Αφηρημένο

Κλωθώ εντοπίστηκε για πρώτη φορά το 1997 και έχει θεωρηθεί ως ένα αντι-γήρανσης του γονιδίου. Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι Klotho έχει μια στενή σχέση με καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, ο καρκίνος του μαστού, κλπ, με την παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού και την προώθηση της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων. Η σισπλατίνη έχει το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο φάρμακο στη χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής. Ωστόσο, η αύξηση σε cisplatin ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα έχει γίνει ένα σημαντικό εμπόδιο στην κλινική διαχείριση των καρκίνων. Στη μελέτη μας, για πρώτη φορά, έδειξε ότι θα μπορούσε να εξασθενήσει Klotho την αντίσταση του καρκίνου του πνεύμονα σε σισπλατίνη χημειοθεραπεία με βάση και την απόπτωση των ανθεκτικών κυττάρων με Klotho υπερέκφραση ήταν σημαντικά αυξημένη. Ωστόσο, Klotho knockdown κυττάρων έδειξαν αυξημένη αντίσταση στη χημειοθεραπεία. Περαιτέρω ανάλυση έδειξε ότι η αναστολή των PI3K /Akt μονοπατιού με ειδικό αναστολέα (LY294002) εξασθενεί τις προωθητικές επιδράσεις στην ανάπτυξη του καρκίνου μετά από παρέμβαση Κλωθώ shRNA. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι Klotho διαμορφωμένο την αντίσταση στη σισπλατίνη σε ένα γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικούς. Οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν ότι Klotho θα μπορούσε να βελτιώσει την αντίσταση του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων σε χημειοθεραπεία και μπορεί να χρησιμεύσει ως ένας πιθανός στόχος για την γονιδιακή θεραπεία των καρκίνων του πνεύμονα ανθεκτικό σε σισπλατίνη χημειοθεραπεία με βάση

Παράθεση:. Wang Υ, Chen L, Huang G, Ο Δ Ο J, Xu W, et al. (2013) Κλωθώ ευαισθητοποιεί τον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα γραμμή με Cisplatin μέσω PI3K /AKT οδό. PLoS ONE 8 (2): e57391. doi: 10.1371 /journal.pone.0057391

Επιμέλεια: Devanand Sarkar, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Ιουν, 2012? Αποδεκτές: 24 Γενάρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 21 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30971320). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει 75-85% των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα και τη χημειοθεραπεία παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα [1]. Η σισπλατίνη έχει το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο φάρμακο στη χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής. Σισπλατίνη μπορεί να ενεργοποιήσει αρκετές οδούς σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων που αφορούν ATR, p53, p73, και ΜΑΡΚ και ενεργοποίηση της απόπτωσης [2], [3]. κυτταροτοξικότητα του αποδίδεται στο σχηματισμό προϊόντων προσθήκης DNA, τα οποία προκαλούν δια- και ενδο-κλώνου εγκάρσια σύνδεση η οποία αναστέλλει την αντιγραφή του DNA. Ωστόσο, η αντίσταση του καρκίνου του πνεύμονα στη χημειοθεραπεία υπήρξε ένας σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει την θεραπευτική αποτελεσματικότητα στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. Έτσι, είναι επιτακτική ανάγκη να αναπτύξουν στρατηγικές για τη βελτίωση της αντοχής του ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα σε πλατίνη χημειοθεραπείας που βασίζεται. Ο μηχανισμός βασίζεται η αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία είναι πολύπλοκη και εμπλέκει την ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /Akt (επίσης γνωστή ως ΡΙ3Κ /ΡΚΒ) οδού, την απώλεια της λειτουργίας ρ53, υπερ-έκφραση του HER-2 /neu και αντι-αποπτωτικών Bcl -2, και ο ενεργοποίηση της κασπάσης σε κίνδυνο [2], [3]. Έτσι, για να ερευνήσει βαθιά του μηχανισμού βασίζεται η αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία έχει μεγάλη κλινική σημασία για την αγωγή καρκίνων.

Klotho είναι ένα πρόσφατα βρέθηκε αντι-γήρανσης γονιδίου και ταυτοποιήθηκε αρχικά σε Klotho ομόζυγα μεταλλαγμένα ποντίκια ( KL – /-) η οποία έδειξε ένα σύνδρομο που μοιάζει με ανθρώπινο σχετίζονται με τη γήρανση και ανάπτυξη πολλαπλών διαταραχών όπως ο υπογοναδισμός, εκτοπική ασβεστοποίηση, οστεοπόρωση, ατροφία του δέρματος, και το πνευμονικό εμφύσημα [4]. Ωστόσο, τα ποντίκια με Klotho υπερ-έκφραση έχουν μια εκτεταμένη διάρκεια ζωής η οποία είναι κατά 30% μεγαλύτερη στους άνδρες και 20% μεγαλύτερη στις γυναίκες [5]. Klotho γονίδιο κωδικοποιεί ένα μονής διέλευσης τύπου 1 διαμεμβράνης ή εκκρινόμενη μορφή της πρωτεΐνης μέσω Klotho εναλλακτικό μάτισμα RNA [6]. Klotho δείχθηκε να ασκεί μία ανασταλτική επίδραση στην ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας-1 (IGF-1) μονοπατιού τόσο σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και κτήνος παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [7], [8]. προηγούμενη μελέτη μας διαπίστωσε επίσης αυτό το φαινόμενο σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα (Α549 κύτταρα) στα οποία Klotho ανατίθενται επίσης ένα προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα μέσω του bcl-2 μονοπάτι bax /[9]. ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι είναι ένα από τα σημαντικά κάτω ρεύματα του IGF-1 μονοπάτι, και πολυάριθμες μελέτες έχουν επιβεβαιώσει το ρόλο της στην απόπτωση των καρκινικών κυττάρων [10] – [12]., Και θα μπορούσε να sensitisize αυτά τα καρκινικά κύτταρα για να σισπλατίνη

σε αυτή τη μελέτη, υποθέσαμε Klotho μπορούσε να αναστείλει την ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι και περαιτέρω να ανακουφίσει την αντοχή του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων στη σισπλατίνη και μπορεί να εξυπηρετεί μία ισχυρή υποψήφιο για την γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Ιατρικού Πανεπιστημίου Nanjing (Αριθμός Άδειας: 2120474). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Κυτταρική καλλιέργεια και διαμόλυνση

καρκινική κυτταρική σειρά ανθρώπινου πνεύμονα (Α549 κύτταρα) λήφθηκε από την American Type Culture Collection (ATCC). Τα κύτταρα Η460 και σισπλατίνη ανθεκτικά Α549 και Η460 (A549DDP και H460DDP) κύτταρα ευγενώς από τον καθηγητή Zhou στη Σαγκάη Πνευμονική Νοσοκομείο. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Life Technologies, Inc.), 100 U /mL πενικιλλίνη, 100 U /mL στρεπτομυκίνη, 2 mM γλουταμίνη σε μία υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2 στους 37 ° C. Για να διατηρηθεί η αντοχή φαρμάκου, Α549 /DDP και Η460 /DDP κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 που περιείχε 2 μg /ml DDP και, στη συνέχεια, σε ελεύθερη DDP RPMI 1640 δύο ημέρες πριν από τα πειράματα. A549DDP κύτταρα φθάνοντας το 80% συρροή επιμολύνθηκαν με pCMV6-MYC-KL και των ειδικών Τα siRNAs της παρουσία λιποφεκταμίνης 2000 (Invitrogen). Η Τα siRNAs ήταν ως εξής:

sh-1: CCTAAGCTCTCACTGGATCAATCCTCGAA?

sh-2: CTGAGGCAACTGCTTTCCTGGATTGACCT?

sh-3: GGTCACTCACTACCGCTTCTCCATCTCGT?

SH- 4:. GTTACAGCATCAGGCGTGGACTCTTCTAT?

Όλα τα πλασμίδια αγοράστηκαν από την ΟηΟεηε (Rockville, MD, USA)

ΜΤΤ Δοκιμασία

Η μισή μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC50) της A549DDP και Α549 κύτταρα προσδιορίζεται από την ΜΤΤ (3- [4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] -2,5-διφαινυλοτετραζολίου) δοκιμασία (Sigma). Τα καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (1 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο), και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σισπλατίνη σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 48 ώρες. Μετά την επώαση, το μέσο αντικαταστάθηκε με 50 μι του αντιδραστηρίου ΜΤΤ (2 mg /mL) που ακολουθείται από περαιτέρω επώαση σε μια ατμόσφαιρα με 5% CO

2 στους 37 ° C για 2 ώρες. Στη συνέχεια, τα μέσα απομακρύνθηκαν και διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (150 μί) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Η οπτική πυκνότητα (OD) του κάθε φρεάτιο μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών στα 560 nm.

μορφολογική εξέταση

Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 80 μΜ (IC50 για A549DDP) σισπλατίνης για 8 ώρες, και 60 μΜ για H460DDP, και στη συνέχεια πλύθηκαν μία φορά σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) ακολουθούμενη από σταθεροποίηση σε κρύο methonal: ακετόνη (1: 1) για 5 λεπτά. Μετά από έκπλυση τρεις φορές σε PBS για 5 λεπτά, τα κύτταρα αυτά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 4 μg /ml 4 ‘, 6-diamidine-2’-φαινυλινδόλης διυδροχλωρίδιο (DAPI) (Sigma) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού. Τα κύτταρα επιλέχθηκαν τυχαία για εξέταση σε μεγάλη μεγέθυνση (× 400) και φωτογραφήθηκαν. Και τα δύο φυσιολογικά κύτταρα (μεγάλα πυρηνικά, διασπορά και ομοιογενή φθορισμό) και τα αποπτωτικά κύτταρα (πυρηνική συρρίκνωση και υπερχρωματικό πυρήνες) μετρήθηκαν σε κάθε πεδίο.

Η κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και απαλά αναλυτικά σε ένα απλό εναιώρημα κυττάρου. Η χρώση έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ο ρυθμός της απόπτωσης που επάγεται από αντικαρκινικά σχήματα αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα κιτ /ΡΙ αννεξίνη V-FITC (BD Biosciences, San Diego, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, San Diego, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και ποσοτικοποιείται με μέτρηση της απορρόφησης στα 260 nm. γονιδιακή έκφραση ανιχνεύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR (qRT-PCR) χρησιμοποιώντας το πρότυπο κιτ SYBR Green RT-PCR (Takara, Dalian, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RevertAid First-Strand cDNA Synthesis (Fermentas, Βίλνιους, Λιθουανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Primer ακολουθίες σχεδιάστηκαν με ΟηΟεηε Technologies, Inc. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής:

Κλωθώ

νόημα: 5′-GCTCTCAAAGCCCACATACTG -3 ‘?

αντίθετης φοράς: 5′ -GCAGCATAACGATAGAGGCC -3 ‘?

β-ακτίνης

νόημα: 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′?

αντίθετης φοράς: 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3 ‘?

συνθήκες PCR αποτελούνταν από προ-μετουσίωση στους 94 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους μετουσίωσης στους στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, αναδιάταξη στους 60 ° C για 30 sec και επέκταση στους 72 ° C για 30 sec και μία τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά.

δοκιμασία κηλίδος Western

24 ώρες και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε παγωμένο PBS και πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από κύτταρα με λύση σε ρυθμιστικό RIPA (150 mM NaCl, 1% [ν /ν] ΝΡ-40, 0,5% [w /v] δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% [w /v] δωδεκύλ θειικό νάτριο (SDS), 50 mM Tris HCl [ ,,,0],ρΗ 8], 10 mM EDTA, και 1 mM PMSF [Sigma]) για 30 λεπτά στους 4 ° C και επακόλουθη φυγοκέντρηση για 15 λεπτά στις 12.000 g. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με κιτ BCA (Pierce) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, 60 μα πρωτεΐνης φορτώθηκε σε 10% (w /v) SDS-πολυακρυλαμιδίου, ηλεκτροφόρηση, και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη PVDF (Millipore Corporation Billerica, ΜΑ 01821), το οποίο στη συνέχεια μπλοκαρίστηκε για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με αποκλεισμό ρυθμιστικό (TBS που περιέχει 0.1% [ν /ν] Tween 20 [Sigma] και 5% [w /v] σκόνη γάλακτος). Πρωτογενή αντισώματα (εφαρμόζεται για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, ή όλη τη νύκτα στους 4 ° C) ήταν: αντι-φωσφο-Ακί, αντι-ΑΚΤ, (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, ΜΑ), αντι-Βαχ, αντι-Klotho , και αντι-GAPDH (Santa Cruz). Αντισώματα αραιώθηκαν σε 1: 1000, εκτός από το αντι-GAPDH αντίσωμα (1: 500). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 2 ώρες με συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) (αλόγου αντι-ποντικού ή κατσίκας αντι-κουνελιού? 1: 20.000). Οπτικοποίηση έγινε με τη χρήση ενός κιτ ECL, και τα σήματα ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία σάρωσης.

Μεταγωγή Lentivirus

Οι φορείς λεντοϊών που εκφράζουν σύντομο RNAs φουρκέτα (Τα siRNAs) κατασκευάστηκαν επιτυχώς με ΟηΟεηε (Rockville , MD, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως. Τα αποτελεσματικά κατασκευάζονται ακολουθίες ολιγονουκλεοτιδίων Κλωθώ-shRNA είχαν ως εξής, την αίσθηση: 5′-

CGCGTCCCC

CTGAGGCAACTGCTTTCCTGGATTGACCT

TCAAGAGAGGTCAATCCAGGAAAGCAGTTGCCTCAGTTTTTGGAAAT

-3′.

The αλληλουχίες εισήχθησαν εντός του

mul

Ι και

CLA

Ι ένζυμο θέσεις του φορέα pLVTHM, αντίστοιχα. Για την αντίδραση ανασυνδυασμό χρησιμοποιώντας pCMV-dR8.74 και φορείς pCMV-VSV-G (

Addgene

, Cambridge, ΜΑ), λεντοϊού DNAs φορέα και φορείς συσκευασιών στη συνέχεια επιμολύνονται σε κύτταρα 293Τ. Μετά από 48 ώρες διαμόλυνσης, τα υπερκείμενα που περιέχουν φακοϊούς συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν στα 1800 g για 10 λεπτά, και διηθείται μέσω ενός 0,45 μm πολυ (βινυλιδενο διφθοριούχου) μεμβράνη Durapore (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) για να απομακρυνθούν οποιαδήποτε μη προσκολλούμενα κύτταρα συσκευασίας. Ανθεκτικό πνεύμονα καρκίνο κυτταρική σειρά (A549DDP) είχε μολυνθεί με τον φακοϊό. Στη συνέχεια, τα μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη (0,4 μg /ml) για 14 ημέρες. κύτταρα A549DDP μολυνθεί με φακοϊό μεσολάβηση shRNA στόχευση Κλωθώ (sh-Κλωθώ) ή φακοϊό μεσολάβηση shRNA (αγωνίζομαι) ονομάστηκαν A549DDP-lenti-SH-2 ή A549DDP-lenti-αγωνίζομαι, αντίστοιχα.

In vivo πειράματα στο Για in vivo πειράματα, χρησιμοποιήθηκαν γυμνοί ποντικοί

Αρσενικά αθυμικά γυμνά ποντίκια (BALB /c ηυ /ηυ, ηλικίας τεσσάρων εβδομάδων). Αυτά εγχύθηκαν υποδορίως με κύτταρα A549DDP-sh-σκαρφάλωμα A549DDP-lenti-sh-2 ή. Όταν οι όγκοι μετρήθηκαν κατά μέσο όρο όγκο 100 mm3, τα ποντίκια (6 ανά ομάδα) υποβλήθηκαν σε αγωγή με σισπλατίνη (3,5 mg /kg, 2 φορές την εβδομάδα) ή PBS για 21 ημέρες. Οι όγκοι μετρήθηκαν με παχύμετρο. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν με τον ακόλουθο τύπο: όγκος (mm3) όγκο = 0,5 * μήκος (mm) * πλάτος (mm) * πλάτος (mm)

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως. μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον εις τριπλούν. Συγκρίσεις έγιναν με δοκιμή t δύο ουρών Student ή ANOVA. Η τιμή του

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

έκφραση Κλωθώ ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε σισπλατίνη resitant κύτταρα

Για να επιβεβαιώσετε η αντίσταση των κυττάρων A549DDP και H460DDP, ΜΤΤ δοκιμασία έγινε για να μετρηθεί η IC50 των κυττάρων Α549 και κύτταρα A549DDP. Τα αποτελέσματα έδειξαν το IC50 ήταν 17,7 ± 1,93 μΜ σε κύτταρα Α549 και 86,6 ± 13,2 μΜ σε κύτταρα A549DDP, ενώ H460DDP και η μητρική κυτταρική σειρά της ήταν 63,5 ± 3,8 και 27,7 ± 2,0 αντίστοιχα (Σχήμα 1Α). Η έκφραση του γονιδίου klotho προσδιορίστηκε με PCR πραγματικού χρόνου και ανιχνεύσεως κηλίδος Western. Το σχετικό επίπεδο mRNA του γονιδίου klotho σε κύτταρα A549DDP ήταν περίπου 35% χαμηλότερη από ότι σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 1Β). δοκιμασία κηλίδος Western έδειξε την ίδια τάση στην πρωτεΐνη έκφραση του γονιδίου klotho στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1 C). Επιπλέον, προσδιορίσαμε την έκφραση του γονιδίου klotho και IC50s σε άλλες κυτταρικές σειρές, περιλαμβανομένων των Η1299, PC-9, H1650 και MCF-7 (Σχήμα 1 C), και βρήκαμε ότι τα ενδογενή εκφράσεις Klotho αρνητικά που συνδέονται με σισπλατίνη ευαισθησίας (Εικ 1C) και στατιστική ανάλυση έδειξε μια αντίστροφη σχέση μεταξύ εκφράσεων Κλωθώ και τα IC50. Έτσι, πιθανολογείται ότι υπήρχε σχέση μεταξύ της έκφρασης του γονιδίου klotho και της αντίστασης στη σισπλατίνη και η έκφραση του γονιδίου klotho μπορεί να συνεισφέρει στην αντίσταση

Α:. Δύο κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη έδειξε διαφορά στην IC50. Β: Ποσοτική RT-PCR για την ανίχνευση του γονιδίου klotho έκφραση σε κύτταρα Α549 και κύτταρα A549DDP. C: Ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης του γονιδίου klotho σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου του πνεύμονα συμπεριλαμβανομένων των ανθεκτικών δύο σισπλατίνης παραλλαγές και καρκίνου του μαστού κυτταρική γραμμή (MCF-7). έκφραση Klotho είναι υψηλότερη σε γονική Η460, και Α549 κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τις ανθεκτικές παραλλαγές σισπλατίνη. Υψηλότερες έκφραση Klotho επίσης ανιχνεύθηκε σε Η1299, PC-9, H1650 και κυτταρικές σειρές MCF-7. GAPDH χρησίμευσε ως εσωτερική αναφορά. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD (* Ρ & lt? 0,05)

Η

Η υπερέκφραση του γονιδίου klotho μπορούσε να αναστείλει Akt μονοπάτι σήματος και επάγουν την απόπτωση των Α549 /κυττάρων DDP

Για τον προσδιορισμό του ρόλου του γονιδίου klotho στην σισπλατίνη αντίσταση ανθεκτικών σισπλατίνη κυττάρων, ανιχνεύσαμε για πρώτη φορά το p-ΑΚΤ έκφραση στο Α549, Η460 και ανθεκτικά κύτταρα σισπλατίνη τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του φωσφορυλιωμένου Akt μειώθηκε σημαντικά στα κύτταρα Α549 και Η460 (Σχήμα 2Α). Στη συνέχεια, τα καρκινικά κύτταρα με Klotho υπερ-έκφραση παρασκευάστηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ, τα πρωτεϊνικά εκφράσεις Klotho σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές αυξήθηκαν σημαντικά μετά την επιμόλυνση. Η επίδραση της Klotho υπερ-έκφραση της αντοχής των Α549 κυττάρων /DDP και Η460 /DDP να σισπλατίνη προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Τα δεδομένα δείχνονται στο Σχήμα 2Β. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων επιμολυσμένων με Klotho κατεστάλη σημαντικά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Οι μέσες IC50s ήταν χαμηλότερες στην Klotho επιμολυσμένα κύτταρα υποδηλώνοντας ότι αυτά τα κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα στη σισπλατίνη. Επιπλέον, η έκφραση του φωσφορυλιωμένου Akt αρνητικά που συνδέονται με την έκφραση του γονιδίου klotho, τα κύτταρα με Klotho υπερ-έκφραση έδειξαν μειωμένη έκφραση του φωσφορυλιωμένου Akt σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 2C). Στη συνέχεια, θα ανιχνεύσει την απόπτωση των κυττάρων που υποβάλλονται σε επιμόλυνση Κλωθώ. χρώση ϋΑΡΙ είναι μια μέθοδος για την ανίχνευση της απόπτωσης. Αποπτωτικών κυττάρων θα παρουσιάσει μορφολογικά τα χαρακτηριστικά της απόπτωσης μετά DAPI χρώση: φωτεινό πυρηνική συμπύκνωση και περιπυρηνικά αποπτωτικά σώματα. Η κυτταρομετρία ροής είναι μια τεχνική για τη μέτρηση, την εξέταση και διαλογή μικροσκοπικά σωματίδια που αιωρούνται σε ένα ρεύμα ρευστού. Επιτρέπει την ταυτόχρονη πολυπαραμετρική ανάλυση των φυσικών ή χημικών χαρακτηριστικών του ενιαίου κυττάρων που ρέει μέσω μιας συσκευής ηλεκτρονικής ανίχνευσης, και χρησιμοποιείται συνήθως για την ανίχνευση της απόπτωσης. δοκιμασία κηλίδος Western αποκάλυψε ότι η έκφραση του Βαχ και Bcl-2 είχε τις ίδιες τάσεις σε εκείνους στην κυτταρομετρία ροής και χρώση ϋΑΡΙ (Σχήμα 2D). Η χρώση ϋΑΡΙ έδειξε τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων με Klotho υπερ-έκφραση αυξήθηκε δραματικά σε σύγκριση με εκείνους που υποβάλλονται σε επιμόλυνση με κενό πλασμίδιο, αλλά η απόπτωση των κυττάρων σε επεξεργασία με κενό πλασμίδιο ήταν συγκρίσιμη με εκείνη του ελέγχου (Σχήμα 2Ε). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι η απόπτωση των κυττάρων A549DDP επιμολυσμένα με Klotho ήταν 47%, ενώ H460DDP ήταν 19,8%, πράγμα που σημαίνει ότι ήταν περισσότερο ευαίσθητοι στην σισπλατίνη, συγκριτικά με τους αρνητικούς μάρτυρες (Σχήμα 2F). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι Klotho θα μπορούσε να αυξήσει την ευαισθησία των ανθεκτικών κυττάρων cisplatin να σισπλατίνη με αύξηση της απόπτωσης σε ένα τρόπο που εξαρτάται από Akt

Α, Β:. Δοκιμασία κηλίδος Western έδειξε το ρ-Akt έκφραση ενισχύθηκε σημαντικά στα κύτταρα ανθεκτικά στη σισπλατίνη. C: δοκιμασία ΜΤΤ έδειξαν μια μεγάλη μείωση στην IC50 του Κλωθώ επιμολυσμένων κυττάρων. D: δοκιμασία κηλίδος Western έδειξε την αυξημένη έκφραση του γονιδίου klotho σε ανθεκτικά κύτταρα σισπλατίνη. P-Akt έκφραση κάτω-ρυθμίζονται σε ανθεκτικά κύτταρα σισπλατίνη μετά την επιμόλυνση Κλωθώ. GAPDH χρησίμευσε ως εσωτερική αναφορά. Πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD (* Ρ & lt? 0,05)

Η

Περαιτέρω, ερευνήσαμε το φαινότυπο των κυττάρων ανθεκτικών στα φάρμακα και τα μητρικά κύτταρα, και βρήκαμε ότι το ERCC1 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω στα Klotho επιμολυσμένα κύτταρα, ενώ το ρ-αρ, ένα γονίδιο που σχετίζονται με την εκροή του φαρμάκου, και συνέβαλαν στην πιο σισπλατίνη αντίσταση, δεν επηρεάστηκε από Klotho (Σχήμα 2C). Αυτά τα αποτελέσματα να εννοηθεί ότι η Κλωθώ μπορεί να επηρεάσει την επισκευή των κυττάρων μέσω ERCC1 να μεταβάλει την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων και όχι την αύξηση της ενεργειακής εξαρτώμενη εκροή υδρόφοβων φαρμάκων.

Κλωθώ νοκ ντάουν ανέστειλε την απόπτωση και αυξημένη αντοχή στην σισπλατίνη σε Α549 /DDP κύτταρα

για να διερευνήσουν περαιτέρω το ρόλο του γονιδίου klotho στην αντίσταση των κυττάρων στη χημειοθεραπεία, Κλωθώ νοκ ντάουν πραγματοποιήθηκε σε A549DDP και H460DDP κύτταρα με συγκεκριμένες τα siRNAs. Τέσσερις Τα siRNAs σχεδιάστηκαν και διαμολύνθηκαν σε A549DDP ή H460DDP κύτταρα όπως περιγράφεται στο προηγούμενο μελέτη μας στην οποία τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι το SH-2 έδειξε την καλύτερη αποδοτικότητα παρεμβολή [9]. Σε αυτή τη μελέτη, SH-2 χρησιμοποιήθηκε στα ακόλουθα πειράματα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, δοκιμασία κηλίδος Western κατέδειξε η έκφραση του γονιδίου klotho ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω κατά περίπου 50% σε σύγκριση με την ομάδα αρνητικού ελέγχου και στις δύο κυτταρικές σειρές. Εμείς στη συνέχεια διερεύνησαν την επίδραση του γονιδίου klotho knockdown στην ευαισθησία των ανθεκτικών κυττάρων σε σισπλατίνη στα οποία ΜΤΤ δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει την IC50 των κυττάρων A549DDP και H460DDP (Σχήμα 3Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν το IC50 του shRNA επιμολυσμένα κύτταρα είχαν έντονη αύξηση της IC50 σε σύγκριση με την ομάδα αρνητικού ελέγχου. Ειδικά σε κύτταρα A549DDP, η μέση IC50 των κυττάρων επιμολυσμένων shRNA ήταν 452,5 ± 20,69 μΜ (Σχήμα 3Α)

Α:. Η ERCC1 και P-gp τα επίπεδα πρωτεΐνης σε ανθεκτικά κύτταρα σισπλατίνη ταυτοποιήθηκαν με κηλίδα western. Β: A549DDP και H460DDP κύτταρα επιμολυσμένα με Κλωθώ συγκεκριμένες shRNA ή κωδικοποιημένα RNA ως αρνητικός μάρτυρας. ΜΤΤ δοκιμασία έδειξαν μια αυξημένη IC50 των κυττάρων επιμολυσμένων με shRNA. C: δοκιμασία κηλίδος Western επιβεβαίωσε την έκφραση Klotho ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω στα κύτταρα μετά από επιμόλυνση με shRNA. D: Η ρ-Akt ανιχνεύθηκε επίσης με δοκιμασία κηλίδος Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν το ρ-Ακί έκφραση ρυθμίζεται προς τα πάνω σημαντικά μετά shRNA επιμόλυνσης. GAPDH χρησίμευσε ως εσωτερική αναφορά. Πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και τα δεδομένα wer παρουσιάζονται ως μέση ± SD (* Ρ & lt? 0,05)

Η

Επιπλέον, η έκφραση του συνολικού-Ακί, φωσφο-Akt (ρ-Akt), Βαχ και bcl. -2 εξετάστηκαν σε Κλωθώ shRNA επιμολυσμένα κύτταρα. δοκιμασία κηλίδος Western έδειξε ότι το knockdown Klotho οδήγησε στη σημαντική αύξηση στην έκφραση της φωσφο-Ακί (Σχήμα 3C) και bcl-2, αλλά η έντονη μείωση στην έκφραση του Bax (ένα προ-αποπτωτική πρωτεΐνη) (Εικ 2Δ). χρώση ϋΑΡΙ έδειξε την απόπτωση των κυττάρων που υφίστανται shRNA διαμόλυνση ήταν σημαντικά μειωμένη αποδεικνύεται από μικροσκοπία σε σύγκριση με κύτταρα που λαμβάνουν επιμόλυνση με σκαρφάλωμα shRNA (Εικ 2Ε). Η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι η απόπτωση των κυττάρων ήταν 0,2% το A549DDP και 0,1% σε H460DDP σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με μπάλα (Σχήμα 2F). Τα ευρήματα έδειξαν ότι η Κλωθώ κάτω ρύθμιση μείωσε την απόπτωση μέσω οδηγούν στην ανισορροπία όσον αφορά την έκφραση που σχετίζονται με την απόπτωση πρωτεϊνών (Bax και bcl-2).

Αυξημένη αντίσταση παρακάτω Κλωθώ κάτω ρύθμιση ήταν εξασθενημένος από την αναστολή Akt με LY294002

για να διερευνήσουν περαιτέρω το εάν η Κλωθώ θα μπορούσε να βελτιώσει την αντίσταση των ανθεκτικών σισπλατίνη κύτταρα να cispaltin μέσω ρύθμιση της p-Akt έκφρασης, κύτταρα επιμολυσμένα με Κλωθώ συγκεκριμένες shRNA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 μΜ και 40 μΜ LY294002, ένας phosphoinositide- 3 αναστολέας κινάσης, για τη διαλεύκανση του ρόλου της Akt στην αυξημένη αντίσταση στη χημειοθεραπεία εξής Klotho knockdown. LY294002 ανέστειλε σημαντικά την έκφραση του ρ-Akt στα shRNA επιμολυσμένα κύτταρα, ειδικά μετά τη θεραπεία με 40 μΜ LY294002 (Σχήμα 4Α), σε σύγκριση με την ομάδα αρνητικού ελέγχου. Στη συνέχεια, ΜΤΤ δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η ευαισθησία αυτών των κυττάρων σε σισπλατίνη. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Β, η IC50 των κυττάρων A549DDP σε επεξεργασία με LY294002 στα 10 μΜ και 40 μΜ ήταν 92,97 ± 10,04 μΜ και 50,52 ± 5,63 μΜ, αντίστοιχα, οι οποίες ήταν σημαντικά χαμηλότερες από ότι στην ομάδα ελέγχου (452,5 ± 20,69 μΜ? Ρ & lt? 0,01), και οι ίδιες αλλαγές παρατηρήθηκαν στα κύτταρα H460DDP. Ως εκ τούτου, 40 μΜ LY294002 χρησιμοποιήθηκε στα ακόλουθα πειράματα. Όπως φαίνεται στο Σχ 2D, Bax, μια προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, ήταν σημαντικά επάνω ρυθμισμένη σε κύτταρα που υποβάλλονται σε θεραπεία LY294002 σε σύγκριση με τα κύτταρα χωρίς θεραπεία με αναστολέα ΡΙ3Κ /Akt. Αντιθέτως, η έκφραση του bcl-2 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω μετά την επεξεργασία LY294002. Επιπλέον, ϋΑΡΙ βαφή και κυτομετρία ροής (Σχήμα 2Ε, F) έδειξαν τα ίδια αποτελέσματα. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι Klotho θα μπορούσε να ανακουφίσει την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων να χημειοθεραπευτικά με τη ρύθμιση της απόπτωσης σε ένα ΡΙ3Κ /Akt σηματοδοτικό μονοπάτι τρόπο που εξαρτάται από

Α:. A549DDP και κύτταρα επιμολυσμένα με H460DDP shRNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LY294002 (10 και 40 μΜ). δοκιμασία κηλίδος Western κατέδειξε ότι LY294002 θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά το π-Akt έκφραση, ειδικά μετά τη θεραπεία με 40 μΜ LY294002. Β: Κύτταρα επιμολυσμένα με shRNA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LY294002 σε διαφορετικές συγκεντρώσεις, και δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη για να μετρηθεί η IC50. C: σχετίζονται με την απόπτωση πρωτεΐνες, Βαχ και Bcl-2, ανιχνεύθηκαν. Τα αποτελέσματα έδειξαν Klotho υπερ-έκφραση θα μπορούσε να αυξήσει το bcl-2 αναλογία Bax /ενώ το νοκ ντάουν Κλωθώ μειώθηκε. LY294002 θα μπορούσε να αντιστρέψει τη μειωμένη αναλογία παρακάτω shRNA επιμόλυνση. GAPDH χρησίμευσε ως εσωτερική αναφορά. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και παρουσιάζονται δεδομένα ως μέση ± SD (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01)

Η

Klotho knockdown

in vivo

αύξησε σημαντικά την αντίσταση των. πνεύμονα καρκινικά κύτταρα με σισπλατίνη

με βάση το

in vitro

πείραμα της Κλωθώ στην αντίσταση σισπλατίνη των καρκίνων του πνεύμονα, που εξετάστηκε περαιτέρω αν Κλωθώ έκφραση επηρεάζει το cispaltin ευαισθησία

in vivo

, A549DDP-lenti-sh-2 και A549DDP-lenti-σκαρφάλωμα κύτταρα ενέθηκαν υποδορίως στην δεξιά πλευρά γυμνών ποντικών. Η σισπλατίνη θα μπορούσε να αναστείλει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς που ενέθηκαν με A549DDP-lenti-σκαρφάλωμα κυττάρων σε σύγκριση με τον μάρτυρα ρυθμιστικό φωσφορικών, ωστόσο, τα ποντίκια ενέθηκαν με A549DDP-lenti-sh-2 κύτταρα έδειξαν αναστολή όχι σημαντικά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 5Α) . κηλίδα Western έδειξε επίσης ότι η έκφραση του γονιδίου klotho στην A549DDP-lenti-sh-2 συμπαγείς όγκους ήταν αδύναμη, ενώ ήταν θετικό στον έλεγχο αγωνίζομαι συμπαγή όγκο. Παρόμοια αποτελέσματα με τα

in vitro μελέτες

εντοπίστηκαν στην έκφραση του ρ-Akt (Σχήμα 5Β). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι Klotho συμβάλλει στη σισπλατίνη αντίσταση στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα σε μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου, και ΡΙ3Κ /Akt συμμετείχε στη διαδικασία

Α:. Απόπτωση των κυττάρων αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Β: Η απόπτωση των κυττάρων διεξήχθη με χρώση ϋΑΡΙ. Συμπυκνωμένη χρωματίνη εξετάστηκε από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. C:

In vivo

δοκιμασία χημειοαντίσταση της Κλωθώ νοκ ντάουν κυττάρων. Οι ξενομοσχεύματος όγκοι του όγκου σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη ή φυσιολογικό ορό απεικονίζεται. Ο όγκος του όγκου παρουσιάζεται ως μέση ± SD. D:. Έκφραση των Κλωθώ και p-Akt στον ιστό του όγκου από τα ποντίκια

Η

Συζήτηση

Η αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία υπήρξε μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις στην κλινική θεραπεία των καρκίνων. Σε προηγούμενη μελέτη μας, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η νέα αντι-γήρανσης γονίδιο Κλωθώ ήταν ζωτικής σημασίας για τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα (Α549 κύτταρα), κυρίως μέσω της αναστολής της IGF-1 /οδός R [9]. Akt, μια κινάση σερίνης /θρεονίνης, παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση [13] – [15], και αλλαγμένη έκφραση του Akt έχει παρατηρηθεί σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [16] – [18]. Akt αποτελεί επίσης βασική κατάντη πρωτεΐνη του IGF-1 /R οδό. Αύξηση απόδειξη υποστηρίζει ότι Akt εμπλέκεται στην αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία [18], [19]. Πρόσφατα, αρκετές μελέτες έχουν προσδιορίσει ότι η αναστολή της ενεργοποίησης Akt μπορεί να μειώσει την επιβίωση των κυττάρων και τη βελτίωση της αντίστασης σισπλατίνη [20], [21]. Έχει αναφερθεί ότι Akt εμπλέκεται στην σισπλατίνη ανθεκτικά σε πολλά καρκίνους [22] – [24]. Μόλις ενεργοποιηθεί ΡΚΒ /Ακί είναι φωσφορυλιώνει και δραστικά στοχεύουν πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε πολλές διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες, οι οποίες εκτείνονται σε εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, την κυτταρική επιβίωση, ριβοσωμάτων βιογένεση, τη μετάφραση πρωτεϊνών και κυτταρική κινητικότητα 25-27. Klotho βρέθηκε για πρώτη φορά το 1997 ως ένα υποθετικό γονίδιο της γήρανσης-καταστολέα σε ποντίκια που επεκτάθηκε διάρκεια ζωής όταν υπερεκφράζεται και προκάλεσε την πρόωρη γήρανση σύνδρομο όταν διαταράσσεται [5]. Δεδομένου ότι η Klotho μπορούν να αναστείλουν την IGF-1 /R μονοπάτι σηματοδότησης σε προηγούμενη μελέτη μας, και αυτοφωσφορυλίωση του IGF-1 R διεγείρει την ενεργοποίηση του Akt με φωσφορυλίωση, υποθέσαμε ότι Klotho θα μπορούσε να ανακουφίσει την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα (A549DDP και κυττάρων H460DDP) να χημειοθεραπευτικά στην οποία Akt διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο.

στην παρούσα μελέτη, ανθεκτικά σισπλατίνη NSCLC κύτταρα (A549DDP και κυττάρων H460DDP) και μητρικά κύτταρα του (Α549 και Η460 κύτταρα) χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα. Πρώτον, η έκφραση του γονιδίου klotho μετρήθηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, και τα αποτελέσματα έδειξαν την έκφραση του γονιδίου klotho τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης στα ανθεκτικά κύτταρα μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τα πατρικά κύτταρα (Ρ & lt? 0,05). Ωστόσο, η έκφραση του ρ-Akt στα σισπλατίνη ανθεκτικά κύτταρα ήταν σημαντικά υψηλότερο από εκείνο των μητρικών κυττάρων. Επιπλέον, τα υψηλά IC50s ήταν σημαντικά μειωμένη σε A549DDP και τα κύτταρα H460DDP μετά Κλωθώ πάνω ρύθμιση. Ωστόσο, Klotho ρύθμιση προς τα κάτω με επιμόλυνση με ειδικές shRNA αύξησε την αντίσταση στη σισπλατίνη, συνοδευόμενη από αύξηση της ρ-Akt έκφρασης. Προηγούμενες μελέτες έχουν προσδιορίσει Akt ως σημαντικό πρωτεΐνη στο κύτταρο διαμεσολαβούμενη επιβίωση IGF-1 [28]. Ιδιοσυστατικά, η ενεργοποίηση Akt αποτρέπει από την επαγόμενη εξωκυττάρια μήτρα απόπτωση [29]. Υπάρχουν 2 κύριους μηχανισμούς αντοχής φαρμάκου στα κύτταρα: πρώτον, διάφορες αλλαγές στα κύτταρα που επηρεάζουν την ικανότητα των κυτοτοξικών φαρμάκων να θανατώνουν κύτταρα, καθώς και οι μεταβολές σε κυτταρικό κύκλο, ενισχυμένη δραστικότητα επιδιόρθωσης του DNA, ελαττωματικά μονοπάτι απόπτωσης, τροποποιημένος μεταβολισμός των φαρμάκων, κλπ? Δεύτερον, η αύξηση της ενεργειακής εξαρτώμενη εκροή υδρόφοβων φαρμάκων, που αντιπροσωπεύεται από υπερέκφραση μιας οικογένειας ενεργειακά εξαρτώμενες μεταφορέων, που είναι γνωστή ως ΑΤΡ-δέσμευσης μεταφορείς κασέτας, όπως Ρ-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) [30]. ERCC1 (επισκευή εκτομή ομάδα cross-συμπληρώσεως 1) είναι ένας περιοριστικός παράγοντας στην νουκλεοτίδιο επιδιόρθωση εκτομής, αφαιρεί προσαγωγές DNA και επισκευή του DNA διπλό σκέλος διαλείμματα [31], [32]. Υψηλά επίπεδα ERCC1 συσχετίζεται με αντοχή στη σισπλατίνη που βασίζονται χημειοθεραπεία σε ασθενείς με NSCLC [33], [34]. P-gp ήταν το πρώτο που ανακαλύφθηκε ανθρώπινο ABC μεταφορέα, και κωδικοποιείται από το γονίδιο MDR1 [35]. P-gp είναι ένα από τα πιο σημαντικά κλινικά μεταφορείς διαμεμβρανική και παίζει σημαντικό ρόλο στην αντοχή σε φάρμακα. Για τον προσδιορισμό του υποκείμενου μηχανισμού της αντίστασης των κυττάρων μας, ερευνήσαμε περαιτέρω τις πρωτεΐνες ERCC1 και P-gp στα επιμολυσμένα κύτταρα, και βρήκαμε ότι ERCC1 μειώθηκε σημαντικά κατά τα Klotho επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τους αρνητικούς μάρτυρες, ωστόσο, καμία σημαντική παρατηρήθηκαν διαφορές στην έκφραση του p-gp. Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι Klotho επηρέασαν την αντίσταση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα σε σισπλατίνη, η οποία σχετίζεται με την οδό σηματοδότησης ΡΙ3Κ /Akt. Περαιτέρω, Klotho θα μπορούσε να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα επιδιόρθωσης του DNA μέσω της ρύθμισης των ERCC1, στη συνέχεια, αλλάξτε την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων. Στην παρούσα μελέτη, να ερευνήσει βαθιά το ρόλο της Akt στην αντίσταση των κυττάρων, βρήκαμε ότι Akt αναστολή από ειδικό αναστολέα της (LY294002) μείωσε την αυξημένη IC50 εξής Klotho shRNA διαμόλυνση συνοδεύεται από μείωση του ρ-Akt έκφρασης. Να προσδιορίσει τα αποτελέσματα

in vitro

, πραγματοποιήσαμε μια

in vivo

πείραμα σε άτριχα ποντίκια. Βρήκαμε ότι η μειωμένη αντικαρκινική αποτελεσματικότητα

in vivo

συσχετίστηκε με την αναστολή της έκφρασης γονιδίου klotho και του ενεργοποιημένου ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι η Κλωθώ, ένα αντι-γήρανσης γονίδιο, θα μπορούσε να ανακουφίσει την αντίσταση της A549DDP και H460DDP με σισπλατίνη αναστέλλοντας σηματοδοτικό μονοπάτι Akt.

Η ρύθμιση της απόπτωσης είναι περίπλοκη και ένας αριθμός γονιδίων που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία, συμπεριλαμβανομένων Bax /bcl-2, κυτταρο-ρυθμιστικές πρωτεΐνες, κλπ. [36] Η μελέτη μας έδειξε την αναλογία του Βαχ /bcl-2 αυξήθηκε δραματικά μετά Klotho υπερ-έκφραση σε κύτταρα ανθεκτικά σισπλατίνη, ενώ ο knockdown Klotho μειώθηκε αυτήν την αναλογία που συνοδεύεται από αναστολή της οδού σήματος Akt. Αυτό ήταν σύμφωνο με την τάση του ρ-Akt έκφρασης και IC50.