Αφηρημένο

FBXW7

δρα ως καταστολέας των όγκων μέσω ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση των πολλαπλών ογκοπρωτεϊνών. Απώλεια της έκφρασης FBXW7, η οποία θα μπορούσε να αποδοθεί εν μέρει από την γονιδιωματική διαγραφή ή μετάλλαξη FBXW7 τόπο, συχνά παρατηρείται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν την έκφραση FBXW7 εξακολουθούν να παραμένουν ελάχιστα κατανοητή. Εδώ εξετάσαμε την περιοχή 5 ‘του

FBXW7

γονίδιο για τη διερεύνηση της ρύθμισης της έκφρασης FBXW7. Έχουμε εντοπίσει επτά μορφές εναλλακτικού ματίσματος (AS) 5′-UTR της FBXW7α που αποτελείται από πολλά νέα, μη-κωδικοποίησης εξώνια. Μία σημαντική διαφορά στην μεταφραστική αποτελεσματικότητα μεταξύ αυτών των 5′-UTRs παραλλαγές παρατηρήθηκε με in vivo δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης και στύπωμα Western. Επιπλέον, βρήκαμε ότι το επίπεδο του mRNA της μορφής AS με υψηλή μεταφραστική αποτελεσματικότητα ήταν ειδικά μειωμένη σε περισσότερο από το 80% των κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού και σε περισσότερο από το 50% των ανθρώπινων πρωτογενών καρκίνων από διάφορους ιστούς. Επιπλέον, προσδιορίσαμε επίσης μεταλλάξεις του FBXW7 σε καρκίνους του προστάτη (5,6%), καρκίνους του νεφρού (16,7%), και καρκίνους της ουροδόχου κύστης (18,8%). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι εκτός από την μετάλλαξη, η διαφορική έκφραση του FBXW7α ως μορφών με διαφορετικές ιδιότητες μεταφραστική μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα νέο μηχανισμό για την απενεργοποίηση του FBXW7 στον ανθρώπινο καρκίνο

Παράθεση:. Liu Υ, Ren S, Castellanos-Martin Α, Perez-Losada J, Kwon YW, Huang Y, et al. (2012) Πολλαπλές Μυθιστόρημα Εναλλακτικές Μορφές Συγκόλληση των FBXW7α έχουν μια λειτουργία Μεταγραφική ρυθμιστική και Εμφάνιση συγκεκριμένη τροποποίηση σε ανθρώπινα καρκινικά. PLoS ONE 7 (11): e49453. doi: 10.1371 /journal.pone.0049453

Επιμέλεια: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19, Αυγ 2012? Αποδεκτές: 9η Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 14, Νοεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. JPL είναι υποστηρίζεται μερικώς από ΕΤΠΑ και MICINN (PLE2009-119), FIS (PI10 /00328) «Fundación Eugenio Rodríguez Pascual», και Fundación Inbiomed (Instituto Oncológico Obra Κοινωνικής de la Caja Guipozcoa-Σαν Σεμπαστιάν, Kutxa). YS υποστηρίζεται από το Εθνικό Πρόγραμμα Βασικής Έρευνας της Κίνας (2012CB518300) και του Υπουργείου Επιστήμης & amp? Τεχνολογία της Σαγκάης (08.410.701.500). JHM υποστηρίζεται από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου επιχορήγηση R01 CA116481, χαμηλή δόση Επιστημονική Περιοχή εστίασης, Γραφείο Βιολογικών & amp? Περιβαλλοντικών Ερευνών, Τμήμα Ενέργειας (DE-AC02-05CH11231) των ΗΠΑ, Εργαστήριο Σκηνοθεσία Έρευνας & amp? Πρόγραμμα Ανάπτυξης (LDRD) πρόγραμμα, και η NASA Εξειδικευμένο Κέντρο για την Έρευνα στην Ακτινοβολία Επιπτώσεις στην υγεία (NNX09AM52G). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το

FBXW7

γονίδιο είναι ένας μεταγραφικός στόχος του p53, των οποίων η έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά σε p53-εξαρτώμενη-τρόπο μετά από θεραπεία με ακτινοβολία [1]. Η

FBXW7

γονίδιο κωδικοποιεί ένα F-box πρωτεΐνη, η οποία είναι απαραίτητη για την ουμπικουιτίνωση διαφορετικών ογκοπρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των c-Myc [2], [3], c-Jun [4], η κυκλίνη Ε [5] , [6], διάφορα μέλη της οικογένειας του Notch [7], [8], Aurora-A [1], [9], mTOR [10], [11], και KLF5 [12], [13]. Η υπερέκφραση πολλών από αυτούς τους στόχους, όπως η κυκλίνη Ε [14], c-Myc [15] και Aurora-Α [16] έχει ενοχοποιηθεί για την πρόκληση γενωμική αστάθεια. Αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι το

FBXW7

είναι ένα ανθρώπινο ογκοκατασταλτικό γονίδιο, ένα συμπέρασμα που υποστηρίζεται επίσης από την ανακάλυψη του

FBXW7

μεταλλάξεις γονιδίων σε καρκίνους από ένα ευρύ φάσμα των ανθρώπινων ιστών, όπως χολικά αγωγός, αίμα, οστά, εγκέφαλο, μαστό, κόλον, το ενδομήτριο, στομάχι, πνεύμονα, των ωοθηκών, του παγκρέατος, και του προστάτη, με συνολική συχνότητα 6% σημειακή μετάλλαξη [17].

η διαγραφή της

Fbxw7

γονίδιο σε ποντίκια οδηγεί σε εμβρυϊκή θνησιμότητα, αλλά ετερόζυγοι ποντικοί αναπτύσσουν κανονικά [18], [19]. Παρόλο που δεν αναπτύσσουν αυθόρμητη όγκοι, έκθεση σε ακτινοβολία δημιουργεί διαφορετικούς τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένου ενός φάσματος επιθηλιακών καρκίνων [1]. Τα ποντίκια που φέρουν αδρανοποιημένο αλληλόμορφα των δύο

Fbxw7

και

p53

δείχνουν επιτάχυνση της ανάπτυξης των όγκων. Haploinsufficient απώλεια του

Fbxw7

παρατηρείται στα περισσότερα λεμφώματα σε αυτό το μοντέλο ποντικού, ακόμη και εκείνες που προκύπτουν από

Fbxw7 /p53

διπλό ετερόζυγα ποντίκια, δηλαδή, απώλεια μόνο ένα αντίγραφο του γονιδίου μπορεί να δημιουργήσει ένα σημαντικές βιολογικές επιπτώσεις [1]. Παρόμοιες παρατηρήσεις του ετερόζυγες μεταλλάξεις βρέθηκαν αργότερα σε ανθρώπινους όγκους [20]. Συνεπώς, είναι πιθανό ότι ο συνολικός αντίκτυπος αυτής της ογκοκατασταλτικό γονίδιο στον καρκίνο του ανθρώπου είναι μεγαλύτερο από το 6% συχνότητα σημειακή μετάλλαξη που αναφέρονται παραπάνω, δεδομένου ότι η απώλεια ενός μόνο γονιδίου αντίγραφο μπορεί να έχει σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη των όγκων. Διαγραφές του χρωμοσώματος 4q31, στην οποία

FBXW7

βρίσκεται, είναι κοινά σε πολλούς τύπους ανθρώπινων καρκίνων [21] – [25], υποδηλώνοντας ότι η διάσπαση αυτού του μονοπατιού μπορεί να είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό πολλών, ή ακόμα και ένα πλειοψηφία, των ανθρώπινων καρκίνων.

η 5 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή (5′-UTR) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της έκφρασης ευκαρυωτικού γονιδίου [26]. Πρόσφατες μελέτες σχετικά με την μεταγραφικό θηλαστικών υποδεικνύουν ότι περισσότερα από τα γονίδια εκφράζουν πολλαπλές εναλλακτικό μάτισμα (AS) 5′-UTRs και UTR ετερογένεια για ένα συγκεκριμένο γονίδιο πιθανόν έχει μια διαφορετική επίδραση επί της έκφρασης πρωτεΐνης [27], [28]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, πολλά ογκογονίδια και τα γονίδια όγκων καταστολέα είναι επίσης ικανά να εκφράζουν ασυνήθιστα συγκρότημα 5′-UTRs [29], [30]. Επιπλέον, καθίσταται σαφές ότι η ακατάλληλη έκφραση του 5’-UTR AS έχει δειχθεί ότι συμβάλλει στην ανάπτυξη του καρκίνου [31], [32].

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε 5 ‘περιοχή του

FBXW7

να κατανοήσει τους ρυθμιστικούς μηχανισμούς της, και προσδιόρισε πολλαπλές νέες μη-κωδικοποίησης εξώνια στο FBXW7α ισομορφή, η οποία παρήγαγε πολλαπλά 5′-UTR ως μορφές. Η λειτουργική επίπτωση αυτών των 5′-UTRs από την αποτελεσματικότητα της μετάφρασης δείχθηκε να ρυθμίσει ακολούθως έκφραση FBXW7α. FBXW7α 5′-UTRs εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των διαφόρων φυσιολογικών και καρκινικών ιστών, οι οποίες πιθανόν ως αποτέλεσμα τη μεταβολή των επιπέδων έκφρασης FBXW7α κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης. Τα ευρήματά μας σε αυτή τη μελέτη δείχνουν ότι διαφορική έκφραση των FBXW7α AS μορφές εξυπηρετεί ένας νέος μηχανισμός αδρανοποίησης

FBXW7

στον ανθρώπινο καρκίνο.

Αποτελέσματα

Πολλαπλές νέες εναλλακτικές μορφές ματίσματος που προσδιορίζονται στο

FBXW7

γονίδιο

Τρεις FBXW7 ισομορφές (α, β και γ) έχουν αναφερθεί μέχρι στιγμής. Διαφέρουν στο πρώτο εξώνιο και μοιραστείτε τα ακόλουθα 2-11 εξώνια. Προκειμένου να εξεταστεί η ρύθμιση του

FBXW7

έκφραση, χαρακτηρίσαμε ‘περιοχή του FBXW7α, β και γ ισομορφή χρησιμοποιώντας το 5’ 5 τεχνική RACE με cDNA από το ανθρώπινο μαστικό επιθηλιακό κύτταρο (HMEC) 184A1. ανάλυση αλληλουχίας των 115 κλώνων RACE αποκάλυψε πέντε νέα, μη κωδικοποιητικά εξώνια εντός

FBXW7α

5′-UTR όταν ευθυγραμμίζεται με την ανθρώπινη γονιδιωματική αλληλουχία, ενώ υπάρχουν επιπλέον εξόνια ανιχνεύθηκαν από

FBXW7β

και

FBXW7γ

με προσδιορισμό της αλληλουχίας 27 και 31 κλώνους RACE αντιστοίχως (Σχήμα 1). Η

FBXW7α

5′-UTR υφίσταται εναλλακτικό μάτισμα (AS) για να παράγει επτά μεταγραφές mRNA με την ίδια ιστοσελίδα πρωτογενή έναρξης της μετάφρασης (Σχήμα 1, Πίνακας S2). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με την ανατίναξη των ακολουθιών με τη βάση δεδομένων της Εκφράζεται Ετικέτες Sequence (dbEST). Οι ακολουθίες των επτά εναλλακτικών μορφών ματίσματος κατατέθηκαν σε Genebank με αριθμό πρόσβασης HQ873864-HQ873870.

Διαρθρωτικά απεικόνιση των πολλαπλών μορφών ματίσματος FBXW7α. Επτά διαφορετικές μορφές ματίσματος FBXW7α εντοπίστηκαν από 5′-RACE χρησιμοποιώντας το γονίδιο ειδικός εκκινητής (ΣΓΠ) και αστάρι φωλιά (RS1). Ο αριθμός των αποικιών για κάθε μορφή μάτισμα που βρέθηκαν κατά τη διάρκεια ελέγχου φάνηκε. Η Ν-τερματική αλληλουχία του ισόμορφου β και γ διερευνήθηκε επίσης με 5′-RACE χρησιμοποιώντας τα αντίστοιχα αρχικά τεμάχια GSPβ, GSPγ, Nestβ και Nestγ. Τα βέλη αντιπροσωπεύουν τα εναύσματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη και τη θέση τους στην αντίστοιχη αλληλουχία.

Η

Μεταξύ αυτών εξόνια, 1αa και 1αc εμφανίζονται στις περισσότερες μορφές AS, ενώ 1αd είναι μόνο σε μία από τις επτά ματίσματος μορφές (Σχήμα 1). Είναι ενδιαφέρον, 1αb και 1αd φαίνεται αντίθετα να συνυπάρχουν στο ίδιο AS μορφή. Για να επιβεβαιωθεί αυτό, σχεδιάσαμε ειδικά αρχικά τεμάχια PCR που αντιστοιχούν στις αλληλουχίες σε 1αb και 1αd, αντίστοιχα (Σχήμα S1) και δεν μπόρεσαν να ανιχνεύσουν οποιαδήποτε μπάντα από mRNA ιστών που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη με RT-PCR (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Επιπλέον, δεν υπάρχουν νέα ORF που βρέθηκαν σε όλα τα επτά ως μορφές FBXW7α, υποδεικνύοντας ότι αυτές οι νέες εξώνια αποτελούν μόνο διαφορετικές περιοχές 5′-UTR διαφορετικών AS μορφές.

Οι διαφορές στην αποτελεσματικότητα της μετάφρασης των διαφόρων

FBXW7α

ως μορφές

για να διερευνήσουν το λειτουργικό αποτέλεσμα αυτών των 5′-UTRs για την μεταφραστική αποδοτικότητα των επόμενων FBXW7α ORF, χρησιμοποιήσαμε για πρώτη φορά μια δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης για να συγκρίνετε επτά ακολουθίες 5′-UTR. Για το σκοπό αυτό, κλωνοποιήσαμε κάθε 5′-UTR ανοδικά του γονιδίου της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας (LUC) στον φορέα ανταποκριτή pGL3 προαγωγό (Promega), και επιμολυσμένα τους σε κύτταρα HeLa. Αδειάστε το pGL3-προαγωγός χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας (LUC-ctrl). δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla-κανονικοποιημένη για κάθε κατασκεύασμα συγκρίθηκε με τη LUC-Πίν. Τα αποτελέσματα αυτών των δοκιμασιών έδειξαν με συνέπεια τις σημαντικές διαφορές στο LUC δραστηριότητες μεταξύ αυτών επτά 5′-UTR παραλλαγών (Σχήμα 2Α). Spli2-UTR παρουσίασαν πάντα την υψηλότερη δραστηριότητα LUC ενώ το επίπεδο της δραστηριότητας LUC σε Spli1-UTR, Spli4-UTR, και Spli5-UTR ήταν ενδιάμεσο, αλλά σημαντικά υψηλότερο από ό, τι LUC-ctrl? η δραστηριότητα LUC του Spli3-UTR, Spli6-UTR, και Spli7-UTR δεν ήταν στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με LUC-ctrl (Εικόνα 2Α). Προκειμένου να επιβεβαιώσει ότι αυτές οι διαφορές στη δραστηριότητα LUC δεν οφείλονταν στις διακυμάνσεις της LUC μεταγραφή, θα πραγματοποιηθεί ποσοτική ανάλυση πραγματικού χρόνου RT-PCR (qRT-PCR). Όπως έδειξε στο Σχήμα 2Β, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα της LUC μεταγραφής μεταξύ των διαφόρων 5′-UTR των παραλλαγών σε σύγκριση με LUC-Πίν. Το αποτέλεσμα αυτό δείχνει σαφώς ότι οι 5′-UTRs της FBXW7α ρυθμίζει την μεταφραστική απόδοση της κατάντη ΑΠΑ.

(Α) Επίδραση του

FBXW7α

5′-UTR παραλλαγές στη δραστηριότητα LUC. LUC κατασκευάσματα ανταποκριτή, το οποίο περιείχε κάθε

FBXW7α

5′-UTR ανοδικά του γονιδίου αναφοράς LUC στον φορέα pGL3, διαμολύνθηκαν σε κύτταρα HeLa. Η δραστικότητα LUC μετρήθηκε ως ο λόγος Firefly /Renilla. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τα δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν. Οι μέσες δεδομένα και οι τυπικές αποκλίσεις εμφανίζονται. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με Luc-CTR. μεταγραφικό επίπεδο (Β) LUC εξετάστηκαν με qRT-PCR. Τα περιεχόμενα LUC mRNA ομαλοποιήθηκαν στα περιεχόμενα Renilla mRNA για όλα τα δείγματα και η σχετική mRNA LUC για pGL3p (κενό φορέα, Promega) αυθαίρετα θεωρείται ότι είναι 1 (έλεγχος). (C) Επίδραση της 5′-UTRs για τα επίπεδα της πρωτεΐνης FBXW7α. Ανοσοστύπωμα αναπτύχθηκε με αντι-ΗΑ αντισώματος από εκχυλίσματα με υποδεικνύεται κατασκεύασμα. Η ένταση του pcDNA3.1 (+) που περιέχει γονίδιο FBXW7α (έλεγχος) θεωρήθηκε ως 1. κατασκεύασμα GFP χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης, και β-ακτίνη ως έλεγχος φόρτωσης. Όλες οι επιμολύνσεις έγιναν εις τριπλούν, και οι ράβδοι υποδεικνύουν την τυπική απόκλιση. * Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. (D) frangments cDNA για FBXW7 (άνω πάνελ), GFP (μεσαίο πλαίσιο) και GAPDH (κάτω πίνακας) ήταν ειδικά ενισχύθηκαν με RT-PCR από κύτταρα Hela επιμολυσμένα με υποδεικνύεται κατασκευάσματα.

Η

Για την περαιτέρω επαλήθευση ο αντίκτυπος της 5′-UTRs για τη ρύθμιση της μετάφρασης, κλωνοποιήσαμε επτά 5′-UTRs σε ανάντι του FBXW7α ORF σε pcDNA3.1 με ετικέτα ΗΑ επιτόπου και ακολούθως επιμολύνθηκαν τους σε κύτταρα HeLa. Ανάλυση Western blotting έδειξε επίπεδο έκφρασης από το κατασκεύασμα Spli2 ήταν σταθερά υψηλότερη από εκείνη που παρατηρήθηκε με τα άλλα UTRs και κατασκευάσματα ελέγχου όταν εξομαλύνεται σε επίπεδο επιμόλυνσης πρωτεΐνης GFP ελέγχου απόδοσης (Σχήμα 2C), το οποίο είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα από την δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης . Επιβεβαιώσαμε ότι η διαφορά έκφραση δεν οφείλεται σε μεταγραφική επιδράσεις δεδομένου ότι τα επίπεδα του mRNA δεν είναι σημαντικά διαφορετικές (Σχήμα 2D). Στο σύνολό τους, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι οι παραλλαγές 5′-UTR της FBXW7α έχει μεταγραφική λειτουργία ρυθμιστική.

προφίλ έκφρασης του

FBXW7α

ως μορφές στην ανθρώπινη φυσιολογικούς ιστούς

Δεδομένου ότι το 5 «-UTR μπορεί να ρυθμίσει τη μετάφραση των κατάντη ORFs, εμείς δίπλα προσπάθησε να ερευνήσει το μοτίβο έκφρασης του

FBXW7α

ως μορφές σε ανθρώπινους ιστούς. Για το σκοπό αυτό, ημι-ποσότητα RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε 21 φυσιολογικούς ιστούς του ανθρώπου με διαφορετικά σύνολα εκκινητών που αντιστοιχούν σε πρόσφατα ταυτοποιημένα εξώνια (Σχήμα 1, Πίνακας S1). RT-PCR αρχικά πραγματοποιήθηκε με ένα ζεύγος εκκινητών (F2 /RS1) που θα μπορούσε να ανιχνεύσει όλα ως μορφές. Όπως ήταν αναμενόμενο, οι πολλαπλές μορφές AS εκφράστηκαν σε όλους τους ανθρώπινους ιστούς (Σχήμα 3Α, άνω πάνελ). Οι AS σχηματίζουν Spli5, Spli4 και Spli2, που αντιστοιχεί σε ζώνη μεγέθη 386 bp, 435 bp, 478 bp αντίστοιχα, έδειξαν υψηλό επίπεδο έκφρασης του mRNA (Σχήμα 3Α, άνω πάνελ), σύμφωνα με τα ευρήματά μας στο 5 ‘μελέτες RACE, όπου ο αριθμός των κλώνων που αντιστοιχούν σε αυτές ως μορφές βρέθηκε πολύ υψηλότερη συχνότητα (Σχήμα 1). επίπεδο έκφρασης διαφορετικών FBXW7α AS μορφές ποικίλλουν μεταξύ των ιστών. Για παράδειγμα, η Spli4 είναι η κυρίαρχη μορφή στους όρχεις (λωρίδα 12 στο Σχήμα 3Α, άνω πάνελ), ενώ ο Spli2 είναι η πιο εκφράζεται ένας σε άλλους ιστούς (Σχήμα 3Α, άνω πάνελ), γεγονός που υποδηλώνει ένα μοτίβο κατανομής ιστού που σχετίζονται.

(Α)

FBXW7α

ως μορφές επίπεδα έκφρασης ανιχνεύθηκαν με ημι-ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας διαφορετικά ζεύγη εκκινητών. (Β) Τα επίπεδα του Spli1 & amp? 2 και η έκφραση Spli3-5 ποσοτικοποιήθηκαν από το πείραμα που φαίνεται στο (Α) κάτω πάνελ. Κανονικούς ιστούς περιλαμβάνουν: 1-οισοφάγου, 2-λιπώδη, 3-καρδιάς, 4-ουροδόχου κύστης, 5-νεφρό, 6-εγκεφάλου, 7-ήπατος, 8-πνεύμονα, 9-τραχήλου της μήτρας, του παχέος εντέρου 10, 11-σπλήνα, 12- όρχεις, 13-θύμου, 14-thyraoid, 15-τραχεία, 16-λεπτό έντερο, 17-σκελετικών μυών, 18-προστάτη, 19-πλακούντα, 20-ωοθήκης, 21-μαστού. «M» αντιπροσωπεύει DNA που σκάλα Marker.

Η

Καθώς ο επτά ως μορφές περιέχουν crossover από διάφορα εξώνια στην 5′-UTR, είναι δύσκολο να διακρίνει αυτές τις παραλλαγές. Έτσι σχεδιάσαμε τα εναύσματα F2 /R2 που βρίσκεται στο εξόνιο 1αa και 1αc να συγκρίνει το επίπεδο έκφρασης του Spli1 & amp? 2 (άθροισμα της έκφρασης Spli1 και Spli2) με τις μορφές Spli3-5 (ένα άθροισμα Spli3, Spli4 και έκφραση Spli5) . Βρήκαμε ότι Spli1 & amp? 2 εκφράζεται κυρίως στους περισσότερους ιστούς (Σχήμα 3Α, κάτω πλαίσιο, και το Σχήμα 3Β). Αλλά μερικοί ιστοί, όπως σπλήνα, θύμο και λεπτό έντερο έδειξε ίσα επίπεδα έκφρασης του Spli1 & amp? 2 και Spli3-5 (λωρίδες 11, 13 και 16 στο Σχήμα 3Α, κάτω πάνελ, και Σχήμα 3Β), ενώ Spli3-5 είναι μόνο υψηλής εκφράζονται σε όρχεις (λωρίδα 12 στο Σχήμα 3Α, κάτω πλαίσιο, και το Σχήμα 3Β).

εναλλάσσονταν έκφραση του

FBXW7α

ειδικές ως μορφές σε ανθρώπινους καρκίνους

από τη διαφορική έκφραση 5′-UTR ως μορφές έχει συνδεθεί με την εξέλιξη του όγκου, ερευνήσαμε το προφίλ έκφρασης του ταυτοποιημένου FBXW7α ως μορφές στον ανθρώπινο καρκίνο με ημι-ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας το ίδιο σετ εκκινητών που περιγράφονται παραπάνω. Το αποτέλεσμα σε ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών μαστού 20 έδειξε ότι οι περισσότερες καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές έχουν μειωμένα επίπεδα έκφρασης του FBXW7α ειδικών ως μορφών σε σύγκριση με φυσιολογικό ανθρώπινο επιθηλιακά κύτταρα μαστού (HMEC) (184A1 και 184B5) (Σχήμα 4Α). Σχεδόν όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού έδειξε αξιοσημείωτη μείωση στην έκφραση του Spli1 & amp? 2 ενώ δεν υπάρχουν αλλαγές στην έκφραση των Spli3-5 σε σύγκριση με τα επίπεδα σε HMECs (Σχήμα 4Α, κάτω πάνελ, Σχήμα 4Β). Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω σε ένα σύνολο 92 ανθρώπινων πρωτογενών καρκίνων του μαστού. Σε σύγκριση με τις συγκεντρωτικές κανονικούς ιστούς του μαστού, Spli1 & amp? 2 επίπεδα έκφρασης έδειξαν σημαντική μείωση σε περισσότερες από το 50% των όγκων. Αναπάντεχα, βρήκαμε ότι οι Spli3-5 επίπεδα έκφρασης έδειξαν σημαντική αύξηση σε περισσότερες από 30% των όγκων (Σχήμα 4C και D).

(Α) προφίλ έκφρασης mRNA του FBXW7α ως μορφές στον ανθρώπινο καρκίνο του μαστού και HMEC κυτταρικές γραμμές προσδιορίστηκε με ημι-ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας διαφορετικά σύνολα εκκινητών. «B1 να B20″ αντιπροσωπεύει 20 διαφορετικά ο καρκίνος του μαστού κυτταρικές γραμμές, «Α1» σημαίνει 184A1, «Β5» για 184B5. (Β) Τα επίπεδα του Spli1 & amp? 2 και η έκφραση Spli3-5 ποσοτικοποιήθηκαν από το πείραμα που φαίνεται στο (Α) κάτω πάνελ. (Γ) Το αντιπροσωπευτικό προφίλ έκφρασης του mRNA του FBXW7α ως μορφών από 92 ανθρώπινους καρκίνους μαστού πρωτογενή με ημι-ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας διαφορετικά σύνολα εκκινητών. (Δ) Ποσοτικοποίηση των Spli1 & amp? 2 και Spli3-5 έκφραση επίπεδα σε 92 ανθρώπινα πρωτογενή καρκίνους του μαστού. (Ε) Το προφίλ έκφρασης mRNA του FBXW7α AS μορφών σε 24 ανθρώπινους καρκίνους πρωτογενή νεφρικά με ημι-ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας διαφορετικά σύνολα εκκινητών. (F) Ποσοτικοποίηση των Spli1 & amp? 2 και Spli3-5 έκφραση επίπεδα σε 24 ανθρώπινα πρωτογενή καρκίνους νεφρού. «Ν» για συγκεντρώνονται τα RNA από φυσιολογικούς ιστούς, «M» για ΟΝΑ σκάλα Marker.

Η

Στη συνέχεια θα καθοριστεί κατά πόσον η διαφορετική έκφραση

FBXW7α

συγκεκριμένη χώρα όπως επίσης και σε άλλους τύπους ανθρώπινης Καρκίνος. Πράγματι, η

FBXW7α

έκφραση ενεργοποιείται από Spli1 & amp? 2 έως Spli3-5 σε ανθρώπινο νεφρό, προστάτη και καρκίνους της ουροδόχου κύστης (Σχήμα 4Ε και F, Εικόνα S2A και S2B). Αυτό το πρότυπο διαφορική έκφραση FBXW7α ως μορφών σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους υποστηρίζει ουσιαστικά την υπόθεσή μας, που FBXW7α ως μορφές περιλαμβάνουν στη ρύθμιση της FBXW7α κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης. Μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης FBXW7 μπορεί να μειωθεί στα καρκινικά κύτταρα μέσω της διαφορικής έκφρασης των FBXW7α AS μορφές, και η μείωση του FBXW7 αφθονία επηρεάζει ουσιαστικά τη λειτουργία του στις ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση των στόχων της (ογκοπρωτεΐνες), κατά συνέπεια, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη του όγκου και την εξέλιξη.

Μεταλλακτική ανάλυση των

FBXW7

σε ανθρώπινους καρκίνους ουρολογικές

Παρά το γεγονός ότι οι μεταλλάξεις σπάνια ανιχνεύονται σε καρκίνους του μαστού, γενετικές αλλοιώσεις βρίσκονται ακόμα σε καρκίνους του προστάτη [35], και δεν υπάρχει καμία αναφορά σχετικά με τις γενετικές αλλοιώσεις στην ουροδόχο κύστη και τα νεφρά όγκων. Επιπλέον, οι ανισότητες του καρκίνου έχουν βρεθεί μεταξύ των διαφόρων εθνοτικών ομάδων. Επίσης, δεν υπάρχει αναφορά σχετικά με το

FBXW7

φάσματος μετάλλαξης στον καρκίνο στους Κινέζους ασθενείς. Αυτό μας ίντριγκες να εξετάσει εάν υπάρχουν μεταλλάξεις και ποια είναι η συχνότητα των μεταλλάξεων σε ασθενείς με καρκίνο κινέζικα. Έτσι, πραγματοποίησε την ανάλυση μετάλλαξης του

FBXW7

γονιδίου σε 18 προστάτη, 24 νεφρών, της ουροδόχου κύστης και 16 ιστούς όγκων από Κινέζους ασθενείς. Και οι δύο μεταλλάξεις και διαγραφές βρέθηκαν σε αυτούς τους όγκους, όπως φαίνεται είτε με ηλεκτροφόρηση γέλης ή χάρτης προσδιορισμού αλληλουχίας στο Σχήμα 5. Αλληλούχηση θραυσμάτων συντομευμένη RT-PCR επιβεβαίωσε δύο δείγματα της ουροδόχου κύστης και ένα δείγμα νεφρό έχουν διαγραφές. Από τις διαγραφές όγκου κύστης, ένας όγκος έχει μια διαγραφή μέρους του εξωνίου 8 συν το σύνολο εξώνιο 9, ενώ στην άλλη όγκου κύστης λείπουν ολόκληρα εξόνιο 2 και 3 αλληλουχίες. Ο καρκίνος του νεφρού έχει μια διαγραφή ενός μέρους των εξονίων 8 και 10, μαζί με ολόκληρο το εξώνιο 9 (Σχήμα 5Β-D, Πίνακας 1). Το συνολικό ποσοστό μετάλλαξης FBXW7 σε καρκίνους του προστάτη είναι 5,6%, 16,7% σε καρκίνους νεφρού, και 18,8% σε καρκίνους της ουροδόχου κύστης από Κινέζους ασθενείς όπως συνοψίζονται στον πίνακα 1.

(Α) RT-PCR ανάλυση του

FBXW7

, προϊόντα RT-PCR που περιέχουν διαγραφές υποδεικνύονται με αστερίσκο. (Β-D) αλληλούχιση επιβεβαίωσε τη διαγραφή σε δύο καρκίνους της ουροδόχου κύστης (Β και C), και ένα καρκίνο του νεφρού (D). (Ε) Εκπρόσωπος ακολουθία ίχνη που δείχνουν τις μεταλλάξεις του

FBXW7

.

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την έκφραση FBXW7α μέσω ένα μυθιστόρημα μοτίβο μάτισμα. Έχουμε εντοπίσει επτά μυθιστόρημα ως μορφές του

FBXW7α

από 5 ‘τεχνική RACE. Παρόλο που παράγουν ουσιαστικά την ίδια πρωτεΐνη, η

FBXW7α

ως μορφές εμφανίζονται να ελέγχουν την έκφραση της πρωτεΐνης μέσω της ρύθμισης των μεταφραστική αποτελεσματικότητα αυτών ως μορφών αφού έχουμε αποδείξει ότι FBXW7α 5′-UTR παραλλαγές έχουν μεταφραστική λειτουργία διαμορφωτική. Πολλαπλές ως μορφές βρέθηκαν μόνο στο

FBXW7α

, όχι στο

FBXW7β

ή

FBXW7γ

. Παρ ‘όλα αυτά, βρήκαμε ότι

FBXW7

α δεσπόζει εκφράζεται σχεδόν σε όλους τους ανθρώπινους ιστούς που εξετάστηκαν, ενώ

FBXW7

β mRNA εμπλουτίζεται στον εγκέφαλο και του θύμου αδένα και είναι απούσα ή στο ποσό ίχνη σε άλλους ιστούς, και

FBXW7

γ mRNA βρέθηκε να περιορίζεται στην καρδιά και τους σκελετικούς μύες (Σχήμα S3), η οποία υπογραμμίζει τη σημασία που

FBXW7

α για τη λειτουργία του FBXW7. Έτσι, η πολλαπλή ως μορφές παρουσιάζονται σε FBXW7α μπορούν να επιτρέπουν την ακριβή ρύθμιση της έκφρασης του κατά τη διάρκεια βιολογικές διεργασίες.

για πρώτη φορά ανακάλυψαν ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης του FBXW7α ρυθμίζεται μέσω ελέγχου μετάφρασης, αποδεικνύοντας την αποτελεσματικότητα διαφορική μεταγραφική του διαφορετικές μορφές FBXW7α AS. Η

in vivo

πειράματα χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς ανταποκριτού LUC με συνέπεια έδειξε ότι η μορφή Spli2 έχει την υψηλότερη μεταφραστική αποτελεσματικότητα σε σύγκριση με τους άλλους. Διάφοροι παράγοντες είναι γνωστοί για τον προσδιορισμό μεταφραστική αποτελεσματικότητα [33]. Οι διαφορές στις μεταφραστική αποτελεσματικότητα μεταξύ FBXW7α 5′-UTR παραλλαγών είναι απίθανο λόγω του μήκους τους, την αλληλουχία γύρω από την περιοχή έναρξης της μετάφρασης, και ο αριθμός των κωδικονίων έναρξης στο εσωτερικό τους ως τον ίδιο αριθμό κωδικονίων έναρξης και την ίδια αλληλουχία γύρω από την περιοχή έναρξης μετάφρασης βρέθηκαν σε όλες τις παραλλαγές FBXW7α 5′-UTR. Το μήκος του Spli2-UTR είναι σαφώς μεγαλύτερο από το Spli6-UTR και Spli7-UTR, μικρότερη από Spli3-UTR, αλλά Spli2 εμφάνισαν υψηλότερη απόδοση της μετάφρασης. Επιπλέον, εξετάσαμε τις διαφορές στη δευτεροβάθμια δομές και ελεύθερη ενέργεια του καθενός

FBXW7α

5′-UTR παραλλαγές χρησιμοποιώντας το λογισμικό online RNA-αναδίπλωση (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi- bin /RNAfold.cgi.). Δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές στην ελεύθερη ενέργεια αξία μετά την ομαλοποίηση με το μήκος μεταξύ των εν λόγω 5′-UTRs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να χορηγείται για τη διερεύνηση των πιθανών μηχανισμών με τους οποίους 5′-UTRs ρυθμίζουν τη μεταγραφική αποτελεσματικότητα.

FBXW7

έχει αναδειχθεί ως ένα σημαντικό γονίδιο καταστολής όγκου ανθρώπου. Αρκετοί μηχανισμοί έχουν αναφερθεί για απενεργοποίηση του FBXW7 στον ανθρώπινο καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων μετάλλαξης, διαγραφής και υπερμεθυλίωση [17], [21] – [25], [34]. Πολλές προσπάθειες έχουν επικεντρωθεί στην ανακάλυψη του FBXW7 μετάλλαξης σε διάφορους τύπους καρκίνου στον άνθρωπο και έχουν δείξει ότι η συνολική συχνότητα σημειακή μετάλλαξη είναι μόνο 6% σε ανθρώπινους καρκίνους [17], αλλά δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή σε όλους τους τύπους όγκου. Περίπου το 30% συχνότητα μετάλλαξης βρέθηκε σε χολαγγειοκαρκίνωμα και Τ-κυττάρων οξεία λεμφοβλαστική leukamias ενώ συχνότητες μετάλλαξης στον προστάτη, ενδομητρίου καρκίνου, καθώς και καρκίνο του γαστρεντερικού κανονίσει από 4% έως 15% [35]. Αποτελείται με αυτά τα ευρήματα, αναφέραμε εδώ για πρώτη φορά οι μεταλλάξεις του FBXW7 ανιχνεύονται σε ανθρώπινο νεφρό και την ουροδόχο κύστη όγκων με τη συχνότητα 16,7% (4/24) και 18,8% (3/16) (Πίνακας 1), αντίστοιχα. Η συχνότητα των όγκων του προστάτη από κινεζικού πληθυσμού είναι 5,6%, παρόμοια με μια προηγούμενη μελέτη που πραγματοποιήθηκε σε Καυκάσιους [36].

Το πιο σημαντικό εύρημα στην παρούσα μελέτη είναι ότι το

FBXW7

γονίδιο απορυθμισμένη μέσω διαφορικής έκφρασης των μορφών AS σε ανθρώπινους καρκίνους. Η σύνδεση μεταξύ της ανάπτυξης των όγκων και η απορρύθμιση της AS έχουν γίνει μια νέα και σημαντική πτυχή της βιολογίας του καρκίνου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η μεταγραφική μοτίβο

FBXW7

AS μορφές σε καρκίνους του ανθρώπου είναι διαφορετικό από το συνηθισμένο διαμέρισμα ιστό. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, η

FBXW7α

σχήματα έκφρασης στην πλειονότητα των ανθρώπινων καρκίνων μεταστρέφονται από Spli1 & amp? 2 έως Spli3-5 σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό τους. Η συνέπεια αυτού του διακόπτη προκαλεί την μείωση του

FBXW7

επίπεδο πρωτεΐνης, και με τη σειρά του οδηγεί σε μερική απώλεια της λειτουργίας του. Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι απελευθερωμένη από

FBXW7α

γονίδιο μπορεί να είναι ένας πρόσθετος μηχανισμός για την αδρανοποίηση

FBXW7

σε ανθρώπινους καρκίνους. Δεδομένου ότι η διαφορική έκφραση του

FBXW7α

ως μορφές έχει βρεθεί σε περισσότερο από το 50% των καρκίνων, προτείναμε ότι ο νέος αυτός μηχανισμός παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του ανθρώπινου καρκίνου.

Εν κατακλείδι, από την ανάλυση

FBXW7

άκρο 5 ‘περιοχή, εντοπίσαμε το μυθιστόρημα

FBXW7α

5′-UTR παραλλαγές που ρυθμίζουν

FBXW7α

γονιδιακής έκφρασης μέσω του μηχανισμού που περιλαμβάνει μεταφραστική απόδοση. Αυτά ως μορφές εκφράζονται σε έναν ιστό που σχετίζεται με τον τρόπο με ποικίλα επίπεδα μεταξύ των διαφόρων ιστών. Η μελέτη μας παρέχει μια νέα εικόνα για την αλλαγή του

FBXW7α

έκφρασης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του ανθρώπινου καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Το ανθρώπινο πρωτογενές μαστού όγκοι συλλέχθηκαν κατά το χρόνο της χειρουργικής εκτομής στο Νοσοκομείο Universitario της Σαλαμάνκα, Σαλαμάνκα, Ισπανία. Συλλογή και η χρήση των δειγμάτων ασθενών εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας ηθική του Νοσοκομείου Universitario της Σαλαμάνκα. Τα ανθρώπινα πρωτογενή προστάτη, της ουροδόχου κύστης και του νεφρού όγκοι συλλέχθηκαν κατά τη στιγμή της χειρουργικής εκτομής σε Changhai Νοσοκομείο, Κίνα. Η συλλογή και η χρήση των δειγμάτων των ασθενών είχαν εγκριθεί βάσει την επιτροπή δεοντολογίας ηθική της Changhai Νοσοκομείου, Δεύτερη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς για την έρευνα με τη χρήση αυτών των δειγμάτων όγκου.

Τα δείγματα ασθενών

Σε δύο νοσοκομεία, τα δείγματα φρέσκου ιστού του όγκου ελήφθησαν κατά το χρόνο της χειρουργικής εκτομής των όγκων των ασθενών. Τα δείγματα αμέσως καταψύχθηκαν ταχέως κάτω σε υγρό άζωτο και έπειτα από αποθήκευση στους -80 ° C καταψύκτη πριν από τη χρήση. Η &? Ε (αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρώση) ολισθαίνει κατεψυγμένων ιστών ανθρώπινου όγκου εξετάστηκαν από τους παθολόγους αυτής της μελέτης για να εξασφαλιστεί ότι οι ιστοί του όγκου που επιλέγεται είχαν υψηλής πυκνότητας εστίες καρκίνου. (& Gt? 80%)

Κυττάρων γραμμές

κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ ή σε RMPI1640 συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και 100 mM στρεπτομυκίνη και πενικιλλίνη? λεπτομέρειες περιγράφονται στην προηγούμενη μελέτη μας [37]. κύτταρα Hela καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 100 mM στρεπτομυκίνη και πενικιλίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2.

Σύνολο εκχύλιση RNA από κύτταρα και ιστούς

Ολικά RNAs παρασκευάσθηκαν από 80% συμβάλλουσες καλλιέργεια του μαστού κυτταρικές σειρές καρκίνου, κύτταρα HeLa 36 ώρες μετά την επιμόλυνση και κατεψυγμένα ανθρώπινου μαστού, του νεφρού, του προστάτη και των ιστών όγκου κύστης χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. δείγματα εκχυλίζονται RNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το κιτ ελεύθερο DNA (Ambion) πριν από την περαιτέρω ανάλυση, ώστε να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα ποσότητα γονιδιακού DNA. συγκέντρωση του RNA και η ποιότητα προσδιορίστηκαν με ένα φασματοφωτόμετρο Nanovue (GE Healthcare). Ανθρώπινο ολικό RNA από διάφορους φυσιολογικούς ιστούς αγοράστηκε από την Ambion.

5 ‘ταχεία ενίσχυση των άκρων cDNA (RACE)

Ο χαρακτηρισμός του

FBXW7

γονίδιο Ν άκρο διεξήχθη χρησιμοποιώντας 5 ‘RACE kit (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, ολικό RNA απομονώθηκε από το ανθρώπινο μαστικό επιθηλιακό κύτταρο (HMEC) 184A1 κυττάρων με ΤπζοΙ (Invitrogen), και cDNA δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας ειδικό εκκινητή (GSP) που παρατίθενται στον Πίνακα S1. Το cDNA ουρά με dCTP χρησιμοποιώντας τελική τρανσφεράση Δεοξυ-και ένα εκκινητή πολυ-G (Invitrogen) συνδυάστηκε με κάθε

FBXW7

cDNA για την PCR. Μία δεύτερη PCR διεξήχθη με αραίωση του πρώτου PCR, χρησιμοποιώντας κάθε εκκινητή φωλιά Nestα (RS1), Nestβ ή Nestγ (Πίνακας S1), και ένα εκκινητή adaptamer που παρέχεται από την Invitrogen. Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα και κλωνοποιήθηκαν σε φορέα pCR4. Κάθε κλώνος αλληλουχήθηκε.

αντίστροφη μεταγραφή και PCR ενίσχυση του cDNA

Ο πρώτος κλάδος cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας SuperScript III κιτ σύνθεσης cDNA (Invitrogen). 1 μα RNA υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή ακολουθώντας τις συνθήκες αντίδρασης που προσδιορίζονται από τον κατασκευαστή. Οι αντιδράσεις πριμοδοτήθηκαν με 50 ng τυχαίων εξαμερών. Τα cDNA από καρκίνο του μαστού κυτταρικές γραμμές, τα ανθρώπινα πάνελ κανονικών ιστών, και πρωτογενείς μαστού, του νεφρού, του προστάτη και της ουροδόχου κύστης όγκοι αναλύθηκαν για AS μεταγραφές

FBXW7

α χρησιμοποιώντας PCR με ζεύγη εκκινητών F2 /RS1, F2 /R2 και F1 /RS1 (Πίνακας S1). Το γονίδιο οικονόμος GAPDH ενισχύθηκε ο έλεγχος από το ζεύγος εκκινητών GapF /ΟΑΡΓ (Πίνακας S1). Το πρωτόκολλο για την αντίδραση PCR ήταν 26-35 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 30 s, ανόπτηση στους 56 ° C για 30 s, και επέκταση στους 72 ° C για 30 s.

Για την ανίχνευση μεταλλάξεων FBXW7 στην πρωτογενή του προστάτη, της ουροδόχου κύστης, και οι όγκοι των νεφρών, η αλληλουχία κωδικοποίησης του

FBXW7

ενισχύθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας τρία ζεύγη εκκινητών P1F /R, P2F /R και P3F /R (Πίνακας S1), και το ενισχυμένο προϊόντα αλληλουχήθηκαν και συγκρίθηκαν στη βάση δεδομένων Genebank. Για διαφορετικού μεγέθους PCR προϊόντα, ζώνες αποκόπηκαν γέλη και καθαρίζεται, και στη συνέχεια επαληθεύεται με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA.

Το πλασμίδιο κατασκευάσματα

Επτά διαφορετικές FBXW7α 5′-UTRs (Spli1 έως 7) ενισχύθηκαν από εκείνους θετική pCR4 κλώνων σε RACE χρησιμοποιώντας το ακόλουθο ζεύγος εκκινητών GL3F /GL3R (Πίνακας S1). Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν με πηκτή, υπέστη πέψη και στη συνέχεια συνδέθηκε εντός φορέα pGL3-υποκινητή (Promega) μέσω θέσεων περιορισμού HindIII /NcoI αμέσως γειτονικά προς το γονίδιο λουσιφεράσης κατάντη. Οι δημιουργούνται κατασκευάσματα ορίστηκαν ως Spli1-UTR, Spli2-UTR, Spli3-UTR, Spli4-UTR, Spli5-UTR, Spli6-UTR, και Spli7-UTR. Ομοίως, επτά 5′-UTRs ενισχύθηκε με ζεύγος εκκινητών GL3F /GL3R2 εισήχθησαν σε ανάντη της FBXW7α γονίδιο συγχωνευμένο με ΗΑ επίτοπο σε pcDNA3.1 (+) φορέα (αποθηκεύονται σε αυτό το εργαστήριο) μέσω HindIII /EcoRI. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση DNA.

παροδική επιμόλυνση

Παροδικές επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα HeLa περίπου 70% συρροή χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Εικοσιτέσσερις ώρες πριν από την επιμόλυνση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και μεταφέρθηκαν σε είτε δίσκους των 96 φρεατίων (για δοκιμασία λουσιφεράσης) ή πιάτα mm 60 (για την απομόνωση RNA). Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε με το αντιδραστήριο ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 0.2 μg του πειραματικού DNA από παρασκευάσματα πλασμιδίου μεγάλης κλίμακας παραδόθηκε στο κάθε φρεάτιο σε 96-κυψελίδων πλάκες παρουσία phRL-ΤΚ

Renilla

πλασμίδιο ελέγχου λουσιφεράσης (Promega, 0,01 μg) ή 4 ug πειραματικών DNA και 0.2 μg του

Renilla

πλασμίδιο ελέγχου λουσιφεράσης στα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε τρυβλίο 60 mm, και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C. Μετά από 4 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με DMEM με 10% FBS και αντιβιοτικά /αντιμυκητιασικά, και τα κύτταρα επωάστηκαν μέχρι να χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση του RNA ή δοκιμασία λουσιφεράσης.