Αφηρημένο

Η βλεννίνη MUC4 και ο συνεργάτης της μεμβράνης του, το ογκογόνο υποδοχέα ErbB2 είναι πιθανοί εταίροι αλληλεπιδρούν με την ανάπτυξη του ανθρώπινου παγκρέατος όγκου. Ωστόσο, ο τρόπος που λειτουργούν είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Σε αυτό το έργο, έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει τα κυτταρικούς μηχανισμούς και τις ενδοκυττάριων οδών σηματοδότησης, υπό τον έλεγχο τόσο ErbB2 και MUC4 σε ένα ανθρώπινο παγκρεατικό adenocarcinomatous κυτταρική σειρά. Χρησιμοποιώντας συνανοσοκαθίζησης και GST pull-down, δείχνουμε ότι MUC4 και ErbB2 αλληλεπιδρούν με το ανθρώπινο παγκρέατος adenocarcinomatous κυτταρική σειρά Capan-2

μέσω

των τομέων EGF των MUC4. Σταθεροί κλώνοι κυττάρων παρήχθησαν στην οποία είτε MUC4 ή ErbB2 είχαν χτυπηθεί κάτω (KD) από μια προσέγγιση shRNA. Βιολογικές ιδιότητες αυτών των κυττάρων στη συνέχεια σπούδασε

in vitro

και

in vivo

. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα κύτταρα ErbB2-KD είναι πιο αποπτωτικά και λιγότερο πολλαπλασιαστική (μειωμένη κυκλίνη D1 και αυξημένη έκφραση p27kip1), ενώ η μετανάστευση και επεμβατικές ιδιότητες δεν μεταβλήθηκαν. MUC4-KD κλώνοι ήταν λιγότερο πολλαπλασιαστική με μειωμένη έκφραση κυκλίνης D1, G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου και αλλοιωμένη έκφραση ErbB2 /ErbB3. ιδιότητες μετανάστευσή τους μειώθηκαν, ενώ επεμβατική ιδιότητες αυξήθηκαν. Είναι σημαντικό ότι, η αναστολή της ErbB2 και της έκφρασης MUC4 δεν βλάπτουν τα ίδια μονοπάτια σηματοδότησης (αναστολή της έκφρασης MUC4 επηρεάζεται το μονοπάτι JNK, ενώ εκείνη του ErbB2 αλλάξει το μονοπάτι ΜΑΡΚ). Τέλος, ErbB2-KD και MUC4-KD κύτταρα έδειξαν εξασθενημένη ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ErbB2 και MUC4, τα οποία αλληλεπιδρούν φυσικά, ενεργοποιούν διαφορετικές οδούς ενδοκυτταρικής σηματοδότησης για τη ρύθμιση των βιολογικών ιδιοτήτων των Capan-2 καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

Παράθεση:. Jonckheere Ν, Skrypek Ν, Merlin J, Dessein AF, Dumont Ρ, Leteurtre Ε, et al. (2012) Η Βλεννίνης MUC4 και μεμβράνης Partner ErbB2 της ρυθμίζουν βιολογικές ιδιότητες των κυττάρων ανθρώπινου Capan-2 καρκίνο του παγκρέατος

μέσω

διαφορετικών οδών σηματοδότησης. PLoS ONE 7 (2): e32232. doi: 10.1371 /journal.pone.0032232

Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, Κίνα

Ελήφθη: 12 Αυγ του 2011? Αποδεκτές: 24 Ιανουαρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 του Φεβρουαρίου του 2012

Copyright: © 2012 Jonckheere et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Δρ. Nicolas Jonckheere είναι αποδέκτης μεταδιδακτορικός υπότροφος από το Institut National du Cancer (INCA) και Ligue Nationale contre le Καρκίνο (LNCC). Nicolas Skrypek είναι αποδέκτης ενός PhD υποτροφία της νοσοκομειακό κέντρο Περιφερειακή Universitaire (CHRU) de Lille /περιοχή Nord-Pas de Calais. Ο Δρ Frédéric Frénois είναι αποδέκτης μεταδιδακτορικός υπότροφος από το Fondation pour la Recherche Médicale (FRM). Johann Merlin είναι ο αποδέκτης ενός διδακτορικού υποτροφία από το Université de Lille 2 και περιφέρεια Nord-Pas de Calais. Το έργο αυτό υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από la Ligue Nationale contre le Καρκίνο (Equipe Labellisée Λιγκ το 2010, IVS). Isabelle Van Seuningen είναι ο αποδέκτης μιας «Contrat νοσοκομειακό de Recherche Translationnelle» /ΟΗΚΤ 2010, AVIESAN. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρέατος πορογενές αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι η 4η κυριότερη αιτία θανάτου από καρκίνο στον κόσμο. Η καμπύλη επιβίωσης είναι εξαιρετικά μικρή (6 μήνες) και το ποσοστό επιβίωσης σε 5 χρόνια, είναι πολύ χαμηλή (3%). Αυτή η δραματική έκβαση σχετίζεται με την έλλειψη θεραπευτικών εργαλείων και την έγκαιρη διάγνωση δείκτες που καθιστά τον καρκίνο του παγκρέατος και τον πιο θανατηφόρο καρκίνο. Κατά τη στιγμή της διάγνωσης, περισσότερο από το 80% των PDAC είναι ήδη μεταστατικό ή τοπικά προχωρημένο και μόνο περίπου 10 έως 15% των ασθενών θεωρούνται επιλέξιμα για χειρουργική εκτομή. Παγκρέατος καρκινογένεση ακολουθεί μια εξέλιξη μεταπλασία /δυσπλασία /καρκίνο με PDAC αναπτυσσόμενες από προδρόμους πορογενές βλάβη ονομάζεται παγκρέατος ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (PanIN-1Α /1Β /-2 /-3), στην οποία ιστολογικές, κυτταρολογική και γενετικές αλλαγές συσσωρεύονται [1], [2 ]. Ταυτοποίηση νέων μοριακών στόχων, ιδιαίτερα εκείνες με αλλοιωμένη έκφραση στις αρχές PanIN, και αποκρυπτογράφηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τη νόσο, είναι βέβαιο ότι θα επιτρέψει την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για να σταματήσει /επιβραδύνουν την εξέλιξη του όγκου.

Σε αυτό το πλαίσιο η δεσμευμένη σε μεμβράνη βλεννίνης MUC4, η οποία εκφράζεται ως νωρίς όπως στην PanIN-1Α ενώ δεν εκφράζεται στα υγιή πάγκρεας, και ο συνεργάτης μεμβράνη του το ογκογόνο ErbB2 υποδοχέα που συχνά υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παγκρέατος, καθώς και σε PanINs, αντιπροσωπεύουν ελπιδοφόρα θεραπευτικοί στόχοι [3], [4], [5], [6].

Το γονίδιο κωδικοποιεί μια MUC4 μεγάλο apomucin (930 kDa) που αποτελείται από δύο υπομονάδες MUC4α και MUC4β [7], [8] , [9], [10]. MUC4α είναι το εξωκυτταρικό υπομονάδα διαθέτει μια τυπική υπεργλυκοζυλιωμένου περιοχή. MUC4β είναι η trans-μεμβράνης υπομονάδα που περιέχει τρία τύπου EGF (EGF3, EGF1 και EGF2 βρίσκεται από το C-άκρο προς Ν-άκρο) που είναι συντηρημένα σε ανθρώπους και τρωκτικά [4], [11]. Πειραματική απόδειξη με ομόλογα του αρουραίου MUC4 και ErbB2 υποδηλώνει ότι οι τομείς τύπου EGF παίζει ένα ρόλο στις αλληλεπιδράσεις υποδοχέα-συνδετήρα και έναν ρυθμιστή στη σηματοδότηση σχετίζονται με την ανάπτυξη, κινητικότητα ή διαφοροποίηση του κυττάρου [4], [12]. Από αυτά τα δεδομένα, Carraway και οι συνεργάτες έχουν προτείνει MUC4 ως ρυθμιστής της ισορροπίας πολλαπλασιασμού /διαφοροποίησης [13], αλλά αυτή τη στιγμή, όπως προτεινόμενος μηχανισμός δεν έχει επικυρωθεί για ανθρώπινη MUC4.

Το neu ογκογονίδιο κωδικοποιεί ErbB2 /τύπος HER2 Ι διαμεμβρανική υποδοχέα αυξητικού παράγοντα που ανήκει στον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR /ErbB1) οικογένεια περιλαμβάνει ErbB3 και ErbB4. Η πρωτεΐνη ErbB2 συνίσταται σε μια εξωκυτταρική περιοχή, μια διαμεμβρανική περιοχή και μια ενδοκυτταρική περιοχή κινάσης τυροσίνης. ErbB2 δεν έχει γνωστό συνδετήρα και περιγράφεται ως συν-υποδοχέας ο οποίος ετερο-διμερίζεται με τους άλλους υποδοχείς ErbB [14]. ErbB2 συνήθως υπερεκφράζεται σε καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων PDAC, όπου ErbB2 συχνά ενισχύεται.

Μελέτες σε ανθρώπινα κύτταρα εξακολουθούν να είναι σπάνια και προτείνουν μέτρο ένα πιθανό ρόλο για MUC4 στις βιολογικές ιδιότητες του παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [15], [ ,,,0],16]. Αναφορικά με ErbB2, μόνο μια πρόσφατη μελέτη σε άλλο μοντέλο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές έχει δείξει ότι ErbB2 μπορεί να εμπλέκεται στις ιδιότητες του παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [17]. Προηγούμενες εργασίες σε κόλον και πνευμονική κύτταρα έδειξαν ότι MUC4 και ErbB2 μπορεί να δρα ως ένα λειτουργικό συγκρότημα και μετάγουν σήματα ενδοκυτταρικά [18], [19]. Ωστόσο, παραμένει ασαφές εάν MUC4 και ErbB2 ενεργοποιούν την ίδια οδό (ες) σηματοδότησης.

Στην παρούσα εργασία, ανέλαβε να προσδιορίσει τα ενδοκυτταρικά μονοπάτια σηματοδότησης υπό τον έλεγχο είτε του ErbB2 ή MUC4 στον ίδιο κυτταρικό μοντέλο του καρκίνου του παγκρέατος να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση. Δείχνουμε ότι η ανθρώπινη MUC4 και ErbB2 μην αλληλεπιδρούν φυσικά σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και ότι η αναστολή της έκφρασης του κάθε εταίρων μεμβράνης δεν βλάπτει τις ίδιες οδούς σηματοδότησης (αναστολή της έκφρασης MUC4 επηρεάζει το μονοπάτι ΙΝΚ, ενώ εκείνο των ErbB2 μεταβάλλει την οδό ΜΑΡΚ). Παρατηρήθηκαν διαφορετικές επιδράσεις στις βιολογικές ιδιότητες των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων, υποδηλώνοντας ανεξάρτητες δραστηριότητες αυτών των δύο πρωτεϊνών με έναν ρόλο στην ανάπτυξη του παγκρέατος όγκου για ErbB2, ενώ MUC4 φαίνεται να ενέχεται τόσο την αύξηση και τη διάδοση του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Καθιέρωση ErbB2 και MUC4 KD κυτταρικές σειρές

Ο παγκρεατικός καρκίνος κυτταρική σειρά Capan-2 (ATCC, ΗΤΒ-80) καλλιεργήθηκε όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [20]. κύτταρα ErbB2-KD ελήφθησαν ακόλουθη σταθερή επιμόλυνση των κυττάρων Capan-2 με pGeneClip ™ φορέα πουρομυκίνη κωδικοποιεί ErbB2 shRNA (SA Biosciences ™). Σταθερή επιμόλυνση 1 μg διασπασμένου από ScaI πλασμιδίου διεξήχθη με Effectene® (Qiagen, Courtaboeuf, Γαλλία) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το κενό φορέα χρησιμοποιήθηκε για την αύξηση των κλώνων ελέγχου που ονομάζεται μη Στόχευση (ΝΤ). Επιλογή διεξήχθη χρησιμοποιώντας Πουρομυκίνης (0,1 μg /ml, InvivoGen, Λιμόζ, Γαλλία) και οι κλώνοι απομονώθηκαν με περιορισμένη σειριακή αραίωση. MUC4-Knocked Down κύτταρα (KD) ελήφθησαν με ρετροϊική μόλυνση των κυττάρων Capan-2 με pRetroSuper πλασμίδιο (SA Biosciences ™) που περιέχει μια αλληλουχία στόχευσης MUC4 (5′-AAGTGGAACGAATCGATTCTGTTCAAGAGACAGAATCGATTCGTTCCACTT-3 ‘). Το κενό φορέα χρησιμοποιήθηκε για την αύξηση των κλώνων ελέγχου που ονομάζεται

Mock

. Επιλογή διεξήχθη χρησιμοποιώντας G418 /γενετικίνη (300 μg /ml, Invitrogen, Cergy Pontoise, France) και οι κλώνοι απομονώθηκαν με αραίωση αύξοντα όριο.

κηλίδωση Western

κυτοσολίου, πυρηνικών και συνολική κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στο Van Seuningen

et al.

[21] και Jonckheere

et al.

[22], αντιστοίχως και διατηρούνται στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη (2 μΙ πυρηνικών εκχυλισμάτων) μετρήθηκε σε πλάκες 96 φρεατίων χρησιμοποιώντας την μέθοδο δικιγχονινικού οξέος, όπως περιγράφεται στο εγχειρίδιο οδηγιών του κατασκευαστή (Pierce). Κηλίδωση Western διεξήχθη σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (0,2 μm, Schleicher και Schuell) όπως περιγράφεται προηγουμένως [23]. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα εναντίον ErbB-2 (κλώνος Ab-1, αραίωση 1/500), p27kip1 (αραίωση 1/500) από Lab Vision Neomarker, USA? φωσφο-P42 /44MAPK (Thr202 /Tyr204) (κλώνος 20G11, αραίωση 1/500), Ρ42 /44MAPK (κλώνος I37F5, αραίωση 1/500), φωσφο-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) (# 9251, αραίωση 1 /500), SAPK /JNK (κλώνος 56G8, 1/500), φωσφο-p38MAPK (Thr180 /Tyr182) (κλώνος D3F9, 1/1000), p38MAPK (# 9212, αραίωση 1/1000), ΡΑΚ (# 3285, αραίωση 1 /1000), φωσφο-Akt (Ser473) (κλώνος D9E, 1/1000), Akt (κλώνος C67E7, αραίωση 1/1000), κυκλίνη D1 (κλώνος DCS6, αραίωση 1/500), EGFR (# 2232, αραίωση 1 /500), όλα από την Cell Signaling Technology, USA? ErbB-3 (κλώνος C-17, 1/500), ErbB-4 (κλώνος C-18, αραίωση 1/500), ΜΜΡ2 (κλώνος Η-76, αραίωση 1/500), ΜΜΡ9 (κλώνος 6-6B, αραίωση 1/500), Bcl-xL (κλώνος Η-5, αραίωση 1/500), Βαχ (κλώνος Ν-20, αραίωση 1/500), MUC4 (8G7, αραίωση 1/500) όλα από Santa Cruz Biotechnology, USA? MUC1 (Μ8, γενναιόδωρο δώρο από τον Dr D. Χελιδόνι, Λονδίνο), ή β-ακτίνης (A5441, αραίωση 1/5000) από την Sigma, Γαλλία. Αντισώματα αραιώθηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει 5% (β /ο) μη λιπαρό ξηρό γάλα και Tween-20 (ΤΒδ-Τ), εκτός από MUC4 και β-ακτίνη και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C πριν από την επεξεργασία με ανοσοχρώση. Η συζευγμένη υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα (Sigma) χρησιμοποιήθηκαν και ανοσοαντιδραστικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το χημικο-ακτινοβόλα υπόστρωμα West Pico (Perbio, Brebieres, France). Χημειο-φωταύγεια οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας LAS4000 συσκευής (Fujifilm) και τα αποτελέσματα ενσωματώθηκαν χρησιμοποιώντας Gel αναλυτής software® (Claravision). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

συνανοσοκαθίζηση του MUC4-ErbB2 συγκρότημα

150 μg του Capan-2 κυτταρικό εκχύλισμα επωάστηκαν όλη τη νύκτα με 1,5 μg του αντισώματος αντι-ΕτοΒ2 (κουνελιού πολυκλωνικό, Ab-1, Thermo Scientific). Η πρωτεΐνη Α ομοιοπολικά συνδεδεμένο σε σφαιρίδια με σταυροειδείς δεσμούς 4% αγαρόζη (Sigma, Γαλλία), εξισορροπημένη με 1 χ ρυθμιστικό σύνδεσης (200 mM Tris-HCl ρΗ 7.5 που περιέχει 1 Μ NaCl, 20 mM EDTA, και 2% ΝΡ40 (ν /ν)) και προστέθηκε στο λύμα-αντισώματος μίγμα και επωάζονται σε μια περιστρεφόμενη πλατφόρμα για 2 ώρες στους 4 ° C. Σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης 1 ×. IgGs κουνελιού (Millipore) χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Τα πλυμένα σφαιρίδια στη συνέχεια αναμίχθηκαν με 2 χ SDS ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης πήγματος πριν ηλεκτροφόρηση σε 2% (w /v) πήκτωμα αγαρόζης και ανοσοκηλίδωση όπως περιγράφεται προηγουμένως [23].

Κατασκευή του GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 πρωτεΐνη σύντηξης

το cDNA που κωδικοποιεί το MUC4

EGF3 + 1 + 2 αλληλουχία ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας έναν FLAG επίτοπο-tagged εκδοχή της υπομονάδας MUC4β [16] που ονομάζεται MUC4F2-CF2 ως ο πρότυπο και F_EGF3 (5′-CGCGGATCCGCCTGTGAGGAGCCG-3 ‘) και R_EGF1 (5′-TCCCCCGGG TCAGAAGCAGCGGCTGTC-3’) ως πριμοδότες. Το προϊόν PCR που κωδικοποιεί MUC4

EGF3 + 1 + 2 αφομοιώθηκε από

BamHI

και

SmaI

και εισάγεται σε pGEX-4Τ1 (GE Lifesciences). Η pGEX-4Τ1-GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 κατασκεύασμα στην συνέχεια μορφομετατράπηκε εντός B834pLysS

E. coli

(Novagen) χρησιμοποιώντας ηλεκτροπόρωση και

Ε. coli

αναπτύχθηκε σε μέσο Luria Bertani (Invitrogen) σε OD

600 0,8. GST-MUC4 έκφραση πρωτεΐνης

EGF3 + 1 + 2 σύντηξης στη συνέχεια επάγεται με την προσθήκη 1 mM του isopropylthiogalactopyranosyl (Ambion) στους 15 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 3800 χ g στους 4 ° C, επαναιωρήθηκε σε 60 ml ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (1 χ PBS, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1% (ν /ν) Triton Χ /100) και λύθηκαν με υπερήχους (Branson Sonifier 250). Μετά από φυγοκέντρηση (20 000 χ g, 90 λεπτά, 4 ° C), το υπερκείμενο ανακτήθηκε, και GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 διαχωρίστηκε από το προϊόν λύσης ολόκληρου κυττάρου χρησιμοποιώντας σφαιρίδια γλουταθειόνης αγαρόζης (Qiagen). Μετά σφαιρίδια πλύση με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 πρωτεΐνη σύντηξης εκλούστηκε με 40 mM ανηγμένης γλουταθειόνης σε 50 mM Tris-HCl ρΗ 8,0 ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 150 mM NaCl, 0,1% (ν /ν) Triton Χ /100 και 1 mM DTT. καθαρότητα πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με την χρώση μπλε του Coomassie μετά από ένα 12% SDS-PAGE. Η καθαρισμένη πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι 1 χ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης και αποθηκεύθηκε στους 4 ° C μέχρι τη χρήση.

GST pull-down

Η GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 φορτώθηκε σε εξισορροπημένη σφαιρίδια γλουταθειόνης (Qiagen,) όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Μετά από ολονύκτια δέσμευσης στους 4 ° C υπό την παρουσία της ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ErbB2 (5 μg, R &? Συστήματα D, Lille, France), τα σφαιρίδια γλουταθειόνης πλύθηκαν 3 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης 1 ×. Τα πλυμένα σφαιρίδια στη συνέχεια αναμίχθηκαν με 2 χ ρυθμιστικό φόρτωσης SDS και βράζεται στους 100 ° C για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο φορτώθηκε σε 6% SDS-PAGE και κηλιδώθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF. ErbB2 κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω.

συνδέτη Proximity δοκιμασία

In situ

δοκιμασίες πρόσδεσης εγγύτητα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Duolink II Red Starter Kit (Olink, Ουψάλα, Σουηδία ) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 2.5 χ 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα θάλαμο Slide permanox (Nunc, Brumath, Γαλλία) και επωάστηκαν 72 ώρες για να φτάσουν 70-80% συρροή. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν 20 λεπτά με 4% (ν /ν) παραφορμαλδεϋδη σε RT πριν από ένα στάδιο δέσμευσης με το διάλυμα αποκλεισμού για 30 λεπτά στους 37 ° C. Πρωτογενή αντισώματα έναντι MUC4 (8G7) και ErbB2 (C-18) αραιώθηκαν στο 1/50 εντός 1 χ PBS ρΗ 7.4 και επωάστηκαν για 90 λεπτά σε RT. ανιχνευτής PLA συν αντι-κουνελιού και μείον αντι-ποντικού αραιώθηκαν σε 1/5 σε αραιωτικό αντισώματος, και επωάστηκε με κύτταρα 1 ώρα στους 37 ° C μετά από δύο στάδια έκπλυσης. Η πρόσδεση και ενίσχυση διεξήχθησαν στη συνέχεια στους 37 ° C προκειμένου να απεικονίσει το σύμπλοκο. Διαφάνειες τοποθετήθηκαν με Duolink ΙΙ Τοποθέτηση Μέσο που περιέχει DAPI. Χρώσεις απεικονίστηκαν με ένα Zeiss LSM 710 συνεστιακό μικροσκόπιο (Zeiss, Jena, Germany), οι εικόνες συλλήφθηκαν και αναλύθηκαν με το λογισμικό πλοήγησης Efficient Zeiss (Zeiss, Jena, Germany).

συνεστιακή μικροσκοπία

συνεστιακή μικροσκοπία διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. MUC4 (8G7, Santa Cruz) και ErbB2 (C-18, Santa Cruz) αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1/50 σε 1 × D-PBS + Mg

2 ++ Ca

2 + (Invitrogen) που περιέχει 0,2% (w /v) σαπωνίνη και 2% (ν /ν) ορό κατσίκας. AlexaFluor® 594 κατσίκας αντι-ποντικού και AlexaFluor® 488 κατσίκας αντι-κουνελιού (Invitrogen) δευτερογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν αντιστοίχως για την ανίχνευση και την έκφραση MUC4 ErbB2.

Μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή ιδιότητες των διαφορετικών κλώνων εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας αντίστοιχα 24 θαλάμους Boyden και ελέγχου (8 μm πόρους) και οι θάλαμοι επικαλυμμένα με Matrigel® μήτρα (BD Biosciences, le Pont de Claix, Γαλλία) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκυστικό στον κατώτερο θάλαμο. 5 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν στον άνω θάλαμο και επωάστηκαν για 48 ώρες. Μετά από χρώση με DiffQuick (Mediane Diagnostics, Plaisir, Γαλλία), τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο σε μεγέθυνση × 100. Οκτώ τυχαία πεδία μετρήθηκαν όραση και το πείραμα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές.

Κυτταρομετρίας Ροής

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί 24 h πριν συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, και μετά επαναιωρήθηκαν σε 1 χ PBS. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με προσθήκη 1 ml 70% (ν /ν) αιθανόλη και η επώαση σε πάγο για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με 1 χ PBS, κατεργάστηκαν για 5 λεπτά με RNase Α (100 mg.ml

-1) και τέλος χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (50 mg.ml

-1, Sigma) για 30 λεπτά. ανάλυση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε Beckman Coulter EPICS XL3-MCL (Villepinte, Γαλλία) με τη χρήση του λογισμικού Wincycle (Phoenix Συστήματα Ροής, San Diego, CA, USA).

Η υποδόρια ξενομοσχεύματα

Η υποδόρια (SC) ξενομοσχεύματα (6 × 10

6 κύτταρα σε 150 μΐ RPMI 1640) του Capan-2 κλώνοι εγχύθηκαν με 150 μΙ του Matrigel® (ref 354262, BD Biosciences, le Pont de Claix, Γαλλία) σε severe- συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID), που εκτράφηκαν και διατηρήθηκαν υπό συνθήκες χωρίς παθογόνα (6 ποντίκια /κυτταρικό τύπο). ανάπτυξη όγκου ακολουθήθηκε περιοδικά. Ο όγκος του όγκου (mm

3) προσδιορίστηκε με υπολογισμό V = W

2 χ L /2 στον οποίο το W αντιστοιχεί στο πλάτος (σε mm) και L προς το μήκος του όγκου (σε mm). Τα ποντίκια θανατώθηκαν 55 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. Όλες οι διαδικασίες ήταν, σύμφωνα με την κατευθυντήρια γραμμή και έχει εγκριθεί από την επιτροπή φροντίδα των ζώων (Comité Ethique πειραματισμός Animale Nord-Pas-de-Calais, άδεια /αριθμός πρωτοκόλλου: AF042008). Για κάθε όγκο SC, ο ιστός είχε καθοριστεί σε φορμόλη πριν από παραφίνη ένταξης. Τα ποντίκια που παρουσιάζουν τα χαρακτηριστικά του πόνου (απώλεια βάρους, καχεξία, ανόρθωση των τριχών) ή φέρουν όγκου επίτευξη ενός εκατοστού

3 θυσιάστηκαν.

Η ανοσοϊστοχημεία

SC ξενομοσχεύτηκε ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε 10% (w /v) ρυθμισμένη φορμαλδεΰδη, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη, κόβονται σε πάχος 4 μm και εφαρμόζεται σε SuperFrost® διαφάνειες (Menzel-Glaser, Braunschweig, Germany). Διαφάνειες στη συνέχεια βάφτηκαν με αιματοξυλίνη-Eosin-Saffron-Astra μπλε. Εγχειρίδιο ανοσοϊστοχημεία (IHC) διεξήχθη όπως περιγράφεται στο Van der Sluis

κ.ά.

[25] και την αυτόματη IHC με ένα αυτοματοποιημένο ανοσοκηλιδωτή (ES, Ventana Medical System, Στρασβούργο, Γαλλία) όπως στο Mariette

et al

[26]. Τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως ακολούθως:. 1:200 αραίωση των αντι-ErbB2 (DAKO), 1:100 αντι-MUC4 8G7 (Santa Cruz Biotechnology) και 1:50 αντι-MUC1 M8

DNA μικροσυστοιχιών ανάλυση

συγκριτικές αναλύσεις μεταγραφικό διεξήχθησαν σε τέσσερις MUC4-KD και τέσσερις ErbB2-KD κυτταρικών κλώνων. Αυτοί συγκρίθηκαν με μια ομάδα από τέσσερα Mock και τέσσερα NT κυτταρικών κλώνων, αντιστοίχως. της ποιότητας του RNA ελέγχθηκε με τη χρήση της Agilent 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies, Massy, ​​Γαλλία). δείγματα cRNA συντέθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ χαμηλής RNA εισόδου φθορισμού γραμμική ενίσχυση (Agilent). Ο υβριδισμός του Cy3 και Cy5 επισημασμένα cRNA πραγματοποιήθηκε στην ανθρώπινη 44 K pangenomic 60 μερές ολιγονουκλεοτίδιο μικροσυστοιχία (Agilent) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μικροσυστοιχίες σαρώθηκαν με τη χρήση του σαρωτή G2505C και χαρακτηριστικό γνώρισμα του λογισμικού Εξαγωγή Agilent (v10.5). Τα δεδομένα επεξεργάστηκαν με το λογισμικό GeneSpring (V10) για την εξομάλυνση, το φιλτράρισμα, και στατιστική ανάλυση. Τα γονίδια ρυθμίζεται προς τα πάνω ή προς τα κάτω ρυθμισμένη (πάσο αλλαγή & gt? 5) με στατιστική σημαντικότητα (P & lt? 0,05) ταξινομήθηκαν χρησιμοποιώντας ασυμπτωτική υπολογισμού αξίας P. Όλα τα δεδομένα είναι MIAME συμμορφώνεται. Τα ακατέργαστα δεδομένα έχει κατατεθεί στη γονιδιακή έκφραση Omnibus (GEO, αριθμός πρόσβασης: GSE31322).

qRT-PCR

Ολικά RNAs από παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ NucleoSpin® RNA II ( Macherey Nagel) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. cDNAs παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ SsoFast ™ Evagreen Supermix ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με τη χρήση του συστήματος σε πραγματικό χρόνο PCR CFX96 (Biorad). Primer πληροφορίες δίνονται στον πίνακα S1.

Η στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Graphpad Prism 4.0 λογισμικό (Graphpad λογισμικά Inc., La Jolla, USA). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. Οι διαφορές στην μέση τιμή δύο δείγματα αναλύθηκαν από το σπουδαστή

t

δοκιμής ή ένας τρόπος ANOVA τεστ με επιλεγμένα σύγκριση χρησιμοποιώντας HSD post-hoc τεστ Tukey για τις διαφορές μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε σημαντική και έγιναν σημειώνονται με *. ** Υποδεικνύει ρ & lt? 0,01, *** υποδεικνύει ρ & lt? 0.001. Οι διαφορές της έκτακτης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμή πλατεία Chi.

Αποτελέσματα

MUC4 και ErbB2 αλληλεπιδρούν φυσικά στο Capan-2 καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

Ανοσοκαταβύθιση Capan-2 κυτταρικό εκχύλισμα με αντι-ΕτοΒ2 πραγματοποιήθηκε πριν ανοσοστύπωμα με αντι-MUC4 αντίσωμα. MUC4 ανοσοχρώση δείχνει ότι MUC4 συν-ανοσοκαταβυθίζεται με ErbB2 σε Capan-2 κύτταρα (Σχήμα 1Α, λωρίδα 1). Ειδικότητα της αλληλεπίδρασης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας άσχετο IgGs κουνελιού που δεν έδειξαν άνοσο ζώνη (λωρίδα 2). Για να δείξει μια άμεση φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ MUC4 και ErbB2, πρώτα πραγματοποιείται μια δοκιμασία pull-down GST. Για αυτό, κάναμε μια GST-MUC4

πρωτεΐνη EGF3 + 1 + 2 σύντηξης, η οποία περιέχει τις τρεις περιοχές τύπου EGF της MUC4. Στη συνέχεια παρασκευάζονται δύο στήλες συγγένειας που φέρουν είτε το GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 πρωτεΐνη σύντηξης ή το GST μόνη της στην οποία φορτώθηκε ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ErbB2. Μετά χρωματογραφία συγγένειας, αντι-ErbB2 ανοσοστύπωμα έδειξε μία συγκεκριμένη ζώνη ErbB2 για τη στήλη σφαιρίδια γλουταθειόνης που φέρει το GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 πρωτεΐνη σύντηξης (Σχήμα 1Β, λωρίδα 1). Καθόλου ζώνες δεν παρατηρήθηκαν για το GST γλουταθειόνης έδρανο στήλη μόνο (λωρίδα 2).

(Α) Συν-ανοσοκαταβύθιση 150 μg του Capan-2 κυτταρικό εκχύλισμα με αντι-ΕΛΒ2 (λωρίδα 1) ή IgGs κουνελιού ( λωρίδα 2). εκχύλισμα Capan-2 κυττάρων μόνο (λωρίδα 3). (Β) ErbB2 ανοσοκηλίδα GST pull-down της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης πρωτεΐνης ErbB2 με GST-MUC4 σφαιρίδια

EGF3 + 1 + 2 γλουταθειόνη (λωρίδα 1) ή σφαιρίδια GST γλουταθειόνης (λωρίδα 2). Η ανασυνδυασμένη ErbB2 μόνο του (λωρίδα 3). (C)

Σε δοκιμασία συνδέτη εγγύτητας situ

σε κύτταρα Capan-2. Οι MUC4 και ErbB2 συγκροτήματα (κόκκινες κουκκίδες) υποδεικνύεται με ένα βέλος. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας DAPI. πείραμα ελέγχου διεξήχθη σε απουσία πρωτογενούς αντισώματος. (Δ) την ανίχνευση ανοσοφθορισμού MUC4 (κόκκινο) και ErbB2 (πράσινο) με συνεστιακή μικροσκοπία έδειξε συν-εντοπισμό των δύο πρωτεϊνών (κίτρινο). (Ε) Έκφραση MUC4 και ErbB2 σε δύο αντιπροσωπευτικά κλώνους κυττάρων MUC4-KD και ErbB2-KD και των αντίστοιχων ελέγχων τους (Mock και NT) με κηλίδωση Western.

Η

Η αλληλεπίδραση μεταξύ MUC4 και ErbB2 ήταν τότε επιβεβαιωθεί χρησιμοποιώντας μια άλλη προσέγγιση, η οποία είναι η

in situ

δοκιμασίες εγγύτητας απολίνωση (PLA). Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι MUC4 και ErbB2 σχηματίζουν ένα ενδογενές σύμπλεγμα σε κύτταρα Capan-2 (κόκκινες κουκκίδες, βέλη, Σχήμα 1 C). Τέλος, συνεστιακή μικροσκοπία μελέτες επιβεβαίωσαν την συν-εντοπισμό των MUC4 και ErbB2 σε Capan-2 κυττάρων (Σχήμα 1D). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι MUC4 και ErbB2 σωματικά αλληλεπιδρούν σε Capan-2 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα

μέσω

MUC4

EGF3 + 1 + 2 περιοχή που περιέχει τα τρία πεδία τύπου EGF. Στη συνέχεια ανέλαβε να προσδιορίσει τους κυτταρικούς μηχανισμούς και τις ενδοκυττάριων οδών σηματοδότησης, υπό τον έλεγχο και των δύο εταίρων.

Δημιουργία και χαρακτηρισμός των σταθερών ErbB2-KD και MUC4-KD κυτταρικών κλώνων

Οι πέντε ErbB2- KD και επτά MUC4-KD κυτταρικών κλώνων έδειξε αντίστοιχα σχεδόν πλήρης ή ολική αναστολή ErbB2 και έκφραση MUC4 σύγκριση με τους μάρτυρες κλώνους (Εικόνα 1 Ε). Η ανάλυση στυπώματος Western ενός άλλου βλεννίνης συνδεδεμένου με μεμβράνη που είναι σημαντικό στον καρκίνο, MUC1, έδειξαν ότι η αναστολή της MUC4 εξασθενημένη δραματικά εκείνη της MUC1 ενώ η αναστολή του ErbB2 δεν είχε καμία επίδραση (Σχήμα S1). Όταν εξετάσαμε την έκφραση των τριών άλλων μελών της οικογένειας υποδοχέα ErbB, η αναστολή της MUC4 ή έκφραση ErbB2 οδήγησε σε ισχυρή μείωση του ErbB2 και ErbB3 (MUC4-KD) και του ErbB3 (ErbB2-KD), αντίστοιχα, ενώ δεν επίδραση ανιχνεύθηκε για ErbB1 και ErbB4 (Σχήμα S1).

ο ρόλος της ErbB2 και MUC4 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την απόπτωση

κύτταρα MUC4-KD εμφάνισε μειωμένο πολλαπλασιασμό από 48 ώρες που διατηρήθηκε στους 72 h και έγινε σημαντική στις 96 ώρες (44% λιγότερο από Mock κύτταρα, ρ & lt? 0,05). κύτταρα ErbB2-KD ήταν επίσης λιγότερο πολλαπλασιαστική με σημαντική μείωση του 27% σε 96 ώρες (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 2Α). Μια ισχυρή διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 φάση (54,5% ± 0,13) παρατηρήθηκε σε κύτταρα MUC4-KD όταν συγκρίνονται με Mock κύτταρα (37,4% ± 7,2, *, ρ = 0,016) (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, η φάση G2M ήταν πολύ μικρότερη σε κύτταρα MUC4-KD (20,9% ± 4,7) σε σύγκριση με Mock κύτταρα ελέγχου (39,6% ± 6,7, **, ρ = 0.0035) (γενικό *, ρ = 0.0102). Σε κύτταρα ErbB2-KD, μια τάση προς μια διακοπή του κυτταρικού κύκλου στις G1 σημειώθηκε επίσης ότι παρέμενε στατιστικά μη σημαντική (p = 0,119) (Σχήμα 2Β). Για τον εντοπισμό των μηχανισμών που ευθύνονται για αυτήν μεταβολή στον πολλαπλασιασμό, έκφραση των δεικτών του κυτταρικού κύκλου εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western (Σχήμα 2C). Σαφώς, μειωμένο πολλαπλασιασμό σε κύτταρα MUC4-KD συνδέθηκε με καταστολή της κυκλίνης D1. Στα κύτταρα ErbB2-KD, μειωμένο πολλαπλασιασμό συνδέθηκε τόσο με την αυξημένη έκφραση του p27

kip1 αναστολέα του κυτταρικού κύκλου και μείωση της κυκλίνης D1 (Σχήμα 2D), γεγονός που υποδηλώνει μια κυτταρική σύλληψη στο σημείο ελέγχου του πολλαπλασιασμού G1 /S.

(Α) η ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε με μέτρηση κυττάρων σε 24, 48, 72 και 96 h για Capan-2-MUC4 KD ή ErbB2-KD και των αντίστοιχων τους ελέγχους τους (Mock και ΝΤ). * = P & lt? 0.05 χρησιμοποιώντας φοιτητής

t-test

. (Β) προφίλ διανομής κυτταρικού κύκλου του MUC4-KD, ErbB2-KD και οι κλώνοι έλεγχό τους (Mock και ΝΤ) με κυτταρομετρία ροής μετά από επώαση με προπίδιο iodure. Οι τιμές εκφράζονται ως ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * = P & lt? 0,05 χρησιμοποιώντας πλατεία τεστ Chi. ns = μη σημαντική. (C) Επίδραση της MUC4 ή ErbB2 αποσιώπηση αναλύθηκε σε κυτταρικό κύκλο κυκλίνης δείκτη D1 και p27

kip1 με κηλίδα western. β-ακτίνη μετρήθηκε ως εσωτερικό έλεγχο. (D) Συγκροτήματα ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία. Τα ιστογράμματα του λόγου (D1 κυκλίνης ή p27

kip1 /β-ακτίνη) εμφανίζεται. (Ε)% του πληθυσμού subG1 MUC4-KD, ErbB2-KD και τους ελέγχους (Mock και ΝΤ, αντίστοιχα) προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από επώαση με προπίδιο iodure (* = ρ & lt? 0,05). (F) στύπωμα Western διεξήχθησαν για διασπασμένης κασπάσης 3, Bcl

XL και Bax σε MUC4-KD, ErbB2-KD και των αντίστοιχων τους ελέγχους τους (Mock και ΝΤ). β-ακτίνη αξιολογήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. (G) ιδιότητες Μετανάστευσης της MUC4-KD, ErbB2-KD και οι κλώνοι ελέγχου (Mock και ΝΤ) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Boyden θαλάμων. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος αριθμός μεταναστευτικών κυττάρων ανά οπτικό πεδίο (*** = Ρ & lt? 0.001, ns = μη σημαντική). (H)% της εισβολής (επεμβατική κύτταρα /μεταναστευτικά κύτταρα) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας θαλάμους Boyden επικαλυμμένα με Matrigel®.

Η

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον MUC4 ή ErbB2 αναστολή θα μπορούσε επίσης να επηρεάσει την απόπτωση, η μέτρηση των αποπτωτικών κυτταρικό πληθυσμό ( subG1 κύτταρα) με κυτομετρία ροής διεξήχθη (Σχήμα 2Ε). Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική αύξηση του πληθυσμού subG1 (13,33% ± 2,1) σε κύτταρα ErbB2-KD όταν συγκρίνεται με κλώνους ελέγχου ΝΤ (6,2% ± 0,4) (*, ρ = 0.017). Στα κύτταρα MUC4-KD, υπάρχουν διαφορές στον πληθυσμό των κυττάρων subG1 παρατηρήθηκαν σε σύγκριση με Mock κλώνους ελέγχου (ns, p = 0,19). Έκφραση των αποπτωτικών δεικτών με ανοσοκηλίδωση έδειξε ότι Βαχ και Bcl

XL είχαν δεν μεταβάλλονται στα δύο κύτταρα MUC4-KD και ErbB2-KD, ενώ παρατηρήθηκε αύξηση της διασπασμένης κασπάσης-3 σε κύτταρα ErbB2-KD (Σχήμα 2F).

ο ρόλος της MUC4 και ErbB2 στην κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή /πρόσφυση

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος της MUC4 και ErbB2 στην κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή, τα πειράματα διεξήχθησαν σε θαλάμους Boyden με ή χωρίς επικάλυψη Matrigel®, αντίστοιχα . Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι παρατηρήθηκε σημαντική μείωση του αριθμού των μεταναστευτικών κυττάρων σε κύτταρα MUC4-KD (37,8 ± 1,5) σε σύγκριση με Mock κύτταρα (60.1 ± 3.3) (p≤0.001), ενώ δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά στα κύτταρα ErbB2-KD (53,5 ± 8,8) σε σύγκριση με κλώνους NT ελέγχου (56,2 ± 6,3) (Σχήμα 2G). Όταν μετρήσαμε διεισδυτικότητα, κύτταρα MUC4-KD εμφανίστηκε σημαντικά περισσότερο επεμβατικές (41,8% ± 1,5, η = 7) από κύτταρα που εκφράζουν MUC4 (mock) (19,5% ± 1,5, η = 5) (ρ = 0.029) (Σχήμα 2Η). ErbB2-KD κλώνους, από την άλλη πλευρά, ήταν ελαφρώς λιγότερο επεμβατικές (9,4% ± 1,15) από ό, τι τα κύτταρα που εκφράζουν ErbB2 (NT, 14,14% ± 2,1), αλλά η μείωση αυτή δεν ήταν σημαντική (ρ = 0,09). Η ικανότητα των MUC4-KD και τα κύτταρα ErbB2-KD να προσκολλώνται σε Matrigel® (κατασκευασμένο από δύο συνιστώσες του παγκρεατικού εξωκυττάριας μήτρας κολλαγόνου IV και λαμινίνη) ή κολλαγόνο Ι αξιολογήθηκε επίσης αλλά δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές για είτε κύτταρα (δεν δείχνεται) .

Ο ρόλος της ErbB2 και MUC4 στην ενδοκυτταρική σηματοδότηση

Ο αντίκτυπος της ErbB2 ή MUC4 για τα σημαντικότερα μονοπάτια της ενδοκυτταρικής σηματοδότησης μελετήθηκε από κηλίδωση Western για: ΜΑΡΚ (Ρ42 /44, p38 και JNK ), Akt, και Focal Adhesion Kinase (ΡΑΚ) (Σχήμα 3 και Σχήμα S2). Η φωσφορυλίωση του ρ42 /ρ44 ΜΑΡΚ ήταν εντελώς καταργήθηκε σε κύτταρα ErbB2-KD σύγκριση με κλώνους ελέγχου NT, υποδεικνύοντας πλήρη αναστολή αυτής της οδού μετά την ErbB2 σίγηση. Σε κύτταρα MUC4-KD σύγκριση με mock κλώνους, συστατική ρ42 /ρ44 ΜΑΡΚ μειώθηκε ενώ φωσφορυλιωμένη ρ42 /44 αυξήθηκε προτείνοντας μια ενεργοποίηση της οδού ΜΑΡΚ που συνδέεται με την καταστολή MUC4.

(Α) αναλύσεις κηλίδος Western διεξήχθησαν επί κυτοσολικό εκχύλισμα MUC4-KD, ErbB2-KD και τους ελέγχους (Mock και ΝΤ αντίστοιχα) για την έκφραση και των δύο φωσφορυλιωμένων και συστατική μορφές ρ42 /ρ44, JNK και ρ38 ΜΑΡΚ. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι δύο αντιπροσωπευτικές κλώνοι που παρουσιάζονται. (Β) Συγκροτήματα ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία. Τα ιστογράμματα του λόγου (φωσφορυλιωμένη /συστατική μορφή) για ρ42 /ρ44, JNK και p38 ΜΑΡΚ κινάσες φαίνεται.

Η

Όταν κοιτάξαμε το μονοπάτι JNK, συνολικά καταστολή της φωσφορυλίωσης της JNK παρατηρήθηκε σε MUC4 -KD κλώνους σε σύγκριση με Mock ελέγχους που υποδηλώνει ότι η έκφραση MUC4 δραματικά τις επιπτώσεις δράση JNK οδό. Καμία επίδραση επί της οδού JNK παρατηρήθηκε σε ErbB2-KD κλώνων. μονοπάτι ρ38 ΜΑΡΚ δεν φάνηκε να μεταβάλλεται σημαντικά μετά είτε ErbB2 ή MUC4 σίγηση (Σχήμα 3). Ομοίως, Akt και ΡΑΚ πορείες δεν ήταν σημαντικά τροποποιημένο (Εικόνα S2).

Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η απώλεια των MUC4 και ErbB2 μειώνει δραματικά JNK και ρ42 /44 ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης, αντίστοιχα.

Επίδραση της ErbB2 και MUC4 σχετικά με τις ιδιότητες του όγκου

in vivo

Η

για να επιβεβαιώσετε

in vitro

δεδομένων των MUC4 και ErbB2 επιπτώσεις στις ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων, μελέτες ξενομοσχεύματος SC διεξήχθησαν . Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο όγκος του όγκου ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ξενομοσχευμένο ποντίκια με M4-2-1 ή M4-2-10 κλώνους την ημέρα 22 (Σχήμα 4Α), στην οποία απουσία του MUC4 επιβεβαιώθηκε με IHC (Σχήμα 4Β). Μείωση της έκφρασης ErbB2 προηγουμένως δείξει

in vitro

με κηλίδωση Western και επιβεβαιώθηκε

in vivo

σε MUC4-KD όγκων με IHC (Σχήμα 4Β).