Αφηρημένο

στέρησης ανδρογόνων (AD) είναι μια αποτελεσματική μέθοδος για την αρχική καταστολή του καρκίνου του προστάτη (PC) εξέλιξη. Ωστόσο, ανδρογόνα πυρίμαχων PC κύτταρα αναπόφευκτα προκύψουν από την αποκρίνονται στο ανδρογόνο όγκου, οδηγώντας σε ανίατη ασθένεια. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει AD επάγει την κυτταρική γήρανση, ένα φαινόμενο το οποίο είναι κύτταρο-αυτόνομα όγκο κατασταλτικός αλλά που προσδίδει προσαρμογές προαγωγής όγκων που μπορούν να διευκολύνουν την έλευση των κυτταρικών πληθυσμών κακοήθων γήρανση ανθεκτική. Επειδή ανδρογόνων-πυρίμαχων κύτταρα PC αναδύονται κλωνικά από την αρχικά ανδρογόνων-απόκρισης του όγκου, επιδιώξαμε να διερευνήσει κατά πόσον AD-που προκαλείται από τη γήρανση (ADIS) επηρεάζει την απόκτηση των ανδρογόνων-πυρίμαχων συμπεριφορά σε LNCaP και του καρκίνου του προστάτη LAPC4 κύτταρα που αποκρίνονται στο ανδρογόνο. Θεωρούμε ότι η επαναλαμβανόμενη έκθεση αυτών των ανδρογόνων-κύτταρα που αποκρίνονται σε γήρανση που προκαλεί ερεθίσματα μέσω κυκλικών μ.Χ. οδηγεί στην ταχεία εμφάνιση του Άδη ανθεκτικά, ανδρογόνο-πυρίμαχα κυττάρων από τον κύριο όγκο του πληθυσμού σε γήρανση των κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο φαινότυπος ADIS σχετίζεται με τα χαρακτηριστικά προαγωγής όγκων, ιδίως χημειοαντίσταση και βελτιωμένους μηχανισμούς προ-επιβίωσης όπως η αναστολή της ρ53 μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο, οι οποίες ενθαρρύνουν επιμονή των γηρασμένων κυττάρων. Βρίσκουμε επίσης ότι η φαρμακολογική επιβολή της p53 ενεργοποίησης /Bax μέσω νουτλίνη-3 πριν από τη δημιουργία του Άδη απαιτείται για να ξεπεραστεί η συνδεδεμένες ανταπόκριση προ-επιβίωσης και κατά προτίμηση να προκαλέσει διάχυτη κυτταρικό θάνατο αντί γήρανση κατά τη διάρκεια της AD. Έτσι, η μελέτη μας δείχνει ότι ADIS προάγει την απόφυση των κυττάρων PC ανδρογόνων-πυρίμαχων και είναι, κατά συνέπεια, μια ελαττωμένη ανταπόκριση του όγκου-καταστολέας στην AD

Παράθεση:. Burton DGA, Giribaldi MG, Munoz Α, Halvorsen Κ, Patel Α, Ζορντά M, et al. (2013) στέρησης ανδρογόνων-Induced Γήρανση Προωθεί μεγάλωμα κυττάρων ανδρογόνα-Πυρίμαχα καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (6): e68003. doi: 10.1371 /journal.pone.0068003

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Νοεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 28 Μαΐου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Burton et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από την Φλόριντα Biomed Bankhead Coley New Investigator Award, ένα Πανεπιστήμιο του Μαϊάμι /Sylvester Comprehensive Cancer Center Παπανικολάου Σώματος Αναπτυξιακή Cancer Research Grant και το Πανεπιστήμιο του Μαϊάμι /Stanley βραβείο Glaser Foundation (για PR). MGG υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Αντικαρκινικό Κέντρο Καλοκαίρι Βραβείο Προπτυχιακά Έρευνα Sylvester ολοκληρωμένη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PC) είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες σε άνδρες και μια κύρια αιτία των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο. Για προχωρημένη νόσο, θεραπεία στέρησης ανδρογόνων είναι η κύρια θεραπευτική αγωγή λόγω της κρίσιμης εξάρτηση του προστατικού ιστού επί ανδρογόνα για πολλαπλασιασμό και την επιβίωση [1]. Ωστόσο, η τελική εμφάνιση των ανδρογόνων-πυρίμαχων όγκων, η οποία δεν είναι πλέον να ανταποκριθεί θετικά στην ανδρογόνων απόσυρση, μειώνει το προσδόκιμο ζωής των ασθενών σε λιγότερο από δύο χρόνια, επειδή οι όγκοι αυτοί είναι ελάχιστα ανταποκρίνονται στις πρόσθετες επεξεργασίες [2], [3]. Οι μοριακοί μηχανισμοί που οδηγούν σε αυτούς τους όγκους ανδρογόνα πυρίμαχα δεν είναι καλά κατανοητοί. Ουσιαστική έρευνα έχει επικεντρωθεί στην ανδρογόνων υποδοχέων (AR) σηματοδότησης και εμπλέκει εκτροπές AR σχετίζονται συμπεριλαμβανομένης γονιδιακής ενίσχυσης, ανεξάρτητη συνδεσμικού ή ενεργοποίηση promiscuous συνδέτη που βασίζεται και αλλοιωμένη έκφραση συν-ρυθμιστής [2], [4] – [7]. μονοπάτια μη-AR που θεωρείται ότι εμπλέκονται στην ανδρογόνων-πυρίμαχων πολλαπλασιασμό περιλαμβάνουν παράκαμψη του AR-based έλεγχο του πολλαπλασιασμού μέσω της ενεργοποίησης ογκογονιδίων ή ογκοκατασταλτικό ρύθμιση προς τα κάτω, μεταβάλλεται ρύθμιση χρωματίνη της μεταγραφής γονιδίων, διαταραχή του μηχανισμού ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και την αυξημένη έκφραση των στερεοειδογόνο ενζύμων [8 ] – [14]

Ωστόσο, πολλές μελέτες για τη διερεύνηση των μηχανισμών αυτών τα εξετάσει στο πλαίσιο των προηγμένων μοντέλων καρκίνο του προστάτη και δεν αντιμετωπίζουν τις πρώτες αλλαγές που απαιτούνται για την αποφυγή της καταστολής όγκου AD-επαγόμενη.. Αυτό είναι ένα σημαντικό ζήτημα διότι, παρά τις υψηλές αρχικές όγκο ανασταλτική δράση της [15], AD δεν σκοτώνουν όλα τα αποκρίνονται στο ανδρογόνο καρκινικών κυττάρων του προστάτη, αλλά μάλλον επάγει μια πολλαπλασιαστική σύλληψης σε σημαντική υποπληθυσμό [16]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι πληθυσμοί κυττάρων ανδρογόνα πυρίμαχο χαρακτηρίζεται από την απόκτηση ή αύξηση των προ-ογκογόνων οδούς στρες-προστατευτική [8], [10], [17], οι ιδιότητες αυτών των κυττάρων πολλαπλασιασμού συλληφθεί είναι πιθανό να είναι σημαντική στην κατανόηση του πώς ανδρογόνων-πυρίμαχων υποπληθυσμών προκύψουν. Πράγματι, είναι εύλογο ότι ένα υποσύνολο αυτών των συλληφθέντων κυττάρων βγείτε πολλαπλασιαστική στάση και να γίνει δεν ανταποκρίνονται στην AD. Προς υποστήριξη αυτής της ιδέας, έχει αναφερθεί ότι οι όγκοι του προστάτη αποτελούνται από μίγματα ετερογενούς κυττάρου σε όρους απόκρισης ανδρογόνων [18], και ότι ανδρογόνα πυρίμαχα κύτταρα να προκύψουν ως έναν επιλεγμένο πληθυσμό παραλλαγή από τα πατρικά ανδρογόνα αποκριτικά κύτταρα [18], [19]. Επιπλέον, σύμφωνα με την κλινική φαινότυπο, παρατεταμένη (& gt? 6 μήνες)

in vitro

ανδρογόνα αποκόπτεται καλλιέργεια αποκρίνονται στο ανδρογόνο κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη οδηγεί στην τελική έκφυση του ανδρογόνου απόσυρση ανθεκτικών κλώνων από την αρχικώς ανάπτυξη -arrested πληθυσμού [8], [20]. Ως εκ τούτου, αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών που βρίσκονται πίσω από το AD-επαγόμενη διακοπή της ανάπτυξης είναι κρίσιμη για τον καθορισμό της αιτιολογίας των ανδρογόνων-πυρίμαχων PC.

Τα μοριακά χαρακτηριστικά της AD-επαγόμενη διακοπή αύξησης περιλαμβάνουν ένα μπλοκ G1 /S, μειωμένη δραστηριότητα που εξαρτάται από κυκλίνη κινάση, υποφωσφορυλιωμένη Rb, και κατάργηση των συλληφθέντων φαινότυπο μέσω εισαγωγής της ογκοπρωτεΐνης, SV40 Μεγάλες Τ αντιγόνου [21]. Αυτά τα γνωρίσματα είναι συνεπείς με το AD επαγόμενη σύλληψης είναι μια μορφή της κυτταρικής γήρανσης [22], και δύο πρόσφατες μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα κύτταρα ανδρογόνο στερηθεί την ανάπτυξη μοριακών δεικτών συνεπής με τη γήρανση [23], [24]. Μοντέλα ογκογονιδίου γνώμονα ογκογένεση έχουν αποδείξει ότι ογκογονίδιο που προκαλείται από γηρασμό οδηγεί σε επιλεκτικές πιέσεις που προωθούν απόφυση του γηρασμού ανθεκτικών επιθετική υποπληθυσμών κυττάρου όγκου [25] – [27]. Ωστόσο, αυτή η ογκοπροάγουσες πτυχή γήρανση δεν έχει, εξ όσων γνωρίζουμε, έχουν προηγουμένως εξερευνηθεί για ορμόνη απόσυρση σχετίζεται με την γήρανση. Ως εκ τούτου, σχεδιασμένη μελέτη μας για να προσδιοριστεί εάν ένα παρόμοιο παράδειγμα, δηλαδή διαφυγή του AD-επαγόμενης γήρανση (ADIS), λειτουργεί στην παραγωγή ανδρογόνων καρκίνο του προστάτη ανθεκτικού κύτταρα από την γονική αποκρίνονται στο ανδρογόνο πληθυσμού. Κατά συνέπεια, στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τις κυτταρικές σειρές LNCaP και LAPC4 PC, είναι γνωστό ότι διαθέτουν τα μεγάλα βασικά χαρακτηριστικά των προστατικών κυττάρων όγκου που αποκρίνονται στο ανδρογόνο συμπεριλαμβανομένων ισχυρή υποδοχέα ανδρογόνων και την έκφραση ειδικού αντιγόνου του προστάτη, ενισχυμένο πολλαπλασιασμό σε απόκριση σε ανδρογόνα και πολλαπλασιαστική παύση μετά απόσυρση των ανδρογόνων, και η αδυναμία να σχηματίζουν όγκους σε ευνουχισμένους ποντικούς. Καλλιεργήσαμε αυτά τα κύτταρα στον ορό απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα (CSS) που περιέχει μέσα ενημέρωσης να ανακεφαλαιώσω μ.Χ. στον πολιτισμό. Ο στόχος μας ήταν να χαρακτηρίζουν τα μοριακά μονοπάτια που σχετίζονται με ADIS και να καθορίσει εάν θα μπορούσαμε να απομονώσουμε παραλλαγές γήρανση ανθεκτική σε θέση να πολλαπλασιάζονται κάτω από AD.

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ADIS οδηγεί στην απόκτηση των χαρακτηριστικών των όγκων-προώθηση, όπως η ενισχυμένη μηχανισμοί προ-επιβίωσης και χημειοαντίσταση. Σημαντικά, υπέστη παρουσία ερεθισμάτων γήρανση που προκαλεί μέσω κυκλικών μ.Χ. διευκολύνει την επέκταση του Άδη ανθεκτικά ανδρογόνων-πυρίμαχων LNCaP και LAPC4 παραλλαγές μέσα σε μια περίοδο εβδομάδων. Αυτές οι παραλλαγές είναι εν μέρει αποτυπώνεται με χαρακτηριστικά προ-επιβίωσης γήρανση που σχετίζεται παρά το γεγονός ότι ADIS ανθεκτικά. Έτσι, τα ευρήματά μας υποστηρίζουν συλλογικά ένα ρόλο για τον φαινότυπο γήρανσης στην οποία επιφέρει αλλαγές που προωθούν την εμφάνιση των καρκινικών κυττάρων ανδρογόνα-πυρίμαχων.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλη η έρευνα που αφορούν τα ανθρώπινα υποκείμενα έχει εγκριθεί από το Πανεπιστήμιο του Μαϊάμι Διοικητικού κριτική Θεσμική. Η IRB ενέκρινε την άρση της συγκατάθεσης για αυτό το πρωτόκολλο.

Cell Culture

LNCaP και LAPC4 κύτταρα (ATCC) καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen) συμπληρωμένου με 5% ορό εμβρύου βοός (FBS? Gibco, Invitrogen) ή 5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα εμβρυϊκό βόειο ορό (CSS? Gibco, Invitrogen) και 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Gibco, Invitrogen) στους 37 ° C σε 21% οξυγόνο /5% CO

2. Για ηρεμία καλλιέργειες, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως παραπάνω, αλλά με την απουσία οποιασδήποτε ορού.

Switchback (SB) μέθοδος για τη δημιουργία ανδρογόνων-πυρίμαχων ADIS ανθεκτικά LNCaP Παραλλαγές

LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν είτε σε 10 cm δίσκους (3 χ 10

5 κυττάρων) ή 15 cm δίσκους (1 χ 10

6 κύτταρα) σε ΚΡΜΙ 5% FBS για 36-48 ώρες πριν να αλλάξει σε RPMI 5% CSS. Το μέσο αντικαταστάθηκε κάθε 3-4 ημέρες για 14 ημέρες, για να προκληθεί ADIS, μετά την οποία οι καλλιέργειες αποκαθίστανται RPMI 5% FBS μέσο. Μετά έκφυση των αποικιών ορατές κυττάρων, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επεκτάθηκαν για ένα ή δύο περάσματα, πριν η διαδικασία επαναλήφθηκε.

Δημιουργία και σταθερή επαγωγή shRNA και φθορίζουσας πρωτεΐνης που εκφράζουν κατασκευάσματα

Ο ρετροϊικός pWZL -blast κατασκεύασμα GFP ήταν ένα δώρο από το εργαστήριο του Δρ Robert Weinberg του. Οι φορείς shRNA δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28], [29]. Οι επικυρωμένες ή εντόνως άνοιξε υποψήφιες αλληλουχίες από τη βιβλιοθήκη TRC Broad Consortium shRNA (https://www.broadinstitute.org/genome_bio/trc/publicSearchForHairpinsForm.php) επιλέχθηκαν και υποκλωνοποιήθηκε στον φορέα λεντοϊού pLKO.1 με μια κασέτα ανθεκτικότητας σε πουρομυκίνη. Τα ολιγονουκλεοτίδια αγοράστηκαν από την Integrated DNA Technologies, Inc. Τα κατασκευάσματα αλληλουχήθηκαν για να εξασφαλίσει την παρουσία του ενθέτου. Ο έλεγχος shRNA απευθυνόταν κατά της GFP: 5′-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCA-3 ‘. Οι παρακάτω ακολουθίες στόχου χρησιμοποιήθηκαν:

shp53: 5’GACTCCAGTGGTAATCTACTT 3 ‘,

shp16: 5’GCATGGAGCCTTCGGCTGACT 3′

Το Σαρ κατασκευή [30] ήταν ένα δώρο από τον Dr. Kerry Burnstein στο Πανεπιστήμιο του Μαϊάμι και είχε ως στόχο κατά την ακόλουθη σειρά:. 5 ‘GAAAGCACTGCTACTCTTCAGCATTATTC 3’

λεντοϊών ή ρετροϊικής παραγωγή διεξήχθη στα κύτταρα ΗΕΚ 293Τ και η μόλυνση των κυττάρων στόχων διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [29]. Τα μετατραπέντα κύτταρα επιλέχθηκαν σε 2 μg /ml πουρομυκίνη που περιέχουν ή 10 μg /ml blastocidin μέσα που περιέχουν (για κύτταρα SB5 GFP) για ελάχιστη περίοδο 5-7 ημερών (που αντιστοιχεί στον χρόνο που απαιτείται για μη μεταδιηγερμένα κύτταρα να πεθαίνουν τελείως στην επιλογή μεσα ΜΑΖΙΚΗΣ ενημέρωσης). Για Τα siRNAs, πρωτεΐνη νοκ ντάουν επαληθεύτηκε μέσω Western κηλίδωσης. έκφραση GFP στα κύτταρα SB5 επιβεβαιώθηκε με απεικόνιση επιφθορισμού και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

Western Blotting και αντισώματα που χρησιμοποιούνται

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με μηχανική απόξεση επί πάγου και λύθηκαν σε ένα φθοριούχο νάτριο (NAF ) ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει βαναδικό νάτριο, PMSF, DTT και αναστολέα πρωτεϊνάσης. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Bradford (Biorad). 30-50 μα συνολικής πρωτεΐνης διεξήχθη σε 4-12% Bis-Tris προ-cast NuPage γέλης (Invitrogen), για το σύστημα προκατασκευασμένα γέλη Novex και ακολούθως μεταφέρθηκε σε ένα τμήμα του μεμβράνη PVDF (Immobilon, Millipore EMD) στους 30 V στους 4 ° C. Οι κηλίδες βάφτηκαν με αντιδραστήριο Ponceau να καθορίσει ακόμη τη φόρτωση και μεταφορά, πλένονται σε 0,1% TBST και στη συνέχεια διερευνήθηκε με αντισώματα έναντι των ακόλουθων πρωτεϊνών: AR (SC-816, Santa Cruz Biotech), ρ53 (SC-126, Santa Cruz Biotech), p21 (SC-817, Santa Cruz Biotech) p16

ΙΝΚ4 (554079, BD Biosciences), κυκλίνη Α (SC-751, Santa Cruz Biotech), GAPDH (AB9485, Abcam) Bcl-2 (SC-492, Santa Cruz Biotech), Bax (SC-493, Santa Cruz Biotech) Mcl-1 (SC-819, Santa Cruz Biotech), Bak (06-536, Millipore), φωσφο-Akt (4060, Cell Signaling) συνολικού Akt (9272, Cell σηματοδότηση) διασπασμένης PARP (9541, Cell Signaling), survivin (71G4B7, Cell Signaling), TAp63 (618.902, BioLegend), p27 (SC-528, Santa Cruz Biotech), deltaNp63 (619.002, BioLegend). Μετά την επώαση με τα κατάλληλα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση δευτερογενούς αρμορακίας (Amersham), στυπώματα αναπτύχθηκαν με χρήση του ECL Plus (GE Healthcare) διάλυμα ανάπτυξης. Μετά από ανοσοαποτύπωση, μεμβράνες βάφτηκαν με Coomassie μπλε χρωστική (Sigma) για την εξομάλυνση για συνολικό φορτίο πρωτεΐνης.

τηλέφωνα Ανάλυση Κύκλου

Περίπου 1 × 10

6 κύτταρα συλλέχθηκαν με επεξεργασία με θρυψίνη. Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά σε ψυχρό μέσο που περιέχει ορό, δύο φορές σε ψυχρό PBS και μετά επαναιωρήθηκαν σε 200 μΐ PBS 2 mM EDTA. Περίπου 600 μΐ ψυχρής αιθανόλης 70% προστέθηκε στάγδην σε κύτταρα ενώ στροβιλισμό τους σε μεσαία ταχύτητα. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 4 ° C όλη τη νύχτα για τη στερέωση. Πριν από την ανάλυση, κύτταρα περιδινίστηκαν στους 4 ° C στις 1000 rpm για 5 λεπτά και η αιθανόλη αναρροφήθηκε προσεκτικά. Τα προκύπτοντα σφαιρίδια κυττάρου επανααιωρήθηκαν σε 0.5 ml PBS 2 mM EDTA και 10 μΐ θερμικά απενεργοποιημένο RNase Α (10 mg /ml, Sigma). Στη συνέχεια, 25 μΐ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (1 mg /ml, Sigma) προστέθηκε στο κυτταρικό εναιώρημα. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υδατόλουτρο για 30 λεπτά και αμέσως αναλύθηκαν σε μια ροή Accuri C6 κυτταρόμετρο (BD) με τη χρήση του λέιζερ διέγερσης ΡΙ (FL2). Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου καθορίστηκε με CFlow Plus κυτταρόμετρο λογισμικό, CFlow Ανάλυση 202,1, μετρώντας την περιοχή κάτω από σχετικό τμήμα του προφίλ (όπως φαίνεται). Προφίλ ήταν relabeled στο MS Excel για λόγους σαφήνειας.

Μετρήσεις του κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Για να προσδιορίσετε τα ποσοστά κυτταρικού πολλαπλασιασμού των κυττάρων LNCaP στα δύο FBS και CSS μέσα που περιέχουν, 1 × 10

5 σπάρθηκαν σε 6 cm πλάκες και ο αριθμός των κυττάρων, χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο, διεξήχθησαν κάθε 24 ώρες, εις τριπλούν σε μια περίοδο έξι ημερών χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. Νωπό μέσο προστίθεται κάθε 2-3 ημέρες. Για πειράματα διάσωσης στο Σχ. 1D, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε FBS μέσων για 24 ώρες πριν από τη μετάβαση στο CSS media. Τα κύτταρα επανέρχεται FBS μέσων στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία.

(Α) που σχετίζεται Γήρανση βήτα-γαλακτοσιδάσης (SA-βήτα-gal) χρώση υπό υποδεικνύεται συνθήκες και χρονικά σημεία. FBS, ορό εμβρύου βοός υποδεικνύοντας ανδρογόνων-γεμάτη πολιτισμό? CSS, απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό υποδεικνύοντας ανδρογόνα στερείται πολιτισμού. 9D FBS μετα-SEN υποδηλώνουν κύτταρα LNCaP που υποβλήθηκαν σε 14 ημέρες πολιτισμό CSS και στη συνέχεια άλλαξαν σε FBS μέσα μαζικής ενημέρωσης για 9 ημέρες. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των θετικά χρωματισμένων κυττάρων παρουσιάζεται στο δικαίωμα των αντιπροσωπευτικών εικόνων. (Β) χρώση δείκτη παν-πολλαπλασιασμού Ki67 παρουσιάζεται σε υποδεικνυόμενες συνθήκες και χρονικά σημεία. χρώση ϋΑΡΙ χρησιμοποιείται για να σηματοδοτήσει πυρήνες κυττάρων για σκοπούς καταμέτρηση Κί67-θετικά κύτταρα. Ποσοστό χρωματισμένο κυττάρων γράφημα στα δεξιά. (C) ιωδιούχο προπίδιο ανάλυση κυτταρικού κύκλου, σε υποδεικνύεται χρονικές στιγμές και συνθήκες καλλιέργειας. Σημειώστε το κλάσμα S-φάσης μειώνεται από 15,6% σε FBS σε 0,4% σε 10d CSS και στο 0,8% μετά την αποκατάσταση της FBS μέσα μαζικής ενημέρωσης για 9 ημέρες (9D FBS μετα-SEN). καμπύλη διάδοσης (D) για τα κύτταρα LNCaP καλλιεργούνται σε CSS για 3, 8 ή 14 ημέρες πριν επανέλθει στα μέσα ενημέρωσης FBS. (Ε) Η μέτρηση της ολικής επιπέδων ROS μέσω κυτταρομετρίας ροής σε κύτταρα LNCaP την ημέρα 1, ημέρα 4 και την ημέρα 7 της υποδεικνυόμενες συνθήκες καλλιέργειας. Σημειώστε το δεξί μετατοπισμένη κορυφή με κόκκινο χρώμα αντιστοιχεί σε αύξηση των επιπέδων ROS στα CSS-καλλιεργημένα κύτταρα LNCaP σε σχέση με FBS-καλλιεργημένα κύτταρα. (F) του DNA διπλό σκέλος διάλειμμα (DSB) εστίες ανιχνεύονται μέσω Η2ΑΧ /53BP1 συν-χρώση (πράσινο = Η2ΑΧ, κόκκινο = 53BP1) για κύτταρα LNCaP καλλιεργήθηκαν υπό τις υποδεικνυόμενες συνθήκες. Αντιπροσωπευτικές εικόνες για κύτταρα με τους διαφορετικούς αριθμούς των καταμετρηθέντων εστιών απεικονίζεται. Σημειώστε ότι το ποσοστό των κυττάρων με 5+ εστίες αυξάνεται με τη διάρκεια του πολιτισμού CSS.

Η

Πειράματα κυττάρων Co-πολιτισμό και Ανάλυση

Για τα πειράματα συγκαλλιέργειας, 1 × 10

5 LNCaP κύτταρα-SB5-GFP (που παράγεται από κύτταρα SB0 LNCaP σταθερώς μεταγωγή με pWZL-blast GFP) απλώθηκαν εις τετραπλούν σε ένα πιάτο 10 cm, είτε μόνη της ή συν-αναμεμιγμένο με 1 χ 10

5 μη επισημασμένου LNCaP SB0, SB5 ή κύτταρα LNAI. Τα κύτταρα αρχικά καλλιεργήθηκαν σε 5% FBS πλήρες μέσο (ημέρα 0) και την Ημέρα 1, οι συν-καλλιέργειες μετατάχθηκαν στο 5% των μέσων ενημέρωσης CSS και διατηρήθηκαν για 7 ημέρες, με μια αλλαγή CSS media κάθε τρεις ημέρες. Αντιπροσωπευτικά καλλιέργειες αναλύθηκαν εις διπλούν με κυτταρομετρία ροής σε ένα κυτταρόμετρο Accuri C6 την ημέρα 1 για να εξασφαλιστεί σχετικώς ισοδύναμους αριθμούς του πράσινου και του μη πράσινου κύτταρα επιβιώνουν σε καλλιέργεια. Χρησιμοποιώντας τα κύτταρα SB5-GFP επιχρυσωμένο μόνο, περίφραξη πραγματοποιήθηκε στο κανάλι FITC για το διαχωρισμό των κυττάρων από κύτταρα GFP μη-GFP. Τα κύτταρα περαιτέρω περιφραγμένη να αποκλείσει χαμηλή FSC /SSC σωματίδια να εξασφαλιστεί μόνο πληθυσμών ζωντανών κυττάρων που αναλύονται. Την ημέρα 7, κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των σχετικών ποσοστών των GFP θετικών έναντι μη επισημασμένο κυτταρικούς πληθυσμούς, καθώς και του συνολικού αριθμού των κυττάρων GFP-θετικά (SB5). Ιστογράμματα και διαγράμματα τελεία χαράχθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό BD Accuri C6 Ανάλυση για Mac OSX. Όλες οι μετρήσεις διεξήχθησαν εις διπλούν σε τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Γήρανση σχετιζόμενη β-γαλακτοσιδάσης (SA-βήτα-gal)

χρώση SA-βήτα-gal διεξήχθη όπως περιγράφεται αλλού [31]. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 0.2% γλουταραλδεΰδη για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν μία φορά σε PBS και επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε φρέσκο ​​παρασκευασμένο διάλυμα χρώσης (1 mg /ml 5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλ β-γαλακτοσίδη (Sigma), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl

2, 5 mM Κ

3Fe (CN)

6, 5 mM Κ

4Fe (CN)

6, 40 mM NaPi, ρΗ 6.0). Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα επωάστηκαν για μία επιπλέον ώρα στους 37 ° C για να εντείνουν τη χρώση και στη συνέχεια πλένονται και αποθηκεύονται σε PBS στους 4 ° C. Για την ποσοτικοποίηση θετική χρώση, & gt? 100 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε δείγμα σε διάφορους τομείς του άποψη, προκειμένου να ληφθεί ένα τυπική απόκλιση. Τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον εις διπλούν, σε δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Ki67 χρώσης

Για την ανίχνευση της χρώσης Ki67, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 2 × 10

4 κύτταρα ανά θάλαμο και αριστερά για 36-48 ώρες πριν είτε να στραφούν σε CSS, βικαλουταμίδη θεραπεία ή σταθεροποίηση για FBS μόνο δείγματα. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεϋδη (16% απόθεμα, Electron επιστήμες μικροσκοπία) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από διαπερατοποίηση σε 0,1% PBST (10 λεπτά σε RT), και δεσμεύτηκαν για 1 ώρα σε 0.1% TritonX, 15% FBS , σε PBS σε RT. Η Κί67 αντίσωμα (Santa Cruz) αραιώθηκε 1:50 σε ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος και επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα πλύθηκαν 5Χ, 10 λεπτά κάθε φορά σε θερμοκρασία δωματίου σε διάλυμα αποκλεισμού σε έναν αναδευτήρα. Το κατάλληλο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με φθορισμοφόρο (κατσίκας αντι-ποντικού-ΡΙΤΟ, Santa Cruz) προστέθηκε σε μία αραίωση 1:100 σε ρυθμιστικό αποκλεισμού και επωάστηκαν για 1 ώρα σε RT στο σκοτάδι. Τα κύτταρα πλύθηκαν 5Χ σε 0.1 TritonX, 10 λεπτά κάθε φορά σε συσκευή ανακίνησης σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. DAPI μέσα στερέωσης (Vectashield) προστέθηκε πριν από την τοποθέτηση καλυπτρίδα. εικόνες ανοσοφθορισμού αποκτήθηκαν σε μια φωτογραφική μηχανή Nikon που συνδέονται προς μία όρθια Zeiss μικροσκόπιο.

Η2ΑΧ /53BP1 Χρώση

χρώση Η2ΑΧ /53BP1 διεξήχθη όπως περιγράφεται αλλού [28]. Εν συντομία, 20.000 κύτταρα σπάρθηκαν ανά θάλαμο (BD Falcon, διαφάνειες κουλτούρα 4-θάλαμο) σε RPMI 5% FBS και να μεταφέρονται σε RPMI 5% CSS 24 ώρες αργότερα. Η2ΑΧ χρώση /53BP1 διεξήχθη στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες απόκτησης σε μια Leica DMI 6000 Β ανεστραμμένο ψηφιακή μικροσκόπιο με ένα συνημμένο DFC350 FX κάμερα και λογισμικό φθορισμού FW4000 μου. Μόνο συν-εντοπισμένη H2AX /εστίες 53BP1 μετρήθηκαν ως θετικό και τουλάχιστον 100 κύτταρα που σημειώθηκαν σε πολλαπλά πεδία.

Drug Θεραπεία των κυττάρων LNCaP

LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλα μέσα (5 % FBS ή CSS) που περιέχει docetaxel (1 ηΜ), φλαβοπιριδόλη (0.5 μΜ), ή bortezomib (1 μΜ) για 72 ώρες, και πλωτά και επεξεργασία με θρυψίνη συνδεδεμένα κύτταρα ομαδοποιήθηκαν και αναλύθηκαν με χρώση Trypan blue. LNCaP-SB0 και LNCaP-SB5 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα (RPMI + 5% FBS) που περιέχει docetaxel (1 ηΜ) για 72 ώρες και αναλύθηκαν με χρώση Trypan blue. Τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα έγιναν εις διπλούν και στατιστικές διαφορές μεταξύ των κυττάρων υπό θεραπεία με φάρμακο προσδιορίστηκαν με

t-test

με ρ & lt δύο ουρών του Student?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

ανάστροφης τρανσκριπτάσης PCR

το συνολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα LNCaP καλλιεργούνται σε FBS και τα μέσα ενημέρωσης CSS για 14 ημέρες, με τη χρήση του RNAqueous-4PCR Kit (Ambion). Ένα σύνολο 1 μg καθαρισμένου RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας ένα τυχαίο εκκινητή, που περιλαμβάνεται στο κιτ, για να ληφθεί cDNA μέσω του High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Το cDNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για την PCR ενίσχυση χρησιμοποιώντας AmpliTaq Gold® 360 Master Mix (Applied Biosystems) και οι εκκινητές ήταν ως εξής

GAPDH πρόσθιο εκκινητή:.

5 ‘GACCCCTTCATTGACCTCAAC 3’

GAPDH αντίστροφη αστάρι:

5 ‘CTTCTCCATGGTGGTGAAGA 3’

IL8 πρόσθιο εκκινητή:

5 ‘TTTTGCCAAGGAGTGCTAAAGA 3’

IL8 αντίστροφο εκκινητή :

5 ‘AACCCTCTGCACCCAGTTTTC 3’

Τα προϊόντα της αντίδρασης έτρεξαν σε 1,5% πηκτή αγαρόζης με βρωμιούχο αιθίδιο. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος κανονικοποίηση.

Μέτρηση

κυτταρικού θανάτου

Κατεργασμένα και κύτταρα ελέγχου συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε PBS, και αραιώνονται 1:01 σε 0,4% Trypan blue (Invitrogen). Dead (μπλε) και να ζήσουν μη χρωματισμένα κύτταρα μετρήθηκαν αμέσως χρησιμοποιώντας ένα αιματοκυτταρόμετρο. Το ποσοστό των νεκρών κυττάρων προσδιορίσθηκε από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα γίνονται εις διπλούν.

Μέτρηση της Κυτταρικής ROS Επίπεδα

Η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [28]. Εν συντομία, τα κύτταρα που αναφέρονται σε ισοδύναμες συρροή συλλέχθηκαν μέσω θρυψίνωση, πλύθηκαν σε παγωμένο ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα 1Χ Hank (HBSS) και επωάστηκαν με φρεσκοπαρασκευασμένο 5- (και-6) -χλωρομεθυλο-2 ‘, 7’-διχλωρο διοξεικό ( CM-DCF-DA? Molecular Probes /Invitrogen, C6827) για 20 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 1Χ HBSS πριν από την ανίχνευση του σήματος FITC μέσω ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων (FACS). ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε σε Accuri C6 κυτταρομετρητή (BD Biosciences). Ο άξονας x αντιπροσωπεύει FITC κανάλι (FL 1) ένταση φθορισμού στο ημερολόγιο κλίμακας και τον άξονα y αντιπροσωπεύει τον αριθμό των κυττάρων. Τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον εις διπλούν, με αντιπροσωπευτικά προφίλ που εμφανίζεται.

χρώση κρυσταλλικού ιώδους

Περίπου 3 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε cm πιάτα 10 που περιέχει RPMI συν 5% FBS για 36-48 ώρες πριν από τη μετάβαση σε RPMI συν 5% CSS. Το μέσο ανανεώνεται κάθε 3-4 ημέρες. Για κρύσταλλο χρώση ιώδες, μέσα αναρροφήθηκαν και τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά σε 1Χ PBS, 1% διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους προστέθηκε σε κάθε τρυβλίο και αφέθηκε για τη χρώση για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο λεκές απομακρύνεται και το κάθε πιάτο ξεπλύθηκαν δύο φορές σε απιονισμένο νερό. Πιάτα στη συνέχεια εμβαπτίστηκαν σε νερό για 20-30 λεπτά για να εκλυθεί η περίσσεια λεκέ και να μειώσει το υπόβαθρο, και αφήνεται να στεγνώσει στον αέρα όλη τη νύχτα πριν την καταμέτρηση αποικιών ή τη λήψη φωτογραφιών. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα των αποτελεσμάτων προσδιορίστηκε με υπολογισμό της τυπικής απόκλισης από τη μέση τιμή και με t-test δύο ουρών του Student, με ρ & lt?. 0.05 θεωρούνται σημαντική.

Αποτελέσματα και Συμπεράσματα

Χαρακτηριστικά του Άδη σε LNCaP και LAPC4 κύτταρα

για να επιβεβαιωθεί κατά πόσο η παρατηρούμενη πολλαπλασιαστική σύλληψης κατά μ.Χ. οφείλεται στην επαγωγή της κυτταρικής γήρανσης , χρησιμοποιήσαμε την καλά χαρακτηρισμένη ανδρογόνο ευαίσθητη κυτταρική γραμμή LNCaP αφού διαθέτει λειτουργική εκδόσεις και των δύο μεγάλων γηρασμό-μεσολάβηση μονοπάτια, ρ53 και ρ16

ΙΝΚ4 & [32], [33]. Επιπλέον, σύμφωνες με κλινικά μοντέλα του καρκίνου του προστάτη, LNCaP κύτταρα δείχνουν αυθόρμητη αποφύσεις των παραλλαγών των ανδρογόνων-πυρίμαχων μετά από μακροχρόνια καλλιέργεια σε ανδρογόνα-εξαντλημένο μέσων [20], [34]. Κατά συνέπεια, καλλιεργήσαμε κύτταρα LNCaP σε μέσα που περιέχουν CSS-(εφεξής καλλιέργεια CSS) για να μιμηθούν AD και αξιολογούνται εμφάνιση της κυτταρικής δείκτες γήρανσης.

Βρήκαμε ότι εκτός από την αναμενόμενη πολλαπλασιαστική σύλληψης (Εικ. S1 Α ) και την απόκτηση ενός νευροενδοκρινούς μορφολογία [35] (Εικ. 1Α), CSS-καλλιεργημένα κύτταρα LNCaP αναπτύσσονται επίσης και άλλα διαφορετικών δεικτών της κυτταρικής γήρανσης (Εικ. 1) [36]. Αυτές περιλάμβαναν αυξημένο γήρανση σχετιζόμενη βήτα-γαλακτοσιδάσης (SA-βήτα-gal) δραστηριότητα (Εικ. 1Α), μειωμένη χρώση για τον δείκτη παν-πολλαπλασιασμού, Ki67 (Εικ. 1Β) και μία σύλληψη G1 /S του κυτταρικού κύκλου (σχ. 1C ). Μετά από 7 ημέρες σε καλλιέργεια CSS, & gt? 50% των κυττάρων εμφάνισαν αυτά τα χαρακτηριστικά και κατά 10 ημέρες σε CSS, ότι κλάσμα αυξήθηκε σε & gt? 80% του πληθυσμού χύδην (Σχήμα 1 Α-Β.). Η θεραπεία με αντι-ανδρογόνο, βικαλουταμίδη, επίσης προκαλούμενη πολλαπλασιαστική παύση και την εμφάνιση ενός γηρασμένου φαινοτύπου όπως προσδιορίζεται με χρώση SA-βήτα-gal και ένα G1 /S σύλληψης (Εικ. S1). Αντίθετα, ελάχιστη κυτταρικός θάνατος παρατηρήθηκε κατά CSS ή βικαλουταμίδη αγωγή όπως κρίνεται με οπτική έλλειψη στρογγυλεμένες, μη συνδεδεμένα κύτταρα και διασπάται έκφραση ΡΑΚΡ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σημαντικά όταν τα κύτταρα αποκατασταθεί ανδρογόνα γεμάτος εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) μέσα μετά από 14 ημέρες καλλιέργειας CSS, το μεγαλύτερο μέρος του πληθυσμού που διατηρούνται σε γήρανση δείκτες (που φαίνεται στην περίπτωση της επαναφοράς στην κορεσμένη FBS καλλιέργεια επί 9 ημέρες, υποδηλώνονται ως 9D FBS ανάρτηση -SEN), υποδεικνύοντας ότι η σύλληψη του πολλαπλασιασμού είναι μόνιμη και όχι παροδικής φύσεως (Εικ. 1Α-C).

Για την περαιτέρω διάκριση της CSS πολιτισμό που προκαλείται από τη σύλληψη του πολλαπλασιασμού από τον προσωρινό φαινόμενο της κυτταρικής ηρεμίας, καλλιεργήσαμε LNCaP κύτταρα σε μέσα χωρίς ορό, που είναι γνωστό ότι επάγουν ηρεμία [37], για 7 ημέρες, παράλληλα με κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε CSS media. Στη συνέχεια αλλάξαμε τα δύο σύνολα των κυττάρων πίσω στο FBS μέσα ενημέρωσης για 4 ημέρες. Ενώ τα κύτταρα LNCaP υποβάλλονται σε καλλιέργειας χωρίς ορό επανέλαβε πολλαπλασιασμό μόλις αποκατασταθεί πλήρως μέσα μαζικής ενημέρωσης, που αντιστοιχεί σε αύξηση του δείκτη πολλαπλασιασμού, κυκλίνη Α, τα CSS-καλλιεργημένα κύτταρα δεν το έπραξε (Εικ. S2). Καθώς τα κύτταρα LNCaP υποστούν καμία περαιτέρω διπλασιασμούς πληθυσμού φορά τοποθετείται κάτω από ανδρογόνο στερηθεί τον πολιτισμό (Εικ. S1 Α), αλλά να διαρκέσει έως και 4 ημέρες για να δείξει σημαντική εξαγορά των δεικτών γήρανση (Εικ. 1Α, Β), θελήσαμε να καθορίσει εάν αυτό σύλληψη του πολλαπλασιασμού ήταν αναστρέψιμη πριν από 4 ημέρες από την εξάντληση των ανδρογόνων. Για να γίνει αυτό, τα κύτταρα LNCaP μεταφέρθηκαν πίσω στην ανδρογόνων-κορεσμένη μέσα μαζικής ενημέρωσης στις 3, 8 ή 14 ημέρες μετά CSS πολιτισμό (Εικ. 1D). Βρήκαμε ότι τα κύτταρα επανέρχεται FBS μέσα μαζικής ενημέρωσης κατά την ημέρα 3 ήταν άμεσα σε θέση να επαναλάβουν τον πολλαπλασιασμό. Σε σύγκριση, τα κύτταρα αλλάξουν σε κορεσμένη μέσων κατά την ημέρα 8 δεν επανέλαβε την πλήρη πολλαπλασιασμό αλλά ένα υποσύνολο αυτών των κυττάρων ήταν σε θέση να συνεχίσει τη διαίρεση, υποδηλώνοντας μια μερική αμετάκλητα συλληφθεί κυτταρικού πληθυσμού. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας στο σχ. 1Α-Β, δεν πολλαπλασιασμός παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα επανέρχεται σε πλήρη μέσα ενημέρωσης μετά από 14 ημέρες σε καλλιέργεια CSS (Σχ. 1D). Έτσι, συνολικά, τα αποτελέσματά μας βεβαιωθείτε ότι μ.Χ. προκαλεί τα κύρια χαρακτηριστικά της κυτταρικής γήρανσης στα κύτταρα LNCaP.

Πριν από τη σταδιακή αύξηση των συνολικών κυτταρικών επιπέδων ROS Ο φαινότυπος ADIS παρατηρούμε στα κύτταρα LNCaP ήταν, παρατηρείται ήδη μία ημέρα μετά την αλλαγή κυττάρων σε CSS μέσα (Σχ. 1Ε), καθώς επίσης και από την εμφάνιση του προοδευτικά μεγαλύτερων αριθμών συν-εντοπισμένη γ-Η2ΑΧ και 53BP1 εστίες (Εικ. 1 F). Αυτές οι εστίες είναι ενδεικτικά μιας ανταπόκρισης βλάβης του DNA στερέωσης (DDR), προφανώς ως απάντηση στην επίμονη επιδιορθώθηκε βλάβη του DNA [28], [38]. Η ADIS σχετιζόμενη αύξηση των επιπέδων ROS και εστίες βλάβης του DNA είναι συνεπή με το γνωστό αιτιολογία της κυτταρικής γήρανσης [36], ενισχύοντας περαιτέρω ότι AD δημιουργεί ανάντη καταπονήσεις που είναι γνωστό ότι ενεργοποιούν την κυτταρική γήρανση.

ADIS είναι διαμεσολαβείται από την ρ16

ΙΝΚ4 & Pathway και των συνδεδεμένων με καταστολή της p53 Pathway

Δύο μεγάλες πορείες ογκοκατασταλτικό, η p53 /p21

Cip1 /WAF1 και p16

ΙΝΚ4 &, συνήθως μεσολαβούν γήρανση [39], [ ,,,0],40]. Ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου ή στρεσογόνο, γηρασμένου φαινότυπος συνδέεται με την ενεργοποίηση ενός ή και των δύο αυτών των οδών [39], [41]. Ωστόσο, ακόμη και αν οι δύο οδοί ενεργοποιούνται, μπορεί κανείς να κυριαρχούν για την επιβολή του γηρασμένου φαινότυπο [28], [40]. Κατά συνέπεια έχουμε προσδιορίστηκαν κύτταρα LNCaP στην αύξηση της διάρκειας του πολιτισμού CSS με ανίχνευση ολικής πρωτεΐνης λύματα από αυτά τα δείγματα για τα επίπεδα των πρωτεϊνών γήρανση-μεσολάβηση, p16

ΙΝΚ4 & και p53 /p21

Cip1 /WAF1. Όπως ήταν αναμενόμενο, η έκφραση AR μειώθηκε με την αύξηση της διάρκειας της CSS πολιτισμό (Εικ. 2Α). Παρά το γεγονός ότι,

a priori

, η ύπαρξη ενός επίμονη ΑΑΕ (Εικ. 1 F) μας οδήγησε να αναμένουμε ότι η οδός ρ53 /ρ21 θα συμμετείχε, διαπιστώσαμε ότι αντί ADIS συσχετίστηκε με αύξηση της έκφρασης του ρ16

ΙΝΚ4 & (Σχ. 2Α). Παραδόξως επίπεδα του p53 και του κύκλου-ρυθμιστική πρωτεΐνη κυττάρου τελεστή του, p21

Cip1 /WAF1, μειώθηκε με την αύξηση της διάρκειας του πολιτισμού CSS (Εικ. 2Α). Επιπλέον, η προσθήκη 10 nM διυδροτεστοστερόνη (DHT) με CSS media ήταν σε θέση να αποτρέψει τόσο την παρατηρούμενη μείωση στην AR και κυκλίνης επίπεδα Α και τα ADIS που σχετίζονται με αλλαγές στο p16

ΙΝΚ4 & και της έκφρασης p53 (Εικ. S3A). Αυτό το εύρημα επιβεβαιώνει αυτά τα μοριακά αλλαγές συμβαίνουν ειδικά λόγω της απουσίας του ανδρογόνου στο μέσο καλλιέργειας.

(Α) Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη επί περίπου 35 μg από τα υποδεικνυόμενα δείγματα πρωτεΐνης με αντισώματα έναντι των πρωτεϊνών υποδηλώνονται. μπλε βαφή Coomassie χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση για ολική πρωτεΐνη φόρτωσης. Σημειώστε ότι η έκφραση AR μειώνεται καθώς αναμένεται κατά πολιτισμό CSS. Η τάση της έκφρασης p53, p21 και p16 πρωτεΐνη διατηρείται μετά την αποκατάσταση της ανδρογόνο γεμάτη πολιτισμό μετα-γήρανση (μετα-SEN) που δείχνει τη μονιμότητα των αλλαγών. (Β) Ανοσοστύπωμα για να δείξει αποτελέσματα της shRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν του p16 σε ADIS. Σημείωση αυξημένα AR και κυκλίνης επίπεδα Α σε κύτταρα shp16 σύμφωνα με CSS πολιτισμού σε σχέση με τον έλεγχο ή την shp53 νοκ ντάουν κύτταρα. (C) Επίδραση της καταστολής p16 σε χρώση SA-β-gal. Τα υποδεικνυόμενα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε CSS για 14 ημέρες και στη συνέχεια άλλαξαν σε FBS- περιέχουν μέσα για περαιτέρω 9 ημέρες. Σημειώστε την παρατηρούμενη μείωση στην κηλίδωση SA-βήτα-gal σε shp16 κύτταρα. * P & lt?. 0.05

Η

Αξίζει να σημειωθεί, p16

επίπεδα έκφρασης ΙΝΚ4 & παρέμεινε σε υψηλά επίπεδα και p53 /p21 παρέμειναν σε χαμηλά επίπεδα στον πληθυσμό μεγαλύτερο ακόμα και μετά την αποκατάσταση των ανδρογόνων-γεμάτη πολιτισμό (Σχήμα 2Α.). Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζει τη μονιμότητα της γήρανση σχετίζεται με μοριακό κύκλωμα που ενεργοποιείται από τα ανδρογόνα στερηθεί τον πολιτισμό, παρά τη μερική ανάκαμψη των επιπέδων έκφρασης AR (Εικ. 2Α). Αυξημένα ρ16

επίπεδα ΙΝΚ4 & μαζί με αυξημένη χρώση SA-βήτα-gal, μειωμένη πολλαπλασιασμό και μειωμένη AR και κυκλίνη Α έκφρασης παρατηρήθηκαν επίσης μετά από CSS καλλιέργεια του αποκρίνονται στο ανδρογόνο αλλά ρ53-μεταλλαγμένο [32] LAPC4 κυτταρικής σειράς (Σχ. S4A-D).