Αφηρημένο

Προσδιορισμός των σωματικών μεταλλάξεων στον καρκίνο είναι ένας σημαντικός στόχος για την κατανόηση και την παρακολούθηση των γεγονότων που σχετίζονται με την έναρξη του καρκίνου και την εξέλιξη. Υψηλής ανάλυσης ανάλυση λιώσιμο (HRM) καμπύλη αντιπροσωπεύει ένα γρήγορο, μετα-PCR μέθοδος υψηλής απόδοσης για τη σάρωση σωματικών μεταβολές αλληλουχίας σε γονίδια-στόχους. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η ευαισθησία και ειδικότητα της ανάλυσης HRM για διαλογή μετάλλαξη όγκου σε ένα φάσμα δειγμάτων όγκου, η οποία περιελάμβανε 216 κατεψυγμένα παιδιατρικούς μικρό στρογγυλεμένο όγκους μπλε-κυττάρων, καθώς και 180 ενσωματωμένες σε παραφίνη όγκους του μαστού, του ενδομητρίου και καρκίνους των ωοθηκών (60 από το καθένα). ανάλυση HRM πραγματοποιήθηκε σε εξώνια από τις ακόλουθες υποψήφια γονίδια που είναι γνωστό ότι το λιμάνι ιδρύθηκε συχνά παρατηρούνται μεταλλάξεις:

PIK3CA

,

ΕΚΒΒ2

,

KRAS

,

TP53

,

EGFR

,

BRAF

,

GATA3

, και

FGFR3

. Ανάλυση Αμφίδρομη αλληλούχιση χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η ακρίβεια της ανάλυσης HRM. Για τους 39 μεταλλάξεις παρατηρούνται σε κατεψυγμένα δείγματα, η ευαισθησία και η ειδικότητα της ανάλυσης HRM ήταν 97% και 87%, αντίστοιχα. Υπήρχαν 67 μετάλλαξης /παραλλαγές στις ενσωματωμένες σε παραφίνη δείγματα, και η ευαισθησία και ειδικότητα για την ανάλυση HRM ήταν 88% και 80%, αντίστοιχα. παραφίνη δείγματα ενσωματωμένα απαιτούν υψηλότερη ποσότητα του καθαρισμένου DNA για υψηλή απόδοση. Εν ολίγοις, η ανάλυση HRM είναι μια πολλά υποσχόμενη δοκιμασία διαλογής μέτριας απόδοσης για μεταλλάξεις μεταξύ γνωστός υποψήφιος περιοχές του γονιδιώματος. Αν και η συνολική ακρίβεια φαίνεται να είναι καλύτερα σε κατεψυγμένα δείγματα, σωματικές αλλαγές ανιχνεύθηκαν σε DNA από δείγματα παραφίνη-ενσωματωμένες

Παράθεση:. Gonzalez-Bosquet J, Calcei J, Wei JS, Garcia-Closas Μ, Sherman ME, Hewitt S, et al. (2011) ανίχνευση σωματικών μεταλλάξεων με υψηλής ανάλυσης-DNA τήξης (HRM) Ανάλυση σε πολλαπλές μορφές καρκίνου. PLoS ONE 6 (1): e14522. doi: 10.1371 /journal.pone.0014522

Επιμέλεια: Philip Awadalla, Πανεπιστήμιο του Μόντρεαλ, στον Καναδά

Ελήφθη: 2, Μάρτη του 2010? Αποδεκτές: 8 Δεκεμβρίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 17, Γενάρη 2011

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της δήλωσης Creative Commons Public Domain που ορίζει ότι, μόλις τοποθετηθεί στο δημόσιο τομέα, το έργο αυτό μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο σκοπό

χρηματοδότηση:.. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Πρόσφατα, οι πρώτες γονιδιώματα του καρκίνου πρέπει να αλληλουχία εντελώς έχουν αποκαλύψει μια unanticiapted εύρος και την πολυπλοκότητα των σωματικών αλλαγών [1], [2], [3]. Η ανακάλυψη των σωματικών αλλαγών ακολουθίας, έχει επιταχύνει την έρευνα της ir υποκείμενων μηχανισμών στην καρκινογένεση. Οι σωματικές αλλαγές που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου και το πλεονέκτημα ανάπτυξης που ονομάζεται

οδηγού μεταλλάξεις. Ωστόσο, η πλειοψηφία των σωματικών μεταβολές στην γονιδιώματα καρκίνου είναι συνέπεια της αστάθειας genomci και φαίνεται να είναι

επιβάτης

ή παριστάμενο μεταλλάξεις που είναι απίθανο να εμπλέκονται στην ογκογένεση [4], [5]. Μελέτες αλληλούχισης ευρείας κλίμακας έχουν δείξει ότι ο επιπολασμός και η υπογραφή σωματικών μεταλλάξεων σε ανθρώπινους καρκίνους είναι εξαιρετικά μεταβλητή [5], [6], [7], [8]. Με βάση αυτές τις μελέτες, μπορούμε να υπολογίσουμε ότι η πλειοψηφία των σωματικών μεταλλάξεων σε καρκινικά κύτταρα είναι πιθανό να είναι μεταλλάξεις των επιβατών, ενώ μια μειοψηφία εκτιμάται ότι είναι μεταλλάξεις οδηγού [5], [7]. Το πλήρες τοπίο της επικράτησης των μεταλλάξεων, καθώς και λειτουργικές συνέπειες τους δεν θα εκτιμηθεί έως ότου έχουν αλληλουχία χιλιάδες των γονιδιωμάτων καρκίνο.

καρκίνο αλληλουχίας γονιδιωμάτων είναι ένα εξαιρετικά δύσκολο έργο που απαιτεί δαπανηρές τεχνολογίες και υπολογιστική υποστήριξη για να συγκεντρώσει μεγάλο τμημάτων του γονιδιώματος. Λόγω του έντονου ενδιαφέροντος για τον προσδιορισμό των βασικών σωματικών αλλαγών, η έρευνα έχει επικεντρωθεί σε τεχνικές για τη διαλογή ή την ανάλυση των περιοχών ενδιαφέροντος. Οι περισσότερες μελέτες έχουν επικεντρωθεί σε περιοχές κωδικοποίησης και δίπλα ιντρονικές ή υποθετικές ρυθμιστικές περιοχές [9]. Μία από αυτές τις τεχνικές είναι η υψηλή ανάλυση λιώσιμο (HRM) ανάλυση καμπύλης, μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) με βάση υψηλής απόδοσης δοκιμασία για την ανίχνευση μιας παραλλαγής σειράς DNA με μέτρηση αλλαγών στην τήξη ενός DNA διπλής όψης, που έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία με το DNA εξάγεται από τόσο κατεψυγμένα και εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό [10], [11], [12].

HRM συγκεκριμένα προϊόντα PCR που δημιουργούνται για να ανακρίνει διαμορφωτικές διαφορές, επίσης γνωστή ως ανάλυση καμπύλης διαχωρισμού, με τη χρήση συμβατικών πραγματικό χρόνο πλατφόρμες PCR. Είναι χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με μία βαφή δίκλωνο δέσμευσης DNA, για να χαρακτηρίσει εκκινητή που σχετίζονται με μη-ειδική ενίσχυση (ή αστάρι διμερές) για την ανίχνευση ενός ειδικού στόχου. Οι αλλαγές μονής βάσης σε προϊόντα PCR ανιχνεύεται από αλλαγμένες ιδιότητες HRM παρακολουθείται μέσω της απελευθέρωσης του φθορισμού διπλής έλικας DNA χρωστική [13] δεσμευτική, [14]. Η ανάπτυξη ακριβών και ανέξοδη μέσα που προσφέρουν δυνατότητες HRM, και νέες φθορίζουσες χρωστικές, καθιστούν αυτή τη μέθοδο ελκυστική για στοχευμένη σάρωσης μετάλλαξη και επίσης βλαστικής του γονότυπου. ανάλυση HRM χρησιμοποιείται για την προ-σάρωση υποψήφιων γονιδίων ύποπτες φέρουν μεταλλάξεις, μειώνοντας σημαντικά την ποσότητα της αλληλουχίας του DNA που πρέπει να εκτελεστούν [15], [16], [17], [18], [19], [20].

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η ευαισθησία και ειδικότητα της φθηνής πλατφόρμας ανάλυση HRM για σάρωση μετάλλαξη παραλλαγή μονής βάσης σε ένα φάσμα δειγμάτων όγκου: κατεψυγμένα παιδιατρική μικρούς όγκους στρογγυλεμένες μπλε-κυττάρου και εγκλεισμένα σε παραφίνη όγκων του μαστού, του ενδομητρίου και των ωοθηκών. Αμφίδρομη ανάλυση της αλληλουχίας διεξήχθη για να προσδιοριστεί η ακρίβεια αυτής της τεχνολογίας HRM DNA.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review για την πολωνική μαστού, των ωοθηκών, και ενδομητρίου μελέτη για τον καρκίνο εγκρίθηκαν από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI), σε Bethesda, MD, του Μ Sklodowska Ινστιτούτο Ογκολογίας και Καρκίνου Κέντρο στη Βαρσοβία, και το Ινστιτούτο Ιατρικής της Εργασίας (IOM) στο Λοτζ, τόσο στην Πολωνία [21] . Γραπτή συγκατάθεση για τη συμμετοχή στις μελέτες που αποκτήθηκε στα συμμετέχοντα ιδρύματα από όλους τους συμμετέχοντες που εμπλέκονται

Όλα τα κατεψυγμένα δείγματα από παιδιατρικούς μικρές στρογγυλεμένες όγκους μπλε-κυττάρων και που λαμβάνονται από το δίκτυο ιστών Συνεταιρισμός Ανθρώπου (http:. //CHTN. nci.nih.gov/), ήταν ανώνυμα, και το πρωτόκολλο μας αναθεωρήθηκε από το Γραφείο για τα Ανθρώπινα Θέματα Έρευνας στο National Institutes of Health, Bethesda, MD, και θεωρείται ότι εξαιρούνται.

δείγματα DNA

τα κατεψυγμένα δείγματα ιστού.

δείγματα κατεψυγμένων όγκων Snap ελήφθησαν από το Δίκτυο ιστών Συνεταιρισμός Ανθρώπου (https://chtn.nci.nih.gov/). Οι κυτταρικές σειρές νευροβλαστώματος και συνθήκες καλλιέργειας τους περιγράφονται αλλού [22]. Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από τα κατεψυγμένα δείγματα πρωτογενούς όγκου (νευροβλάστωμα, n = 140? Ραβδομυοσάρκωμα, n = 63), και κυτταρικές σειρές νευροβλαστώματος (n = 13) χρησιμοποιώντας ένα δημοσιευμένο πρωτόκολλο [23]. συγκέντρωση του DNA προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE), και στη συνέχεια ρυθμίζονται στην ίδια συγκέντρωση, 10 ng /μL, για τις 12 δοκιμασίες. Συμφωνήθηκε έλεγχο γονιδιακό DNA ήταν διαθέσιμο από το περιφερικό αίμα για 43 καρκίνους.

δείγματα ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη.

Η πολωνική μαστού, των ωοθηκών, του ενδομητρίου και Μελέτης του Καρκίνου είναι μέρος μιας συλλογικής μελέτης μεταξύ των ΗΠΑ εθνικό Ίδρυμα καρκίνου (NCI), το Μ Sklodowska Ινστιτούτο Ογκολογίας και Αντικαρκινικού Κέντρου στη Βαρσοβία, και το Ινστιτούτο Ιατρικής της Εργασίας (IOM) στο Λοτζ [21] σχεδιάστηκε για να μελετήσει τους παράγοντες κινδύνου για καρκίνο του μαστού, του ενδομητρίου και τον καρκίνο των ωοθηκών [24], [25], [26]. Παραφίνη μπλοκ του καρκινικού ιστού από τους συμμετέχοντες αυτής της μελέτης που υποβλήθηκε σε χειρουργική επέμβαση συλλέχθηκαν. Συνολικά, συμπεριλάβαμε ιστού από 60 συμμετέχοντες με καρκίνο του μαστού, 60 με καρκίνο του ενδομητρίου και 60 με καρκίνο των ωοθηκών.

Ενιαία πυρήνες ιστού 0,6 χιλιοστά στοχεύει σε περιοχές με όγκο που είχαν εντοπιστεί και χαρακτηρίζεται από έναν παθολόγο (MES ) ελήφθησαν από κάθε μπλοκ του όγκου για την εκχύλιση του DNA, χρησιμοποιώντας μια βελόνα εκπυρήνωση μικροσυστοιχία ιστού για κάθε δείγμα. Μικροανατομίας διεξήχθη για ένα μικρό ποσοστό των δειγμάτων, γεγονός που καθιστά δύσκολο να εκτιμηθεί με ακρίβεια το ποσοστό του υλικού του όγκου. εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων εκτελέστηκε με το κιτ Agencourt® FormaPure ™ (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να αποφύγετε παρεμβολές με την PCR θα αφαιρεθεί RNA από καθαρισμένο συνολικό νουκλεϊκών οξέων κατά τη διάρκεια της μεθόδου εκχύλισης. Μετά από εκχύλιση και καθαρισμό, συγκέντρωση DNA και η καθαρότητα προσδιορίστηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE). Ολικό γενωμικό DNA εκχυλίζεται με τη μέθοδο αυτή απέδωσε ένα μέσο όρο από 2,07 μg (εύρος 0,03 να 7,69 μg). Η καθαρότητα του DNA για κάθε μέθοδο εκχύλισης αξιολογήθηκε με τη μέτρηση της έντασης της απορρόφησης του διαλύματος DNA σε μήκη κύματος 260 nm (Α260) και 280 nm (Α280).

Επιλογή εξόνια για τη διαλογή

Το σύνολο των εξώνια που έχουν επιλεγεί για αυτή την ανάλυση σάρωσης μετάλλαξη αντλήθηκαν από τα γονίδια του καρκίνου συχνά μεταλλαγμένο (

PIK3CA

,

ΕΚΒΒ2

,

KRAS

,

TP53

,

EGFR

,

BRAF

,

GATA3

, και

FGFR3

) σε δημοσιευμένες εκθέσεις, με ιδιαίτερη έμφαση στην μαστού, των ωοθηκών και του ενδομητρίου καρκίνων [ ,,,0],5], [9], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. Επίσης, η ανάλυση HRM για αυτές τις συγκεκριμένες περιοχές του γονιδιώματος είχαν ήδη βελτιστοποιηθεί.

Εκκινητές και προ-HRM PCR

εκκινητές της εξόνια, καθώς και το μέγεθος των αμπλικονίων, που χρησιμοποιείται για την προ -HRM PCR παρατίθενται στον πίνακα 1. κατά μέσον όρο, το 40 bp του εγγύς – ή 5′- ιντρονική περιοχή που πλευρίζει την εξώνιο στόχος και 41 bp του εσωνίου περιοχής 3 ‘που πλευρίζουν το εξόνιο στόχος καλύφθηκαν από το αμπλικόνιο. Η μόνη εξαίρεση ήταν το εξόνιο 6 του

GATA3

, η οποία μετρά 1462 bp, εκ των οποίων 284 bp αντιστοιχούν στους κωδικούς νουκλεοτίδια. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, η αμπλικόνιο δεν εκτείνονται πάνω πλευρά του 3 ‘του ιντρονίου (Πίνακας 1 για λεπτομέρειες)

Η

Η προσοχή στη λεπτομέρεια σε προ-HRM συνθήκες PCR είναι υψίστης σημασίας για τη βελτιστοποίηση:. 1) σχεδιασμός των εκκινητών PCR για να κρατήσει το περιεχόμενο GC υπό ή όσο πιο κοντά το 60%, όπως είναι δυνατόν, το μέγεθος του προϊόντος περίπου 200 bp και αποφυγή γνωστών παραλλαγών εντός της περιοχής εκκινητή? 2) επιλογή της βέλτιστης θερμοκρασίας ανόπτησης με βαθμίδα PCR? 3) και το σχεδιασμό των πειραμάτων PCR με συνεπή τρόπο:. Ίδια δοκιμασία, με ίδια παρτίδα δείγματος και ίδια μηχανή κίνηση

με βάση την PCR αναλύσεις για τα διάφορα γονίδια εκτελέσθηκαν σε μορφή 96 φρεατίων με 10 όγκους μL και περιλάμβανε 10 ng γενωμικού DNA για τα κατεψυγμένα δείγματα, και 1 μl διαλύματος που περιέχει γενωμικό DNA για δείγματα ιστών εγκλεισμένων σε παραφίνη, με μέση συγκέντρωση 25,8 ng /μL (SD = 21.7), και κυμαίνονται από 2 έως πάνω από 55 ng /μL ( πρώτο τεταρτημόριο 8.4 ng /μL, και το τρίτο τεταρτημόριο 36,3 ng /μL). Master Mix που περιλάμβανε όλα τα τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών, Taq πολυμεράση, και το LCGreen® PLUS (Idaho Technology, Salt Lake City, UT) χρησιμοποιήθηκε για την προ-HRM PCR. PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν MJ Research PTC 225 Thermal Cycler (MJ Research, Inc. GMI, Ramsey, ΜΝ) με αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 2 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους θερμοκρασίας 2 στάδιο του κύκλου των 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και 66 έως 70 ° C για 30 δευτερόλεπτα (

PIK3CA

,

ΕΚΒΒ2

,

KRAS

στους 66 ° C?

TP53

,

EGFR

,

BRAF

στους 68 ° C?

GATA3

,

FGFR3

στους 70 ° C). Μετά την PCR, τα δείγματα θερμάνθηκαν στους 93 ° C για 30 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια ψύχεται στους 25 ° C πριν HRM.

χειρισμό

κατεψυγμένο δείγμα. αναλύσεις HRM διεξήχθησαν εις διπλούν σε όλα τα δείγματα αποδίδοντας είτε Frank (n = 59) ή ελάχιστη παραλλαγές (n = 99) στην κανονικοποιημένη καμπύλη HRM, και επίσης σε 20% επιλέγονται τυχαία αρνητικών δειγμάτων (n = 45). Ένας δεύτερος γύρος HRM διεξήχθη για να εκτιμηθεί η αναπαραγωγιμότητα της μεθόδου, χρησιμοποιώντας γνωστές αρνητικούς μάρτυρες και θετικοί έλεγχοι. Frank παραλλαγές ορίστηκαν ως οι καμπύλες HRM ερμηνεύεται από το λογισμικό να είναι καχύποπτοι φιλοξενούν μια αλλαγή νουκλεοτιδίου ή μια μετάλλαξη /παραλλαγή, και εκπροσωπήθηκαν στο κόκκινο στα γραφικά (Σχήμα S1). Minimal διακύμανσης για δείγμα θεωρήθηκε όταν το λογισμικό ανιχνεύεται ανήλικος διακύμανση στην καμπύλη HRM με σχέση προς τη μέση καμπύλη άγριου τύπου, χωρίς να χρησιμοποιεί αυτό μία μετάλλαξη (3% όλων των κλήσεων) (Σχήμα S1). Τα δείγματα αυτά αντιπροσωπεύονται είτε σε γκρι ή πράσινο, ανάλογα με το βαθμό του διαχωρισμού με το μέσο όρο της καμπύλης άγριου τύπου. Όλα τα δείγματα με ειλικρινή ή ελάχιστη μεταβολή της καμπύλης υποβλήθηκε σε μια επαναλαμβανόμενη ανάλυση HRM, και ήταν επίσης η αλληλουχία τους.

παραφίνη-ενσωματωμένες. Αναλύσαμε 60 δείγματα καρκίνου του μαστού, του ενδομητρίου 60 δείγματα καρκίνου και 60 δειγμάτων καρκίνου των ωοθηκών. Η ποιότητα του εκχυλίζεται DNA μετρήθηκε με την παρουσία του προ-HRM προϊόν PCR στην ανάλυση HRM και με την παρουσία ενός μόνο ζώνη σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1,5% [33]. Σε αυτό το σύνολο, όλα τα δείγματα ήταν αμφίδρομα προς την αλληλουχία.

Ανάλυση Καμπύλης HRM

Τα δείγματα ενισχύθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων, και την απόκτηση καμπυλών HRM πραγματοποιήθηκε σε πρωτότυπη έκδοση του οργάνου HRM , LightScanner ™, χρησιμοποιώντας LCGreen® Plus + Dye (Idaho Technology, Salt Lake City, UT). Ανάλογα με τον συνδυασμό δοκιμασίας επί της πλάκας, το εύρος HRM ορίστηκε για να φιλοξενήσει κάθε δοκιμασία ατομικό προφίλ με τουλάχιστον 4 ° C πριν από την πρώτη μετάβαση τήξης στην πλάκα, με κλίση 0,3 ° C /s, και τουλάχιστον 3 βαθμούς μετά το τελευταίο κομμάτι έχει λιώσει εντελώς.

Από HRM διεξήχθη σε αυτή τη μελέτη ως την τεχνολογία ελέγχου, οι καμπύλες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό προσαρμοσμένο LightScanner ™ (Idaho Technology, Salt Lake City, UT). Κανονικοποίηση και αφαίρεση φόντο πραγματοποιήθηκαν για πρώτη φορά από την τοποθέτηση μια εκθετική στο παρασκήνιο γύρω από τις μεταβάσεις HRM ενδιαφέροντος. Οι κανονικοποιημένες καμπύλες HRM ήταν θερμοκρασίας-επικαλύπτονται, για την εξάλειψη ελαφρά σφάλματα θερμοκρασίας μεταξύ φρεατίων ή τρέχει. Διαφορά οικόπεδα αυτών των κανονικοποιημένων και θερμοκρασίας-επικαλύπτονται καμπύλες ελήφθησαν από τη διαφορά φθορισμού κάθε καμπύλη από τη μέση καμπύλη άγριου τύπου σε όλα τα σημεία θερμοκρασία [13], [14]. καμπύλες HRM με οικόπεδο ερμηνεύεται από το λογισμικό να είναι διαφορετικό από το μέσο όρο της καμπύλης άγριου τύπου θεωρήθηκαν ύποπτες της φιλοξενούν μια αλλαγή νουκλεοτιδίου ή μια μετάλλαξη /παραλλαγή (Σχήμα S1). Αυτές οι αναλυτικές μέθοδοι έχουν εφαρμοστεί στο παρελθόν για τη σάρωση μετάλλαξη [34], [35].

Bi-directional Ανάλυση Ακολουθία

ανάλυση Bi-directional ακολουθία πραγματοποιήθηκε με εκκινητές που σχεδιάστηκαν με την επέκταση κάθε ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιείται στην προ-HRM PCR με μια καθολική αστάρι αλληλουχίας: Μ13 προς τα εμπρός (TGTAAAACGACGGCCAGT) ή Μ13 αντίστροφη (CAGGAAACAGCTATGACC). Οι συνθήκες PCR για ανάλυση αλληλούχισης διεξήχθησαν σε μορφή 96 φρεατίων με 10 όγκους μL και περιλαμβάνονται 1 μL του ενισχυμένου DNA από την αντίδραση προ-HRM PCR. Γονιδιωματικό DNA χρησιμοποιήθηκε μόνο όταν η αντίδραση αλληλουχία απέτυχε με ενισχυμένο DNA. Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο ΑΒΙ Prism® BigDye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ασυγχώνευτος βαφές τερματιστές και τα άλατα απομακρύνθηκαν χρησιμοποιώντας μια στήλη Sephadex G-50 (Sigma, St Louis, ΜΟ) στήλες σπιν σε ένα MultiScreen®-HV πλάκα φίλτρου 96 φρεατίων (Millipore, Billerica, ΜΑ). Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σε ένα ΑΒΙ 3730XL (Applied Biosystems, Foster City, CA). ίχνη ακολουθία αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας δύο πακέτα λογισμικού (v2.5 SeqScape ™ και v1.0 Variant Reporter ™, τόσο από την Applied Biosystems, Foster City, CA) και εξετάστηκε από δύο ανεξάρτητους κριτές [9]. Όταν το λογισμικό δεν ήταν σε θέση να ευθυγραμμίσει και να συγκεντρώνει τις προς τα εμπρός και η αντίστροφη αλληλουχίες το δείγμα θεωρείται ότι έχει αποτύχει η διαδικασία προσδιορισμού αλληλουχίας για τους σκοπούς της παρούσας μελέτης. Για τις δοκιμασίες εμπεδωθεί με παραφίνη που δεν πραγματοποιήθηκαν, καθώς και τα κατεψυγμένα τους ομολόγους τους (εξώνια συγκεκριμένα από γονίδια

TP53

και

GATA3

), οι συνθήκες της PCR καθώς και αστάρια τους είχαν τροποποιηθεί για τη βελτίωση της αλληλουχίας . Αυτό περιελάμβανε τη δημιουργία εκκινητών που εκτείνεται σε περισσότερες από τις περιοχές του γονιδιώματος ή σύρετε 20-30 bp προς τα πάνω ή κάτω από το ρεύμα. Αλλά εμείς σημειωθεί ότι οι νέες, ειδικές αναλύσεις απέτυχαν να βελτιστοποιήσετε ενώ δοκιμάζοντας διαφορετικές περιοχές θα αλλάξει το σκοπό της μελέτης. Εν ολίγοις, το ποσοστό σφάλματος αλληλουχίας ήταν 2,5% για τα κατεψυγμένα δείγματα και 20,0% για τις ενσωματωμένες σε παραφίνη.

αλλαγές νουκλεοτιδίων ανιχνεύονται με προσδιορισμό της αλληλουχίας ταξινομήθηκαν ως νέες αλλοιώσεις ή είναι γνωστό SNPs (ή ενός νουκλεοτιδίου πολυμορφισμοί), αν βρεθεί σε dbSNP, Κατασκευάστηκε 130, από το NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/), χρησιμοποιώντας Genewindow (genewindow.nci.nih.gov) [36].

Στατιστική Ανάλυση

Η συσχέτιση μεταξύ της ποσότητας του DNA που εξάγεται από το εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστού (επίπεδα: ≤10 ng /μL, 11-20 ng /μL, 21-30 ng /μL, και & gt? 30 ng /μL) και ένα επιτυχημένο PCR δοκιμασία προ-HRM, μετρούμενη είτε από την παρουσία ενός και μόνο αμπλικονίου σε πηκτή αγαρόζης ή με την παρουσία ενός προϊόντος DNA στην ανάλυση HRM, διεξήχθη με ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης. Συμφωνία μεταξύ 2 μεταβλητών (ή την αξιοπιστία) προσδιορίστηκε με δοκιμή Kappa. Kappa τιμές λιγότερο από 0.40 δείχνουν χαμηλή συσχέτιση, μεταξύ 0.40 και 0.75 δείχνουν μέσο σύνδεσης, και τιμές μεγαλύτερες από 0.75 δείχνουν υψηλή συσχέτιση μεταξύ των δύο μέτρων. Screening δυνατότητες της Διαχείρισης Ανθρώπινου Δυναμικού και της συνέπειας της ανάλυσης ήταν μέτρου, χρησιμοποιώντας την κλασική μετρήσεις, όπως η ευαισθησία, η ειδικότητα, ψευδώς αρνητικά και θετικά ποσοστά, λαμβάνοντας υπόψη την ανάλυση αλληλουχίας ως το πρότυπο μέτρησης για τόσο κατεψυγμένα και ενσωματωμένες σε παραφίνη εξάγεται δείγματα.

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Microsoft® Excel (Redmond, WA) και R στατιστικό πακέτο (www.r-project.org/).

Αποτελέσματα

τα κατεψυγμένα δείγματα

διαλογής μετάλλαξη έγινε στις 12 αμπλικόνια για κάθε ένα από 216 κατεψυγμένα δείγματα κατά την αρχική ανάλυση HRM (2.592 διαφορετικούς προσδιορισμούς). Παρατηρήσαμε 59 HRM θετικά δείγματα, 2510 HRM αρνητική, και μόνο 23 από αυτές τις μετρήσεις δεν ήταν αξιολογήσιμα (λιγότερο από 1%). Για τα πειράματα HRM επανάληψη, 47 ήταν θετικά, 156 αρνητικές, και μόνο 1 από 204 δεν είναι αξιολογήσιμα. Συνολικά, 2.772 από 2.796 (2.592 στον πρώτο γύρο HRM, και 204 στο δεύτερο γύρο HRM), ή 99,1%, τα πειράματα αξιολογήθηκαν για τον έλεγχο των μεταλλάξεων /παραλλαγές με ανάλυση HRM.

Στο αρχικό γύρο της ανάλυσης, 4 δοκιμασίες είχαν ανιχνευθεί καμία μετάλλαξη:

ERBB2

εξόνιο 25, η περιφερική περιοχή του

ΤΡ53

εξόνιο 5,

GATA3

εξόνιο 5, και η εγγύς περιοχή του

GATA3

εξόνιο 6. Για τις υπόλοιπες δοκιμαστεί εξώνια, μεταξύ ανιχνεύθηκαν 1-9 υποτιθέμενη νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις? ιδίως το εξώνιο 13 του

FGFR3

είχε τον υψηλότερο αριθμό 30. Τα αποτελέσματα της εξέτασης μετάλλαξης με τεχνολογία HRM και στα δύο πειράματα, οι αρχικές και επαναλάβετε, καθώς και η επικύρωση με καθορισμό αλληλουχίας για τα κατεψυγμένα δείγματα εμφανίζονται στον πίνακα 2.

η

πειράματα HRM επαναλήφθηκαν σε όλα τα δείγματα με ενδείξεις πιθανής μεταλλάξεως επί της καμπύλης HRM, και επίσης σε ένα υποσύνολο των αρνητικών δειγμάτων. Η συμφωνία μεταξύ της αρχικής και της επανάληψης της οθόνης των πειραμάτων HRM ήταν 91%, με τιμή κάππα δοκιμή των 0,77, ή υψηλής συμφωνία μεταξύ των δύο. Σε γενικές γραμμές, οι καμπύλες HRM παρουσιάζονται παρόμοια σχήματα σε δύο ανεξάρτητες αναλύσεις (Εικόνα S2). Η πλειοψηφία των διαφωνιών διαμείνει σε δείγματα που ονομάζεται ανώμαλη στην αρχική οθόνη και κανονική, ή χωρίς μετάλλαξη, στο πείραμα επανάληψης HRM (n = 12), οι οποίες επιβεβαιώθηκαν κανονική με αλληλούχιση. Μόνο 1 επαναλαμβανόμενες αναλύσεις HRM απέτυχε να ανιχνεύσει μια υποκατάσταση νουκλεοτιδίου σε ένα δείγμα σε σχέση με την αρχική οθόνη. Αργότερα αλληλουχίας του δείγματος ανιχνεύεται υποκατάσταση των αλληλόμορφα GG αναφοράς, στη θέση 7518234 του χρωμοσώματος 17 (εξόνιο 7 του γονιδίου

TP53

), από ΑΑ.

Η ευαισθησία και η ειδικότητα για μετάλλαξη /παραλλαγή ελέγχου ήταν 97% και 87% αντίστοιχα, σε σύγκριση με αμφίδρομη αλληλουχίας, με ένα ψευδώς αρνητικό ποσοστό του 3%. Η συνολική ακρίβεια της δοκιμασίας ήταν 89% (Πίνακας 3). Όταν το δεύτερο, επαναλαμβανόμενες αναλύσεις HRM συγκρίθηκε με τα αποτελέσματα αλληλούχισης, εξειδίκευση αυξήθηκε σε 94%, καθώς και η ακρίβεια, 94% (κάππα 0,82)? αλλά το ψευδώς αρνητικό ποσοστό αυξήθηκε επίσης στο 5%. Οι λεπτομέρειες των αποτελεσμάτων αλληλουχίας για μεταλλάξεις που περιγράφονται στον Πίνακα 4. Ένα ψευδώς αρνητικό ανιχνεύθηκε κατά τη σύγκριση των πειραμάτων HRM με αλληλούχιση, παραλείποντας να ανιχνεύσει μια αλλαγή νουκλεοτιδίου, από ΑΑ έως AG, τόσο στις αρχικές και επαναλάβετε οθόνες. Αυτή η παραλλαγή κατέληξε να είναι ένα γνωστό SNP στο εξόνιο 13 του

FGFR3

, rs7688609 (Πίνακας 4). Αξίζει να σημειωθεί ότι, πλήρης δημόσιες βάσεις δεδομένων (dbSNP και Ensembl) έδειξε G ως προγονική, αλληλόμορφο αναφορά στην αλληλουχία DNA για αυτού του τόπου, αλλά η πλειοψηφία των αλληλουχία δειγμάτων στη μελέτη μας, 63 από 67 (ή 94%), ήταν ομοζυγώτες για AA , και μόνο το 6% ήταν ετερόζυγο για το G (GA). Δεδομένης αυτής ανισότητα στις συχνότητες αλληλίου με διαθέσιμα δημόσια δεδομένα, αποφασίσαμε να ακολουθία και τα 3 πληθυσμούς HapMap καθώς και τον πληθυσμό SNP500 για το συγκεκριμένο αμπλικόνιο (n = 366) [37], [38]. Συνολικά, αλληλόμορφο Α συχνότητα ήταν 94%, και η συχνότητα αλληλόμορφο G ήταν 6%. Γιορούμπα πληθυσμού παρουσίασε την υψηλότερη συχνότητα G με 17%. Την ίδια στιγμή, η αλληλουχία αυτή την περιοχή για 43 διαθέσιμες βλαστικής γραμμής DNA από τους ασθενείς που πάσχουν από αυτούς τους παιδιατρικούς όγκους? όλοι τους ήταν ομοζυγώτες για ΑΑ. Μετά την αλληλούχιση όλα τα δείγματα παραφίνη-ενσωματωμένες, βρήκαμε παρόμοιες συχνότητες αλληλόμορφο.

Η

παραφίνη δείγματα ενσωματωμένο

Ο λόγος /A280 A260, ένα μέτρο της καθαρότητας της παραφίνης -embedded εκχυλίζεται DNA, είχαν μέση του 1.92 (SD = 0,45) για όλα τα δείγματα καρκίνου του μαστού, μια μέση τιμή των 1,82 (SD = 0.12) για ενδομητρίου δείγματα καρκίνου, και μία μέση τιμή 2,0 (SD = 0.27) για τα δείγματα καρκίνου των ωοθηκών. Υπήρξε άμεση συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης του DNA (σε ng /μL) που εξάγεται από τα εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα, η ποσότητα του DNA που χρησιμοποιείται για την προ-HRM PCR, και η παρουσία ενός μονή ζώνη στην πηκτή αγαρόζης (ρ & lt? 0.001 ). Επίσης, υπήρχε μία συσχέτιση μεταξύ εκχυλίζεται συγκέντρωση DNA και την παρουσία ενός κατάλληλου καμπύλη HRM για ανάλυση (ρ & lt? 0.001). HRM ήταν επιτυχής 96% του χρόνου, όταν η ποσότητα των εγκλεισμένων σε παραφίνη εκχυλίστηκε DNA που χρησιμοποιείται για την τεχνική αυτή ήταν περισσότερο από 30 ng σε σύγκριση με το 92% όταν η ποσότητα ήταν ≤30 ng (Πίνακας 5).

Η

Συνολικά, το 93% (2.008 από 2.153) των μετρήσεων της εμπεδωθεί με παραφίνη δείγματα από την ανάλυση HRM αξιολογήθηκαν. Αυτή η τεχνική ήταν πιο επιτυχής όταν καταψύχονται δείγματα DNA αναλύθηκαν ό, τι όταν DNA από δείγματα παραφίνη-ενσωματωμένες χρησιμοποιήθηκε, 99,1% έναντι 93,3% (p & lt? 0.001).

Τα αποτελέσματα του ελέγχου μετάλλαξης από την τεχνολογία Διαχείρισης Ανθρώπινου Δυναμικού και επικύρωση του με αμφίδρομη ανάλυση αλληλουχίας για τις ενσωματωμένες σε παραφίνη δείγματα παρουσιάζονται στον πίνακα 6. Επίσης, μια αναπαράσταση αυτών των αποτελεσμάτων απεικονίζεται στην Εικόνα S3. Η συνολική ευαισθησία και ειδικότητα για τα δείγματα ύποπτα για μετάλλαξη στην ανάλυση HRM ήταν 88% και 80% αντίστοιχα σε σύγκριση με αλληλούχιση, με ψευδώς αρνητικό ποσοστό 12% (Πίνακας 7). Ωστόσο, ένα σχετικά μικρό ποσοστό του DNA από δείγματα εμπεδωθεί με παραφίνη ήταν δύσκολο να ακολουθία. Όπως αναφέραμε, η αντίδραση αλληλουχία αναλήφθηκε χρησιμοποιώντας ενισχυμένο DNA από την προ-HRM PCR. Όταν αλληλούχιση μιας συγκεκριμένης δοκιμασίας απέτυχε, γονιδιωματικό DNA χρησιμοποιήθηκε και αλληλούχιση επαναλήφθηκε. Με αυτή τη στρατηγική, επιβεβαιωτική αλληλουχία σε κατεψυγμένα δείγματα θα μπορούσαν να εκτελεστούν πάνω από 97% του χρόνου. Αυτή δεν ήταν η περίπτωση με το DNA που εξάγεται από εμπεδωμένα σε παραφίνη ιστό, όπου αλληλούχιση επιτεύχθηκε το 80% του χρόνου, χρησιμοποιώντας την ίδια στρατηγική. Ειδικότερα, το ποσοστό επιτυχίας της αλληλουχίας του DNA από εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστός ήταν μικρότερη από 50% για τα εξώνια από γονίδια

ΤΡ53

(περιφερική περιοχή του εξονίου 5, και το εξόνιο 7) και

GATA3

( εγγύς περιοχή του εξονίου 6), που επηρεάζουν την σύγκριση μεταξύ ανάλυση αλληλουχίας και καμπύλες HRM. Αλληλούχιση αυτών των αμπλικονίων απέτυχε σε 341 από 397 αντιδράσεις, οι οποίες αντιπροσώπευαν το 86% του συνόλου των απέτυχε αλληλουχίας. Όταν αυτά απέτυχαν δοκιμασίες αποκλείστηκαν από τη σύγκριση μεταξύ των καμπυλών HRM και αλληλούχιση, η ευαισθησία αυξήθηκε σε 92%, με ακρίβεια 80%. Τα στοιχεία προσδιορισμού αλληλουχίας εγκλεισμένα σε παραφίνη που περιγράφονται στον Πίνακα S1. Όλα τα νέα νουκλεοτίδια αλλαγές που βρέθηκαν στα δείγματα της μελέτης υποβλήθηκαν σε dbSNP (build 131) και παρουσιάζονται στον Πίνακα S2.

Η

Συζήτηση

ανάλυση HRM χρησιμοποιώντας το LightScanner ™ αντιπροσωπεύει μια δοκιμασία διαλογής μέτρια απόδοσης για μεταλλάξεις μεταξύ των υποψήφιων περιοχές του γονιδιώματος. Η σύγκριση με την ανάλυση αμφίδρομη αλληλουχίας παρέχει ισχυρά αποδεικτικά στοιχεία για την ακρίβειά του, παρά το ρυθμό μετάλλαξης /παραλλαγή χαμηλό επιπολασμό, ιδιαίτερα από επιλεγμένα εξώνια έτρεφε καμία μεταλλάξεις. Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με προηγούμενες αναφορές [28], [39]. Ο παρατηρούμενος ρυθμός ήταν 39 για 2569 (ή 1,5%) μετάλλαξης /παραλλαγής για όλες αναλύθηκαν εξώνια εντός των 216 κατεψυγμένων παιδιατρικούς μικρό στρογγυλεμένο όγκους μπλε-κυττάρων, και 67 για 1586 (ή 4,2%) μετάλλαξης /παραλλαγής για όλες αναλύθηκαν εξονίων στο 180 γυναικολογικές συμπαγείς όγκους (πίνακες 4 και S1, αντίστοιχα).

ευαισθησία και ειδικότητα της ανάλυσης HRM ήταν υψηλότερη σε κατεψυγμένα δείγματα σε σύγκριση με τα δείγματα εγκλεισμένοι σε παραφίνη, με μια παρατηρούμενη ευαισθησία 97% για το DNA που εξάγεται από κατεψυγμένα δείγματα ενώ είναι 88% για το DNA που εξάγεται από εμπεδωμένα σε παραφίνη ιστού. Χαμηλότερες επιδόσεις ορισμένων δοκιμασιών κατά τη σύγκριση του DNA από παραφίνη-ενσωματωμένες δείγματα σε σχέση με τα κατεψυγμένα δείγματα έχει επίσης περιγραφεί σε προηγούμενες μελέτες για

KRAS

και

EGFR

[12]. Οι διαφορές αυτές οφείλονται, τουλάχιστον σε κάποιο βαθμό, τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA μεταβολές στην σχετίζονται με εγκάρσια σύνδεση μεταξύ των πρωτεϊνών και του DNA, και αντιστρόφως ανάλογη με τον αριθμό των κυττάρων εντός των δειγμάτων [40], [41], [42]. Επίσης, η παρουσία πολλαπλών μεταλλάξεων και διαγραφές μπορεί να μεταβάλλει την αποτελεσματικότητα της δοκιμασίας, πιθανώς ο λόγος για τη χαμηλή απόδοση σε

ΤΡ53

δοκιμασίες [16], [43]. Η πλειοψηφία των μελετών HRM πραγματοποιήθηκαν μέχρι σήμερα έχουν καταλήξει στο συμπέρασμα ότι, με ορισμένους περιορισμούς, αυτή είναι μια σχετικά απλή, ταχεία και ανέξοδη τεχνική για την ανίχνευση γενωμικού μεταβολή σε δείγματα ιστών εγκλεισμένων σε παραφίνη [43]? με συνεχείς αναφορές σε μερικά από τα γονίδια που εξετάζονται στην παρούσα μελέτη [11], [16], [40], [44]. Οι περιορισμοί της που σχετίζονται με την χαμηλότερη απόδοση σε περιοχές με διαγραφές (ή προσθήκες), για την ανίχνευση ομόζυγη παραλλαγές (σε σύγκριση με heterozigous), σε συγκεκριμένες αναλύσεις, καθώς και η έλλειψη συμφωνίας σχετικά με το βέλτιστο μήκος του προϊόντος ή της τήξης τομείς PCR ανά προϊόν ενίσχυσης [ ,,,0],12], [13], [16].

για να εξαλειφθούν οι λεπτές διαφορές στα συστατικά του αντιδραστηρίου μεταξύ των τελικών ρυθμιστικά διαλύματα έκλουσης από πολλαπλές πλατφόρμες εξόρυξης και να ελαχιστοποιηθεί η διακύμανση μέσα σε δείγματα προσέγγισή μας ήταν να εκτελέσει το DNA εκχύλιση χρησιμοποιώντας ένα κοινό εξόρυξη πλατφόρμα, τις συνθήκες και το πρωτόκολλο. Με βελτιστοποιημένες χειρισμού του δείγματος και τυποποιημένες εκχύλιση του DNA, είναι δυνατό για τη διαλογή δειγμάτων εγκλεισμένους σε παραφίνη με υψηλότερη ευαισθησία [40], [41]. Παρά την αυξημένη κατάτμηση του DNA που εξάγεται από εμπεδωμένα σε παραφίνη ιστός, είναι δυνατόν να διαλογή αξιόπιστα μικρότερη προϊόντων ενίσχυσης έως 250 bp σε μήκος. Επιπλέον, η έκταση της κατάτμησης του DNA συσχετίζεται με τύπο ιστού [12], [45], [46]. Η επιτυχία και στις δύο, καμπύλη HRM και αλληλούχιση αναλύσεις, είναι πάνω από 97% όταν 10 ng του DNA χρησιμοποιείται από κατεψυγμένα δείγματα. Αλλά τα αποτελέσματα αυτά δεν θα μπορούσε να επιτευχθεί με την ίδια ποσότητα εγκλεισμένων σε παραφίνη εκχυλίστηκε DNA (επιτυχής ανάλυση HRM σε 84%). Με την αύξηση της ποσότητας του καθαρισμένου DNA προστίθεται στην προ-HRM PCR ≤30 ng επιδόσεις βελτιώθηκαν, ξεπερνώντας εν μέρει την πρόκληση που θέτει η υπο-βέλτιστη δίκλωνο DNA. Βελτιστοποίηση της προ-HRM PCR μπορεί επίσης να μετριάσει μειωμένη ευαισθησία, ιδιαίτερα κατά τη χρήση ειδικής χημείας βαφής [46].

DNA από ιστούς παραφίνης ήταν επίσης πιο δύσκολο να αλληλουχία από το DNA από κατεψυγμένα ιστό [47], [48]. Ωστόσο, ο σκοπός της μελέτης αυτής ήταν να μη δημιουργήσει μια βελτιστοποιημένη πρωτόκολλο για την ανάλυση αλληλουχίας του DNA που εξάγεται από εμπεδωμένα σε παραφίνη ιστό, αλλά να αξιολογήσουν τις ικανότητες διαλογής της ανάλυσης HRM. Μόλις βέλτιστες πειραματικές συνθήκες για HRM και αλληλούχιση αναλύσεις σχετικά με τα κατεψυγμένα δείγματα προσδιορίστηκαν, μπορούμε να εφαρμόζεται στο σύνολο παραφίνη-ενσωματωμένες, για να επιτευχθεί μια δίκαιη σύγκριση μεταξύ των δύο συνόλων των δειγμάτων. τροποποιήσεις Πρωτόκολλο πειραμάτων προσδιορισμού αλληλουχίας θα μπορούσαν να βελτιώσουν την απόδοση συγκρατημένα, όπως η χρήση του πολλαπλασιασμού ολόκληρο το γονιδίωμα [49], [50], αλλά αυτή μπορεί να εισαγάγει απώλεια της ετεροζυγωτίας. Βήματα για τη βελτιστοποίηση της αλληλουχίας μπορεί επίσης να περιλαμβάνει εναλλακτικά εναύσματα ή συνθήκες μετουσίωσης.

Με βάση αυτές τις σκέψεις, τις προτάσεις μας για τη διατήρηση και, ίσως, να ενισχύσει τις δυνατότητες ανάλυσης διαλογής HRM για εξάγεται παραφίνη δείγματα ενσωματωμένο με ένα LightScanner ™ θα περιλαμβάνουν τα ακόλουθα:.

ένταξη των ≥30 ng συνολικού γονιδιακού DNA μπορεί να αυξήσει το ποσοστό επιτυχίας ανάλυση HRM έως 96%

βελτιστοποίησης Pre-HRM PCR θα πρέπει να περιλαμβάνουν την προσεκτική επιλογή έναυσμα για να μειωθεί το περιεχόμενο GC, επαρκές μέγεθος αμπλικονίου, και βέλτιστη θερμοκρασία ανόπτησης.

αμπλικόνια που απέτυχε αλληλουχίας πάνω από το 50% των περιπτώσεων, επίσης, απέδωσε κακώς κατά την ανάλυση HRM. Έτσι, μπορεί να αξίζει τον κόπο να δοκιμάσετε τα επιλεγμένα αμπλικόνια με αλληλούχιση μερικά δείγματα κατά την έναρξη του πειράματος.

Η

Το ποσοστό ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων της ανάλυσης HRM σε τομές παραφίνης δείγματα ήταν περίπου 20%, πράγμα που σημαίνει ότι επιπλέον αλληλούχιση χρειάζεται για να βελτιωθεί η ακρίβεια στην υποομάδα των δειγμάτων με μια υποθετική μετάλλαξη [12]. ανάλυση HRM για τα κατεψυγμένα δείγματα λαμβάνονται υπόψη μόνο 59 από αυτούς ανώμαλη, για 39 με την πραγματική μετάλλαξη /παραλλαγές. Έτσι, θα ήταν απαραίτητο να αλληλουχηθεί λιγότερα δείγματα για κάθε μετάλλαξη. Ως εκ τούτου, δεν είναι μόνο η απόδοση είναι καλύτερη σε κατεψυγμένα δείγματα σε σχέση με παραφίνη ενσωματωμένο δείγματα, αλλά και του κόστους-αποδοτικότητας.

Εν κατακλείδι, η ανάλυση HRM με την LightScanner ™ είναι ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο ελέγχου για μετάλλαξη /παραλλαγή σωματικών DNA που εξάγεται από είτε κατεψυγμένα ή παραφίνη-ενσωματωμένες δείγματα, αν και συνολικά η ακρίβεια είναι καλύτερη σε κατεψυγμένα δείγματα, πιθανώς σχετίζονται με την ποιότητα του DNA. Αυτή η μέθοδος είναι σε θέση να ανιχνεύσει μεταλλάξεις, καθώς όπως είναι γνωστό SNPs, ακόμη και σε περιοχές του γονιδιώματος με χαμηλό ποσοστό επικράτησης μετάλλαξη στην περιοχή του 5% ή ίσως και χαμηλότερα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Αντιπροσωπεία της καμπύλης Διαχείρισης Ανθρώπινου Δυναμικού του

BRAF

εξόνιο 15 από γονιδιακό DNA που εξάγεται από τα κατεψυγμένα δείγματα. Κόκκινο βέλος: καμπύλες HRM με οικόπεδο έχει ερμηνευθεί από το λογισμικό για να είναι καχύποπτοι φιλοξενούν μια αλλαγή νουκλεοτιδίου ή μια μετάλλαξη /παραλλαγή. HRM επαναλήφθηκε για όλους αυτά τα δείγματα, και όλοι τους αλληλουχήθηκαν. Πράσινα βέλη: Καμπύλες HRM με ελάχιστες αποκλίσεις σε σχέση με το μέσο όρο καμπύλη άγριου τύπου. Όλα αυτά τα δείγματα επίσης υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας και HRM επαναλήφθηκε. Μαύρο βέλος: Όλες οι κανονικοποιημένες καμπύλες HRM θεωρείται ότι έχει μία αλληλουχία άγριου τύπου.