Αφηρημένο

επιγενετικές μεταβολές, συμπεριλαμβανομένης της ανώμαλης μεθυλίωσης του DNA, έχει ως αποτέλεσμα αλλαγμένο γονίδιο έκφραση και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση. Τα φυτοχημικά, όπως η σουλφοραφάνη (SFN) και 3,3′-Diindolylmethane (DIM) υποσχόμενη χημειοπροληπτική παράγοντες για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Και οι δύο έχουν αποδειχθεί ότι επάγουν επανέκφραση των γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των ογκοκατασταλτικών γονιδίων σιγήσει σε καρκινικά κύτταρα, μέσω της διαφοροποίησης των επιγενετικών σημάτων που περιλαμβάνουν DNA μεθυλίωση. Ωστόσο, παραμένει ασαφές τα αποτελέσματα SFN και DIM στο μεθυλίωσης του DNA σε γενωμική κλίμακα. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει το γονιδίωμα-ευρεία επιδράσεις της SFN και DIM για μεθυλίωση προαγωγού σε κανονικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα και κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Τόσο SFN και DIM θεραπεία μειωμένη έκφραση μεθυλτρανσφεράση DNA στα φυσιολογικά κύτταρα επιθηλιακά προστάτη (PrEC), και εξαρτώμενων από ανδρογόνα (LnCAP) και ανεξάρτητος από ανδρογόνο καρκινικών κυττάρων (PC3) του προστάτη. Οι επιδράσεις της SFN και DIM στο προφίλ μεθυλίωση προαγωγού σε κανονική PrEC, LnCAP και καρκινικά κύτταρα προστάτη PC3 προσδιορίστηκαν με χρήση ανοσοκατακρήμνισης μεθυλο-DNA που ακολουθείται από το γονιδίωμα-ευρεία γκάμα μεθυλίωση του DNA. Δείξαμε εκτεταμένες αλλαγές στα πρότυπα μεθυλίωσης υποκινητή, συμπεριλαμβανομένων τόσο αυξάνεται και μειώνεται μεθυλίωσης, σε όλες τις κυτταρικές σειρές τρία προστάτη σε απόκριση σε SFN ή DIM θεραπείες. Ειδικότερα, SFN και DIM αλλοιωμένη μεθυλίωση προαγωγού σε χωριστές σειρές γονιδίων σε PrEC, LnCAP, και τα κύτταρα PC3, αλλά μοιράζονται παρόμοιους στόχους γονίδιο εντός ενός κυτταρική γραμμή. Δείξαμε επίσης ότι SFN και ΔΗΜ αντιστραφεί πολλές από τις σχετίζονται με τον καρκίνο μεθυλίωση μεταβολές, συμπεριλαμβανομένης έκτροπα μεθυλιωμένα γονίδια που έχουν απορρυθμιστεί ή έχουν μεγάλη συμμετοχή στην εξέλιξη του καρκίνου. Συνολικά, τα δεδομένα μας πρότειναν ότι τόσο SFN και DIM είναι επιγενετικές ρυθμιστές που έχουν ευρεία και πολύπλοκες επιδράσεις στα προφίλ μεθυλίωσης του DNA τόσο σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα επιθηλιακά προστάτη. Τα αποτελέσματα από τη μελέτη μας μπορεί να παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τις επιγενετικές μηχανισμούς μέσω των οποίων SFN και ΔΗΜ ασκούν καρκίνο chemopreventive επιπτώσεις τους

Παράθεση:. Wong CP, Hsu Α, Buchanan Α, Palomera-Sanchez Ζ, Beaver LM, Houseman ΕΑ , et al. (2014) Επιδράσεις των σουλφοραφάνη και 3,3′-Diindolylmethane για Genome-Wide υποστηρικτής μεθυλίωση σε φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα και κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 9 (1): e86787. doi: 10.1371 /journal.pone.0086787

Επιμέλεια: Bernard W. Futscher, Το Πανεπιστήμιο της Αριζόνα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Αύγ, 2013? Αποδεκτές: 13 Δεκ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Wong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ χορηγεί CA90890, CA65525, CA122906, CA122959, CA80176, R01GM104977, και από NIEHS Κέντρο Ρ30 επιχορήγηση ES00210. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή μηχανισμοί

Επιγενετική είναι απαραίτητα για τη ρύθμιση και τη διατήρηση πρότυπα γονιδιακής έκφρασης. Η κακή ρύθμιση της επιγενετικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της μεθυλίωσης παρεκκλίνουσα του DNA, τροποποίηση ιστονών, και προφίλ microRNA, να οδηγήσει σε αλλοιωμένη γονιδιακή έκφραση και λειτουργία και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση. Ειδικότερα, οι εκτεταμένες αλλαγές στα πρότυπα μεθυλίωσης του DNA που παρατηρούνται κατά την έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου, η οποία χαρακτηρίζεται από παγκόσμια και site-specific υπομεθυλίωσης DNA, καθώς και υπερμεθυλίωση προαγωγού γονιδίου-ειδικό [1], [2]. DNA υπομεθυλίωση στον καρκίνο μπορεί να συμβάλει στην γονιδιώματος αστάθεια και αυξημένη έκφραση των ογκογονιδίων. Από την άλλη πλευρά, το DNA υπερμεθυλίωση μπορεί να οδηγήσει σε αποσιώπηση γονιδίων καταστολής όγκου, παράγοντες μεταγραφής, καθώς και γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Η δημιουργία και η συντήρηση των προτύπων μεθυλίωσης του DNA διαμεσολαβούνται από μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMTs) [3]. Η υπερέκφραση του DNMTs παρατηρείται σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένης της λευχαιμίας [4], παγκρεατικό καρκίνο [5], γαστρικού καρκίνου [6], τον καρκίνο του πνεύμονα [7], και του καρκίνου του προστάτη [8], και απορυθμισμένη έκφραση DNMT πιθανό είναι ένα από τα συμβάλλουν παράγοντες που οδηγούν σε παρεκκλίνουσα μοτίβα μεθυλίωσης του DNA κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου. Σε αντίθεση με γενετικές μεταλλάξεις, επιγενετικές μεταβολές είναι δυνητικά αναστρέψιμη και αντιπροσωπεύουν ένα ελκυστικό και πολλά υποσχόμενο στόχο για στρατηγικές καρκίνο χημειοπροφύλαξη. Πολλοί επιγενετικών φαρμάκων που αναπτύχθηκε για να αντιστραφεί η μεθυλίωση του DNA και την τροποποίηση των ιστονών ανωμαλίες στον καρκίνο είναι επί του παρόντος υπό διερεύνηση. Εκτός από φαρμακολογικών παραγόντων, ένας αυξανόμενος αριθμός των απαραίτητων μικροθρεπτικών και διαιτητικές φυτοχημικά έχουν δειχθεί ότι δρουν ως διαμορφωτές επιγενετική, και είναι ελκυστικοί υποψήφιοι για χρήση στη θεραπεία επιγενετικές [9], [10]. Η ικανότητα των διατροφικών παραγόντων που ασκούν επιγενετικές επιδράσεις υπογραμμίζει τη δυνητική σημασία των συγκεκριμένων θρεπτικών συστατικών και βιοενεργά φυτοχημικά σε επιγενετικές στρατηγικές ρύθμισης και χημειοπροφύλαξη του καρκίνου.

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη πιο κοινή διάγνωση του καρκίνου στους άνδρες στις Ηνωμένες Πολιτείες [11 ]. Η διατροφή είναι ένα τροποποιήσιμο παράγοντα κινδύνου και μπορούν να επηρεάσουν την ευαισθησία στην ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη. κίνδυνο καρκίνου του προστάτη έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζεται αντιστρόφως με την κατανάλωση σταυρανθή λαχανικά [12], [13]. Ειδικότερα, η σουλφοραφάνη (SFN) και 3,3′-Diindolylmethane (DIM), δύο φυτοχημικά που προέρχονται από γλυκοζινολικών στα σταυρανθή λαχανικά έχει αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματική χημειοπροληπτική παράγοντες κατά του καρκίνου του προστάτη [14], [15]. SFN είναι ένας ισοθειοκυανικό που προέρχεται από την υδρόλυση του glucoraphanin, και DIM είναι ένα σημαντικό προϊόν οξύ συμπύκνωσης ινδόλη-3-καρβινόλη (I3C), ένα προϊόν υδρόλυσης glucobrassicin. Οι αντικαρκινικές επιδράσεις τόσο SFN και ΔΗΜ είναι πολύπλευρη, με τη συμμετοχή διαφόρων χημειοπροληπτικές μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης της επαγωγής της φάσης 2 ενζύμων, αύξηση της απόπτωσης, διέγερση διακοπής του κυτταρικού κύκλου, και η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Πιο πρόσφατα, αυξάνοντας στοιχεία δείχνουν ότι SFN και DIM μπορούν επίσης να δρουν ως επιγενετική διαμορφωτές και ασκούν αντικαρκινικές ιδιότητες με τη στόχευση επιγενετικές σήματα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Για παράδειγμα, SFN και DIM μπορεί να αναστείλει αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) δραστηριότητες, μεταβάλλουν έκφραση HDAC, και να οδηγήσει σε εκ νέου έκφραση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων [16], [17]. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι SFN μπορούν να αναστείλουν την έκφραση DNMT και μεταβάλλουν μεθυλίωσης του DNA στον προστάτη και κύτταρα καρκίνου του μαστού, που αντιπροσωπεύει ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο χημειοπροφύλαξη SFN ρυθμίζει επιγενετικώς γονιδιακή έκφραση [18] – [20]. Η διπλή επιδράσεις της SFN στην αναστολή HDAC και μεθυλίωσης του DNA είναι μια ελκυστική διατροφικές παράγοντας χημειοπροφύλαξης κάνουν. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τις επιδράσεις της SFN σε άλλες παρεκκλίνοντα μεθυλιωμένα γονίδια στόχοι, καθώς και αν SFN έχουν διαφορετικές επιδράσεις επί των μεθυλίωσης του DNA σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Επιπλέον, απομένει να καθοριστεί αν DIM μπορεί να ασκήσει παρόμοια διπλή επιγενετικές επιδράσεις και ρυθμίζουν μεθυλίωση του DNA σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Αυτή η τρέχουσα μελέτη διεξήχθη για τον προσδιορισμό των γονιδίωμα-ευρεία επιδράσεις της SFN και DIM για μεθυλίωση προαγωγού σε φυσιολογικό προστάτη και επιθηλιακά κύτταρα καρκίνου του προστάτη κύτταρα. Υποθέτουμε ότι και οι δύο SFN και ΔΗΜ είναι αποτελεσματικές διαιτητικές διαμορφωτές της μεθυλίωσης του DNA λόγω ανασταλτική δράση τους στην έκφραση DNMT. Υποθέτουμε επιπλέον ότι SFN και DIM μπορεί να επηρεάσει διαφορικά τα προφίλ μεθυλίωσης προαγωγό σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα επιθηλιακά προστάτη, και αντίστροφη παρεκκλίνουσα μεθυλιωμένα γονίδια σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Η μελέτη μας θα αυξήσει την κατανόησή μας για τους στόχους μεθυλίωσης του SFN και DIM, και να παρέχει γνώσεις σχετικά με τις επιγενετικές μηχανισμούς μέσω των οποίων SFN και ΔΗΜ ασκούν καρκίνο χημειοπροληπτικές τα αποτελέσματά τους.

Υλικά και Μέθοδοι

Πολιτισμός τηλέφωνα και θεραπεία Συνθήκες

Κανονικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (PrEC) ελήφθησαν από την Lonza (Allendale, NJ) και καλλιεργήθηκαν σε PrEC βασικά μέσα που περιέχουν συμπληρώματα PrEGM SingleQuot Kit και αυξητικούς παράγοντες (Lonza, Allendale, NJ). Ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη (LnCAP) και επιθηλιακά κύτταρα μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη (PC3) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA), και καλλιεργήθηκαν σε μέσα RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή σε 5% CO

2 και 37 ° C. SFN (LKT Laboratories, St. Paul, ΜΝ) και DIM (Sigma, St. Louis, ΜΟ) διαλύονται σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). PrEC, LnCAP, και PC3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με τον έλεγχο του οχήματος (0,03% DMSO), 15 μΜ SFN, ή 15 μΜ DIM σε βιολογικά τριπλούν για χρήση σε συστοιχίες μεθυλίωσης του DNA. Η δόση της θεραπείας επελέγη ώστε να αντικατοπτρίζει φυσιολογικά σχετικές συγκεντρώσεις των SFN και DIM [21], [22]. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά την θεραπεία για χρήση σε δοκιμασίες μεθυλίωσης ή χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) δοκιμασίες. Για προσδιορισμούς γονιδιακής έκφρασης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 72 ώρες μετά τη θεραπεία. Σε ομάδες που έλαβαν θεραπεία με παράγοντα απομεθυλίωσης DNA, 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (ΑΖΑ), 5 μΜ ΑΖΑ χρησιμοποιήθηκαν και τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία.

Προετοιμασία δείγματος για μεθυλίωσης του DNA Array

Ένα σύνολο 27 δείγματα υποβλήθηκαν για ανάλυση DNA συστοιχίας μεθυλίωσης, συμπεριλαμβανομένων των δειγμάτων από κάθε μία από τις τρεις κυτταρικές γραμμές που έλαβαν θεραπεία με χειριστήρια του οχήματος (η = 3 ανά κυτταρική σειρά), DIM (η = 3 ανά κυτταρική σειρά), και SFN (η = 3 ανά κυτταρική σειρά). Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας DNeasy Blood & amp? Ιστού Kit (Qiagen, Valencia, CA). Για γονιδιωματικό κατακερματισμού του DNA, καθαρισμένο DNA υποβλήθηκε σε πέψη με ένζυμο περιορισμού ΜδθΙ (New England Biolabs, Ίπσουιτς, ΜΑ) όλη τη νύκτα στους 37 ° C για να δώσει θραυσμάτων DNA μεταξύ 200 έως 1000 bp. Μεθυλιωμένο ϋΝΑ εμπλουτίστηκε με χρήση ανοσοκατακρήμνισης μεθυλ-DNA (MeDIP) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Roche NimbleGen, Madison, WI). MeDIP εμπλουτισμένο DNA καθώς επίσης και είσοδο DNA ενισχύθηκε με GenomePlex ολοκληρωμένο σύνολο κιτ Genome Amplification (Sigma). Το ενισχυμένο MeDIP και DNA εισόδου δείγματα υποβλήθηκαν σε Κέντρο Genome Research & amp? πυρήνα Βιοϋπολογιστική εγκατάσταση (Oregon State University, Corvallis, OR) για την επισήμανση του δείγματος, υβριδοποίηση του δείγματος, και σάρωση πίνακα. υβριδοποίηση του δείγματος και σάρωσης σειρά έγιναν χρησιμοποιώντας NimbleGen υβριδισμός Σύστημα 4 (Roche) και Axon GenePix Pro 4200 Α (Molecular Device, Sunnyvale, CA), αντίστοιχα.

Η μεθυλίωση του DNA Array Ανάλυση Δεδομένων

NimbleGen χρησιμοποιήθηκε ανθρώπινο DNA η μεθυλίωση 3 × 720 K CpG νησί Plus REFSEQ υποστηρικτής Array (Roche) με βάση την απελευθέρωση γονιδίωμα HG18. Η διάταξη περιείχε 720.000 ανιχνευτές 50-75 bp σε μήκος με μία μέση απόσταση ανιχνευτή 104 bp, καλύπτοντας 30.848 μεταγραφές, 22.532 υποστηρικτές, και 27.728 CpG νησιά. Οι πρώτες εντάσεις της σαρωμένης εικόνας τόσο για Cy5 και Cy3 διαύλους εξήχθησαν χρησιμοποιώντας την NimbleScan (Roche). Τα αρχεία ζεύγος πρώτων ένταση εισήχθησαν στην στατιστική περιβάλλον προγραμματισμού R χρησιμοποιώντας λογισμικό προσαρμοσμένο R.

Προσδιορισμός των ανιχνευτών με σημαντική κλιμακούμενες log

2 αναλογία.

Οι αναλογίες της έντασης του σήματος, παρήχθησαν αφαιρώντας τις μεταμορφωθεί καταγραφής εντάσεις κανάλι IP από τα μετασχηματισμένα καταγραφής εντάσεις κανάλι εισόδου. Οι αναλογίες επικεντρώνεται σε μια βάση ανά δείγμα από τη λειτουργία του Tukey biweight. Ανιχνευτές με σημαντική κλιμακούμενες log

αναλογία 2 εντοπίστηκαν από το λογισμικό NimbleScan χρησιμοποιώντας προκαθορισμένες παραμέτρους, όπως προβλέπεται από τον κατασκευαστή.

Διαφορική μεθυλίωση φορές αλλαγή μεταξύ των κυτταρικών σειρών ή /και θεραπείες.

ζεύγη συγκρίσεις πραγματοποιήθηκαν μέσω της εκ νέου παραμετροποίησης για να καθορίσει κυτταρική σειρά και τα αποτελέσματα της θεραπείας. Τυπικά σφάλματα και βαθμών ελευθερίας εξήχθησαν και χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή t-στατιστικές και καθορισμός της σημασίας.

δεδομένα array μεθυλίωση αποτέθηκαν σε Έκφραση NCBI Gene Omnibus, αριθμός ένταξης GSE47017.

Κατάλογος των ιχνηλατών με σημαντική log2 πολλαπλή μεταβολή (τιμή-ρ & lt? 0,05) σύγκριση μεταξύ της θεραπείας (SFN ή DIM) έναντι του ελέγχου του οχήματος, ή συγκρίνοντας μεταξύ καρκίνου του προστάτη κύτταρα (έλεγχος οχήματος) έναντι των φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων προστάτη (έλεγχος οχήματος) παρήχθησαν . Ανιχνευτές με σημαντική πολλαπλή μεταβολή χαρτογραφήθηκαν σε σχολιασμένο χαρακτηριστικά στο ανθρώπινο γονιδίωμα (HG18) και οπτικοποιείται χρησιμοποιώντας Generic Γονιδίωμα Browser (GBrowse) [23]. Ανιχνευτές μέσα σε 2 kb ανάντη και 1 kb κατάντη της θέσης έναρξης της μεταγραφής (TSS) συμπεριλήφθηκαν στις αναλύσεις στην παρούσα έκθεση. Ιεραρχική συσταδοποίηση αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας λογισμικό MeV [24]. Διαγράμματα Venn συγκρίνοντας την επικάλυψη των διαφόρων καταλόγων γονιδίου παράχθηκαν με BioVenn [25]. Γονίδιο εμπλουτισμό και λειτουργικές αναλύσεις σχολιασμό έγιναν με τη χρήση βάσεων δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery v6.7 (David) [26]. Λειτουργικό εργαλείο σχολιασμού ομαδοποίηση αυτή χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό σημαντικά εμπλουτισμένη Γονιδιακή Οντολογία (GO) τους όρους μέσα σε κάθε clusters σχολιασμό. χαρτογράφηση επιγονιδιώματος σημαντικά διαφορικά μετουσιωμένο ανιχνευτές για την κωδικοποίηση δεδομένων τροποποίηση των ιστονών έγινε χρησιμοποιώντας EpiExplorer [27].

Εκκαθάριση δεδομένων μεθυλίωση του DNA

Επιλέξτε διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια, όπως καθορίζεται από NimbleGen σειρά μεθυλίωση επικυρώθηκαν από Pyrosequencing. Γονιδιωματικό DNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όξινο θειώδες νάτριο χρησιμοποιώντας EpiTech Bisulfite Kit (Qiagen). Pyrosequencing PCR και εκκινητές αλληλουχίας για επιλεγμένα διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας PyroMark Δοκιμασία Σχεδιασμός έκδοση 2.0.1 του λογισμικού (Qiagen) (Πίνακας S1). PCR ενίσχυση διθειώδους-μετατρέπονται γονιδιωματικό DNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κιτ PyroMark PCR (Qiagen) υπό τις συνθήκες που προδιαγράφονται από τον κατασκευαστή. Τα προϊόντα της PCR υποβλήθηκαν σε Πανεπιστήμιο του Στάνφορντ πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων Facility (Palo Alto, CA) για Pyrosequencing. Ποσοτικές αναλύσεις μεθυλίωση έγιναν χρησιμοποιώντας PyroMark Q23 έκδοση 2.0.6 λογισμικού (Qiagen).

Gene Expression Αναλύσεις

Ολικό RNA από επεξεργασμένα κύτταρα απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Life Technologies). Ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix για qRT-PCR (Life Technologies). Η γονιδιακή έκφραση ποσοτικοποιήθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές qPCR: ανθρώπινη DNMT1 (προς τα εμπρός: 5′-GTGGGGGACTGTGTCTCTGT-3 ‘, αντίστροφος: 5′-TGAAAGCTGCATGTCCTCAC-3′), Dnmt3a (προς τα εμπρός: 5’-CACACAGAAGCATATCCAGGAGTG-3 ‘, αντίστροφος: 5’-AGTGGACTGGGAAACCAAATACCC-3 ‘), DNMT3B (εμπρός: 5′-AATGTGAATCCAGCCAGGAAAGGC-3′, αντίστροφη: 5’-ACTGGATTACACTCCAGGAACCGT-3 ‘), GAPDH (εμπρός: 5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3′, αντίστροφη: 5’-TTCACACCCATGACGAACAT -3 ‘), CCR4 (εμπρός: 5′-AATTGTGCACGCGGTGTTTT-3′, αντίστροφη: 5’-TCCAGGGAGCTGAGAACCTT-3 ‘), CXCR4 (εμπρός: 5′-GAACTTCCTATGCAAGGCAGTCC-3′, αντίστροφη: 5’-CCATGATGTGCTGAAACTGGAAC-3 ‘) , CYR61 (εμπρός: 5’-CTTAGTCGTCACCCTTCTCCAC-3 ‘, αντίστροφη: 5′-CAGGGTCTGCCCTCTGACT-3′), και TGFBR1 (εμπρός: 5’-CCTCGAGATAGGCCGTTTGT-3 ‘, αντίστροφη: 5′-ATGGTGAATGACAGTGCGGT-3’). Όλες οι αντιδράσεις qPCR έγιναν με τη χρήση ταχείας SYBR Green βασικού μείγματος (Life Technologies) για 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). γονιδιακή έκφραση ομαλοποιήθηκε σε GAPDH και η σχετική ποσοτικοποίηση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt στο RQ Διευθυντής 1.2.1 λογισμικό (Applied Biosystems).

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) Αναλύσεις

αναλύσεις ChIP έγιναν ως περιγράφηκε προηγουμένως με ελαφρές τροποποιήσεις [28]. Εν συντομία, επεξεργασμένα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλδεΰδη και χρωματίνη διατμήθηκε με υπερήχους. σύμπλοκα πρωτεΐνης /DNA ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντισώματα ειδικά έναντι H3K4me3 (Abcam, Cambridge, ΜΑ). Αρνητική ChIP έλεγχος έγινε με τη χρήση της κανονικής IgG. Μετά ανοσοκαταβύθιση, αντιστροφή εγκάρσιας σύνδεσης, και πρωτεϊνάση Κ θεραπεία, Chip DNA καθαρίστηκε με εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου. Τσιπ qPCR εκκινητές σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν συγκεκριμένες περιοχές υποκινητή TGFBR1 και CYR61 που έδειξαν διαφορική μεθυλίωση λόγω DIM θεραπεία (TGFBR1 προς τα εμπρός: 5′-GGATCGGGAAGGGGTTTGAG-3 ‘, αντίστροφη: 5′-CCCTTCACATGCGACTCACT-3′? CYR61 προς τα εμπρός: 5’ CTCCCACCCCTAACCCTCTA-3 ‘, αντίστροφος: 5′-GGCCCTTAGTGCTAATGCTGA-3’). Τσιπ qPCR αντιδράσεις έγιναν εις τριπλούν, και ποσοτικοποίηση των δειγμάτων άνοσο DNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μιας πρότυπης καμπύλης που δημιουργείται από σειριακές αραιώσεις του καθαρισμένου DNA εισόδου. Τα αποτελέσματα υπολογίζονται ως ποσοστό του DNA των εισροών (% των εισροών) και αναφέρονται ως σχετική φορές αλλαγή σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος DMSO.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική δοκιμή των τιμών επικάλυψη EpiExplorer να καθοριστεί αν επιλέξτε ανιχνευτές μεθυλίωση επικαλύπτονται σημαντικά περισσότερο από ό, τι αναμένεται από την τύχη (τυχαιοποιημένη ελέγχου) με H3K4me3 και H3K9ac κορυφές στη βάση δεδομένων ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ έγιναν χρησιμοποιώντας Διαδοχική Μόντε Κάρλο αλγόριθμο πολλαπλών δοκιμών (MCFDR) σε Γονιδιωματικό HyperBrowser [29], [30]. Στατιστική διαφορά μεταξύ των ανιχνευτών DNA που σχετίζονται με DIM μεσολάβηση αυξημένη ή μειωμένη μεθυλίωση και την αντίστοιχη επικάλυψη τους με τα σήματα ιστόνης προσδιορίστηκαν από την αναλογία t-test δύο δειγμάτων σε SciPy (https://scipy.org). Παραμένοντας στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism Version 5,02 (GraphPad, La Jolla, CA), όπου τα δεδομένα αναφέρθηκαν ως μέση ± SEM, και ρ-τιμές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο t τεστ ή μονόδρομη ANOVA ακολουθούν από Tukey-Krammer πολλαπλή σύγκριση δοκιμή όπου ενδείκνυται. Στατιστικό επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε ως α 0.05.

Αποτελέσματα

SFN και ΔΗΜ Μειώθηκε DNMT Gene Expression και προκάλεσε Ξεχωριστά Η μεθυλίωση του DNA Αλλαγές Προφίλ Ανάλογα με προστάτη κυτταρική γραμμή

αξιολόγησε τις επιδράσεις της SFN και DIM στην έκφραση του DNMT1, Dnmt3a, και DNMT3B σε κανονικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα (PrEC), εξαρτώμενων από ανδρογόνα (LnCAP) και ανεξάρτητου από ανδρογόνο (PC3) κύτταρα καρκίνου προστάτη. LnCAP και PC3 κύτταρα είχαν σημαντικά υψηλότερα αρχικά επίπεδα έκφρασης της DNMT1, Dnmt3a και DNMT3B σε σύγκριση με τα κύτταρα PrEC (Εικ. 1Α). Σε κύτταρα PrEC και LnCAP, τόσο SFN και DIM θεραπείες μειωμένη DNMT1 και γονιδιακή έκφραση DNMT3B (Σχ. 1Β και 1Γ). Σε κύτταρα PC3, SFN μείωσε σημαντικά την έκφραση και των τριών DNMTs εξετάστηκαν, και DIM μείωσε την έκφραση του DNMT1 (Σχ. 1D). Με βάση αυτό το αποτέλεσμα, καθώς και τα προηγούμενα ευρήματά μας που SFN μπορεί να μεσολαβήσει υποστηρικτής de-μεθυλίωση σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη [18], πραγματοποιήσαμε μια έρευνα του γονιδιώματος-ευρεία ώστε να καθορίσει τις παγκόσμιες επιπτώσεις της SFN και DIM με υποκινητή μεθυλίωσης του DNA στο PrEC, LnCAP, και τα κύτταρα PC3.

(Α) Gene έκφραση του DNMT1, Dnmt3a, και DNMT3B σε μη επεξεργασμένα PrEC, LnCAP, και τα κύτταρα PC3 (η = 3-5 ανά ομάδα). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση κανονικοποιημένη πολλαπλή μεταβολή ± SEM σε σύγκριση με PrEC. (Β-D) Επίδραση της SFN και DIM στην έκφραση γονιδίων σε κύτταρα DNMT PrEC (Β), LNCaP κύτταρα (C), και τα κύτταρα PC3 (D). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με έκδοχο ελέγχου (DMSO), 15 μΜ SFN, ή 15 μΜ DIM (n = 6 ανά ομάδα στα Β-D). DNMT1, Dnmt3a, και DNMT3B γονιδιακής έκφρασης αναλύθηκαν 48 ώρες μετά τη θεραπεία. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση κανονικοποιημένη πολλαπλή μεταβολή ± SEM σε σύγκριση με DMSO. * Τιμή p & lt?. 0.05

Η

Η κατάσταση μεθυλίωσης των μεμονωμένων ανιχνευτών εντοπίστηκε για πρώτη φορά σε κάθε μία από τις τρεις κυτταρικές σειρές με τη σύγκριση MeDIP εμπλουτισμένο σε σχέση με τα δείγματα εισόδου (κλίμακα αναλογίας log2). Ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίηση έδειξε ότι PrEC, LnCAP και PC3 είχαν διακριτά προφίλ μεθυλίωσης (Εικ. 2Α). Στη συνέχεια, προσδιορίσθηκαν διαφορική μεθυλίωση μεταξύ κυττάρων καρκίνου του προστάτη και φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακών κυττάρων. Ανιχνευτές με σημαντική κλιμακούμενες log

2 αναλογία που προσδιορίζονται στην LNCaP κύτταρα και PC3 κύτταρα σε σύγκριση με εκείνες που παρατηρήθηκαν σε κύτταρα PrEC μέσω σύγκριση ανά ζεύγος για να προσδιοριστεί σημαντικές log2 πτυσσόμενο διαφορές μεταξύ καρκινικών κυττάρων του προστάτη και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη (LnCAP έναντι PrEC, και PC3 έναντι PrEC). Όλες οι επόμενες αναλύσεις της κυτταρικής σειράς ή /και τα αποτελέσματα της θεραπείας που αναφέρονται σε σημαντικές αλλαγές μεθυλίωσης που βασίζονται σε συγκρίσεις πολλαπλή μεταβολή log2. LNCaP κύτταρα και PC3 κύτταρα είχαν 78.272 ανιχνευτών και 54876 ανιχνευτές, αντίστοιχα, που ήταν σημαντικά διαφορικά μεθυλιωμένα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα PrEC (Εικ. 2Β). Σε κύτταρα PC3, 64% των ανιχνευτών είχε αυξηθεί μεθυλίωσης, σε σύγκριση με 49% των ανιχνευτών σε LNCaP κύτταρα που είχαν αυξηθεί σε σχέση με μεθυλίωση PrEC. Δεδομένου ότι το προφίλ μεθυλίωση του κάθε γονιδίου αξιολογήθηκε με πολλαπλούς ανιχνευτές, προσδιορίσαμε το μέσο επίπεδο μεθυλίωσης ανά γονίδιο τον μέσο όρο της σημαντικής log2 πολλαπλή μεταβολή όλων των ιχνηλατών εκχωρηθεί σε μεμονωμένα γονίδια. Αυτό αντιπροσώπευε 10315 και 8013 διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια σε LnCAP και τα κύτταρα PC3, αντίστοιχα, σε σχέση με τα κύτταρα PrEC (Εικ. 2C). Παρατηρήσαμε ότι η πλειοψηφία των ανιχνευτών εντός κάθε γονιδίου είχαν παρόμοιες αλλαγές μεθυλίωσης, όπου περισσότερο από 92%, είτε είχαν αυξημένη ή μειωμένη μεθυλίωση. Μόνο το 7,4% των ανιχνευτών σε LNCaP κύτταρα και 4,2% των ανιχνευτών σε κύτταρα PC3 είχαν μικτό προφίλ μεθυλίωσης σε κάθε γονίδιο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Log2 πολλαπλή μεταβολή ανά γονίδιο κυμαίνονταν -3,322 έως 2,893 σε LNCaP κύτταρα, και -2,411 έως 2,941 στα κύτταρα PC3. Οι αναλύσεις Λειτουργική σχολιασμό έδειξαν ότι τα γονίδια με αλλοιωμένες προφίλ μεθυλίωσης σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη εμπλουτίστηκαν σε γονίδια που απορρυθμισμένη ή εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των κατηγοριών GO συνδέονται με τη μετανάστευση των κυττάρων, κυτταρικής προσκόλλησης, σηματοδότηση κυττάρου-κυττάρου, καθώς και ρύθμιση της μεταγραφής (στοιχεία δεν φαίνεται). Επιλέξτε γονιδίων με διαφορική μεθυλίωση με βάση τη σειρά μεθυλίωση NimbleGen επικυρώθηκαν από Pyrosequencing (Σχήμα S1).

(Α) Ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης των ανιχνευτών με σημαντική κλιμακούμενες log

2 αναλογία PrEC, LnCAP και PC3 κύτταρα. Πράσινο και κόκκινο μπάρες αντιπροσωπεύουν άτομο ανιχνευτές με σημαντική μειωμένη και αυξημένη μεθυλίωση, αντίστοιχα, των δειγμάτων MeDIP DNA σε σχέση με δείγματα DNA εισόδου. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τις κορυφαίες 1.000 σημαντικότερες ανιχνευτές μέσα σε κάθε κυτταρική σειρά. (Β) Από τη σύγκριση των μεταβολών μεθυλίωσης σε LnCAP και PC3 κύτταρα σε σχέση με κύτταρα PrEC. Σημαντικές μεθυλιωμένα ανιχνευτές σε LnCAP και PC3 κύτταρα σε σύγκριση με PrEC, και η κατανομή των ιχνηλατών με σημαντική log2 πολλαπλών μεταβολών παρουσιάζονται. (C) Μέση επίπεδο μεθυλίωσης σε επιμέρους γονίδια σε LnCAP και PC3 κυττάρων σε σύγκριση με PrEC. Log2 πολλαπλή μεταβολή ανά γονίδιο προσδιορίστηκε από το μέσο όρο της log2 φορές αλλαγή όλων των διαφορικά μετουσιωμένο ανιχνευτές εκχωρηθεί σε κάθε γονίδιο, και παριστάνεται ως κιβώτιο και μουστακιού οικόπεδα. Αριθμός πάνω από τη γραμμή υποδηλώνει τον αριθμό των γονιδίων σε κάθε ομάδα. Μουστάκια αντιπροσωπεύουν μέγιστες και ελάχιστες τιμές, και το «+» αντιπροσωπεύει μέση αξία.

Η

Εξετάσαμε δίπλα τα αποτελέσματα της SFN και DIM στο προφίλ μεθυλίωσης υποστηρικτής σε κάθε κύτταρο του προστάτη γραμμή. Log2 φορές αλλαγή συγκρίθηκε μεταξύ SFN ή ΔΗΜ θεραπείες σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος DMSO σε PrEC, LnCAP, και τα κύτταρα PC3. θεραπείες SFN οδήγησε σε σημαντική log2 πολλαπλή μεταβολή στο 6154 ανιχνευτές στα κύτταρα PrEC, 9.302 ανιχνευτές σε LNCaP κύτταρα, και 20.783 ανιχνευτές στα κύτταρα PC3 (Εικ. 3Α), που εκπροσωπεί 2.472, 3.508, και 6.778 διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια, αντίστοιχα (Σχ. 3Β ). ΔΗΜ θεραπείες που προκαλείται σημαντική log2 φορές αλλαγή σε 8.970 ανιχνευτές στα κύτταρα PrEC, 15237 ανιχνευτές σε LNCaP κύτταρα, και 7.386 ανιχνευτές σε κύτταρα PC3, που εκπροσωπεί 3.224, 4.404, και 2.394 διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια, αντίστοιχα (Σχ. 3Β). Μεμονωμένα ανιχνευτές μέσα σε κάθε γονίδιο είχαν παρόμοιες αλλαγές μεθυλίωσης, όπου περισσότερο από 95% των ανιχνευτών είτε είχαν αυξημένη ή μειωμένη μεθυλίωση, και πολύ λίγα γονίδια είχαν μικτό προφίλ μεθυλίωσης (& lt? 5% των ανιχνευτών σε SFN-κατεργασμένα κύτταρα και & lt? 2.5 % των ανιχνευτών σε DIM κατεργασμένα κύτταρα) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το φάσμα των πολλαπλής μεταβολής λόγω SFN και DIM θεραπείες ήταν μεταξύ -1,380 έως 1,243, και ήταν στενότερο σε σχέση με εκείνες που παρατηρούνται κατά τη σύγκριση κυττάρων καρκίνου του προστάτη έναντι φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα (Σχ. 2Β). Κατανομή των διαφορικά μεθυλιωμένων ιχνηλάτες εντός του υποκινητή εξετάστηκε και δεν έδειξε προτιμησιακή προκατάληψη σε συγκεκριμένες περιοχές προαγωγού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Επίδραση της SFN και DIM στο προφίλ μεθυλίωση σε PrEC, LnCAP, και PC3 κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος. Σε κάθε μία από τις τρεις κυτταρικές σειρές, σημαντική μεθυλιωμένα ανιχνευτές σε SFN ή DIM-αγωγή ομάδες συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες ελέγχου οχημάτων τους για να καθορίσουν ανιχνευτή ειδικό log2 πολλαπλή μεταβολή. Η κατανομή των ανιχνευτών με σημαντική log2 φορές αλλαγή εμφανίζεται. (Β) Μέσο επίπεδο μεθυλίωσης σε επιμέρους γονίδια σε SFN και DIM-αντιμετωπίζονται PrEC, LnCAP και PC3 κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος. Log2 πολλαπλή μεταβολή ανά γονίδιο προσδιορίστηκε από το μέσο όρο της log2 φορές αλλαγή όλων των διαφορικά μετουσιωμένο ανιχνευτές εκχωρηθεί σε κάθε γονίδιο, και παριστάνεται ως κιβώτιο και μουστακιού οικόπεδα. Αριθμός πάνω από τη γραμμή υποδηλώνει τον αριθμό των γονιδίων σε κάθε ομάδα. Μουστάκια αντιπροσωπεύουν μέγιστες και ελάχιστες τιμές, και το «+» αντιπροσωπεύει μέση αξία.

Η

διάγραμμα Venn αναλύσεις έδειξαν ότι SFN και DIM κάθε μεταβληθεί μεθυλίωση σε διακριτά σύνολα των γονιδίων σε κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές. Σύγκριση των συνόλων των γονιδίων μεταβάλλεται από SFN ή DIM έδειξε ότι μόνο ένας μικρός αριθμός γονιδίων (219 και 209 γονίδια, αντίστοιχα) μοιράστηκαν μεταξύ όλων των τριών κυτταρικών γραμμών, που αντιπροσωπεύουν μεταξύ 3% έως 9% των διαφορικά μεθυλιωμένων γονιδίων μέσα σε κάθε κυτταρική σειρά (Σχ. 4Α). Από αυτό το βασικό σύνολο γονιδίων, υπήρχαν -30% επικάλυψη μεταξύ SFN και ΔΗΜ θεραπείες. Αντίθετα, υπήρχε ένα υψηλό βαθμό επικάλυψης των γονιδίων επηρεάζεται τόσο από SFN και ΔΗΜ θεραπείες μέσα στα κύτταρα PrEC και LnCAP (1.926 γονίδια και 2.671 γονίδια, αντίστοιχα), και σε μικρότερο βαθμό, τα κύτταρα PC3 (1.408 γονίδια) (Εικ. 4Β) . Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν υποδιαιρούνται τα σύνολα δεδομένων σε γονίδια με αυξημένη μεθυλίωση ή μειωμένη μεθυλίωση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι αναλύσεις έδειξαν Λειτουργική σχολιασμό διαφορετικά σύνολα εμπλουτισμένο γονιδίων σε επιθηλιακά κύτταρα φυσιολογικό προστάτη σε σύγκριση με κύτταρα καρκίνου προστάτη, αλλά παρόμοια σύνολα γονιδίων εμπλουτίστηκαν κατά τη σύγκριση SFN και DIM θεραπεία μέσα σε κάθε κυτταρική γραμμή (Σχ. 5). Σε κύτταρα PrEC, τα γονίδια που εμπλέκονται στην μεταγραφή, την απόπτωση και χρωματίνης οργάνωση /τροποποίηση εμπλουτίστηκαν με τόσο SFN και ΔΗΜ θεραπείες. Σε LNCaP κύτταρα, εμπλουτίστηκαν δύο γενικές κατηγορίες γονιδίων. Τα πρώτα εμπλεκόμενα γονίδια που σχετίζονται με την κίνηση των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των κυτταρική μετανάστευση, προσκόλληση, και εντοπισμού. Το δεύτερο εμπλεκόμενα γονίδια που σχετίζονται με την ανοσολογική απάντηση, συμπεριλαμβανομένης της φλεγμονής και την άμυνα, την ενεργοποίηση των λευκοκυττάρων και το ανοσοποιητικό ρύθμιση. Λειτουργική ανάλυση σχολιασμού σε κύτταρα PC3 έδειξε εμπλουτισμένο κατηγορίες γονίδιο μοιράζεται ομοιότητα τόσο PrEC και LnCAP, συμπεριλαμβανομένων γονιδίων που εμπλέκονται στην μεταγραφή, απόπτωση, μετανάστευση κυττάρου και ανοσοαπόκριση.

(Α) διαγράμματα Venn δείχνει τον αριθμό των γονιδίων που διαφορικά μεθυλιωμένο σε PrEC, LnCAP, και τα κύτταρα PC3 μετά τις θεραπείες με SFN ή Dim σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος. (Β) διαγράμματα Venn δείχνει τον αριθμό των διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια στόχοι της SFN και DIM μέσα σε κάθε κυτταρική σειρά.

Η

Λειτουργική σχολιασμό των διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια στόχοι της SFN και ΔΗΜ σε PrEC, LnCAP και PC3 κύτταρα εξετάστηκαν και ο αριθμός των γονιδίων που εμπλέκονται σε επιλεγμένες βιολογικές διαδικασίες και λειτουργίες απεδείχθη. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ο αριθμός των γονιδίων σε κάθε σημαντικά εμπλουτισμένη κατηγορία GO.

Η

SFN και DIM αντίστροφης Cancer σχετιζόμενη μεθυλίωσης του DNA Μεταβολές στα κύτταρα LNCaP

Στη συνέχεια, δεδομένης της πιο σημαντικής μείωσης σε DNMT1 και DNMT3B τόσο με SFN και ΔΗΜ θεραπεία σε LNCaP κύτταρα, επιλέξαμε να εστιάσουμε σε χαρακτηρίζουν ένα υποσύνολο των γονιδίων που ήταν διαφορικά μετουσιωμένο σε LNCaP κύτταρα σε σχέση με τα κύτταρα PrEC και αντιστράφηκαν με SFN ή /και ΔΗΜ θεραπείες. Από τα 10.315 γονίδια που είχαν απόκλιση μεθυλίωση σε LNCaP κύτταρα (Σχ. 2C), SFN και DIM θεραπείες αντιστραφεί τα προφίλ μεθυλίωση του 1509 (14,6%) και 2.219 γονίδια (21,5%), αντίστοιχα (Σχ. 6Α). Αυτά τα γονίδια ανήκαν σε δύο κατηγορίες: 1) τα γονίδια που είχαν αυξημένη μεθυλίωση προαγωγού σε LNCaP κύτταρα σε σχέση με κύτταρα PrEC, και μειωμένη μεθυλίωση κατά SFN ή /και DIM θεραπεία, και 2) τα γονίδια που είχαν μειωθεί μεθυλίωση προαγωγού σε LNCaP κύτταρα σε σχέση με κύτταρα PrEC και αυξημένη μεθυλίωση κατά SFN ή /και DIM θεραπεία. Ένα παράδειγμα ενός γονιδίου που ανήκει σε κάθε κατηγορία, C-C χημειοκίνης υποδοχέα τύπου 4 (CCR4) και μετασχηματισμού αυξητικού παράγοντα τύπου-β1 Ι (TGFBR1), δείχθηκε στο Σχ. 6Β. αναλύσεις λειτουργική σχολιασμό έδειξε εμπλουτισμό GO για πολλά γονίδια που είναι γνωστό ότι απορυθμίζεται ή μεγάλη συμμετοχή στην εξέλιξη του καρκίνου. Αυτό το σύνολο δεδομένων που περιλαμβάνονται γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση και της χημειοταξίας, καθώς συνδέονται με το ανοσοποιητικό γονίδια που εμπλέκονται στη φλεγμονή και την άμυνα, δέσμευσης κυτοκίνης, και ανάπτυξη του ανοσοποιητικού (Εικ. 6C). Venn σύγκριση διάγραμμα έδειξε ότι το 86% των γονιδίων στη λίστα γονίδιο SFN (1309 από 1509) μοιράστηκαν με τον ΔΗΜ λίστα γονίδιο (Εικ. 6D). Δεδομένου ότι η πλειοψηφία των γονιδίων επηρεάζεται από SFN περιλήφθηκαν στον κατάλογο ΔΗΜ γονίδιο, μετά την έκφραση του γονιδίου αναλύσεις επικεντρώνονται σε επιλεγμένα γονίδια, όπου ΔΗΜ θεραπεία ανέτρεψε την απορυθμισμένη προφίλ μεθυλίωσης σε LNCaP κύτταρα.

(Α) Αριθμός διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια σε LNCaP κύτταρα σε σχέση με τα κύτταρα PrEC που είχαν αντιστραφεί με SFN ή ΔΗΜ θεραπείες. Μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει γονίδια που είχαν μειωθεί μεθυλίωση σε LNCaP κύτταρα που αυξήθηκαν με SFN /ΔΗΜ θεραπείες. Λευκή γραμμή αντιπροσωπεύει γονίδια που είχαν αυξημένη μεθυλίωση σε LNCaP κύτταρα που μειώθηκαν με SFN /ΔΗΜ θεραπείες. (Β) Δύο παραδείγματα γονιδίων, CCR4 και TGFBR1, με απορυθμισμένη προφίλ μεθυλίωσης σε LNCaP κύτταρα που είχαν αντιστραφεί με SFN ή /και ΔΗΜ θεραπείες. Έγχρωμες γραμμές αντιπροσωπεύουν την γονιδιωματική θέση των ανιχνευτών μεθυλίωσης του DNA που είχαν μειωμένη μεθυλίωση (μπλε) ή να αυξήσουν μεθυλίωση (κόκκινο) κατά τη σύγκριση του ανιχνευτή ειδικό log2 φορές αλλαγή στην LNCaP κύτταρα έναντι PrEC, ή DIM έναντι του ελέγχου του οχήματος DMSO σε LNCaP κύτταρα. TSS (μπλε κύκλος) αντιπροσωπεύει θέση έναρξης της μεταγραφής του κάθε γονιδίου. (C) Λειτουργική σχολιασμό των διαφορικά μετουσιωμένο στόχων γονιδίου σε LNCaP κύτταρα που είχαν αντιστραφεί με SFN ή ΔΗΜ θεραπείες. διάγραμμα (D) Βεν δείχνει τον αριθμό των στόχων του γονιδίου με μεθυλίωση προαγωγού που απορυθμίζεται σε LNCaP κύτταρα και να αντιστραφεί με SFN ή ΔΗΜ.

Η

Τέσσερα γονίδια (TGFBR1, πλούσια σε κυστεΐνη αγγειογενετική επαγωγέα 61 (CYR61) , επελέγησαν CCR4, και CXC τύπος υποδοχέα χημειοκινών 4 (CXCR4)) για να εξεταστεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ της μεταβολής στην υποκινητή προφίλ μεθυλίωση και γονιδιακή έκφραση σε LNCaP κύτταρα. Τα προφίλ μεθυλίωση προαγωγού του καθενός από αυτά τα τέσσερα γονίδια μεταβάλλονται σε LNCaP κύτταρα σε σύγκριση με κύτταρα PrEC, και θεραπεία DIM ανέστρεψε τα σχετίζονται με τον καρκίνο προφίλ μεθυλίωση. Η έκφραση καθενός από τα τέσσερα υποψήφια γονίδια έχουν αναφερθεί να απορυθμίζεται σε καρκίνο, και συσχετίζεται με την πρόοδο του καρκίνου.