Αφηρημένο

1-μεθυλ-D-τρυπτοφάνη (1-D-ΜΤ) χρησιμοποιείται αυτή τη στιγμή σε κλινικές δοκιμές σε ασθενείς με υποτροπιάζουσα ή ανθεκτική συμπαγείς όγκους, με στόχο την παρεμπόδιση ινδολοαμίνης-2,3- διοξυγενάση (IDO) μεσολάβηση του όγκου του ανοσοποιητικού διαφυγής. IDO εκφράζεται σε όγκους και όγκο λεμφαδένες παροχέτευσης και υποβαθμίζει τρυπτοφάνης (trp) για τη δημιουργία ενός immunsuppressive micromilieu τόσο με τη μείωση trp και με τη συσσώρευση ανοσοκατασταλτική μεταβολίτες της κυνουρενίνης (Kyn) οδό. Εδώ δείχνουμε ότι ο πολλαπλασιασμός των αλλοαντιδραστικών Τ-κυττάρων συν-καλλιεργήθηκαν με IDO1-θετικά ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα παραδόξως ανεστάλη από 1-D-ΜΤ. Παραδόξως επώαση με 1-D-ΜΤ παραγωγή αυξήθηκε Kyn ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων. ανιχνεύσεις χωρίς κύτταρα αποκάλυψε ότι 1-D-ΜΤ δεν μετέβαλε την ενζυματική δραστηριότητα IDO1. Αντ ‘αυτού, 1-D-ΜΤ επαγόμενη IDO1 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης μέσω οδών που περιλαμβάνουν ρ38 ΜΑΡΚ και σηματοδότηση JNK. Θεραπεία των ασθενών με καρκίνο με 1-D-ΜΤ έχει μεταγραφική επιδράσεις που μπορεί να προωθήσει παρά την καταστολή κατά του όγκου άνοσο διαφυγής με την αύξηση IDO1 στα καρκινικά κύτταρα. Αυτές οι off-στόχο επιπτώσεις θα πρέπει να αναλυθούν προσεκτικά στις εν εξελίξει κλινικές δοκιμές με 1-D-MT

Παράθεση:. Opitz CA, Litzenburger UM, Opitz U, Sahm F, Ochs Κ, Lutz C, et al. (2011) Η ινδολοαμίνης-2,3-διοξυγενάση (IDO) Αναστολέας 1-μεθυλ-D-τρυπτοφάνη ρυθμίζει προς τα πάνω IDO1 σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 6 (5): e19823. doi: 10.1371 /journal.pone.0019823

Επιμέλεια: Matej Oresic, Κυβερνητικές Τεχνικό Κέντρο Ερευνών της Φινλανδίας, της Φινλανδίας

Ελήφθη: 25 του Νοεμβρίου του 2010? Αποδεκτές: 18, Απριλίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: May 20, 2011

Copyright: © 2011 Opitz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από την Ένωση Helmholtz (VH-NG-306) για να βουλευτή και του Ιδρύματος Hertie να WW. CAO υποστηρίζεται από το Πανεπιστήμιο της Χαϊδελβέργης Ιατρικής Σχολής μεταδιδακτορικής έρευνας. Όπως Uta Opitz και Χριστιανικό Lutz είναι υπάλληλοι της Χαϊδελβέργης Pharma, Χαϊδελβέργη Pharma είχε ένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα. Uta Opitz και Χριστιανικό Lutz είναι υπάλληλοι της Χαϊδελβέργης Pharma. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Τα τελευταία χρόνια τρυπτοφάνης (trp) υποβάθμιση έχει λάβει αυξανόμενη προσοχή ως ένα ισχυρό ανοσοκατασταλτικό μηχανισμό που εμπλέκονται στη διατήρηση της ανοσολογικής ανοχής. Η trp ένζυμο αποσυνθέσεως ινδολοαμίνης-2,3-διοξυγενάση (IDO) έχει ενοχοποιηθεί σε μητρικό ανεκτικότητα έναντι αλλογενών concepti [1], τον έλεγχο αυτοάνοσων ασθενειών [2], [3] και χρόνιας λοίμωξης [4], καθώς και την προώθηση των όγκων ανοσολογική διαφυγή [5], [6], [7]. IDO μεσολάβηση αποικοδόμηση trp δεν περιορίζεται σε κύτταρα όγκου [7], αλλά ανιχνεύεται επίσης σε όγκο λεμφαδένες παροχέτευσης [8]. Σε αμφότερες όγκο λεμφαδένες παροχέτευσης και όγκων, IDO1 δημιουργεί τοπική ανοχή με την άμεση καταστολή αποκρίσεων Τ-κυττάρων και την ενίσχυση της ανοσοκαταστολής που διαμεσολαβείται από ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Τ

reg

) [6]. IDO είναι χρονίως ενεργοποιείται σε πολλούς ασθενείς με καρκίνο [9] και η έκφρασή του ή ενζυμική δραστηριότητα σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με διάφορους καρκίνους όπως καρκίνωμα ωοθήκης [10], [11], ενδομητρικό καρκίνωμα [12], [13], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [14] και ορθοκολικού καρκινώματος [15].

Παρά το μεγαλύτερο μέρος των στοιχείων που υποστηρίζουν ένα ρόλο για IDO στην προώθηση σχηματισμού όγκων και όγκων του ανοσοποιητικού διαφυγής, έχουν υπάρξει μελέτες που δείχνουν μια δραστικότητα κατά του όγκου του IDO1. Η επαγωγή IDO1 έχει περιγραφεί ως ένας μηχανισμός με τον οποίο η ιντερφερόνη (IFN) -γ αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κακοήθων κυττάρων [16], [17]. Μερικά πειράματα σε ζώα έδειξαν ότι η έκφραση IDO1 συσχετιζόταν θετικά με την εξάλειψη των κακοηθών κυττάρων [18], [19]. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν σε κλινικές μελέτες που δείχνουν ότι παρά το γεγονός ότι ένας ισχυρός επαγωγέας IDO1, ΙΡΝ-γ ήταν αποτελεσματική στη θεραπεία καρκίνου των ωοθηκών και καρκίνο της ουροδόχου κύστης [20], [21], [22]. Επιπλέον, η έκφραση σε δείγματα IDO1 ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και στα ενδοθηλιακά κύτταρα του καρκινώματος νεφρικών κυττάρων συσχετίζεται θετικά με επιβίωση χωρίς εξέλιξη και μακροχρόνια επιβίωση, αντίστοιχα [23], [24]. έτσι Εκεί παραμένει αβεβαιότητα σχετικά με την κλινική σχετικότητα της έκφρασης IDO1 σε όγκους.

Σε προκλινικές μελέτες η IDO αναστολέα 1-μεθυλ-τρυπτοφάνη (1-ΜΤ) μείωσε τον όγκο του όγκου των ποντικών προανοσοποιηθείς με ένα αντιγόνο όγκου [7 ] και – σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες – προκάλεσε υποχώρηση των καθιερωμένων καρκίνων του μαστού ποντικού [5]. Ως εκ τούτου, Αναστολή της IDO σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία ή ως ανοσοενισχυτικό εμβολίου αντιπροσωπεύει μια ελκυστική προσέγγιση για ανοσοθεραπεία του καρκίνου [5], [6], [7], [25], [26]. Πρόσφατα, μια νέα IDO ισομορφή, που ονομάζεται IDO2 ανακαλύφθηκε, η οποία – όπως και IDO1 – εκφράζεται σε όγκους και όγκο λεμφαδένες παροχέτευσης [27]. Η τρίτη trp ένζυμο αποσυνθέσεως σε ανθρώπους, τρυπτοφάνη-2,3-διοξυγενάση (TDO) εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ και ρυθμίζει τις συγκεντρώσεις trp μετά διατροφική πρόσληψη trp. Ο αναστολέας IDO 1-ΜΤ υπάρχει ως δύο στερεοϊσομερή, 1-D-ΜΤ και 1-L-ΜΤ. Οι περισσότερες προκλινικές μελέτες έχουν χρησιμοποιηθεί το ρακεμικό μίγμα 1-D /L-ΜΤ για την αναστολή της IDO. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι IDO1 είναι η προτιμησιακή στόχος του 1-L-ΜΤ, ενώ 1-D-ΜΤ αναστέλλει κατά προτίμηση IDO2 [26], [27], [28], [29]. 1-D-ΜΤ χρησιμοποιείται επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές φάσης Ι σαν ένα πρόσθετο σε συμβατική χημειοθεραπεία με βάση την προκλινικών μελετών σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο. Ήμασταν ενδιαφέρονται για τις ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις της 1-D-ΜΤ στην IDO1-θετικά ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα.

Αποτελέσματα

1-D-MT προκαλεί ανοσοκαταστολή των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων

SKOV-3 κύτταρα ιδιοσυστατικά αποικοδομούνται trp να Kyn και εκφράζουν υψηλά επίπεδα mRNA IDO1 ενώ IDO2 και TDO mRNA εκφράζονται σε χαμηλά επίπεδα (Σχ. 1Α). Εξόντωση IDO1 με siRNA σε SKOV-3 κύτταρα μειωμένη έκφραση IDO1 mRNA με 87,5% (Σχ. 1 Β) που οδηγεί σε μία ισχυρή μείωση της έκφρασης πρωτεΐνης IDO1 όπως αποδεικνύεται από την Western Blot (Σχ. 1C) και ανοσοκυτοχημεία (Σχ. 1D). Τέλος, η παραγωγή Kyn ανεστάλη κατά 91,4% στα IDO1 knockdown κυττάρων σε σύγκριση με τη μέση παραγωγή Kyn του SKOV-3 κύτταρα επιμολυσμένα χωρίς siRNA είτε με μη-στόχευσης ελέγχου siRNA (Σχ. 1Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι IDO1 είναι κυρίως υπεύθυνη για η συστατική παραγωγή Kyn σε SKOV-3 κύτταρα. Για να προσδιοριστεί η επίδραση της θεραπείας 1-ΜΤ στον φαινότυπο ανοσορυθμιστική των καρκινικών κυττάρων, διεξήχθησαν SKOV-3 πειράματα συγκαλλιέργειας /MLR. Η προσθήκη Kyn (Εικ. 2Α) ή την παρουσία SKOV-3 κύτταρα (Σχ. 2Β) ανέστειλαν αλλοαντιδραστικός πολλαπλασιασμό Τ κυττάρου σε MLR. Εξόντωση IDO1 με siRNA αντιστραφεί όχι μόνο τη SKOV-3 μεσολάβηση κυττάρων καταστολή του πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων, αλλά ακόμη και αυξημένο πολλαπλασιασμό Τ κυττάρων (Σχ. 2C), πιθανώς λόγω επιπλέον αλλογενή διέγερση των Τ κυττάρων με το IDO ανεπάρκεια SKOV-3 κύτταρα. Στη συνέχεια εξετάσαμε τις επιδράσεις των δύο στερεοϊσομερών του 1-ΜΤ. Η προσθήκη 1-μεθυλο-L-τρυπτοφάνη (1-L-ΜΤ) αντέστρεψε επίσης την καταστολή του πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων στα πειράματα συγκαλλιέργειας SKOV-3 /MLR (Σχ. 2D). Παραδόξως, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Τ δεν ενισχύθηκε αλλά αναστέλλεται σε συνκαλλιέργειες επεξεργασία με 1-μεθυλ-D-τρυπτοφάνη (1-D-ΜΤ, Σχ. 2Ε). Η προσθήκη του trp αυτή δεν άλλαξε αναστολή, υποδεικνύοντας ότι η εξάντληση trp δεν εμπλέκεται σε αυτό το παράδοξο αποτέλεσμα της 1-D-ΜΤ (Σχ. 2F). Στη συνέχεια αναλύσαμε την επίδραση του 1-D-ΜΤ για την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SKOV-3, όπως μία ανασταλτική δράση του 1-D-ΜΤ επί κυττάρων SKOV-3 θα μπορούσε να εξηγήσει την πρόσληψη μειώνεται

3Η θυμιδίνης σε τα πειράματα συγκαλλιέργειας (Εικ. 3). Ωστόσο, 1-D-ΜΤ μεταβληθεί ούτε

πρόσληψη 3Η θυμιδίνης (Σχ. 3Α) ούτε την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου του SKOV-3 κύτταρα (Σχ. 3Β). Για να αποκλειστεί, ότι το 1-D-ΜΤ θα μπορούσε να ανασταλεί

θυμιδίνης 3Η του SKOV-3 κύτταρα μόνο όταν αυτά καλλιεργήθηκαν στον πολλαπλασιασμό MLR, Τ κυττάρων σε συνκαλλιέργειες του SKOV-3 κύτταρα με MLR με την παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεις 1-D-ΜΤ μετρήθηκε με χρώση CFSE και κυτταρομετρία ροής (Σχ. 3C). 1-D-ΜΤ εξάρτηση από τη συγκέντρωση ανέστειλε πολλαπλασιασμό Τ κυττάρου επίσης σε αυτές τις δοκιμασίες (Εικ. 3C), επιβεβαιώνοντας έτσι ότι το 1-D-ΜΤ αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ και όχι τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SKOV-3 στις συνκαλλιέργειες.

(Α) σχετική έκφραση του mRNA των τριών ενζύμων trp αποικοδόμησης IDO1, IDO2 και τρυπτοφάνη-2,3-διοξυγενάση (TDO) (λευκές ράβδοι) και την παραγωγή Kyn (μαύρη μπάρα) του SKOV-3 κύτταρα, μετρήθηκε με ποσοτική RT-PCR και υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC). (Β) Νοκ ντάουν του

IDO1

mRNA με siRNA μετράται με qRT-PCR. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει IDO1 έκφραση πρωτεΐνης σε SKOV-3 κύτταρα με siRNA μεσολαβεί knockdown του IDO1 σε σύγκριση με τους ελέγχους. (D) Ανοσοκυτοχημεία (κόκκινο, χρώση IDO1? Μπλε, πυρηνική χρώση DAPI) ελέγχου κυττάρων SKOV-3 και τα κύτταρα SKOV-3 με IDO1 νοκ ντάουν. απελευθέρωσης (Ε) Kyn του SKOV-3 κύτταρα μετά knockdown του IDO1 σε σύγκριση με τους ελέγχους. Τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον εις τριπλούν. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM. * (P & lt? 0,05)

Η

(Α) πολλαπλασιασμό αλλοαντιδραστικά Τ κυττάρων μετά την προσθήκη 25 μΜ Kyn σε μικτές αντιδράσεις λευκοκυττάρων (MLR).. (Β) πολλαπλασιασμός αλλοαντιδραστικά Τ κυττάρου σε παρουσία 6.000 SKOV-3 κύτταρα. (Γ) Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε MLR συν-καλλιεργήθηκαν με 2,000 ελέγχου SKOV-3 κύτταρα (λευκή ράβδος) ή 2000 SKOV-3 κύτταρα με ένα knockdown του IDO1 (μαύρη γραμμή). τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (D) Τ σε συνκαλλιέργειες του MLR με 2.000 SKOV-3 κύτταρα μετά την προσθήκη αυξανόμενων συγκεντρώσεων 1-L-ΜΤ. τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Ε) Τ σε συνκαλλιέργειες του MLR με 2.000 SKOV-3 κύτταρα μετά την προσθήκη αυξανόμενων συγκεντρώσεων 1-D-ΜΤ. (F) Εκπρόσωπος αποτέλεσμα της MLR /SKOV-3 πειράματα συγκαλλιέργειας με PBMC από πέντε διαφορετικούς δότες και 2000 ή 6000 κύτταρα SKOV-3. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 1 mM 1-D-MT σε συνδυασμό με ή χωρίς 250 μΜ trp. Ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε με

3 [Η] πρόσληψη methylthymidine. Τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον εις τριπλούν. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM. * (P & lt? 0,05)

Η

(Α)

3 [Η] ενσωμάτωση methylthymidine της SKOV-3 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 1 mM 1-D-ΜΤ (μαύρη γραμμή) ή όχημα (λευκό. bar) για 6 ημέρες. (Β) ανάλυση κυτταρικού κύκλου των κυττάρων SKOV-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 1 mM 1-D-ΜΤ ή οχήματος για 48 ώρες. (C) Ανάλυση Πολλαπλασιασμός CFSE χρωματισμένων λεμφοκυττάρων από 6 ημέρα συγκαλλιέργειες του MLR με 2.000 SKOV-3 κύτταρα, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις 1-D-ΜΤ (άνω πάνελ). Plot των αριθμών των κυττάρων σε κάθε γενεά του παραπάνω πειράματος (κάτω πλαίσιο).

Η

1- D-ΜΤ αυξάνει την παραγωγή Kyn σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα

Στη συνέχεια εξετάσαμε το αποτέλεσμα της 1-ΜΤ για την παραγωγή Kyn του SKOV-3 κύτταρα. Παραδόξως, 1-D-ΜΤ εξάρτηση από τη συγκέντρωση αυξημένο σχηματισμό Kyn (Σχ. 4Α), ενώ στερεοϊσομερές 1-L-ΜΤ σχηματισμός ανέστειλε Kyn του όπως αναμένεται (Σχ. 4Α). Το ρακεμικό μίγμα 1-ΜΤ, η οποία έχει χρησιμοποιηθεί σε πολλές μελέτες, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που έχουν καθιερώσει IDO1 ως ένα ανοσοκατασταλτικό ένζυμο, ανέστειλε το σχηματισμό Kyn, αν και λιγότερο από 1-L-ΜΤ μόνο (Σχ. 4Α). Όπως συγκεντρώσεις trp στα μέσα μαζικής ενημέρωσης μπορεί να έχουν περιορίσει την αύξηση της παραγωγής Kyn, μετρήσαμε επίσης τις συγκεντρώσεις Kyn παράγονται από SKOV-3 κύτταρα σε απόκριση προς 1-D-ΜΤ παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων trp. Υπό αυτές τις συνθήκες πολύ υψηλότερες συγκεντρώσεις Kyn επιτεύχθηκαν (Εικ. 4Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι το οροπέδιο που παρατηρήθηκε παραπάνω συγκεντρώσεις περίπου 250 μΜ 1-D-ΜΤ (Σχ. 4Α) ήταν λόγω της περιορισμένης διαθεσιμότητας trp. Οι συγκεντρώσεις Trp σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας ποικίλουν συνήθως μεταξύ 12 και 20 μΜ, ενώ οι συγκεντρώσεις σε ανθρώπινο ορό εύρος μεταξύ 50 και 70 μΜ. σχηματισμός Kyn σε κύτταρα κατεργασμένα με 1-D-ΜΤ ήταν περισσότερο έντονη όταν οι συγκεντρώσεις trp υπάρχουν στον ανθρώπινο ορό (62,5 μΜ) και όχι συγκεντρώσεις trp παρούσα στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας (15 μΜ) χρησιμοποιήθηκαν (Εικ. 4C). Ωστόσο, η φορές αύξηση στην Kyn με προσθήκη trp ήταν ίση σε κύτταρα κατεργασμένα με ή χωρίς 1-D-ΜΤ (Εικ. 4C). Για να ελέγξετε περαιτέρω εάν 1-D-MT επηρεάζει άμεσα την ενζυματική δραστηριότητα IDO1 μετρήσαμε IDO1 μεσολάβηση της παραγωγής Kyn στο SKOV-3 εκχυλίσματα κυττάρων. 1-D-ΜΤ δεν μετέβαλε σχηματισμός Kyn ανεξάρτητα από το αν trp ήταν παρόν σε μια σταθερή συγκέντρωση 100 μΜ (Εικ. 4D), ή σε συγκεντρώσεις ισομοριακές προς 1-D-ΜΤ (Εικ. 4Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αύξηση του σχηματισμού Kyn με 1-D-ΜΤ σε SKOV-3 δεν διαμεσολαβείται από ένα άμεσο αποτέλεσμα του 1-D-ΜΤ στην ενζυματική δραστηριότητα IDO1.

συγκεντρώσεις Kyn (Α) που απελευθερώνεται από SKOV-3 κύτταρα μετά από επεξεργασία με 1- D-ΜΤ (λευκοί κύκλοι), 1-L-ΜΤ (μαύροι κύκλοι) και το ρακεμικό μίγμα του 1-ΜΤ (μαύρα τρίγωνα) μετρήθηκε μετά από 48 ώρες με HPLC. (Β) απελευθέρωση Kyn του SKOV-3 κύτταρα σε απόκριση προς 500 μΜ 1-D-ΜΤ παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων trp. απελευθέρωσης (C) Kyn του SKOV-3 κύτταρα σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του trp μόνο (ανοικτοί κύκλοι) ή σε συνδυασμό με 1 mM 1-D-ΜΤ (γεμάτοι κύκλοι) μετρήθηκε μετά από 48 ώρες με HPLC. παραγωγής (Δ) Kyn σε IDO1 ενζυματικές δοκιμασίες διεξάγονται με την παρουσία 100 μΜ trp σε συνδυασμό με την αύξηση του 1-D-ΜΤ συγκεντρώσεις. παραγωγής (Ε) Kyn ενζύμου IDO1 παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων trp μόνο (ανοικτοί κύκλοι) ή σε συνδυασμό με 1-D-ΜΤ (γεμάτοι κύκλοι). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM. * (Ρ & lt? 0,05).

Η

IDO1 έκφραση ενισχύεται με 1-D-ΜΤ σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα

Στη συνέχεια, διερευνήσαμε κατά πόσον 1-D-ΜΤ επηρέασε την έκφραση του trp-ένζυμα μεταβολισμού. Προς έκπληξή μας, βρήκαμε ότι το 1-D-MT αυξήθηκε IDO1 mRNA και πρωτεΐνης σε SKOV-3 κύτταρα, ενώ IDO2 και TDO παρέμειναν αμετάβλητα (Εικ. 5Α). Προς τα πάνω ρύθμιση IDO1 mRNA ήταν εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση (Σχ. 5Β) και εντοπίστηκε για πρώτη φορά μετά από 16 ώρες επώασης με 1-D-ΜΤ (Εικ. 5C). Σημαντικά, οι επιδράσεις IDO1 προαγωγής δεν περιορίζονται σε SKOV-3 κύτταρα. Ενώ 1-D-ΜΤ δεν προκάλεσε

de novo

IDO1 mRNA έκφρασης και Kyn παραγωγής σε καρκινικά κύτταρα του τραχήλου IDO1 αρνητικά HeLa, αυξήθηκε IDO1 mRNA και παραγωγή Kyn μετά την επαγωγή της έκφρασης IDO1 και την παραγωγή Kyn από IFN- γ (Σχ. 6Α, Β). Είναι ενδιαφέρον ότι η 1-D-ΜΤ-μεσολαβούμενη αυξητική ρύθμιση του IDO1 mRNA σε πολλές IDO1-αρνητικά καρκινικά κύτταρα ήταν εξαρτώμενη διαφορικά της συγκέντρωσης ΙΡΝ-γ που χρησιμοποιήθηκε για την επαγωγή

de novo

έκφραση του IDO1 (Σχ. 6C). Μετά από διέγερση με κατάλληλες συγκεντρώσεις ΙΡΝ-γ, 1-D-MT αυξήθηκε IDO1 mRNA και παραγωγή Kyn σε ένα πάνελ διαφορετικών καρκινικών κυττάρων (Σχ. 6C-F), υποδεικνύοντας μια καθολική μηχανισμό 1-D-ΜΤ-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της IDO1 .

(Α) Αριστερό πλαίσιο: mRNA έκφραση του IDO1, IDO2 και TDO σε SKOV-3 κύτταρα μετά από επεξεργασία με 1 mM 1-D-ΜΤ, αναλύθηκαν μετά από 24 ώρες από qRT-PCR. Δεξιό πλαίσιο: Western Blot ανάλυση της έκφρασης IDO1 σε SKOV-3 κύτταρα που εκτελούνται μετά από 48 ώρες 1 mM 1-D-ΜΤ. GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) έκφραση IDO1 mRNA σε απόκριση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις 1-D-ΜΤ μετρήθηκε μετά από 24 ώρες από qRT-PCR. ανάλυση (C) Χρονική πορεία της επαγωγής IDO1 mRNA με 1 mM 1-D-ΜΤ, αναλύθηκαν με qRT-PCR. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM. * (Ρ & lt? 0,05).

Η

(Α) Αντιπροσωπευτική γραφήματα HPLC παραγωγής Kyn κυττάρων HeLa, τα οποία ήταν είτε χωρίς θεραπεία, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 mM 1-D-ΜΤ και /ή 1000 U ΙΡΝ γ για 72 ώρες. Η απορρόφηση του Kyn μετρήθηκε στα 365 nm. (Β) Σε μη επεξεργασμένα κύτταρα HeLa 1 mM 1-D-ΜΤ δεν προκάλεσε

de novo

IDO1 mRNA, αλλά αυξήθηκε IDO1 mRNA μετά την επαγωγή της από 1.000 U έκφρασης του mRNA της ΙΡΝ-γ αναλύθηκε με qRT-PCR 24 h μετά τη θεραπεία. (C) Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα της επίδρασης των διαφορετικών συγκεντρώσεων IFN-γ σε επαγωγή IDO1 mRNA με 1-D-ΜΤ, που δείχνεται σε κύτταρα γλοιώματος U251. (D) έκφραση mRNA IDO1 της αναγραφόμενης κυτταρικές σειρές που διεγέρθηκαν για 24 ώρες με κατάλληλες συγκεντρώσεις ΙΡΝ-γ μόνο (λευκές ράβδοι) ή σε συνδυασμό με 1 mM 1-D-ΜΤ (μαύρες μπάρες). (Ε) Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα επαγωγής IDO1 mRNA με 200 μΜ 1-D-ΜΤ σε IFN-γ-διεγερμένα κύτταρα γλοιώματος T98G. απελευθέρωσης (F) Kyn της αναγραφόμενης κυτταρικές σειρές που διεγέρθηκαν για 72 ώρες με κατάλληλες συγκεντρώσεις ΙΡΝ-γ μόνο (λευκές ράβδοι) ή σε συνδυασμό με 1 mM 1-D-ΜΤ (μαύρες ράβδοι), μετρήθηκε με HPLC. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM. * (P & lt? 0,05).

Η

1-D-MT-μεσολάβηση έκφραση IDO1 περιλαμβάνει JNK και p38 ΜΑΡΚ

Στη συνέχεια διερευνώνται οδών που εμπλέκονται στην ρύθμιση προς τα άνω των IDO1 σε απάντηση σηματοδότησης θεραπεία 1-D-ΜΤ. IFN-μεσολάβηση φωσφορυλίωση STAT1 εμπλέκεται στην επαγωγή IDO1 σε πολλούς διαφορετικούς ιστούς και κύτταρα [30], αλλά knockdown του STAT1 με siRNA δεν μειώνουν την παραγωγή Kyn του 1-D-ΜΤ-κατεργασμένα κύτταρα (Σχ. 7Α). Σύμφωνα με αυτό το αποτέλεσμα, 1-D-ΜΤ δεν επάγουν την έκφραση του mRNA της ΙΡΝ-β ή ΙΡΝ-γ (Σχ. 7Β). έχουν ενεργοποιημένη πρωτεΐνη κινάση (ΜΑΡΚ) οδοί Μιτογόνου έχει αναφερθεί ότι ρυθμίζεται από το ρακεμικό μίγμα του 1-ΜΤ και με τον τρόπο αυτό να επηρεάσει την πόλωση των δενδριτικών κυττάρων (DC) [31]. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε εάν η αναστολή της ΜΑΡΚ σηματοδότησης επηρέασε το 1-D-ΜΤ-διαμεσολαβούμενη αύξηση στην έκφραση IDO1. Αναστολή της φωσφορυλίωσης ERK από PD98059 επηρεάζονται έκφραση IDO1 mRNA και την απελευθέρωση Kyn ούτε σε μη επεξεργασμένα ούτε σε 1-D-ΜΤ κύτταρα που υπέστησαν αγωγή (Σχ. 8Α). Ενώ η αναστολή της φωσφορυλίωσης ρ38-ΜΑΡΚ με SB203580 [32] μειώνεται ελαφρώς IDO1 mRNA σε μη επεξεργασμένα κύτταρα, μετριάζεται σχεδόν πλήρως την αύξηση στην έκφραση mRNA IDO1 σε απόκριση προς 1-D-ΜΤ (Εικ. 8Β). Η ελαφρά αναστολή της IDO1 μεταγραφέα σε μη επεξεργασμένα κύτταρα δεν μεταφράζεται σε σημαντικά μειωμένη απελευθέρωση Kyn, ενώ η μείωση στην απελευθέρωση Kyn έγινε σημαντική σε 1-D-ΜΤ κύτταρα που υπέστησαν αγωγή (Εικ. 8Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν αναστολή JNK από SP600125 (Εικ. 8C) [33]. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν, ότι ΜΑΡΚ ρ38 και JNK σηματοδότησης εμπλέκονται στη διαμεσολάβηση της επαγωγής IDO1 σε απόκριση προς 1-D-ΜΤ.

(Α) εξόντωση STAT1 mRNA με SI-RNA (λευκές ράβδοι) δεν επηρέασε Kyn απελευθέρωσης (μαύρες ράβδοι) 1-D-ΜΤ (1 mM) κατεργάζεται SKOV-3 κύτταρα. (Β) Ανάλυση της ΙΡΝ-γ και η έκφραση του mRNA της ΙΡΝ-β σε SKOV-3 κύτταρα μετά από διέγερση με 1 mM 1-D-ΜΤ επί 24 ώρες.

Η

IDO1 mRNA (αριστερό πάνελ) και Kyn απελευθέρωσης (δεξί πάνελ) του SKOV-3 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με (Α) 50 μΜ του PD98059 αναστολέα ΜΕΚ1, (Β) 20 μΜ του SB203580 αναστολέα ΜΑΡΚ p38 και (Γ) 20 μΜ του SP600125 ή έλεγχος αναστολέα JNK 1 ώρα πριν προσθήκη 1 mM 1-D-ΜΤ αναλύθηκαν με qRT-PCR μετά από 24 ώρες και HPLC μετά από 48 ώρες, αντίστοιχα. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SEM. * (Ρ & lt? 0,05)

Η

Συζήτηση

Στο παρελθόν αναστολή IDO ως επί το πλείστον επιτυγχάνεται με τη χρήση του ρακεμικού μίγματος του 1-ΜΤ [34].. Όπως έγινε φανερό ότι η αναστολή IDO μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου, τα επιμέρους στερεοϊσομερή των 1-ΜΤ ερευνήθηκαν με μεγαλύτερη λεπτομέρεια [5], [35]. Αν και 1-L-ΜΤ αποδείχθηκε ότι αναστέλλει πιο αποτελεσματικά IDO1 σε δοκιμασίες ενζύμου και σε κυτταρικές σειρές καρκίνου, 1-D-ΜΤ έδειξαν ανώτερη αντικαρκινική δραστικότητα σε μοντέλα ποντικού και ως εκ τούτου επελέγη για κλινικές δοκιμές [35]. Μια μεταγενέστερη μελέτη προτείνει ότι η ανώτερη αντικαρκινική δραστικότητα του 1-D-ΜΤ μπορεί να προκύψει από την αναστολή της ισομορφής IDO2 [27]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι 1-D-ΜΤ αναστέλλει δραστικότητα IDO ούτε σε δενδριτικά κύτταρα, ούτε σε κύτταρα όγκου [26], [28] και δεν αποκαθιστά αποτελεσματικά IDO επαγόμενη σύλληψη του πολλαπλασιασμού των Τ-κυττάρων [36]. Στη μελέτη μας, 1-D-ΜΤ κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων όταν ιδιοσυστατικά IDO1 κύτταρα που εκφράζουν SKOV-3 καλλιεργήθηκαν με μικτές αντιδράσεις λεμφοκυττάρων (Εικ. 2Ε, F). Διερεύνηση των υποκείμενων μηχανισμών απροσδόκητα αποκάλυψαν ότι 1-D-ΜΤ αύξησε την παραγωγή Kyn των καρκινικών κυττάρων με δραστικότητα IDO1 (Εικ. 4, 6) λόγω της προς τα πάνω ρύθμιση IDO1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης (Εικ. 5, 6). Η προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης και της δραστηριότητας IDO1 παρατηρήθηκε μόνο σε καρκινικά κύτταρα με έκφραση IDO1 είτε ιδιοσυστατική ή ΙΡΝ-γ που προκαλείται (Εικ. 5, 6). Προς τα πάνω ρύθμιση IDO1 από 1-D-ΜΤ σε πολλά καρκινικά κύτταρα ήταν περισσότερο εμφανής σε μέτριες συγκεντρώσεις ΙΡΝ-γ που είναι πιθανό να μοιάζουν με φυσιολογικές συγκεντρώσεις (Σχ. 6C). Χαμηλές συγκεντρώσεις IFN-γ δεν μπορεί να προκάλεσε επαρκή έκφραση IDO1 (Εικ. 6C), πιθανώς εξηγεί γιατί 1-D-ΜΤ δεν αύξησε IDO1 σε αυτές τις συγκεντρώσεις, ενώ η διέγερση με πολύ υψηλές συγκεντρώσεις ΙΡΝ-γ μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την μέγιστη IDO1 επαγωγής (Εικ. 6C), εξηγώντας έτσι γιατί δεν παρατηρήθηκε περαιτέρω αύξηση κατά 1-D-ΜΤ. Σε όλα τα εξετάστηκαν IDO1-κύτταρα που εκφράζουν μια αύξηση στην έκφραση και Kyn απελευθέρωση IDO1 παρατηρήθηκε σε απόκριση σε θεραπεία με 1-D-ΜΤ, υποδεικνύοντας μία γενική μηχανισμός που εμπλέκεται σε 1-D-ΜΤ-διαμεσολαβούμενη επαγωγή IDO1 (Σχ. 4, 5, 6).

σε προηγούμενη μελέτη, το ρακεμικό μίγμα του 1-ΜΤ έχει αναφερθεί να τροποποιήσει την πόλωση των δενδριτικών κυττάρων (DC) διαμορφώνοντας ΜΑΡΚ [31]. Αναστολή της φωσφορυλίωσης ρ38 ΜΑΡΚ απέτρεψε την αύξηση IDO1 mRNA και παραγωγή Kyn από 1-D-ΜΤ (Εικ. 8Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι η ρ38-ΜΑΡΚ συμμετέχει σε 1-D-ΜΤ μεσολάβηση σηματοδότηση. Σύμφωνα με αυτό το αποτέλεσμα, p38 ΜΑΡΚ έχει προηγουμένως δειχθεί ότι συνεισφέρουν στην επαγωγή IDO1 σε μία κυτταρική γραμμή λευχαιμίας και στο DC [37], [38]. Επίσης η αναστολή της σηματοδότησης JNK μετρίασε την επαγωγή του mRNA και IDO1 απελευθέρωση Kyn παρουσία 1-D-ΜΤ (Εικ. 8C). Η αναστολή της φωσφορυλίωσης JNK έχει πρόσφατα περιγραφεί ότι μειώνει την έκφραση IDO1 που προκαλείται από LPS σε μικρογλοία ποντικού [39]. 1-D-MT μεσολάβηση διαμόρφωση της p38-MAPK και JNK δείχνει ότι 1-D-ΜΤ μπορεί να έχει περισσότερες επιπτώσεις από την απλή ρύθμιση προς τα άνω του IDO1.

Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση της 1-D- MT-διεγερτών στην γονιδιακή έκφραση σε ανθρώπινα κύτταρα. Το στερεοϊσομερές του 1-D-ΜΤ, 1-L-ΜΤ αναφέρθηκε πρόσφατα για την καταστολή της IFN-γ-επαγόμενη έκφραση IDO1 σε κύτταρα καρκινώματος του ορθού ποντικού [40]. Επιπλέον, έχει περιγραφεί προηγουμένως ότι το 1-ΜΤ επηρεάζει την ωρίμανση των DC ανεξάρτητα από IDO [31]. Ωστόσο το ρακεμικό μίγμα του 1-ΜΤ χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη και είναι ως εκ τούτου δεν είναι γνωστό ποια στερεοϊσομερούς ήταν υπεύθυνος για τις παρατηρούμενες επιδράσεις [31]. Μένει να διευκρινιστεί αν 1-D-ΜΤ ασκεί περισσότερο επιδράσεις στην γονιδιακή έκφραση από την ρύθμιση του IDO1. Σε αντίθεση με IDO1, το ένζυμο IDO2 trp-καταβολισμού δεν προκλήθηκε με 1-D-ΜΤ. Αυτό το εύρημα τονίζει την αντίληψη ότι IDO1 και IDO2 ρυθμίζονται διαφορικά σε ένα μετεγγραφικό επίπεδο [27]. Πιθανές άλλες επιδράσεις του 1-D-ΜΤ στη γονιδιακή έκφραση μπορεί να συνεισφέρουν στην υψηλή αποτελεσματικότητα κατά του όγκου του 1-D-ΜΤ παρατηρήθηκαν σε μοντέλα όγκου ποντικού [35]. υπάρχουν σημαντικές διαφορές στην έκφραση IDO και ρύθμιση μεταξύ ανθρώπων και ποντικών [29], [41], το οποίο θα μπορούσε να εξηγήσει τις παρατηρούμενες διαφορές σχετικά με τη δράση 1-D-MT σε μοντέλα ποντικών και των ανθρώπινων κυττάρων. Σε μια μελέτη με τη χρήση 1-D-MT στη SIV μολυσμένα ρέζους μακάκους, ένα μοντέλο που μοιάζει περισσότερο τον άνθρωπο από μοντέλα ποντικών, Boasso και οι συνεργάτες παρατήρησαν ότι τα επίπεδα Kyn πλάσμα δεν μειώθηκαν αλλά μάλλον επάγεται κατά τη διάρκεια της θεραπείας με 1-D-ΜΤ [42 ]. Αυξημένη έκφραση IDO1 mRNA σε λεμφαδένες της μακάκους μετά τη θεραπεία 1-D-ΜΤ ερμηνεύτηκε ως αντισταθμιστικό μηχανισμό αντισταθμιστικής ενεργοποιείται από 1-D-ΜΤ, που μπορεί να αντιπροσωπεύουν την έλλειψη επίδρασης στην Kyn πλάσμα [42]. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η προς τα πάνω ρύθμιση του IDO1 και Kyn λάβει χώρα επίσης σε απομονωμένα ανθρώπινα κύτταρα, στα οποία ένας μηχανισμός αντισταθμιστικής που μεσολαβεί ανοσοκαταστολή είναι απίθανο.

Καθώς υπάρχουν ενδείξεις ότι IDO1 μπορεί να περιορίσει την ανάπτυξη του όγκου ως μεσολαβητής της ογκοκτόνο IFN -γ σε πειραματικά μοντέλα και σε ασθενείς [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22] και ως έκφραση IDO1 σε όγκους συσχετίζεται θετικά με την επιβίωση χωρίς εξέλιξη και μακροπρόθεσμη όρος επιβίωση σε μερικές μελέτες [23], [24] είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι η επαγωγή της IDO1 από 1-D-ΜΤ μπορεί στην πραγματικότητα αντιπροσωπεύουν μερικά από τα αποτελέσματα κατά του όγκου του 1-D-ΜΤ.

εν κατακλείδι, έχουμε εντοπίσει την προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης IDO1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα ως μια βαθιά επίδραση του 1-D-ΜΤ, μια ένωση που χρησιμοποιείται σήμερα σε κλινικές μελέτες σε ασθενείς με υποτροπιάζουσα ή ανθεκτική συμπαγείς όγκους, με στόχο την αναστολή (IDO ) μεσολάβηση του όγκου του ανοσοποιητικού διαφυγής. έκφραση IDO1 είναι γνωστό ότι είναι ανοσοκατασταλτική και μπορεί να ενισχύσει το ανοσοποιητικό όγκου διαφυγής, αλλά έχει επίσης εμπλακεί σε άμεσα αποτελέσματα κατά του όγκου. Οι περισσότερες μελέτες που απαιτούνται για την καλύτερη κατανόηση του ρόλου της IDO στη βιολογία του καρκίνου και την πιθανή χρήση της 1-D-ΜΤ ως αντικαρκινικού παράγοντα.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

SKOV-3 και ΝΙΗ: 3 OVCAR-κυττάρων καρκινώματος ωοθηκών καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α Medium (BioConcept, Allschwil, Switzerland) συμπληρωμένο με Ε-Τφ όπως υποδεικνύεται (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία), 300 mg /L γλουταμίνη (Carl Roth, Karlsruhe, Germany), 10% FBS (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, μΑ, USA) και 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (ΡΑΑ Laboratories, Pasching, Αυστρία). κύτταρα τραχηλικού καρκινώματος HeLa, Α375 κακοήθη κύτταρα μελανώματος, LN18, LNT229, T98G και U251 κύτταρα κακοήθους γλοιώματος διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM, ΡΑΑ) που περιείχε 10% FBS (Thermo Fisher Scientific Inc) και 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (ΡΑΑ Laboratories). Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) απομονώθηκαν από πέντε υγιή, μη συγγενών αίματος δοτών με βαθμίδωσης πυκνότητας φυγοκέντρηση χρησιμοποιώντας διαχωρισμού λεμφοκυττάρων μέσου LSA 1077 (ΡΑΑ Laboratories) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (ΡΑΑ Laboratories) που περιέχει 10% FBS (Thermo Fisher Επιστημονική Inc) και 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (ΡΑΑ Laboratories). Όλα τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε εξετάσεις ρουτίνας για μόλυνση από τη Multiplex κύτταρο Μόλυνση δοκιμής [43]. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα

20 mM διαλύματα παρακαταθήκης του 1-μεθυλ-D-τρυπτοφάνη (1-D-ΜΤ, αριθμοί παρτίδας: 09315BH, 08007EJ). και 1-μεθυλο-L-τρυπτοφάνη (1-L-ΜΤ, αριθμοί παρτίδας: 08023HE, 15399MJ) (Sigma-Aldrich) παρασκευάστηκαν με διάλυση των αναστολέων σε 0.1 Ν ΝαΟΗ. Το ρΗ ρυθμίστηκε στο 7,5 χρησιμοποιώντας υδροχλωρικό οξύ. Για να αποφευχθεί η μόλυνση των κυτταρικών καλλιεργειών, τα αποθεματικά διαλύματα filfotered μέσω 0,2 μm φίλτρων. IFN-γ αγοράσθηκε από Immunotools (Friesoythe, Γερμανία). φωσφορυλίωση ERK ανεστάλη με τη χρήση του αναστολέα PD98059 ΜΕΚ1 (Cell Signaling Technology, Beverly ΜΑ, USA). Η κινάση c-Jun Ν-τερματικό (JNK) SP600125 αναστολέα και ο αναστολέας της φωσφορυλίωσης ρ38 κινάσης SB203580 αγοράστηκαν από Enzo Life Sciences (Lörrach, Γερμανία).

Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC)

υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) διεξήχθη σύμφωνα με το [44] χρησιμοποιώντας ένα Beckman HPLC με σειρά φωτοδιόδων (PDA) ανίχνευση και Lichrosorb RP-18 στήλη (250 mm × 4 mm ΙΟ, 5 μm, Merck, Darmstadt, Γερμανία ). αποδέσμευσης Kyn και αποικοδόμησης trp μετρήθηκαν στο μέσο του 3 * 10

5 κύτταρα σε 2 5Α ml μέσου McCoy του (BioConcept) που περιέχει 10% FBS (Perbio), 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (ΡΑΑ Laboratories ) συμπληρωμένο με 0-125 μΜ L-trp (Sigma-Aldrich). Το μέσο συλλέχθηκε από πλάκες 6 φρεατίων σε δεικνυόμενα χρονικά σημεία, φυγοκεντρήθηκε και καταψύχθηκαν μέχρι περαιτέρω ανάλυση. Μετά την απόψυξη, τα δείγματα συμπληρώθηκαν με τριχλωροξεικό οξύ για καταβύθιση πρωτεΐνης, φυγοκεντρήθηκε και 100 μΙ του υπερκείμενου αναλύθηκε με HPLC. Πρότυπες καμπύλες παράχθηκαν με L-Kyn και L-trp (Sigma-Aldrich) στο ίδιο μέσο. Από FBS περιέχει Kyn, χαμηλές συγκεντρώσεις Kyn (~ 1 μΜ) ανιχνεύθηκαν σε όλα τα δείγματα και μέσο χωρίς κύτταρα ήταν πάντα μετρήθηκε για σύγκριση.

Ποσοτική (q) RT-PCR

συνολικό RNA απομονώνονται με τη Qiagen RNAeasy κιτ απομόνωσης RNA (Hilden, Germany) και το DNA συνετέθη με την Applied Biosystems ανάστροφης μεταγραφής-Kit (Foster City, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. QRT-PCR προδιαμορφωμένοι με ΑΒΙ 7000 θερμικό ανακυκλωτή με SYBR Green PCR βασικού μείγματος (Applied Biosystems) σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα. Οι αντιδράσεις PCR ελέγχθηκαν με τη συμπερίληψη δεν-RT-ελέγχων, με παράλειψη των προτύπων και τόσο από την καμπύλη τήξης και ανάλυση ζελέ. Πρότυπες καμπύλες παράχθηκαν για κάθε γονίδιο. Σχετική ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης προσδιορίστηκε με σύγκριση των τιμών κατωφλίου. Όλα τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν σε GAPDH, το οποίο κυμαινόταν ούτε με IFN-γ, ούτε θεραπεία 1-D-MT

Primer ακολουθίες ήταν (5′-3 ‘προς τα εμπρός, πίσω):.

CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC, TGAGCGATGTGGCTCGGCT (GAPDH),

TTCAGTGCTTTGACGTCCTG, TGGAGGAACTGAGCAGCAT (IDO1),

TGCTTCATGCCTTTGATGAG, GAAGGCCTTATGGGAAGGAG (IDO2),

ACTGCCTCAAGGACAGGATG? AGCCAGGAGGTTCTCAACAA (IFN-β),

TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA? TCCTTTTTCGCTTCCCTGTTTT (IFN-γ),

AGGAAAAGCAAGCGTAATCTTCA? TATTCCCCGACTGAGCCTGAT (STAT1),

GGTTCCTCAGGCTATCACTACC? CAGTGTCGGGGAATCAGGT (TDO)

Η

πειράματα siRNA

Για να IDO1 (Ινδο) και STAT1 ON-TARGETplus SMART-πισίνα siRNA από Dharmacon RNA Technologies (Lafayette, CO, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) knockdown χρησιμοποιήθηκε.

Οι αλληλουχίες ήταν ως εξής:

Ανθρώπινο Ινδο, NM_002164

, αίσθηση, 5′-UCACCAAAUCCACGAUCAUUU-3 ‘, αντίθετης φοράς, 5′-PUAUGCGAAGAACACUGAAAUU-3′? sense, 5’-UUUCAGUGUUCUUCGCAUAUU-3 ‘, αντινόημα, 5′-PUAUGCGAAGAACACUGAAAUU-3′? sense, 5’-GUAUGAAGGGUUCU GGGAAUU -3 ‘, αντινόημα, 5′-PUUCCCAGAACCCUUCAUACUU-3′? αίσθηση, 5’-GAA CGGGACACUUUGCUAAUU-3 ‘, αντίθετης φοράς, 5′-PUUAGCAAAGUGUCCCGUUCUU-3’

Ανθρώπινο STAT1, NM_139266

, αίσθηση, 5′-GCACGAUGGGCUCAGCUUUUU-3 ‘, αντίθετης φοράς, 5 «-PAAAGCUGAGCCCAUCGUGCUU-3 ‘? sense, 5’-CUACGAACAUGACCCUAUCUU-3 ‘, αντινόημα, 5′-PGAUAGGGUCAUGUUCGUAGUU-3′? sense, 5’-GAACCUGACUUCCAUG CGGUU-3 ‘, αντινόημα, 5′-PCCGCAUGGAAGUCAGGUUCUU-3′? αίσθηση, 5’-AGAAAGAG CUUGACAGUAAUU-3 ‘, αντίθετης φοράς, 5′-PUUACUGUCAAGCUCUUUCUUU-3’.

Η

ON-TARGETplus siCONTROL μη στόχευση πισίνα (D-001810-10-05, Dharmacon) και η επιμόλυνση χωρίς siRNA χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες.

Για την επιμόλυνση του siRNA, η Amaxa Nucleofector Kit V (Amaxa Biosystems, Koeln, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε. Εν συντομία, 3 * 10

5 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 100 μΐ του διαλύματος nucleofector V και αναμιγνύεται με 1,5 μg του siRNA, τότε με ηλεκτροδιάτρηση χρησιμοποιώντας V005 πρόγραμμα. Το μέσο αλλάχθηκε μετά από 24 ώρες, η ανάλυση του περιεχομένου Kyn του μέσου με HPLC, η συγκομιδή των κυττάρων για την εκχύλιση του RNA ή την παραγωγή προϊόντων λύσης και ανοσοκυτταροχημική ανάλυση διεξήχθησαν μετά από 48 ώρες.

ανάλυση κηλίδος Western

λύματα πλήρων κυττάρων παρασκευάστηκαν σε παγωμένο τρις ​​(υδροξυμεθυλ) αμινομεθάνιο υδροχλωρίδιο (Tris-HCI, 50 mM, ρΗ 8,0? Ο Carl Roth) που περιέχει 150 mM NaCl (JT Baker, Deventer, Ολλανδία), 1% Triton Χ-100 (Applichem, Darmstadt, Γερμανία), 10 mM EDTA (Gerbu Biotechnik, Gaiberg, Γερμανία), 200 mM διθειοθρεϊτόλη (Carl Roth), 3% 2-μερκαπτοαιθανόλη (Sigma-Aldrich), 100 μΜ φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο (PMSF), 10 μg /mL απροτινίνη και 5 μg /mL λευπεπτίνη (Carl Roth) και φυγοκεντρήθηκε στους 4 ° C (10 λεπτά, 13 000 rpm).