Αφηρημένο

Ιστορικό

Diosgenin, μια στεροειδή σαπωνίνη λαμβάνεται από τριγωνέλλα (

Trigonella foenum graecum

), βρέθηκε να ασκεί αντι-καρκινογόνες ιδιότητες, όπως η αναστολή του πολλαπλασιασμού και επαγωγή απόπτωσης σε μια ποικιλία καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, η επίδραση των διοσγενίνη επί μετάστασης καρκίνου παραμένει ασαφής. Ο σκοπός της μελέτης είναι να εξετάσει την επίδραση της diosgenin για τη μετανάστευση και την εισβολή στα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη PC-3.

Μέθοδοι και ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Diosgenin ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των PC-3 κύτταρα ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μη-τοξικές δόσεις των διοσγενίνη, μετανάστευση κυττάρων και εισβολή ήταν αξιόλογα κατασταλμένα με in vitro επούλωσης πληγών δοκιμασία και δοκιμασία Boyden θάλαμο εισβολή, αντίστοιχα. Επιπλέον, διοσγενίνη μείωσε τις δραστηριότητες της μεταλλοπρωτεϊνάσης-2 (ΜΜΡ-2) και ΜΜΡ-9 με δοκιμασία ζελατίνης ζυμογραφία. Το επίπεδο του mRNA της ΜΜΡ-2, -9, -7 και εξωκυτταρικό επαγωγέας μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (EMMPRIN) επίσης κατέστειλε ενώ αναστολέα ιστού μεταλλοπρωτεϊνάσης-2 (ΤΙΜΡ-2) αυξήθηκε κατά διοσγενίνη. Επιπλέον, διοσγενίνη κατάργησε την έκφραση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) σε κύτταρα PC-3 και ο σχηματισμός σωλήνα των ενδοθηλιακών κυττάρων. ανοσοαποτύπωση αναλύσεις μας έδειξαν ότι diosgenin ισχυρά κατέστειλε την φωσφορυλίωση της phosphatidylinositide-3 κινάσης (PI3K), Akt, εξωκυτταρικό σήμα που ρυθμίζουν κινάση (ΕΚΚ) και c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK). Επιπλέον, diosgenin μειωθεί σημαντικά το πυρηνικό επίπεδο πυρηνικού παράγοντα κάππα Β (NF-kB

κ

Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι diosgenin αναστέλλει τη δράση του NF-κΒ.

Συμπέρασμα /Σημασία

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι διοσγενίνη ανέστειλε τη μετανάστευση και την εισβολή του PC-3 κύτταρα με μείωση της έκφρασης ΜΜΡ. Είναι ανέστειλε επίσης ERK, JNK και ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτια σηματοδότησης καθώς και ΝΡ

κ

Β δραστικότητα. Τα ευρήματα αυτά αποκαλύπτουν νέες θεραπευτικές δυνατότητες για diosgenin σε αντι-μεταστατική θεραπεία

Παράθεση:. Chen PS, Shih YW, Huang HC, Cheng HW (2011) Diosgenin, ένα στεροειδές σαπωνίνη, αναστέλλει τη μετανάστευση και την εισβολή του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη PC-3 κύτταρα από τη μείωση του Matrix Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες έκφρασης. PLoS ONE 6 (5): e20164. doi: 10.1371 /journal.pone.0020164

Συντάκτης: Robert E. Μέσα, Yale της Ιατρικής Σχολής, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Φεβρουαρίου του 2011? Αποδεκτές: 14, Απριλίου 2011? Δημοσιεύθηκε: May 23, 2011

Copyright: © 2011 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Diosgenin είναι ένα φυσικό στεροειδές σαπωνίνης παρούσα σε ένα. ποικιλία των φυτών συμπεριλαμβανομένων fenugreek (

Trigonella foenum graecum

) και τις ρίζες των άγριων γιαμ (

Dioscorea villosa

) [1]. Diosgenin έχει χρησιμοποιηθεί στην παραδοσιακή ιατρική ως antihypercholesterolemia, antihypertriacylglycerolemia, αντιδιαβητικά και antihyperglycemia παράγοντα [1], [2], [3], [4]. Αρκετές αναφορές έχουν δείξει ότι διοσγενίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση σε ευρεία ποικιλία καρκινικών κυττάρων του ανθρώπινου κόλον [5], οστεοσάρκωμα [6], λευχαιμία [7], ερυθρολευχαιμίας [8], του μαστού [9], και το ήπαρ [10] . Η αντικαρκινική δράση των διοσγενίνη, έχει αποδειχθεί από διακοπή του κυτταρικού κύκλου [7], [11], η ενεργοποίηση της ρ53 και της κασπάσης-3 [5], [7], [8], [12]. Επιπλέον, διοσγενίνη αναστέλλει τη δράση του NF-κΒ και NF-κΒ-ρυθμιζόμενη έκφραση γονιδίων και στη συνέχεια ελάττωση του πολλαπλασιασμού, εισβολή και την οστεοκλαστογένεση [6], [13]. Diosgenin καταργεί επίσης κυκλοοξυγενάσης-2 [11] και της λιποξυγενάσης [14], τα οποία εμπλέκονται στην καρκινογένεση και ως σημαντικούς στόχους για χημειοπροφύλαξη και θεραπεία του καρκίνου. Ως εκ τούτου, διοσγενίνη μπορούν να διαθέτουν το χημειοθεραπευτικό του καρκίνου δυναμικού και τη δραστηριότητά της περιλαμβάνει πολλαπλές κυτταρικές και μοριακών στόχων.

Ο καρκίνος του προστάτη είναι ένας από τους πιο συχνά διαγιγνώσκεται όγκων στους άνδρες και η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [ ,,,0],15]. Αν και ο καρκίνος του προστάτη κατά το αρχικό στάδιο μπορεί να θεραπευθεί με χειρουργική επέμβαση και θεραπεία στέρηση ανδρογόνου, τελικά προχωρήσει σε περισσότερο κακοήθη, μετάσταση, και ο καρκίνος του ορμονοάντοχο προστάτη (HRPC), για τα οποία δεν υπάρχει θεραπευτική αγωγή [16], [17] . Έτσι, απαιτείται ανάπτυξη καινοτόμων θεραπειών για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Επειδή προχωρημένο καρκίνο του προστάτη κύτταρο με εξαιρετικά επιθετική πιθανότητα ως αποτέλεσμα υψηλά ποσοστά νοσηρότητας και θνησιμότητας, η αναστολή της εισβολής και της μετάστασης θα μπορούσε να είναι μια καλή προσέγγιση για τη θεραπεία της HRPC.

μετάστασης του καρκίνου είναι ένα ιδιαίτερα συντονισμένη σταδιακή διαδικασία η οποία περιλαμβάνει αποκόλληση των κυττάρων από τον πρωτογενή όγκο, τοπική πρωτεόλυση της εξωκυτταρικής μήτρας (ECM), η διείσδυση μέσω της βασικής μεμβράνης των τριχοειδών και λεμφαγγείων, ενδαγγείωση, και στη συνέχεια σε νέα εισβολή ιστού και την αύξηση [18], [19]. Η διαδικασία της μετάστασης προωθείται από εκφράζουν και να εκκρίνουν διάφορα πρωτεολυτικά ένζυμα που μπορεί να υποβαθμίσει τα περισσότερα συστατικά του ECM. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs), μια οικογένεια από Ζη που εξαρτώνται από ενδοπεπτιδάσες, είναι τα κύρια πρωτεάσες συμμετέχουν στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, εξάπλωση, εισβολή ιστού και μετάσταση [20]. Μεταξύ των MMPs, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 είναι βασικά ένζυμα για την αποικοδόμηση κολλαγόνου τύπου IV και συμβάλλουν στη διαδικασία της μετάστασης [21], [22]. ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 είναι επίσης ικανά να διασπούν το κολλαγόνο τύπου Ι [23], [24], το κύριο συστατικό που σχηματίζει μια δομή πλέγματος στο στρώμα [25]. Η ενεργοποίηση αυτών των ενζύμων έχουν συσχετισθεί με την αύξηση της μετάστασης όγκου, γεγονός που υποδηλώνει έναν κεντρικό λειτουργικό ρόλο για αυτές τις πρωτεάσες στη μεταστατική διαδικασία [26]. Η πρωτεολυτική αποικοδόμηση του στρωματικών μικροπεριβάλλον παίζει κρίσιμο ρόλο στην προώθηση της εισβολής. Για την απόκτηση λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τον καρκίνο κελί εισβολή στο στρώμα, κολλαγόνου τύπου Ι χρησιμοποιείται σε δοκιμασία εισβολή θαλάμου Boyden στην παρούσα μελέτη.

Επιπλέον, η πρωτεολυτική αποικοδόμηση της ECM σε μετάσταση όγκου μπορεί να ρυθμίζονται από άλλες πρωτεΐνες όπως ως εξωκυτταρικό επαγωγέας μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (EMMPRIN) και αναστολέας μεταλλοπρωτεϊνασών ιστού (TIMPs). EMMPRIN είναι μια πολυλειτουργική γλυκοπρωτεΐνη που μπορεί να τροποποιήσει το μικροπεριβάλλον του όγκου ενεργοποιώντας πρωτεϊνάσες, επάγοντας αγγειογόνων παραγόντων σε κύτταρα όγκου και στρωματικά. EMMPRIN είναι σε θέση να ρυθμίζουν MMPs και να συμμετέχουν στις διαδικασίες εισβολής και της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων του προστάτη [27]. Οι δραστηριότητες των πιο MMPs ρυθμίζονται από TIMPs. Η ισορροπία μεταξύ των επιπέδων της ΜΜΡ και ΤΙΜΡ είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της καθαρής πρωτεολυτική δραστηριότητα [28].

Μιτογόνο-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (ΜΑΡΚ) έχει γίνει γνωστό να συμμετάσχουν σε πολλές καταρράκτες σηματοδότησης που παίζουν σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη, η απόπτωση, διαφοροποίηση, και μετάσταση [29]. Τα ποικίλα μέλη ΜΑΡΚ ενεργοποιούνται σε απόκριση σε διάφορα εξωκυτταρικά ερεθίσματα και έχουν διακριτές κατάντη στόχους, διεγείροντας έτσι την κυτταρική μετανάστευση, πρωτεϊνάση-επαγωγή, και της αγγειογένεσης, τα γεγονότα που είναι απαραίτητα για τη μετάσταση [30]. Εξωκυτταρικό σήμα που ρυθμίζουν κινάση (ERK1 /2) και c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK), δύο σημαντικές ΜΑΡ κινάσες των θηλαστικών, έχουν εμπλακεί στην κυτταρική μετανάστευση και πρωτεϊνάσης-επαγωγής, γεγονότα που είναι απαραίτητα για τη μετάσταση [30]. ERK1 /2 και ΙΝΚ διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης των MMPs [20]. Η αναστολή της οδού ΜΑΡΚ ενδέχεται να έχει την δυνατότητα να εμποδίσει την αγγειογένεση, πολλαπλασιασμό, εισβολή, και μετάσταση για ένα ευρύ φάσμα των όγκων [31], [32], [33]. Μετάσταση ρυθμίζεται επίσης από τον /Akt μονοπάτι ΡΙ3Κ σηματοδότησης, η οποία εμπλέκεται σε πολλές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένων κυτταρική επιβίωση, κυτταρική προσκόλληση και μετάσταση [34], [35]. Η αναστολή της ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ μονοπάτια /Akt μπορεί να έχει τη δυνατότητα να εμποδίζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, εισβολή, και μετάσταση [31], [33]. Επιπλέον, ΡΙ3Κ /Akt και ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης παίζουν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης των MMPs από μεταγραφικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων του ΝΡ-κΒ [34], [36], [37]. ΝΡ-κΒ διατηρείται σε ανενεργό μορφή στο κυτταρόπλασμα με ανασταλτικές πρωτεΐνες που ονομάζονται αναστολείς της κΒ (ΙκΒ). Σε απόκριση σε ένα σήμα ενεργοποίησης, ΝΡ-κΒ απελευθερώνεται από ΙκΒα και μετατοπίζεται από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, όπου συνδέεται με τον συγγενή αλληλουχίες στην περιοχή προαγωγέα ενός αριθμού γονιδίων στόχων και στη συνέχεια διευκολύνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την αγγειογένεση, και μετάσταση. Έτσι, ο αποκλεισμός ΡΙ3Κ /Akt και μονοπάτια ΜΑΡΚ καθώς και NF-κΒ παρέχουν πιθανοί στόχοι για καρκινικά θεραπευτικές στρατηγικές.

Αν και διοσγενίνη ενοχοποιείται ως νέου multitarget που βασίζεται χημειοπροληπτικός παράγοντας κατά αρκετών καρκινικών κυττάρων, ο ρόλος των διοσγενίνη κατά τη μετάσταση των όγκων και την αγγειογένεση είναι ακόμα ασαφής. Ο στόχος αυτής της εργασίας είναι να εξετάσει τις ανασταλτικές επιδράσεις και μοριακών μηχανισμών της diosgenin για μετάσταση. Από ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη PC-3 κυττάρου εμφανίζει υψηλά διεισδυτική και μεταστατική δραστηριότητα και έχει χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση των βιοχημικές αλλαγές σε προχωρημένο προστάτη καρκινικά κύτταρα και στην αξιολόγηση απόκρισή τους σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [38], PC-3 κυττάρων που χρησιμοποιούνται για τα παρόντα πειράματα .

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και Cell Culture

Diosgenin, διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), Tris-HCl, EDTA, SDS, φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF), Nonidet Ρ -40, δεοξυχολικό οξύ και ορθοβαναδικού νατρίου, αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). κιτ δοκιμασίας Πρωτεΐνης λήφθηκε από την Bio-Rad Labs (Hercules, CA). μέσον κονιοποιημένο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (DMEM) αγοράστηκε από την Gibco /BRL (Gaithersburg, MD). Σύνολο κυτίο εκχύλισης RNA και κιτ PCR ήταν από Viogene (Sunnyvale, CA). Αντισώματα έναντι ERK, JNK, Akt, ΝΡ-κΒ (ρ65), C23 και φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αντισώματα έναντι ΡΙ3Κ και φωσφορυλιωμένων ΡΙ3Κ αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Ανθρώπινα προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές PC-3 και ελήφθη από BCRC (Food Industry Research Institute και Ανάπτυξης, Ταϊβάν). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /ml πενικιλλίνης και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και επωάστηκαν σε 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ° C. Ανθρώπινα ομφάλια φλεβικά ενδοθηλιακά κυττάρων (HUVEC), ευγενική προσφορά από Dr. Hua-Lin Wu [39], απομονώθηκε από ανθρώπινο φλέβες ομφάλιου λώρου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39], και καλλιεργήθηκαν σε 0,1% πιάτα επικαλυμμένα με ζελατίνη και διατηρήθηκαν σε μέσο Μ199 συμπληρωμένο με 16% FBS, συμπλήρωμα ανάπτυξης ενδοθηλιακών κυττάρων και θειικής ηπαρίνης (Upstate Biotechnology). HUVECs μεταξύ των διόδων 2 και 6 χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα. Για διοσγενίνη θεραπεία, διοσγενίνης διαλύθηκε σε αιθανόλη και αραιώνεται με μέσο καλλιέργειας (η τελική συγκέντρωση αιθανόλης ήταν μικρότερη από 0,2%).

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [ ,,,0],40]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διοσγενίνης εις τριπλούν. Μετά από 24 και 48 ώρες επώασης, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 0.5 mg /ml ΜΤΤ [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου]. Μετά από 4 ώρες, τα υπερκείμενα απομακρύνθηκαν και το προκύπτον ΜΤΤ φορμαζάνης διαλύθηκε σε DMSO και μετριέται φασματοφωτομετρικά στα 570 nm.

Επούλωση Μετανάστευση Δοκιμασία

Η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [41] . PC-3 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μια 12-κυψελίδων πλάκα και αυξήθηκε σε συρροή. Η καλλιέργεια μονοστοιβάδας στη συνέχεια ξύστε τραυματίες με ένα αποστειρωμένο άκρο μικροπιπέτας για να δημιουργήσετε μια απογυμνωμένη ζώνη (χάσμα) του σταθερού πλάτους. Μετά την απομάκρυνση των κυτταρικών θραυσμάτων με PBS, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις διοσγενίνη μετά από 24 ώρες. PC-3 κύτταρα μετανάστευσαν στην τραυματίες περιοχή παρατηρήθηκαν από την Olympus CK-2 ανεστραμμένο μικροσκόπιο και φωτογραφήθηκαν (100 × μεγέθυνση). Η περιοχή του τραύματος μετρήθηκε με την J πρόγραμμα εικόνας (https://rsb.info.nih.gov/ij/). Το ποσοστό του κλεισίματος του τραύματος υπολογίστηκε από την ακόλουθη εξίσωση: τραύματος% κλείσιμο = [1- (περιοχή τραύματος σε Τ

t /περιοχή τραύματος σε Τ

0) χ 100%, όπου Τ

t είναι η φορά μετά τον τραυματισμό και Τ

0 είναι ο χρόνος αμέσως μετά τον τραυματισμό.

Boyden Επιμελητήριο εισβολή δοκιμασία

δοκιμασία εισβολής θάλαμο Boyden διεξήχθη όπως στο παρελθόν [41]. Εν συντομία, το πολυανθρακικό φίλτρο (8 μm πόρου) προ-επικαλύπτονται με τύπου Ι κολλαγόνο (10 μg /ml). Μετά από αγωγή με διοσγενίνη για 24 ώρες, τα κύτταρα (1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) προστέθηκαν στον άνω θάλαμο σε μέσο χωρίς ορό. Το πλήρες μέσο (που περιέχει 10% FBS) εφαρμόστηκε στον κάτω θάλαμο ως χημειοπροσελκυστικό. Ο θάλαμος επωάστηκε για 6 ώρες στους 37 ° C. Στο τέλος της επώασης, τα κύτταρα στην άνω επιφάνεια της μεμβράνης αφαιρέθηκαν προσεκτικά με μια μπατονέτα και κύτταρα που εισέβαλαν στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 5% διάλυμα Giemsa. Τα εισέβαλαν κύτταρα στην κατώτερη επιφάνεια του φίλτρου μεμβράνης βαθμολογήθηκαν από πέντε τυχαία πεδία κάτω από μικροσκόπιο (200 χ μεγέθυνση).

Tube Σχηματισμός Προσδιορισμός

Η δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα έγινε όπως περιγράφεται. Εν συντομία, ένα 15-φρεατίων μ-Διαφάνειες (ibidi, Γερμανία) επικαλύφθηκε με 10 μΙ Matrigel το οποίο αφέθηκε να στερεοποιηθεί στους 37 ° C. Για να αξιολογηθεί η επίδραση της διοσγενίνη, PC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις διοσγενίνη για 24 ώρες και το εμπλουτισμένο μέσο συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα. HUVEC σπάρθηκαν στο Matrigel και καλλιεργήθηκαν σε ρυθμισμένο μέσο από PC-3 κυττάρων για 6 ώρες. Οι περικλείεται δίκτυα πλήρων σωλήνων μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Τα σωληνοειδή μήκη των κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Image J.

RNA Εκχύλιση και PCR αντίστροφης μεταγραφής και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ολικό RNA εκχύλιση χρησιμοποιώντας ολικό κιτ εκχύλισης RNA σύμφωνα με το τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ολικό RNA (1 μα) από κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή με ολιγο (dT) αρχικά τεμάχια με κιτ PCR σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το συντεθέν cDNA χρησιμοποιήθηκε για PCR με τα ακόλουθα εναρκτήρια [41]: ΜΜΡ-9, 5′-gcacgacgtcttccagtacc-3 ‘(For), 5′-tcaactcactccgggaactc-3′ (Rev)? ΜΜΡ-2, 5’-ggactatgaccgggataagaaatatg-3 ‘(For), 5′-gggcaccttctgaatttcca-3′ (Rev)? β-ακτίνης: 5’-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ‘(For), 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’ (Rev). cDNA ενισχύθηκαν για 35 κύκλους και κάθε συνθήκη αντίδρασης PCR ήταν ως εξής: στάδιο παρασκευής στους 94 ° C για 5 λεπτά, στάδιο στους 94 ° C μετουσίωσης επί 30 δευτερόλεπτα, στάδιο αναδιάταξης στους 56 ° C για 30 sec, και το στάδιο του πολυμερισμού στους 72 ° C για 30 sec. Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Οι εκφράσεις mRNA του ΜΜΡ-2, -9, -7, EMMPRIN και ΤΙΜΡ-1, -2 προσδιορίστηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR που διεξάγεται σε σύστημα StepOne (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). Εν συντομία, το κάθε μίγμα ενισχύσεως (50 μΐ) περιέχει 10 ng cDNA και 25 μl SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Οι συνθήκες PCR είχαν ως εξής: 95 ° C για 2 λεπτά, 40 κύκλους στους 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 45 s. Οι αλληλουχίες εκκινητών για β-ακτίνη, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, ΜΜΡ-7, EMMPRIN, ΤΙΜΡ-1, ΤΙΜΡ-2 και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) έχουν συναχθεί από PrimerBank και παρατίθενται στον Πίνακα 1. Αποτελέσματα PCR ήταν που προέρχονται χρησιμοποιώντας τη συγκριτική C

μέθοδο Τ.

η

Ανάλυση ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 δραστηριότητες με ζυμογραφία ζελατίνης

οι δραστηριότητες των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 ήταν προσδιορίστηκαν με ζυμογραφία ζελατίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [41]. Εν συντομία, συρρέοντα κύτταρα PC-3 επωάστηκαν με μέσο χωρίς ορό με διάφορες συγκεντρώσεις διοσγενίνη για 24 ώρες. Το ρυθμισμένο μέσο στη συνέχεια συλλέχθηκε και συμπυκνώθηκε με φυγοκέντρηση υπερ-διήθηση. Το δείγμα (20 μg) αναμίχθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης και υποβλήθηκαν σε 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου που περιείχε 0,1% ζελατίνη. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε στα 100 V για 3 ώρες στους 4 ° C. Τα πήγματα στη συνέχεια πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (2.5% Triton Χ-100 σε dd H

2O) σε θερμοκρασία δωματίου για να απομακρυνθεί SDS, ακολουθούμενη από επώαση στους 37 ° C σε ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (40 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0, 10 mM ΟαΟ

2, 0,02% NaN

3). Μετά από 16 ώρες, τα πηκτώματα χρωματίστηκαν με Comassie μπλε R-250 (0,125% Comassie blue R-250, 50% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ) για 1 ώρα και αποχρωματίζονται με διάλυμα αποχρωματισμού (20% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ, 70% αναπτυξιακής δυσπλασίας του ισχίου

2Ο) έως ότου εμφανίστηκαν οι σαφείς ζώνες.

πυρηνική πρωτεΐνη Εξόρυξη

οι πυρηνικές πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [41]. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS, φυγοκεντρούνται, και επαναιωρήθηκαν σε υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα (10 mM HEPES, ρΗ 7.9, 1.5 mM MgCl

2, 10 mM KCl, 0,05% ΝΡ-40, 0,5 mM DTT και 0,5 mM PMSF). Οι πυρήνες φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στις 3000 rpm στους 4 ° C. Το δισκίο ακολούθως εναιωρείται εκ νέου σε ρυθμιστικό πυρηνικό εκχύλισμα (20 mM HEPES, ρΗ 7.9, 1.5 mM MgCl

2, 420 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 0,5 mM PMSF και 25% γλυκερίνη) και επωάστηκαν για 30 λεπτά στον πάγο. Μετά από μια άλλη φυγοκέντρηση στα 14.000 rpm για 10 λεπτά, το υπερκείμενο που περιέχει το πυρηνικό πρωτεΐνη μεταφέρθηκε σε προψυχθείσα σωλήνα μικροφυγοκέντρησης. Τα εκχυλίσματα αποθηκεύθηκαν στους -80 ° C.

Western Blot

Μετά την θεραπεία με διοσγενίνη, κύτταρα PC-3 πλύθηκαν δύο φορές με PBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ρυθμιστικό εκχύλισης (50 mM Tris-Cl , ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% ΝΡ-40 και 0,5% δεοξυχολικό οξύ). Οι κυτταρικές εκχυλίσεις συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα 10.000 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν ως λύματα κυττάρων. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Millipore, Bedford, ΜΑ). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% (w /v) γάλα χωρίς λιπαρά σε PBS που περιέχει 0.1% Tween-20, και στη συνέχεια κηλιδώθηκαν με πρωτογενές αντίσωμα. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν με ένα κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα (horseradish υπεροξειδάση-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού IgG). Οι ανοσο-ανιχνευθούν πρωτείνες στη συνέχεια αποκαλύφθηκε με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. Η στατιστική σημαντικότητα αναλύθηκε με μονόδρομη ANOVA. Αν παρατηρήθηκε η σημασία, δοκιμή post-hoc του Dunnett χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η διαφορά μεταξύ των ομάδων θεραπείας και μη ομάδα, με τιμές

ρ

& lt?. 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

κυτταροτοξική δράση του diosgenin σε PC-3 κύτταρα

διευκρινιστεί πρώτα το κυτταροτοξικό αποτέλεσμα των διοσγενίνη επί κυττάρων καρκίνου του προστάτη PC-3 (Εικ. 1). Έχουμε αποδείξει ότι αντιμετωπίζονται από διοσγενίνη σε συγκέντρωση κάτω από 20 μΜ για 24 ή 48 ώρες δεν επηρέασε σημαντικά τη βιωσιμότητα του PC-3 κυττάρου. Βιωσιμότητα των PC-3 κυττάρου ήταν σημαντικά μειωμένη με το diosgenin στους 30 μΜ. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η θεραπεία με διοσγενίνη σε δόσεις όχι περισσότερο από 20 μΜ για 24 και 48 ώρες δεν προκάλεσε κυτταροτοξικότητα του PC-3 κύτταρα.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις διοσγενίνη για 24 ώρες και 48 ώρες . Η βιωσιμότητα των κυττάρων παρουσιάζεται ως μέση ± δ.ϋ. από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

*** ρ

& lt?. 0.001 σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

Diosgenin Αναστέλλει τη Μετανάστευση στο PC-3 κύτταρα

Επειδή μια υψηλότερη συγκέντρωση των διοσγενίνη ήταν τοξικά , διερευνούμε το ανασταλτικό αποτέλεσμα διοσγενίνη για τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων PC-3 με τη χρήση μη-τοξικές δόσεις. Μετά από επώαση με διαφορετικές συγκεντρώσεις διοσγενίνη για 24 ώρες, διοσγενίνη κατέστειλε μετανάστευση των PC-3 κυττάρων στην απογυμνωμένη ζώνη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 2, Α και Β). Αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι διοσγενίνη ανέστειλε την κινητικότητα του PC-3 κύτταρα σημαντικά.

μονοστοιβάδες κυττάρων αποξέονται με ένα αποστειρωμένο άκρο μικροπιπέτα και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις διοσγενίνη για 24 ώρες. (Α) κύτταρα που μετανάστευσαν στον πληγωμένο περιοχή φωτογραφήθηκαν (100 × μεγέθυνση). (Β) Η περιοχή του τραύματος των κυτταρικών καλλιεργειών ποσοτικοποιήθηκαν σε τέσσερα πεδία σε κάθε θεραπεία, και τα δεδομένα υπολογίστηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± ως S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

* ρ

& lt? 0,05,

** ρ

& lt?. 0.01, σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

Diosgenin Αναστέλλει Εισβολή σε κύτταρα PC-3

για να διευκρινιστεί η ανασταλτική επίδραση του διοσγενίνη στην εισβολή των PC-3 κυττάρων σε όλη την εξωκυτταρική μήτρα, τα κύτταρα που εισέβαλαν μέσω του τύπου Ι κολλαγόνου επικαλυμμένα πολυκαρβονικό φίλτρο στον θάλαμο Boyden αναλύθηκαν. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι διοσγενίνη κατέστειλε εισβολή του PC-3 κυττάρων σε όλη την επικαλυμμένες με κολλαγόνο φίλτρο τύπου Ι σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η θεραπεία με διοσγενίνη των 10 και 20 μΜ ανέστειλε 22% και 40% των κυτταρικών εισβολής, αντίστοιχα (Εικ. 3, Α και Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το diosgenin αξιοσημείωτα ανέστειλε την εισβολή του PC-3 κύτταρα.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις διοσγενίνη για 24 ώρες και προσδιορισμό κυτταρικής εισβολής διεξήχθη. (Α) Τα κύτταρα εισέβαλαν φωτογραφήθηκαν (200 × μεγέθυνση). (Β) Τα κύτταρα εισέβαλαν PC-3 μετρήθηκαν σε πέντε τυχαία πεδία σε κάθε θεραπεία, και τα δεδομένα υπολογίστηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

* ρ

& lt? 0,05,

** ρ

& lt?. 0.01, σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

Diosgenin αναστέλλει την ενεργοποίηση και έκφραση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 σε κύτταρα PC-3

Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση των MMPs είναι ζωτικής σημασίας για την αποικοδόμηση ECM, η οποία απαιτείται για την κυτταρική εισβολή, η επίδραση της διοσγενίνη στην ενεργοποίηση των MMPs διερευνήθηκε. Αφού τα κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις διοσγενίνη για 24 ώρες σε μέσο ελεύθερο ορού, το ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε, συμπυκνώθηκε και προσδιορίστηκαν για δραστικότητα ΜΜΡ με ζυμογραφία ζελατίνης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-2 δραστηριότητες μειώνεται σημαντικά κατά 20 μΜ διοσγενίνης (Σχ. 4Α). Δείξαμε επίσης ότι διοσγενίνη κατέστειλε την έκφραση των ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-2 mRNA και πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με RT-PCR και κηλίδωση Western, αντίστοιχα (Σχ. 4, Β και C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο δραστηριότητες ενζύμου και εκφράσεις του ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-2 ανεστάλησαν από diosgenin.

(Α) κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις διοσγενίνη για 24 ώρες και τις δραστηριότητες των ΜΜΡ -9 και MMP-2 προσδιορίστηκαν με ζυμογραφία ζελατίνης. Οι εκφράσεις του ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-2 mRNA (Β) και πρωτεΐνη (C) αναλύθηκαν με RT-PCR και κηλίδωση Western, αντιστοίχως. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. (D) Τα επίπεδα της ΜΜΡ-2, -9, -7, EMMPRIN και ΤΙΜΡ-1, -2 mRNA εκφράστηκαν ως μέση ± δ.ϋ. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

* ρ

& lt? 0,05,

** ρ

& lt?. 0.01, σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

Diosgenin Αναστέλλει mRNA έκφραση της ΜΜΡ-2, ΜΜΡ -9, ΜΜΡ-7 και εξωκυτταρικό επαγωγέας μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (EMMPRIN), ενώ Προκαλεί ΤΙΜΡ-2 έκφραση

προκειμένου να αποσαφηνιστεί η επίδραση της διοσγενίνη στην έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην αποδόμηση της ECM, τα επίπεδα mRNA του ΜΜΡ-2 , ΜΜΡ-9, ΜΜΡ-7, EMMPRIN, ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 αναλύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι διοσγενίνη ανέστειλε την έκφραση του mRNA του ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, ΜΜΡ-7 και EMMPRIN με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Diosgenin αυξημένα επίσης την έκφραση του ΤΙΜΡ-2, το οποίο είναι γνωστό για να εμποδίσει την πρωτεολυτική δυναμικό των ΜΜΡ (Σχ. 4D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι διοσγενίνη ενδέχεται να επηρεάσει την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται σε πρωτεολυτική ενεργοποίηση.

Diosgenin ανέστειλε PC-3 που επάγεται κύτταρο ανθρώπινων ομφάλιων φλεβικών ενδοθηλιακών κυττάρων (HUVEC) σχηματισμός σωλήνα

Ο σχηματισμός σωλήνα του ενδοθηλιακού κυττάρου είναι ένα από τα κρίσιμα βήματα στην αγγειογένεση που σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση. Για να εξεταστεί το ανασταλτικό αποτέλεσμα των διοσγενίνη στην επαγόμενη PC-3 κυττάρου αγγειογένεση, εκτελέσαμε in vitro σχηματισμός σωλήνα HUVEC με ρυθμισμένο μέσο από PC-3 κύτταρα. HUVEC καλλιεργούνται επί Matrigel υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το εμπλουτισμένο μέσο από PC-3 κύτταρα που κατεργάζονται με διοσγενίνη για 24 ώρες, και ο σχηματισμός σωλήνα αξιολογήθηκαν. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν ρυθμισμένα μέσα από PC-3 κυττάρων που επάγεται σχηματισμός σωλήνα HUVEC, και ρυθμισμένα μέσα από κύτταρα που εκτίθενται σε diosgenin καταστέλλεται σχηματισμός σωλήνα HUVEC με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 5, Α και Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι διοσγενίνη μπορούσε καταστέλλουν προκαλούμενη PC-3 κυττάρου αγγειογένεση in vitro. Επειδή PC-3 κύτταρα επάγουν αγγειογένεση μέσω εκφράζουν αγγειογόνους παράγοντες όπως VEGF, αξιολογούμε αν διοσγενίνη αναστέλλει την έκφραση του VEGF σε κύτταρα PC-3. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του mRNA του VEGF σε κύτταρα PC-3 ήταν σημαντικά μειώθηκε κατά diosgenin με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 5C). Τα δεδομένα μας πρότειναν ότι αναστέλλουν διοσγενίνη PC-3 κυττάρων που επάγεται αγγειογένεση καταστέλλοντας την έκφραση του VEGF.

(Α) HUVECs σπάρθηκαν επί Matrigel και επωάστηκαν με ρυθμισμένο μέσο από PC-3 κύτταρα που κατεργάζονται με διοσγενίνη για 24 ώρες. Μετά από 6 ώρες, οι συνημμένες δίκτυα πλήρων σωλήνων φωτογραφήθηκαν (100 × μεγέθυνση). (Β) Τα σωληνοειδή μήκη των κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J. (Γ) Η έκφραση του mRNA του VEGF προσδιορίστηκε και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

* ρ

& lt? 0,05,

** ρ

& lt?. 0.01, σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

Diosgenin αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της PI3K, Akt, ΕΚΚ και JNK

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι οι πρωτεΐνες σηματοδότησης περιλαμβανομένων των ΡΙ3Κ, Akt και μέλη ΜΑΡΚ που εμπλέκονται στην έκφραση των MMPs και επαγωγής μετάστασης [30], [34], [35]. Ερευνήθηκαν οι επιδράσεις των διοσγενίνη στην φωσφορυλιωμένη κατάσταση της ΡΙ3Κ, Akt, ERK1 /2, JNK1 /2 και p38 σε PC-3 κύτταρα. Τα δεδομένα έδειξαν ότι διοσγενίνη μείωσε την φωσφορυλίωση της Akt ΡΙ3Κ και σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 6, Α και Β). Επιπλέον, διοσγενίνη κατέστειλε την φωσφορυλίωση των ERK1 /2 και JNK1 /2 σε ένα δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο, ενώ δεν μετέβαλε τη φωσφορυλίωση της ρ38 (Εικ. 7, Α και Β).

κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες δόσεις διοσγενίνη για 24 ώρες (Α), ή 20 μΜ διοσγενίνη για 3, 6, 12, 18 και 24 h (Β). Η φωσφορυλίωση της ΡΙ3Κ και Akt προσδιορίστηκε με SDS-PAGE και κηλίδωση Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες δόσεις διοσγενίνη για 24 ώρες (Α), ή 20 μΜ διοσγενίνη για 3, 6, 12, 18 και 24 h (Β). Η φωσφορυλίωση του ERK1 /2, JNK1 /2 και p38 προσδιορίστηκαν με SDS-PAGE και κηλίδωση Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Για να διερευνηθεί περαιτέρω αν η αναστολή της κυτταρικής εισβολής και ΜΜΡ-2/9 έκφρασης ήταν μέσω αναστολής του ERK1 /2, JNK1 /2 και ΡΙ3Κ σηματοδότηση μονοπάτια, τα κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με έναν αναστολέα της ΡΙ3Κ (LY294002? 20 μΜ), αναστολέα της ERK (U0126? 20 μΜ) και αναστολέα JNK (SP600125? 20 μΜ) για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία του LY294002, U0126 και SP600125 μειωμένη κυτταρική εισβολή και ΜΜΡ-2/9 έκφραση σημαντικά (Σχ. 8, Α και Β), υποδηλώνοντας ότι θα μπορούσε να συμβεί εν μέρει η αναστολή της κυτταρικής εισβολής και ΜΜΡ-2/9 έκφρασης με διοσγενίνη μέσω καταστολής ΡΙ3Κ, ERK και JNK πορείες.

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με LY294002, U0126 και SP600125 για 24 ώρες και το κύτταρο επεμβατική ικανότητες διεξήχθησαν με δοκιμασία εισβολή θαλάμου Boyden. (Β) Η έκφραση του ΜΜΡ-2, -9 mRNA προσδιορίστηκαν και εκφράζονται ως μέσος όρος ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

** ρ

& lt? 0,01,

*** ρ

& lt? 0.001, σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

Diosgenin ρυθμίζει προς τα κάτω την Πυρηνική Περιεχόμενο της ΝΡ. κΒ σε κύτταρα PC-3

για να διερευνηθεί η ανασταλτική δράση των διοσγενίνη επί της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ, το ποσό των ΙκΒα στα εκχυλίσματα κυτταρολύματος και NF-κΒ στα πυρηνικά εκχυλίσματα κυττάρων μετρήθηκαν με κηλίδωση Western. Τα δεδομένα αποκάλυψαν ότι διοσγενίνη-επεξεργασμένα κύτταρα PC-3 έδειξαν μια αύξηση στο κυτοσολικό επίπεδο πρωτεΐνης ΙκΒα και μείωση του επιπέδου της πυρηνικής πρωτεΐνης του ΝΡ-κΒ (Εικ. 9). Τα αποτελέσματα ενοχοποιηθεί ότι diosgenin ανέστειλε σημαντικά δραστικότητα ΝΡ-κΒ.

PC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με διάφορες δόσεις διοσγενίνη για 24 ώρες. (Α) Η κυτοσολίου και πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν για την αποικοδόμηση ΙκΒα και NF-κΒ ρ65 μετατόπισης. β-ακτίνης και C23 χρησιμοποιήθηκαν ως κυτταρολύματος και ελέγχου πυρηνική πρωτεΐνη φόρτωση, αντίστοιχα. (Β) Προσδιορίζεται επίπεδα ΙκΒα και NF-κΒ ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρική ανάλυση. Τα πυκνομετρική αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση ± δ.ϋ. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

* ρ

& lt? 0,05,

** ρ

& lt? 0,01,

*** ρ

& lt?. 0.001, σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο έλεγχο

Συζήτηση

Diosgenin έχει αποδειχθεί ότι κατέχουν αντι-καρκινογόνες δυνατότητες, όπως την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και επαγωγή απόπτωσης διαφόρων καρκινικών κυτταρικών σειρών [5], [6], [7], [8] , [9], [10]. Στην παρούσα μελέτη, υπό τον όρο ενδείξεις ότι διοσγενίνη ήταν ικανή να αναστείλει την μετάσταση

in vitro

, όπως η μετανάστευση και εισβολή σε PC-3 κύτταρα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει ότι ίσως διοσγενίνη έχουν αντι-μεταστατικό δυναμικό.

αποδείξαμε ότι διοσγενίνη κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των PC-3 κύτταρα σημαντικά σε συγκέντρωση 30 μΜ. Όταν το PC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με διοσγενίνη σε μη-τοξικές δόσεις (κάτω από 20 μΜ), τη μετανάστευση και εισβολή ανεστάλησαν. Αυτά τα αποτελέσματα υπονοείται ότι τα ανασταλτικά αποτελέσματα των διοσγενίνη στο PC-3 κυτταρική μετανάστευση και εισβολή δεν οφείλονταν σε κυτταροτοξική δράση του.

μετάσταση καρκίνου απαιτεί μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Κατά τη μετανάστευση των κυττάρων, περικυτταρική πρωτεόλυση ECM είναι σημαντική για την κυτταρική προεξοχή. Η πρωτεολυτική αποικοδόμηση του ECM διαμεσολαβείται από εξωκυτταρικές πρωτεάσες, όπως MMPs, απαιτείται για μετανάστευση καρκίνου του προστάτη και των κυττάρων εισβολής. Μεταξύ αυτών, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-7 παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Η έκφραση του ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 συνδέονται με την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη [42], [43]. Αναστολή ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 έκφραση καταστέλλουν την μεταστατικό δυναμικό του καρκίνου του προστάτη [32], [44]. ΜΜΡ-7 διαθέτει πρωτεολυτική δραστικότητα έναντι μιας ποικιλίας υποστρωμάτων ECM, συμπεριλαμβανομένων κολλαγόνα, πρωτεογλυκάνες, ελαστίνη, η λαμινίνη, ινονεκτίνη, και καζεΐνη. ΜΜΡ-7 παράγεται επίσης από διάφορα κακοήθη κύτταρα όγκου, συμπεριλαμβανομένων προστάτη, του στομάχου, του κεφαλιού και του λαιμού, του πνεύμονα, ηπατοκυτταρικό, και ορθοκολικά καρκινώματα [45], [46]. Η υπερέκφραση ΜΜΡ-7 προάγει εισβολή των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [47]. Επιπλέον, EMMPRIN είναι σε θέση να ρυθμίζουν MMPs και να συμμετέχουν στις διαδικασίες εισβολής και της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων του προστάτη [27]. Η αναστολή της έκφρασης EMMPRIN μειώνει εισβολή των καρκινικών κυττάρων στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη κυττάρου [48]. TIMPs, ο ρυθμιστής των MMPs, εμπλέκονται επίσης στην εξέλιξη του όγκου, εισβολή, μετάσταση και αγγειογένεση [49], [50]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι διοσγενίνη ανέστειλε τη μετανάστευση και την εισβολή του PC-3 κύτταρα.