες, μεγάλους πυρήνες (ως επί το πλείστον ευχρωματινικούς) με διακριτές πυρηνίσκους και μια καλά οργανωμένη κυτταρόπλασμα σε όλη τη διάρκεια της θεραπείας (Σχήμα 3, Έλεγχος:. A-F). Θεραπεία των καλλιεργειών HCT116 με κουρκουμίνη ή 5-FU μόνη της μέχρι και 36 ώρες είχε ως αποτέλεσμα εκφυλιστικές αλλαγές, όπως είναι η εμφάνιση πολλαπλών κενοτόπια, πρήξιμο των μιτοχονδρίων και τραχύ ER και εκφυλισμό των άλλων κυτταρικών οργανιδίων (Εικ. 3, 5-FU, Cur : A-C). Οι μεγαλύτερες περίοδοι επώασης με κουρκουμίνη ή 5-FU (60 και 72 ώρες) είχε ως αποτέλεσμα περισσότερο κυτταρικό εκφυλισμό. Αυτό περιλάμβανε και τομείς της συνοπτικής ετεροχρωματίνης στα πυρήνες των κυττάρων και πολλαπλές, αυτοφαγικά κυτταροπλασματικά κενοτόπια? τα κύτταρα κατέστησαν αποπτωτικά (Σχήμα 3, 5-FU:. F, Cur: Ε-Ρ). Προεπεξεργασία των καλλιεργειών HCT116 με κουρκουμίνη (5 μΜ) για 4 ώρες, που ακολουθείται από συν-θεραπεία με 5-FU (1 μΜ) κατά την ίδια χρονική περίοδο αποκάλυψε μια ισχυρή επίδραση. Εκτεταμένες μορφολογικά χαρακτηριστικά εκφυλιστικές, μιτοχονδριακή διόγκωση και την απόπτωση βρέθηκαν ήδη από 36 ώρες σε κύτταρα HCT116 και συνέχισε να συσσωρεύονται μέχρι 72 ώρες (Εικόνα 3, Cur + 5-FU HCT116:. C). Σε σύγκριση με τα κύτταρα HCT116, εξετάσεις πραγματοποιήθηκαν επίσης σε HCT116 + CH3 κύτταρα που κατεργάζονται με ένα συνδυασμό 5 μΜ κουρκουμίνη και 0,1 μΜ 5-FU. Εδώ, αυτές οι επιδράσεις ήταν ακόμη πιο εμφανή και αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν ήδη μετά από 12 ώρες αγωγής (Σχήμα 3, Cur + 5-FU HCT116 + CH3: α.). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι η ευαισθησία σε 5-FU ενισχύθηκε δια προκατεργασίας με κουρκουμίνη και ότι αυτό επιδεινώθηκε σε HCT116 + CH3 κύτταρα.

κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με κουρκουμίνη (20 μΜ), 5-FU (5 μΜ) ή με συνδυασμό των δύο (5 μΜ κουρκουμίνη και 1 μΜ 5-FU) για 12, 24, 36, 48, 60 και 72 ώρες. Χρησιμοποιώντας ένα διαφορετικό κύτταρα HCT116 προσέγγιση + CH3 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα συνδυασμό 5 μΜ κουρκουμίνη και 0,1 μΜ 5-FU για 12, 24, 36, 48, 60 και 72 ώρες. Υπέρλεπτες τομές παρασκευάστηκαν και αξιολογήθηκαν με μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίου. Μικροφωτογραφίες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά όλων των πολιτισμών αξιολογούνται. Το νωρίτερο χρονικό σημείο όταν η απόπτωση ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά οι εικόνες είναι επισημασμένα βέλη. Οι μιτοχονδριακές μεταβολές (αιχμές βελών) εμφανίζεται. Μεγέθυνση: x5000, bar = 1 μm

Η

Η ποσοτικοποίηση και τη στατιστική αξιολόγηση των υπερδομής δεδομένων κατέδειξε σαφώς τα χρονικά εξαρτώμενη επιπτώσεις της κουρκουμίνης ή /και τη θεραπεία 5-FU στο μιτοχονδριακό αλλαγές (MC) και την απόπτωση. σε HCT116 και HCT116 + CH3 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α & amp? Β, περισσότερο από το 50% των κυττάρων παρουσίασαν MC ή αποπτωτικά χαρακτηριστικών στο χρόνο επώασης 24 h στα πειράματα συνδυασμό με κύτταρα HCT116 και στις 12 ώρες στα πειράματα συνδυασμό με HCT116 + CH3 κύτταρα (

ρ & lt?

0.05) . Και πάλι αυτό δείχνει ότι η κουρκουμίνη ευαισθητοποιεί HCT116 και HCT116 + CH3 κύτταρα σε 5-FU-επαγόμενη απόπτωση. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μία πολύ χαμηλή ποσότητα της 5-FU (0,1 μΜ) που απαιτείται για να καταστείλει τη βιωσιμότητα των κυττάρων όταν συνδυάζονται σε μια μέτρια δόση της κουρκουμίνης (5 μΜ). Επιπλέον, αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώνουν ότι η εισαγωγή του χρωμοσώματος 3 στα κύτταρα HCT116 αυξάνει σημαντικά την ευαισθησία των κυττάρων στην αγωγή με 5-FU και /ή κουρκουμίνης σε σύγκριση με τα κύτταρα HCT116.

Για να ποσοτικοποιηθούν οι λεπτήν ευρήματα, HCT116 (Α) και HCT116 + CH3 (β) τις καλλιέργειες σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Σχ. 3 εξετάστηκαν για αποπτωτική και μιτοχονδριακή αλλαγές (MC) μετρώντας 100 κύτταρα από 20 μικροσκοπικά πεδία. Η εξέταση πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και τα αποτελέσματα παρέχονται ως μέσες τιμές με τυπικές αποκλίσεις SD (

ρ

& lt? 0,05). Από τρία ανεξάρτητα πειράματα

Η

Επιδράσεις της κουρκουμίνης και /ή 5-FU επί του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε HCT116 και HCT116 + CH3 κύτταρα

για να εξετασθούν οι μηχανισμοί με τους οποίους η κουρκουμίνη ή /και 5-FU αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των HCT116 και HCT116 + CH3 κύτταρα, εξετάσαμε και συγκρίθηκαν τους επίδραση στο ρυθμό της αναστολής της ανάπτυξης και των επιπέδων της απόπτωσης. Επομένως, προσδιορίσαμε τη συμπεριφορά αυτών των δύο κυψελών CRC στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (Εικ. 5Α /Β). κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 20 μΜ κουρκουμίνη ή 5 μΜ 5-FU ή το συνδυασμό τους (5 μΜ κουρκουμίνη και 1 μΜ 5-FU) επί 12 και 24 ώρες. Σε ένα ανεξάρτητο πείραμα, HCT116 + CH3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ κουρκουμίνη ή 1 μΜ 5-FU ή το συνδυασμό τους (5 μΜ κουρκουμίνη και 0,1 μΜ 5-FU) επί 12 και 24 ώρες. Τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και επεξεργάστηκαν για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Η πιο σημαντική επίδραση τόσο στην ενιαία και συνδυασμένη θεραπεία ήταν ένα χρόνο και την εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση μείωση των κυττάρων στην G1 φάση και τη συσσώρευση των κυττάρων στην S-φάση του κυτταρικού κύκλου. Αυτή η επίδραση ήταν ακόμη πιο έντονη σε HCT116 + CH3 κύτταρα από ό, τι στα κύτταρα HCT116. Μετά από 12 ώρες θεραπείας, η οποία ήταν το νωρίτερο χρονικό σημείο που εξετάστηκαν, τα αποτελέσματα της κουρκουμίνης και /ή 5-FU επί του κυτταρικού κύκλου ήταν ήδη πολύ διακριτές. Εκτός από τις αλλαγές στην G1- και διανομή S-φάση, ο αριθμός των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση ήταν σημαντικά αυξημένα με τη θεραπεία. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα αποτελέσματα της θεραπείας συνδυασμού υπερέβη σαφώς εκείνα των μονών θεραπείες. Σε 24 ώρες θεραπείας, η επίδραση επί του κυτταρικού κύκλου έγινε συνολικά πιο έντονη στα δύο κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, αλλά ήταν ακόμη πιο εμφανής σε HCT116 + CH3 κύτταρα σε σχέση με τα κύτταρα HCT116. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ.