Abstract

Η χρήση των αναστολέων της κινάσης τυροσίνης (ΤΚΙδ) έναντι EGFR /c-Met σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) έχει αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματικό στην αύξηση της μετάβασης ασθενή επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS) , αλλά η αποτελεσματικότητά τους είναι περιορισμένη λόγω της ανάπτυξης αντίστασης και επανεμφάνισης του όγκου. Ως εκ τούτου, η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που υπόκεινται στην ανάπτυξη αντοχής φαρμάκου σε NSCLC είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη νέων και αποτελεσματικών θεραπευτικών προσεγγίσεων για τη βελτίωση της έκβασης του ασθενούς. Η μελέτη αυτή έχει ως στόχο να κατανοήσουμε τον μηχανισμό του EGFR /c-Met αναστολέας της τυροσινικής κινάσης (ΤΚΙ) αντίσταση σε NSCLC. κυτταρικές σειρές H2170 και Η358 έγιναν ανθεκτικά σε SU11274, έναν αναστολέα c-Met, και erlotinib, έναν αναστολέα EGFR, μέσω κατά στάδια αυξήσεις στην έκθεση ΤΚΙ. Το IC

50 συγκεντρώσεις των ανθεκτικών γραμμές παρουσίασαν 4-5 και 11-22 φορές αύξηση για SU11274 και erlotinib, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τη γονική γραμμές. Επιπλέον, mTOR και σηματοδότηση Wnt μελετήθηκε σε δύο κυτταρικές σειρές για να καθορίσει τους ρόλους τους στην διαμεσολάβηση αντίσταση ΤΚΙ. Παρατηρήσαμε μια 2-4 φορές προς τα πάνω ρύθμιση των πρωτεϊνών σηματοδότησης mTOR και 2- έως 8-πλάσια προς τα πάνω ρύθμιση των πρωτεϊνών σηματοδότησης Wnt σε H2170 erlotinib και ανθεκτικά κύτταρα SU11274. H2170 και Η358 κύτταρα περαιτέρω επεξεργασία με το everolimus αναστολέα mTOR και του αναστολέα XAV939 Wnt. ανθεκτικά κύτταρα Η358 ανεστάλησαν κατά 95% από ένα τριπλό συνδυασμό του everolimus, erlotinib και SU11274 σε σύγκριση με 34% από ένα διπλό συνδυασμό αυτών των φαρμάκων. Γονικά κύτταρα H2170 εμφανίζεται καμία ευαισθησία σε XAV939, ενώ ανθεκτικά κύτταρα αναστέλλεται σημαντικά (39%) από XAV939 ως μονοθεραπεία, καθώς και σε συνδυασμό με SU11274 και erlotinib. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με κύτταρα ανθεκτικά Η358. Αυτή η μελέτη προτείνει ένα νέο μοριακό μηχανισμό της ανθεκτικότητας στα φάρμακα για τον καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Fong JT, Jacobs RJ, Moravec DN, Uppada SB, Botting GM, Nlend M, et al. (2013) Εναλλακτικές μονοπάτια σηματοδότησης ως πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι για την υπέρβαση EGFR και c-Met Αναστολέας Αντίσταση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (11): e78398. doi: 10.1371 /journal.pone.0078398

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Απρ 2013? Αποδεκτές: 11 του Σεπτέμβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 4 Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Fong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Έρευνας αναφερθεί σε αυτή τη δημοσίευση υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας υπό τον αριθμό βραβείο R21CA158965-01A1 https://www.nih.gov να Neelu Puri. Το περιεχόμενο είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα εξής ενδιαφέροντα: Δρ Μαρία Nlend απασχολείται από Thermo Fisher Scientific . Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

EGFR και c-Met είναι τόσο πολύ εκφράζεται σε όγκους NSCLC και μοιράζονται κοινές οδούς σηματοδότησης [1] – [3]. Ενώ TKIs εναντίον EGFR και c-Met βρίσκονται στην αιχμή της θεραπείας του καρκίνου, οι ατομικές efficacies τους περιορίζονται [4] λόγω της ανάπτυξης της αντίστασης [5]. λογαριασμούς ενίσχυση c-Met για περισσότερο από 20% της επίκτητης αντίστασης σε EGFR TKIs σε NSCLC τόσο

in vitro

και

in vivo

[6], [7]. Επιπλέον, η ανάπτυξη της δευτερογενούς «φύλακα» λογαριασμούς Τ790Μ μετάλλαξη για το 50% του συνόλου των επίκτητη αντοχή σε EGFR TKIs τόσο

in vitro

και

in vivo

[8]. Επίσης, η παρουσία του πριν από τη θεραπεία με TKIs οδηγεί σε πρωτογενή αντίσταση στη θεραπεία με EGFR ΤΚΙ [9]. Ως εκ τούτου, να διερευνήσει τους μηχανισμούς αντίστασης είναι σημαντικό να διεξάγει πρόσθετες

in vitro

μελέτες για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών στόχων υπεύθυνη για την αντίσταση ΤΚΙ σε NSCLC.

SU11274 είναι μια ATP-ανταγωνιστικός αναστολέας μικρό μόριο του καταλυτική δράση του c-Met [10] και είναι αποτελεσματικό έναντι NSCLC [11]. Tivantinib, ένα c-Met ΤΚΙ η οποία αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς [12], είναι επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές φάσης III και έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν PFS από 9,7 έως 16,1 εβδομάδες, όταν χορηγείται σε συνδυασμό με erlotinib [13], [14]. Στις δοκιμές αυτές, μόνον ορισμένες υποομάδες ασθενών (μεταλλάξεις KRAS, μη πλακώδους ιστολογία και EGFR κατάσταση άγριου τύπου) εμφάνισαν σημαντικά αυξημένη PFS [14], υποδηλώνοντας ότι οι νέες TKIs πρέπει να προστεθούν σε αυτό το συνδυασμό. Επιπλέον, η θεραπεία με ένα συνδυασμό MetMab (αντι c-Met mAb) και erlotinib μείωσε τον κίνδυνο θανάτου κατά 3 φορές σε μόνο ένα υποσύνολο των ασθενών θετικά για έκφραση c-Met [15]. Ενώ η χρήση των συνδυασμένων τρόπων θεραπείας μπορεί να περιορίσει την ικανότητα των όγκων να αναπτύσσουν αντοχή [7], την κατανόηση του μηχανισμού της αντίστασης είναι η καλύτερη προσέγγιση για τη βελτίωση στοχευμένη θεραπεία [16].

Οι μελέτες από την ομάδα μας και τους άλλους δείχνουν ότι το c-Met και EGFR έχουν σημαντικές αλληλοπαρεμβολών που αυξάνει την αποτελεσματικότητα για συνδυασμούς ΤΚΙ

in vitro

[1], [17]. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι ο HGF μπορεί να μετενεργοποιούν EGFR και φωσφορυλίωση του EGFR μπορεί να ενεργοποιήσει c-Met με αποτέλεσμα συνεργιστικά αποτελέσματα στην ανάπτυξη του όγκου [18] – [20]. Συνεπώς, ερευνήσαμε μια νέα θεραπευτική προσέγγιση για την υπερνίκηση αντίσταση σε EGFR, c-Met και EGFR /θεραπείες συνδυασμού c-Met ΤΚΙ σε NSCLC. Για την περαιτέρω κατανόηση πώς τα κύτταρα αναπτύσσουν αυτή την αντίσταση έχουμε αναπτύξει κυτταρικές σειρές H2170 και Η358 NSCLC με επίκτητη αντοχή σε TKIs του c-Met, EGFR και ένα συνδυασμό των δύο. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές επελέγησαν επειδή εκφράζουν υψηλά επίπεδα του EGFR και c-Met, τα συνεργικά αναστέλλονται από EGFR /c-Met TKIs και δεν έχουν προϋπάρχουσα EGFR ή αντίσταση c-Met που προκαλούν μεταλλάξεις.

Προηγούμενη μελέτες έχουν αποδείξει αυξημένη αποτελεσματικότητα με θεραπείες συνδυασμού σε σύγκριση με μονοθεραπείες [13], [14], [21] – [24]. Η ραπαμυκίνη αναστολέας mTOR είναι σε θέση να συνεργαστεί με c-Met αναστολέας PHA665752 στον NSCLC [25]. Περαιτέρω, με τη χρήση erlotinib και ραπαμυκίνη ή everolimus (ένας από του στόματος χορηγούμενη παράγωγο της ραπαμυκίνης) σε συνδυασμό έδειξε συνεργιστικά αποτελέσματα στη βιωσιμότητα των κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και autophagy [26], [27]. Αυτός ο συνδυασμός αποδείχθηκε επίσης για την αποκατάσταση της ευαισθησίας gefitinib [28]. Ωστόσο, οι μελέτες αυτές χορηγούνται μόνο αναστολείς EGFR και mTOR σε συνδυασμό. Στις μελέτες μας, έχουμε βρει ότι οι αναστολείς mTOR μπορεί να αυξήσει την αποτελεσματικότητα του EGFR /θεραπείας συνδυασμού c-Met ΤΚΙ για NSCLC

in vitro

. Περαιτέρω, έχει προταθεί ότι αλληλοπαρεμβολές μεταξύ EGFR και μονοπάτι Wnt μπορεί να συμμετέχει στην εμφάνιση και την εξέλιξη της ογκογένεσης και αλληλοπαρεμβολών μεταξύ συνδετήρων χωριστών RTK μεσολάβηση οδοί μπορούν να διευκολύνουν αντίσταση σε TKIs [29]. Υπερκινητικότητα του Wnt στον καρκίνο του μαστού έχει δειχθεί ότι διενεργοποιεί EGFR και αντιστρόφως, ενεργοποιημένα EGFR μπορεί να συμβάλει στην αυξημένη επίδραση του κανονικού μονοπατιού Wnt [30] – [33]. Επιπλέον, μελέτες σε τομές όγκων των ασθενών έχουν δείξει μια θετική συσχέτιση μεταξύ EGFR μεταλλάξεις ενεργοποίησης και πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης σε πρωτογενείς NSCLC [34]. Έχει επίσης δειχθεί ότι η οδός /β-κατενίνης Wnt έχει ένα ουσιαστικό ρόλο στη συντήρηση των κυττάρων, παθογένεση και αντίσταση μετά την αναστολή του EGFR σε NSCLC [35].

Τα στοιχεία μας δείχνει ότι η προσθήκη αναστολέων Wnt να TKIs SU11274 και τα αποτελέσματα erlotinib σε σημαντικά μειωμένη βιωσιμότητα σε κυτταρικές σειρές με επίκτητη αντοχή σε θεραπεία συνδυασμού EGFR /c-Met ΤΚΙ. Προτείνουμε ότι η ενεργοποίηση εναλλακτικών οδών σηματοδότησης είναι ένας πιθανός μοριακός μηχανισμός της ανθεκτικότητας στα φάρμακα σε NSCLC, χρησιμοποιώντας αναστολείς c-Met, EGFR, mTOR και Wnt μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την πρόγνωση του καρκίνου του πνεύμονα του ασθενούς και να είναι η βάση για νέες κλινικές δοκιμές.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

SU11274: [(3Ζ) -Ν- (3-χλωροφαινυλ) -3 – ({3,5-διμεθυλ-4 – [(4 μεθυλοπιπεραζιν-1-υλ) καρβονυλ] 1Η-πυρρολ-2-υλ} μεθυλενο) -Ν-μεθυλο-2-οξο-2,3-διϋδρο-1Η-ινδόλη-5-σουλφοναμίδιο] και XAV939: [3,5, 7,8-τετραϋδρο-2- [4- (τριφθορομεθυλ) φαινυλ] -4Η-θειοπυρανο [4,3-d] πυριμιδιν-4-όνη] ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Η erlotinib και Το everolimus ελήφθησαν από LC Laboratories (Woburn, ΜΑ). Tivantinib ελήφθη από Chemietek (Indianapolis, ΙΝ). Όλοι οι αναστολείς εναιωρούνται σε DMSO και φυλάσσονται σε κλάσματα 0,1 ml στους -20 ° C. HGF ελήφθη από Peprotech (Rocky Hill, NJ) και EGF λήφθηκε από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Phosphospecific mAbs κουνέλι για ρ-EGFR (Tyr1068, Κλώνος D7A5), ρ-mTOR (Ser2448, Κλώνος D9C2) και ρ-4E-BP1 (Thr37 /46, Κλώνος 2855) ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology, Inc (Beverly, ΜΑ) . Phosphospecific πολύκλωνα αντισώματα κουνελιού για ρ-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, 2532) και ρ-p70S6K (Tyr421 /Ser424, 9208) ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology. Ένα αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό για ρ-c-Met (Tyr 1003, 44882G) ελήφθη από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Ένα mAb ποντικού για την ενεργό β-κατενίνης (κλώνος 8E7, 05-665) ελήφθη από την Millipore (Billerica, ΜΑ). Για Wnt μελέτες σηματοδότησης, όλα τα αντισώματα που ελήφθησαν από το κιτ δειγματοληψίας αντισώματος σηματοδότησης Wnt από την Cell Signaling Technology (2915). Μη φωσφορυλιωμένη mAbs κουνέλι για p70S6K (2708) και mTOR (2983) ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology. Μη φωσφορυλιωμένη c-Met (C-12, sc-10) και EGFR (1005, sc-03) ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Ένα mAb ποντικού για β-ακτίνη (A5441) ελήφθη από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Ποντίκι (7076) και κουνελιού (7074) IgG δευτερογενή αντισώματα ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology. Όλα τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στις οδηγίες του κατασκευαστή.

Γραμμές Κυττάρων και Cell Culture

Η358 και κυτταρικές γραμμές H2170 NSCLC ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD, CRL-5807 και CRL-5928, αντιστοίχως) και καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες τους. Οι κυτταρικές σειρές επωάστηκαν στους 37 ° C και 7% CO

2 και διατηρούνται σε Roswell Park Memorial Institute (RPMI) μέσο (Thermo Fisher Scientific, Pittsburg, ΡΑ, Cat Νο: SH3002701) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA) και 1% (ν /ν) αντιβιοτικό /αντιμυκητιασικό (Invitrogen, Cat Νο: 15240). Για τη μελέτη των αποτελεσμάτων της erlotinib και SU11274 ως ενιαίο θεραπευτικοί παράγοντες, όπως επίσης και σε συνδυασμό, Η358 και H2170 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία μετά από 24 ώρες. Στη συνέχεια, δοκιμασίες βιωσιμότητας ΜΤΤ και στυπώματα Western πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται παρακάτω. IC

50 τιμές για κάθε κυτταρική σειρά υπολογίστηκαν με τη χρήση Sigma Οικόπεδο V12.0 (SYSTAT Λογισμικό, San Jose, CA).

ΜΤΤ κυττάρων Βιωσιμότητας Αναλύσεις

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με ένα ΜΤΤ δοκιμασία μείωσης χρωματομετρική χρωστική (Sigma, St. Louis, ΜΟ) με τη χρησιμοποίηση 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε πείραμα διεξήχθη σε πλάκες 96-φρεατίων σε επαναλήψεις έξι για κάθε συνθήκη αγωγή και επαναλήφθηκε τρεις φορές. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν στα 5000 κύτταρα /φρεάτιο και θεραπεία με αναστολείς μετά από 24 ώρες ανάπτυξης. Σε 96 ώρες μετά την επίστρωση, η βιωσιμότητα των κυττάρων τοις εκατό υπολογίστηκε σε σχέση με τον έλεγχο με μέτρηση της απορρόφησης σε μήκος κύματος 570 nm. Κύτταρα κατεργασμένα με tivantinib εκτέθηκαν μόνο για 24 ώρες, μετά από το οποίο αφαιρέθηκε το φάρμακο. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν για επιπλέον 72 ώρες, όπως περιγράφεται από τον προγενέστερο τους ερευνητές [12].

Παρασκευή κυτταρικά λύματα και κηλίδωση Western

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν και υποβλήθηκαν σε λύση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36] [37], σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 20 mM Tris (ρΗ, 8.0), 150 mM NaCl, 10% γλυκερόλη, 1% ΝΡ-40, 0,42% NaF, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, και 10 mM αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Sigma- Aldrich). Τα κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με 7.5% ή 10% SDS-PAGE υπό αναγωγικές συνθήκες. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες ακινητοποίηση (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Οι μεμβράνες μετά ανιχνεύθηκαν με τα προαναφερθέντα αντισώματα. Οι κηλίδες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο κιτ χημειοφωταύγειας (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) και ποσοτικοποίηση της διαφοροποίησης των διαφορετικών πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού ΝΙΗ ImageJ.

Ειδικά φωσφορυλίωση του c-Met /EGFR και άλλα μονοπάτια σηματοδότησης μέσω HGF /EGF και η αναστολή τους

τα κύτταρα στερήθηκαν παραγόντων ανάπτυξης με επώαση για 24 ώρες σε μέσο χωρίς ορό που περιέχει 0.5% BSA με ή χωρίς αναστολείς. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 40 ng /mL HGF για 7,5 λεπτά ή 5 ng /ml EGF για 5 λεπτά στους 37 ° C. Μετά την προετοιμασία λύματα, κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω.

ανοσοφθορισμού

10000 κύτταρα απλώθηκαν σε πλακίδια θαλάμου υάλου (Lab-Tek, Scotts Valley, CA) και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες σε μέσο χωρίς ορό με 0,5% BSA. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με EGF για 15 λεπτά, σταθεροποιήθηκαν με 1:01 ακετόνη: μεθανόλη και οπτικοποιήθηκαν με ρ-EGFR (Y1068) πρωτογενές αντίσωμα, DyLight αντι-κουνελιού 488 (πράσινο) δευτερεύον αντίσωμα (Thermo Fisher Scientific) και Hoechst χρωστική για την πυρηνική χρώση (μπλε) χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού Zeiss Axio Παρατηρητής Ζ1. λογισμικό ΝΙΗ ImageJ χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η ολική ένταση φθορισμού των κυττάρων πάνω από 8 μικροσκοπικά πεδία ανά συνθήκη και ελήφθη η μέση τιμή.

DNA Sequencing

5 εκατομμύρια κύτταρα απλώθηκαν σε δίσκους διαμέτρου 150 mm και αφέθηκαν να προσκολληθούν και αναπτύσσονται σε μέσα όπως περιγράφηκε παραπάνω. DNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το Qiagen DNeasy® Blood & amp? Κιτ ιστού (αρ. κατ. 69504) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. PCR πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια για να ενισχύσει εξόνια 18-21 του EGFR χρησιμοποιώντας εκκινητές που περιγράφονται από Paez et al [38], με τη χρήση της AmpliTaq Gold® PCR Master Mix (Applied Biosystems, αρ. Κατ. 4327058). Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού GeneJET ™ PCR (αρ. Κατ. K0701) και στη συνέχεια η αλληλουχία της Εγκατάστασης Πανεπιστήμιο του Ιλλινόις DNA Υπηρεσιών.

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS 17.0. Επαναλαμβανόμενες μετρήσεις της ANOVA με πολλαπλές συγκρίσεις κατά ζεύγη και έθιμο έρχεται σε αντίθεση με εκτελέστηκαν Bonferroni προσαρμογές. Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε με α στο 0,05. Για να επιβεβαιώσετε τις διαφορές μεταξύ των θεραπειών

t-test

επίσης χρησιμοποιείται σε συνδυασμό δύο-ουρά του Student. Για όλες τις αναλύσεις, μια τιμή p μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Δημιουργία ανθεκτικών στα φάρμακα κυτταρικές σειρές

Για τον προσδιορισμό των κατάλληλων συγκεντρώσεων του SU11274 , erlotinib και ένας συνδυασμός και των δύο TKIs για την ανάπτυξη των ανθεκτικών κυτταρικών γραμμών, κυτταρικές σειρές H2170 και Η358 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με προοδευτικά αυξανόμενες συγκεντρώσεις του SU11274 (2,5 έως 17 μΜ) [1], ερλοτινίμπη (0. 5-14 μΜ) [39 ], ή και τα δύο SU11274 (1,25 έως 13,5 μΜ) και erlotinib (0,25 έως 9 μΜ) για 96 ώρες. κυτταρικές σειρές H2170 και Η358 επελέγησαν επειδή δεν έχουν EGFR ΤΚ ή c-Met μεταλλάξεις. IC

50 τιμές για μεμονωμένα TKIs ή συνδυασμό προσδιορίστηκαν για κάθε κυτταρική γραμμή (Πίνακας 1). Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με αυξανόμενες συγκεντρώσεις SU11274 [1], erlotinib [39] ή ένα συνδυασμό για αρκετές εβδομάδες μετά από την οποία πέντε επιμέρους ανθεκτικοί κλώνοι απομονώθηκαν από μεμονωμένα κύτταρα, επεκτάθηκε και στη συνέχεια ελέγχονται για σταθερή αντίσταση μετά από κάθε δίοδο σειράς (μία φορά την εβδομάδα ) [40]. Ανθεκτικά κύτταρα αναπτύχθηκαν σε απουσία TKIs για 12 περάσματα (12 εβδομάδων) και βρέθηκαν να διατηρήσουν αντίσταση. Ανθεκτικοί κλώνοι από κυτταρικές σειρές που περιγράφονται στον Πίνακα 1, με IC

50 συγκεντρώσεις (που προσδιορίζεται όπως περιγράφεται στα υλικά και τις μεθόδους τμήμα) 4-5 φορές υψηλότερη για SU11274, 11-22 φορές υψηλότερη για erlotinib, και 6-8- φορές υψηλότερη για SU11274 και 15-30 φορές υψηλότερη για erlotinib σε συνδυασμό, απομονώθηκαν και επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτες. Χαμηλότερες συγκεντρώσεις ήταν απαραίτητες για την αντοχή συνδυασμός, δεδομένου ότι παρατηρήθηκε βελτιωμένη επιδράσεις της erlotinib και SU11274 όταν χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με άλλα ανθεκτικοί κλώνοι (δεδομένα που δεν φαίνονται).

Η

ανθεκτικών κυττάρων SU11274 (SR) εμφανίζουν μειωμένη ευαισθησία στον αναστολέα c-Met στόματος, tivantinib

Η επίδραση του tivantinib, ένα από του στόματος c-Met ΤΚΙ επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές [12], [14], για την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης σε γονικά και ανθεκτικά κύτταρα διερευνήθηκε. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις tivantinib για 24 ώρες, μετά από το οποίο αφαιρέθηκε το φάρμακο [12]. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν για επιπλέον 72 ώρες και τελικά μια δοκιμασία βιωσιμότητας ΜΤΤ διεξήχθη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, στα 0.1 μΜ tivantinib, γονικά κύτταρα H2170 ανεστάλησαν κατά 32% σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα γονικά κύτταρα, ενώ ανθεκτικά κύτταρα ανέστειλε μόνο κατά 10% σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ανθεκτικά (ρ & lt? 0,01). Munshi et al έχουν επίσης δείξει ευαισθησία σε υπομικρογραμμομοριακές συγκεντρώσεις tivantinib σε NSCLC όπως παρατηρήθηκε στις μελέτες μας [12]. Α 3-φορές μείωση στην αναστολή παρατηρήθηκε σε H2170 ανθεκτικά κύτταρα σε σύγκριση με γονικά κύτταρα (η = 6, ρ & lt? 0,01). Στην SR κύτταρα Η358 σε επεξεργασία με 0,2 μΜ tivantinib, μια 3,7-πλάσια μείωση στην αναστολή παρατηρήθηκε σε ανθεκτικά κύτταρα σε σύγκριση με γονικά κύτταρα (η = 6, ρ & lt? 0,01) (Fig1B). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η SR κύτταρα είναι επίσης ανθεκτικά σε tivantinib.

H2170 και τα κύτταρα Η358 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με tivantinib (0,01-0,4 μΜ) για 24 ώρες, tivantinib απομακρύνθηκε, και τα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες, μετά τις οποίες δοκιμασία βιωσιμότητας ΜΤΤ διεξήχθη. SR H2170 κύτταρα έδειξαν μία 3,2-πλάσια μείωση στην ευαισθησία προς την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του tivantinib στα 0,1 μΜ tivantinib σύγκριση με γονικά κύτταρα. Μια 3.7-πλάσια μείωση στην αναστολή της ανάπτυξης παρατηρήθηκε επίσης σε SR κύτταρα Η358 με 0,2 μΜ tivantinib συγκριτικά με γονικά κύτταρα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που δείχνουν παρόμοια αποτελέσματα (n = 6, ρ & lt? 0,01).

Η

Η δευτερεύουσα μετάλλαξη Τ790Μ δεν είναι απαραίτητη για την αντίσταση erlotinib

Αποτελέσματα DNA Sanger αλληλουχίας των προϊόντων PCR του εξώνια 18-21 από H2170 και Η358 γονικής και ανθεκτικά κύτταρα δεν έδειξαν δευτεροβάθμιας σημειακές μεταλλάξεις erlotinib /gefitinib Τ790Μ ή αντίσταση D761Y [41]. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν ότι τα κύτταρα μας δεν έχουν γνωστή δευτεροβάθμια μεταλλάξεις που θα μπορούσε να προκαλέσει αντίσταση. Έτσι, ο μηχανισμός με τον οποίο είναι ανθεκτικά μπορεί να οφείλεται σε εναλλακτικό σηματοδότηση μέσω υποδοχέων πλην EGFR.

Επίδραση του EGF και erlotinib στη φωσφορυλίωση του EGFR και πρωτεϊνών σηματοδότησης σε δυο ανθεκτικά μοντέλα NSCLC

για να κατανοήσουμε τον μηχανισμό της αντίστασης erlotinib, συγκρίναμε δύο διαφορετικές ανθεκτικές erlotinib κυτταρικές σειρές, H2170 ER και Η358 ER, με τις αντίστοιχες γονικές κυτταρικές σειρές τους. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία είτε με διαλυτικό, EGF, ερλοτινίμπη ή EGF + erlotinib. Η erlotinib ανθεκτικά (ER) H2170 κύτταρα εμφανίστηκαν να παρουσιάζουν ιδιοσυστατικά αυτοφωσφορυλιωμένης EGFR (Y1068) απουσία του συνδέτη του, EGF (19-πλάσια αύξηση), ενώ τα κύτταρα ER Η358 παρουσίασαν 6-πλάσια μείωση στο ρ-EGFR (Y1068) στο παρουσία EGF (Σχήμα 2Α). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με ανοσοφθορισμό η οποία κατέδειξε μια ελάχιστη επίδραση του ΕΤΠ στην φωσφορυλίωση του EGFR σε κύτταρα ER H2170. Μετά την επεξεργασία του +/- EGF, H2170 γονική και H2170-ER κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ειδικό πρωτεύον EGFR αντι-φωσφο (Y1068) αντίσωμα και DyLight 488-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικιού δεύτερο αντίσωμα φωσφορυλιωμένη EGFR (πράσινο) και οι πυρήνες βάφτηκαν μπλε με βαφή Hoechst. Αυτό υποδηλώνει αυτοφωσφορυλίωση του EGFR (Εικόνα 2Β). Όταν μετρήθηκαν συνολικός μονάδες φθορισμού, μια αύξηση 3.8- και 1.7-φορές σε φθορισμό παρατηρήθηκε σε παρουσία και απουσία του EGF, αντίστοιχα, ανθεκτικά κύτταρα σε σύγκριση με γονικά κύτταρα (η = 8, ρ & lt? 0,01). Είναι ενδιαφέρον, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο φθορισμό στα κύτταρα H2170 ER υπό την παρουσία και απουσία του EGF (ρ & lt? 0,01).

A. Ο EGFR αυτοφωσφορυλιωμένης σε ER H2170 και προς τα κάτω σε ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές Η358-Ε4. p-mTOR (S2448) και πρωτεΐνη κατάντη σηματοδότησης της φωσφο-p70S6K (T389) είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω και στις δύο ανθεκτικές κυτταρικές σειρές. H2170 και Η358 γονικών και ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές στερήθηκαν τροφής όλη τη νύχτα σε 0.5% BSA και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς 7,0 μΜ erlotinib για 24 ώρες και τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 10 ng /mL του EGF για 2,5 λεπτά. Υψηλότερες συγκεντρώσεις της erlotinib χρησιμοποιήθηκαν δεδομένου ότι αυτές οι NSCLC κυτταρικές σειρές δεν έχουν καμία μετάλλαξη του EGFR ΤΚ. Η αυτοφωσφορυλίωση του EGFR επί Y1068 παρατηρήθηκε σε απουσία του EGF σε κύτταρα ER H2170 που δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα ER Η358-Ε4. Προς τα πάνω ρύθμιση του p-mTOR και κατάντη πρωτεΐνη της phosho-p70S6K (T389) παρατηρείται σε ανθεκτικά H2170 γραμμές +/- erlotinib. κύτταρα ER H2170 εμφανίζουν αυξημένη φωσφορυλίωση του EGFR +/- ΕΤΠ. Προς τα πάνω ρύθμιση του π-ERK (2-5 φορές) παρατηρήθηκε επίσης σε H2170 και Η358 κύτταρα ER σε +/- erlotinib B. Για να επιβεβαιωθεί αυτοφωσφορυλίωση EGFR, τα κύτταρα απλώθηκαν σε πλακίδια θαλάμου, αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες και στη συνέχεια Starved διανυκτέρευση. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με EGF +/- για 15 λεπτά, σταθεροποιήθηκαν με ακετόνη: μεθανόλη και οπτικοποιήθηκαν με ρ-EGFR (Y1068) πρωτογενές αντίσωμα και δεύτερο αντίσωμα αντι-κουνελιού DyLight (Thermo Fisher Scientific) (πράσινο) ή βαφή Hoechst για πυρηνική χρώση ( μπλε) σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού Zeiss Axio Παρατηρητής Ζ1. Γραφική παράσταση που παρουσιάζει σε σχέση με το μέσο συνολικό μονάδες φθορισμού των κυττάρων ανά 8 μικροσκοπικά πεδία. Υπήρξε μια 3.8-πλάσια αύξηση του φθορισμού κατά τη σύγκριση γονικών να ανθεκτικών κυττάρων απουσία του EGF σε H2170 κύτταρα.

Η

Μελετήσαμε περαιτέρω την επίδραση της αντίστασης erlotinib επί της οδού mTOR, ένας ρυθμιστής κλειδί της ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων [42], μετρώντας ρ-mTOR και κατάντη του υποστρώματος του ρ-p70S6K. Σε ER Η358 και H2170 κυττάρων, ρύθμιση προς τα άνω (2-4 φορές) ρ-mTOR παρατηρήθηκε παρουσία erlotinib (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, προς τα πάνω ρύθμιση (2 φορές) ρ-p70S6K παρατηρήθηκε επίσης σε ER H2170 και Η358 κύτταρα παρουσία της erlotinib. Περαιτέρω, ρ-ERK επίσης ρυθμίζεται αυξητικά (2-5 φορές) σε ER H2170 και Η358 κύτταρα παρουσία και απουσία της erlotinib (Σχήμα 2Α). Αριθ διαμόρφωση του συνολικού mTOR, EGFR, p70S6K ή ERK παρατηρήθηκε (Εικ S1). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η οδός mTOR και άλλους υποδοχείς θα μπορούσαν να ρυθμίζουν προς τα πάνω ρ-p70S6K αντίσταση έτσι μεσολαβούν μέσω δύο χωριστών μηχανισμών H2170 και Η358 NSCLC μοντέλα.

Επίδραση του HGF και SU11274 επί της φωσφορυλίωσης c-Met και οι πρωτεΐνες σηματοδότησης σε δύο μοντέλα NSCLC

για να κατανοήσουμε το μηχανισμό αντίστασης σε αναστολείς c-Met, ιδρύσαμε SR H2170 και SR κυτταρικές σειρές Η358 και να τους αντιμετωπίζεται με διαλυτικό, HGF, SU11274 και HGF + SU11274. SR κύτταρα H2170 και SR H358 παρουσίασαν 4 και 1,5-φορές προς τα κάτω ρύθμιση του p-c-Met (Y1003) αντίστοιχα, χωρίς αλλαγές στα συνολικά επίπεδα c-Met όπως αναλύθηκε με κηλίδωση Western (Σχήμα 3). Προς τα κάτω ρύθμιση φαίνεται να είναι εντελώς ανεξάρτητη από οποιαδήποτε θεραπεία SU11274 αφού η καταστολή παρατηρήθηκε μετά από έξι περάσματα σε απουσία του φαρμάκου. Αυτό θα μπορούσε να σημαίνει ότι η SR H2170 και Η358 δεν χρησιμοποιούν π-c-Met ως μέσο αντίστασης που θα προτείνει ένα ξεχωριστό μηχανισμό. Παρόμοια με τα κύτταρα ER, σε μη επεξεργασμένα SR H2170 κυττάρων, βρήκαμε μία αξιοσημείωτη ανοδική ρύθμιση (20-φορές) ρ-p70S6K, μία πρωτεΐνη κατάντη του mTOR που εμπλέκεται στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων [42], και μια ρύθμιση προς τα άνω παρατηρήθηκε σε κύτταρα κατεργασμένα με HGF και SU11274 (Σχήμα 3). Μια 2-πλάσια αυξητική ρύθμιση σε ρ-4Ε-BP1, πρωτεΐνη κατάντη του mTOR που προωθεί ογκογονικότητα, παρατηρήθηκε σε αμφότερα SR H2170 και Η358 κύτταρα (Σχήμα 3). Αριθ διαμόρφωση του συνολικού mTOR, EGFR, p70S6K ή ERK παρατηρήθηκε σε οποιαδήποτε κυτταρική γραμμή (Σχ S1). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η οδός mTOR μπορεί να εμπλέκεται στη διαμεσολάβηση αντίσταση.

Τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής όλη τη νύκτα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς 8,0 μΜ SU11274 για 24 ώρες. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 40 ng /mL του HGF για 2.5 λεπτά μετά από το οποίο διεξήχθη ανάλυση κηλίδας western. Προς τα κάτω ρύθμιση του ρ-c-Met (Y1003) παρατηρήθηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Προς τα πάνω ρύθμιση του π-p70S6kinase (S371) παρατηρήθηκε σε SR H2170 κύτταρα. Προς τα πάνω ρύθμιση του π-4E-BP1 (Τ37 /46) παρατηρήθηκε επίσης σε δύο γραμμές κυττάρων +/- SU11274.

Η

Ενεργοποίηση του μονοπάτι Wnt συμβάλλει στην EGFR /c-Met ΤΚΙ αντίσταση

Το μονοπάτι Wnt ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διαδραματίζει βασικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα [43], [44]. Από σηματοδότηση β-κατενίνης δείχθηκε να ενεργοποιεί το μονοπάτι σηματοδότησης ERK [45], εξετάσαμε ρ-ΕΚΚ (Τ202 /Y204) και ενεργός β-κατενίνης σε απόκριση σε HGF την πάροδο του χρόνου σε SR H2170 κύτταρα. Βρήκαμε ότι το ρ-ΕΚΚ παρέμεινε αυξημένη για περισσότερο από 120 λεπτά σε SR H2170 κύτταρα αλλά μόνο για 30 λεπτά σε γονικά κύτταρα (Σχήμα 4Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε μη διεγερμένα κύτταρα, τα βασικά επίπεδα των δραστικών β-κατενίνης (2 φορές) και ρ-ΕΚΚ (5,6 φορές) ήταν υψηλότερες και παρέμεινε αυξημένη για 120 λεπτά μετά την αγωγή HGF σε SR H2170 κυττάρων σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα μετά 60 επώαση λεπτά (η = 3, ρ & lt? 0,01) (Εικ 4Α), το οποίο υποδηλώνει στιχομυθία του μονοπατιού c-Met, mTOR και Wnt. Μετά τη θεραπεία με SU11274 και HGF, παρατηρήσαμε μια 3-8 φορές αύξηση στην ενεργό β-κατενίνης με την παρουσία και απουσία του SU11274 σε SR H2170 κύτταρα (Εικόνα 4Β). Ένα 2-3-φορές προς τα πάνω ρύθμιση του ρ-LRP6 υπό την παρουσία και απουσία του SU11274 παρατηρήθηκε επίσης. Προς τα πάνω ρύθμιση πρωτεϊνών που σχετίζονται με το μονοπάτι Wnt επιβεβαιώθηκε σε κύτταρα ER H2170. Παρατηρήσαμε μια αύξηση 2-4 φορές και 3-5 φορές αύξηση του ρ-LRP6 απουσία ή παρουσία της erlotinib, αντίστοιχα. φωσφορυλίωση LRP6 μπορεί να υποδεικνύει την ενεργοποίηση του μονοπάτι Wnt [46]. Παρατηρήσαμε επίσης μία 2-3,5-πλάσια αύξηση στην έκφραση του Axin1, έναν ρυθμιστή του LRP6, και στη συνέχεια το μονοπάτι Wnt [31] (Εικόνα 4C).

A. Στην SR H2170 κυττάρων, HGF που επάγεται προφέρεται σηματοδότηση ρ-ERK σε σύγκριση με γονικά κύτταρα. Τα κύτταρα πεινασμένο για 48 ώρες και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 40 ng /mL του HGF. Κηλίδωση Western σε SR H2170 έδειξε ότι, HGF ενεργοποιηθεί π-ΕΚΚ (T202 /Y204) παρέμεινε σε υψηλά επίπεδα για 120 λεπτά σε σύγκριση με τη γονική γραμμές. Τα βασικά επίπεδα του δραστικού β-κατενίνης ήταν επίσης 2-πλάσια υψηλότερη και παρέμεινε σε υψηλά επίπεδα (3,6 φορές) για 120 λεπτά μετά την αγωγή HGF σε SR H2170 κυττάρων σε σύγκριση με εκείνους σε γονικά κύτταρα επί 60 λεπτά επώασης. Αυτά τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν. Σχετική πυκνομετρία ρ-ΕΚΚ /β-ακτίνης σε SR H2170 κυττάρων απεικονίζεται η οποία είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (η = 3, ρ & lt? 0,01). B. Κανονισμός πρωτεϊνών στο μονοπάτι σηματοδότησης Wnt μετά τη θεραπεία του H2170 με SU11274. Προς τα πάνω ρύθμιση pLRP6 (2 έως 3,0 φορές) και β-κατενίνης (3 έως 8.0 φορές) παρατηρήθηκαν σε κύτταρα ανθεκτικά H2170 παρουσία ή απουσία SU11274. Γ κανονισμού πρωτεϊνών στο μονοπάτι σηματοδότησης Wnt μετά την επεξεργασία των κυττάρων ER H2170 με erlotinib. Προς τα πάνω ρύθμιση LRP6 (2 έως 5 φορές), και Axin1 (2 έως 3,5 φορές) παρατηρήθηκαν σε κύτταρα ανθεκτικά H2170 παρουσία ή απουσία της erlotinib.

Η

Η ανάπτυξη του συνδυασμού H2170 και Η358 τα ανθεκτικά κύτταρα (CR) αναστέλλεται από everolimus και XAV939

Δεδομένου ότι η οδός mTOR συμμετέχει στην ανθεκτικότητα αντικαρκινικού φαρμάκου [47], ευαισθησία στην αναστολή mTOR σε CR H2170 και κυτταρικές σειρές Η358 ελέγχθηκε. Η θεραπεία με 1 μΜ everolimus αναστέλλεται Η358 γονικών κυττάρων κατά 40% και ανθεκτικά κύτταρα μόνο κατά 20%. Είναι ενδιαφέρον ότι η ίδια συγκέντρωση του everolimus ανέστειλε την ανάπτυξη των γονικών κυττάρων εντελώς και ανθεκτικά κύτταρα κατά 95% όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό είτε με SU11274 (8 μΜ) ή ερλοτινίμπη (8 μΜ) (Σχήμα 5Α). Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν σε κύτταρα CR H2170 (99% αναστολή της ανάπτυξης, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια εξετάσαμε το αποτέλεσμα της αναστολής της Wnt σε ανθεκτικά κύτταρα. H2170 γονικής και CR κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις XAV939 και μια δοκιμασία ΜΤΤ βιωσιμότητα διεξήχθη. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα γονικά κύτταρα έδειξαν μικρή ή καμία απόκριση σε XAV939, ωστόσο, τα κύτταρα CR αναστάλθηκαν σε μία δόση απόκρισης τρόπο (Σχήμα 5Β). Περαιτέρω, όταν XAV939 συνδυάστηκε με SU11274 (8 μΜ) και erlotinib (8 μΜ), μια μείωση 85% στη βιωσιμότητα παρατηρήθηκε σε κύτταρα CR. Αυτό υποδηλώνει ότι σηματοδότηση Wnt έχει σημαντικό ρόλο στην ανθεκτικά κύτταρα.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 96% αναστολή αύξησης παρατηρήθηκε όταν everolimus χρησιμοποιήθηκε τόσο με SU11274 και erlotinib. Β κύτταρα Γονικός H2170 δείχνουν μικρή ή μηδενική αναστολή όταν δίνεται αυξανόμενες συγκεντρώσεις XAV939. Αντιστρόφως, τα κύτταρα CR H2170 όταν έλαβαν θεραπεία με XAV939, ανεστάλησαν σε μία δόση απόκρισης τρόπο. κύτταρα H2170 CR δείχνει 40% αναστολή σε Wnt ανταγωνιστή XAV939 (10 μΜ) και μόνο, έδειξε 85% αναστολή με τριπλό συνδυασμό XAV939, SU11274 και ερλοτινίμπη (p & lt? 0,01). Κάθε πείραμα για κάθε συνθήκη θεραπεία επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Η

Συζήτηση

μοριακά στοχευμένες TKIs έχουν γίνει αναπόσπαστο μέρος της θεραπείας που χρησιμοποιείται από τους κλινικούς για την καταπολέμηση προηγουμένως ανίατες NSCLC. Ωστόσο, επίκτητη αντοχή σε TKIs έχει σοβαρά περιορίσει το βαθμό στον οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά η θεραπεία αυτή. Σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες, οι οποίες έχουν επικεντρωθεί στην EGFR μεταλλάξεις [8], [48], ερευνήσαμε πιθανές εναλλακτικές πορείες σε ανθεκτικά στα φάρμακα κυτταρικές σειρές σηματοδότησης. Μελετήσαμε δύο NSCLC μοντέλο κυτταρικές σειρές που παρουσίασαν είτε αυξητική ρύθμιση (H2170) ή προς τα κάτω ρύθμιση (Η358) ρ-EGFR και προς τα κάτω ρύθμιση ρ-c-Met (H2170 και Η358). Ανθεκτικά κύτταρα δεν εμφανίζουν ούτε το Τ790Μ ή μεταλλάξεις D761Y, προτείνοντας τη χρήση ενός εναλλακτικού μηχανισμού σηματοδότησης για να ξεπεραστούν επιδεκτικότητα erlotinib. Είναι ενδιαφέρον ότι τόσο H2170 και ανθεκτικά Η358 κύτταρα εμφανίζουν ανοδική ρύθμιση του μονοπατιού mTOR. Επιπλέον, H2170 ανθεκτικές κυτταρικές σειρές έδειξε διαφοροποίηση τόσο των μονοπατιών του mTOR και Wnt που προτείνει ρόλους τους στο μηχανισμό αντίστασης.

Αυτή τη στιγμή καμία σχέση έχει καθιερωθεί μεταξύ της αντίστασης c-Met ΤΚΙ και mTOR σε NSCLC. Ωστόσο, οι προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι η αναστολή της δραστηριότητας της κινάσης c-Met οδηγεί σε μειωμένη ενεργοποίηση του ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /μονοπάτι mTOR σε μετασχηματισμένα κύτταρα [25]. Ωστόσο, στην παρούσα μελέτη, παρατηρήσαμε καμία φωσφορυλίωση του c-Met σε H2170 και ανθεκτικό Η358 κυτταρικές σειρές όταν αντιμετωπίζονται με SU11274. Αυτό υποδηλώνει ότι SU11274, ενώ ένας αποτελεσματικός αναστολέας της φωσφορυλίωσης c-Met, έχει μικρή επίδραση επί της αναστολής της mTOR και οδών κατάντη σηματοδότησης του είναι αναγκαία για την ανάπτυξη των κυττάρων και την επιβίωση σε ανθεκτικές γραμμές [25]. Δεδομένου ότι ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές έχουν δειχθεί ότι πολλαπλασιάζονται παρουσία του SU11274, προτείνουμε εναλλακτικές οδοί έχουν σημαντικό ρόλο στην υπερνίκηση αναστολής c-Met και επιπλέον μοριακή στόχευση μπορεί να είναι απαραίτητη για την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης. Ο ρόλος του μονοπατιού mTOR σε μηχανισμούς αντοχής αποδεικνύεται από μια 2-4 φορές αύξηση του ρ-mTOR σε ανθεκτικά H2170 και Η358 κυττάρων σε σύγκριση με γονικά κύτταρα σε απόκριση σε θεραπεία erlotinib.