Abstract

NRP-2 είναι ένας υψηλής συγγένειας υποδοχέα ανεπάρκεια κινάσης για συνδέτες που ανήκουν στην κατηγορία 3 σημαφορίνης και αγγειακών οικογένειες ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα. NRP-2 έχει ανιχνευθεί επί της επιφανείας διαφόρων τύπων ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων, αλλά η έκφραση και η λειτουργία του σε γαστρεντερική (GI) τα καρκινικά κύτταρα παραμένει να προσδιοριστεί. Επιδιώξαμε να προσδιοριστεί η λειτουργία του ΕΠΜ-2 στην μεσολάβηση κατάντη σήματα που ρυθμίζουν την ανάπτυξη και την επιβίωση των ανθρώπινων γαστρεντερικών καρκινικών κυττάρων. Σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο δείγματα, έκφραση NRP-2 ανιχνεύθηκε σε ιστούς όγκων αλλά όχι σε γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο. Σε CNDT 2.5 κύτταρα, shRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν έκφραση ΕΠΜ-2 οδηγούν σε μειωμένη μετανάστευση και την εισβολή in vitro (p & lt? 0,01). Εστιασμένη ανάλυση γονιδίων-συστοιχία απέδειξε ότι η απώλεια του ΕΠΜ-2 μείωσε την έκφραση ενός κρίσιμου γονιδίου μετάσταση διαμεσολαβητή, S100A4. Σταθερής κατάστασης επίπεδα και τη λειτουργία των β-κατενίνης, ένα γνωστό ρυθμιστή της S100A4, μειώθηκαν επίσης στα shNRP-2 κλώνων. Επιπλέον, νοκ ντάουν του ΕΠΜ-2 ευαισθητοποιημένα κύτταρα CNDT 2.5

in vitro

σε τοξικότητα 5FU. Αυτό το αποτέλεσμα συσχετίστηκε με την ενεργοποίηση των κασπασών 3 και 7, η διάσπαση της PARP, και προς τα κάτω ρύθμιση του Bcl-2.

In vivo

ανάπτυξη του CNDT 2.5 κυττάρων στο συκώτι των γυμνών ποντικών μειώθηκε σημαντικά στην ομάδα shNRP-2 (ρ & lt? 0,05). Η ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση του ΕΠΜ-2-siRNA DOPC μείωσε το φορτίο του όγκου σε ποντικούς (ρ = 0,01). Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι ο όγκος των κυττάρων που προέρχονται από ΕΠΜ-2 μεσολαβεί κρίσιμο επιβίωσης σηματοδότησης στο γαστρεντερικό καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Samuel S, Gaur P, Fan F, Xia L, Gray MJ, Ντάλας ΝΑ, κ.ά. . (2011) νευροπιλίνη-2 διαμεσολαβείται από β-κατενίνης Σηματοδότησης και την επιβίωση ανθρώπων Γαστρεντερικές Καρκίνος Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 6 (10): e23208. doi: 10.1371 /journal.pone.0023208

Επιμέλεια: Xin-γιουάν Guan, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 31 Μάρτη, 2011? Αποδεκτές: 12 του Ιούλη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 20, Οκτωβρίου, 2011

Copyright: © 2011 Samuel et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. RE » Bob «Ταμείο Smith για την Έρευνα του Καρκίνου (SS)? Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορήγησης 5 Τ32 CA09599 (ΝΔ, PG, και DB)? το Κέντρο για την παρέμβαση RNA και μη-κωδικοποίησης RNA (GL-B, AS), και ένα πρόγραμμα ανάπτυξης επιχορήγησης του έργου αποτελούν το καρκίνο των ωοθηκών Ταμείο Έρευνας (GL-B, AS)? Ο William C. Liedtke, Jr., πρόεδρος για την Έρευνα του Καρκίνου (LE)? National Institutes of Health επιχορήγησης R01 CA112390 (LE). Αυτές οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Genentech, Inc. καταβάλλεται για το μισθό και τις ερευνητικές υποδομές για τους υπαλλήλους τους GP και ΑΒ, αλλά δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Genentech, Inc. ενέκρινε τη δημοσίευση του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. LE είναι σύμβουλος της Genentech, Inc., ο οποίος παρείχε τα ΕΠΜ-2 αντισώματα, και στη Roche. GP και AB πληρώθηκαν οι εργαζόμενοι της Genentech κατά το χρόνο της μελέτης. Μια αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας έχει κατατεθεί σχετικά με τις αντι-ΕΠΜ αντισώματα από την Genentech που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το χειρόγραφο. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

νευροπιλίνη-2 (ΕΠΜ-2) είναι μια γλυκοπρωτεΐνη διαμεμβράνης που αρχικά περιγράφηκε σαν ένας υποδοχέας για τους μεσολαβητές καθοδήγηση νευραξόνων, οι σεμαφορίνες [1]. Στη συνέχεια, βρέθηκε ότι εκφράζεται από φλεβική και λεμφική ενδοθηλιακά κύτταρα και ταυτοποιήθηκε ως ένα συν-υποδοχέα για τα μέλη της οικογένειας αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) [2], υποδηλώνοντας ένα ρόλο στην αγγειογένεση και λεμφαγγειογένεση [3]. έκφραση NRP-2 έχει αναφερθεί σε κύτταρα όγκου στον καρκίνο του πνεύμονα [4], [5], νευροβλάστωμα [6], παγκρεατικό καρκίνο [7], οστεοσάρκωμα [8], και καρκίνου της ουροδόχου κύστης [9]. Ωστόσο, η λειτουργία του ΕΠΜ-2 στην κυτταρική μεμβράνη του όγκου σε ανθρώπινους καρκίνους, περιλαμβανομένων και των γαστρεντερικών (GI) νευροενδοκρινή και γαστρικό προέλευσης, παραμένει σε μεγάλο βαθμό απροσδιόριστη. Προηγουμένως, έχουμε δείξει ότι NRP-2 εκφράζεται επί του παχέος εντέρου και του καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα και ότι η έκφρασή του που εμπλέκονται στην προώθηση της ανάπτυξης του όγκου [10], [11]. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιοριστεί η λειτουργία του ΕΠΜ-2 στην μεσολάβηση κατάντη σήματα που ρυθμίζουν την ανάπτυξη και την επιβίωση των ανθρώπινων γαστρεντερικών καρκινικών κυττάρων. Βρήκαμε ότι NRP-2 υπερεκφράστηκε σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο δείγματα και στα γαστρικά και καρκινοειδές κύτταρα in vitro. Εμείς διευκρινιστεί ο ρόλος του ΕΠΜ-2 στις κυτταρικές γραμμές με την υψηλότερη έκφραση ΕΠΜ-2. Βρήκαμε ότι η απώλεια της ΕΠΜ-2 μείωσε τα επίπεδα σταθερής κατάστασης και τη λειτουργία των β-κατενίνης στα κύτταρα αυτά. NRP-2 knockdown οδήγησε να μειώνεται στην έκφραση του S100A4 και μειωμένη μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων in vitro. Επιπλέον, knockdown του ΕΠΜ-2 ευαισθητοποιημένα CNDT 2.5 κυττάρων in vitro με την τοξικότητα της 5FU. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι NRP-2 μεσολαβεί κρίσιμο ογκογόνο λειτουργίες σε καρκινικά κύτταρα ΓΕ και ότι η αναστολή της έκφρασης και της δραστηριότητας του θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για θεραπευτικό όφελος σε ασθενείς με μεταστατική νόσο.

Αποτελέσματα

Έκφραση NRP-2 σε ανθρώπινο γαστρικό γραμμές καρκινικό ιστό και κυτταρικές

αξιολογούνται πρώτα την έκφραση της πρωτεΐνης ΕΠΜ-2 σε ιστούς παραφίνης του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου και γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο με χρώση ανοσοϋπεροξειδάσης. Σε αντιπροσωπευτικές γαστρικό δείγματα καρκίνου, πρωτεΐνη ΕΠΜ-2 εκφράστηκε στο γαστρικό επιθήλιο του καρκίνου, αλλά όχι σε φυσιολογικό επιθήλιο του βλεννογόνου (Σχήμα 1Α). πρωτεΐνη ΕΠΜ-2 (~ 130 kD) ήταν ετερογενή εκφράζεται σε πέντε από τις έξι γαστρεντερικού καρκίνου κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν με western αποτύπωση: AGS, CNDT 2.5, ΜΚΝ74, NCI-Ν87 και KKLS (Εικόνα 1Β). CNDT2.5 (μια ανθρώπινη κυτταρική γραμμή καρκινοειδές [12], [13]) και ΝΟΙ-Ν87 εξέφρασαν τα υψηλότερα επίπεδα του ΕΠΜ-2 και επομένως χρησιμοποιήθηκε για τις επόμενες knockdown μελέτες. Ως μάρτυρας, προεπώαση του αντισώματος ΕΠΜ-2 με το πεπτίδιο ανοσοποίησης επιβεβαίωσε την ειδικότητα του αντισώματος.

(Α) Ανοσοϊστοχημική χρώση για έκφραση ΕΠΜ-2 σε αντιπροσωπευτικές τομές ιστού (20Χ) των φυσιολογικών ανθρώπινων γαστρικού βλεννογόνου και γαστρικό δείγματα καρκίνου (Β) Ανοσοστύπωμα ανάλυση της έκφρασης ΕΠΜ-2 σε έξι ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές GI. Βινκουλίνης υπηρέτησε ως εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Δημιουργία σταθερών κυτταρικών γραμμών CNDT 2,5 με NRP-2 knockdown. Η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως της ΕΠΜ-1 και -2 έκφραση σε CNDT 2.5 κύτταρα επιμολυσμένα με shcntr ή shNRP-2 πλασμιδίων (shNRP-2 κλώνοι? C6 και C10). Βινκουλίνης χρησίμευσε ως μάρτυρας φόρτωσης. (D) Αποτελέσματα ανάλυση ΜΤΤ. Οι ρυθμοί ανάπτυξης δεν ήταν διαφορετική μεταξύ των κυττάρων ελέγχου και ΕΠΜ-2 κλώνοι νοκ ντάουν. Μπάρες δείχνουν SEM. (Ε) Κορυφή: Μέσος αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν σε μία δοκιμασία θαλάμου Boyden. Κάτω: Εκπρόσωπος εικόνες (10Χ) των δοκιμασιών μετανάστευσης. (F) Top: Μέσος αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν σε δοκιμασία θάλαμο εισβολή BIOCOAT Matrigel. Κάτω: Εκπρόσωπος εικόνες (10Χ) των δοκιμασιών εισβολής

Η

Επίδραση του ΕΠΜ-2 έκφρασης για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων in vitro

Για να κατανοήσουμε τη λειτουργία του ΕΠΜ-2 στον καρκίνο του γαστρεντερικού, εμείς. εξέτασε πρώτα τις επιδράσεις του ΕΠΜ-2 σίγηση για την ανάπτυξη των κυττάρων 2.5 CNDT in vitro. Εμείς επιλέξαμε αυτά τα κύτταρα, επειδή εκφράζουν υψηλά επίπεδα ενδογενούς του ΕΠΜ-2. CDNT 2.5 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με ένα μάρτυρα shRNA (shcntr) ή shNRP-2 (shNRP-2) πλασμιδίου και δύο shNRP-2 επιμολυσμένων κλώνων με μία έντονη μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης NRP-2 (C6 και C10, σχήμα 1Γ) ήταν επιλέξει. shNRP-2 διαμόλυνση δεν επηρέασε την έκφραση του ΕΠΜ-1 στα κύτταρα αυτά, επιβεβαιώνοντας την ειδικότητα του ΕΠΜ-2 shRNA. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε μία δοκιμασία ΜΤΤ για να προσδιοριστεί η επίδραση της ΕΠΜ-2 knockdown σε ρυθμούς ανάπτυξης των κυττάρων in vitro. Οι κλώνοι σταθερά επιμολυσμένα με shNRP-2 δεν έδειξε καμία αλλαγή στα ποσοστά πολλαπλασιασμού σε σχέση με εκείνη των κυττάρων shcntr-επιμολυσμένα (Σχήμα 1D).

Επίδραση του ΕΠΜ-2 έκφρασης για τη μετανάστευση και την εισβολή

Το αποτέλεσμα του ΕΠΜ-2 RNAi επί της κινητικότητας του CNDT 2.5 κυττάρων εξετάστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες θαλάμου Boyden. Ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν στο θάλαμο του πυθμένα ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε shNRP-2 επιμολυσμένα κύτταρα (37 ± 5 ανά πεδίο) σε σχέση με shcntr επιμολυσμένα κύτταρα (140 ± 12 ανά πεδίο) (ρ & lt? 0,001? Σχήμα 1Ε, κορυφή). Αντιστρόφως, όταν τα κύτταρα με χαμηλή ενδογενή έκφραση του ΕΠΜ-2 (KKLS) διαμολύνθηκαν παροδικά με έκφραση cDNA NRP-2 κατασκεύασμα ώστε να υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη, κυτταρική μετανάστευση αυξήθηκε σημαντικά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

κυττάρων εισβολή αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την τροποποιημένη δοκιμασία θαλάμου Boyden με μεμβράνες επικαλυμμένες με Matrigel. ΕΠΜ-2 RNAi ανέστειλε σημαντικά την εισβολή των CNDT 2.5 κυττάρων (64,4%? P & lt? 0.001? Σχήμα 1F, κορυφή). Ωστόσο, επειδή εισβολή των κυττάρων σε αυτή τη δοκιμασία είναι επίσης συνάρτηση του μεταναστευτικού δυναμικού των κυττάρων, είναι δύσκολο να δώσουμε έμφαση στα επιμέρους εισφορές. Ως εκ τούτου, δεδομένου ότι οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων είναι παρόμοια και στις δύο τις δοκιμασίες, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την ιδέα ότι η μείωση του αριθμού των εισβάλλοντας κυττάρων μπορεί απλώς να αντανακλούν μείωση της μετανάστευσης των shNRP2 κλώνων.

Επίδραση της NRP- 2 knockdown στην έκφραση των γνωστών γονιδίων μεταστατικών

από εισβολή και η μετανάστευση είναι συνδεδεμένες με το μεταστατικό φαινότυπο, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση της σειράς γονιδίου χρησιμοποιώντας μια εστιασμένη ανθρώπινου όγκου μετάστασης μικροσυστοιχιών που αντιπροσωπεύει 113 γονίδια είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στη μετάσταση. Καταστολή της ΕΠΜ-2 προκάλεσε μια μείωση στο επίπεδο έκφρασης αρκετών μεταστατικών γονιδίων (Σχήμα 2Α). Πολλά από τα μειωτικά γονίδια που ήταν αποκρίνεται σε NRP-2 knockdown είναι γνωστό ότι σχετίζονται με την αποδόμηση της εξωκυτταρικής μήτρας και είναι ιδιαίτερα εκφράζονται κατά την διάρκεια της μετάστασης. Πιο συγκεκριμένα, παρατηρήσαμε ότι προς τα κάτω ρύθμιση NRP-2 προκάλεσε μια σημαντική μείωση (& gt? 95%) στην έκφραση του S100A4 (Εικόνα 2Α). Επειδή S100A4 ήταν άκρως ανταποκρίνεται στις ΕΠΜ-2 νοκ ντάουν, επικεντρωθήκαμε σε αυτό το γονίδιο για περαιτέρω μελέτες. Η ανάλυση στυπώματος Western επιβεβαίωσε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης S100A4 ήταν σημαντικά μειωμένη μετά NRP-2 knockdown (Σχήμα 2Β).

(

A

) αυτοραδιογραφική εικόνα της μεμβράνης συστοιχίας δείχνει διαφορική έκφραση γονιδίων σε μεταστατικό shcntr (

αριστερά

) και shNRP-2 (

δεξιά

) κύτταρα. Κύκλο σημεία δείχνουν τη θέση του γονιδίου S100A4. (Β) Επικύρωση του επιπέδου έκφρασης πρωτεΐνης S100A4 σε κύτταρα με ανάλυση ανοσοστυπώματος. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) Μείωση του επιπέδου σταθερής κατάστασης του β-κατενίνης με την ΕΠΜ-2 νοκ ντάουν. έκφραση β-κατενίνης σε shcntr και κύτταρα shNRP-2 προσδιορίστηκε με ανοσοστύπωση. Βινκουλίνης χρησίμευσε ως μάρτυρας φόρτωσης. (D) Επαλήθευση της μειωμένης έκφρασης β-κατενίνης σε κύτταρα shNRP-2 με χρώση ανοσοφθορισμού. shcntr και shNRP-2 CNDT 2.5 κύτταρα που αναπτύσσονται σε πλάκες θαλάμου σταθεροποιήθηκαν και ανοσοχρώση με το αντίσωμα αντι-β-κατενίνης (κόκκινο). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (μπλε). (Ε) Επικύρωση της μείωσης της β-κατενίνης σε ένα δεύτερο ΕΠΜ-2 νοκ ντάουν γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή. NCI-Ν87 γαστρικό καρκίνο κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό περιέχουν shcntr ή shNRP-2 κατασκευάσματα. Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως έδειξε μείωση στην έκφραση β-κατενίνης σε NCI-Ν87 ΕΠΜ-2 κύτταρα knockdown. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (F) το επίπεδο της β-κατενίνης στην κυτταροπλασματική (Cyto) και πυρηνικών (Nuc) κλάσματα shcntr και κυττάρων shNRP-2. HSP90 (κυτταροπλασματική) και LaminB (πυρηνικό) χρησίμευσαν ως μάρτυρες κλασματοποίηση.

Η

Επίδραση του ΕΠΜ-2 νοκ ντάουν στην έκφραση και ο εντοπισμός της β-κατενίνης

Επειδή S100A4 είναι ένας άμεσος μεταγραφικός στόχος του β-κατενίνης, εξετάσαμε την έκφραση του β-κατενίνης στα κύτταρα knockdown ΕΠΜ-2. Συνολική πρωτεϊνική έκφραση β-κατενίνης ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα κύτταρα CNDT 2,5 shNRP-2 από ό, τι στα κύτταρα shcntr (Σχήμα 2C). Για περαιτέρω επιβεβαίωση, shcntr και shNRP-2 κλώνοι σταθεροποιήθηκαν και ανοσοχρώση με το αντίσωμα αντι-β-κατενίνης (ερυθρός φθορισμός). Σε συμφωνία με τα δεδομένα κηλίδος western, τα συνολικά επίπεδα β-κατενίνης ήταν σημαντικά μειωμένες στα κύτταρα ΕΠΜ-2 knockdown (Σχήμα 2D). Για περαιτέρω επικύρωση σε ένα δεύτερο γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή, ΕΠΜ-2 χτυπήθηκε κάτω σε κύτταρα NCI-Ν87, που εκφράζουν ένα υψηλό ενδογενές επίπεδο ΕΠΜ-2, με σταθερή ενσωμάτωση φακοϊό μεσολάβηση shNRP-2. Μετά την επαλήθευση του ΕΠΜ-2 knockdown (Σχήμα 2Ε, μεσαίο πάνελ) σε αυτά τα κύτταρα, το επίπεδο β-κατενίνης εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western. Το συνολικό επίπεδο της β-κατενίνης ήταν σημαντικά μειωμένη σε αυτά τα κύτταρα ΕΠΜ-2 νοκ ντάουν (Σχήμα 2Ε, Top πίνακα).

Για να καθοριστεί αν η ΕΠΜ-2-μεσολάβηση έκφραση της β-κατενίνης ήταν εξαρτώμενη από συνδέτη ή συνδετήρα ανεξάρτητη, β-κατενίνης κατάσταση αξιολογήθηκε με ανάλυση Western blot σε CNDT 2.5 κύτταρα μετά από θεραπεία με αντισώματα αποκλεισμού για NRP-2 (αντι-NRP-2

Β, που δεσμεύει σύνδεση VEGF-C, και παν-αντι-ΕΠΜ, το οποίο αποκλείει Sema δεσμευτική και για τα δύο ΕΠΜ-1 και ΕΠΜ-2, αλλά και αποκλείει τη δέσμευση του VEGF με στερεοχημική παρεμπόδιση)? αντι-NRP1 αντίσωμα χρησίμευσε ως έλεγχος (όλα από την Genentech, San Francisco, CA). Σε σύγκριση με τον έλεγχο, δεν υπήρχε καμία διαφορά στην έκφραση της β-κατενίνης σε κύτταρα κατεργασμένα με τα αντισώματα αποκλεισμού, γεγονός που υποδηλώνει ότι το ΕΠΜ-2-διαμεσολαβούμενη σηματοδότηση σε αυτά τα κύτταρα είναι ανεξάρτητη συνδέτη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

β-κατενίνης είναι γνωστό ότι ασκεί τη λειτουργία του μέσω μετατόπισης από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, όπου συνδέεται με παράγοντες μεταγραφής όπως ο παράγοντας Τ κυττάρων (TCF) /λεμφοειδή παράγοντα αύξησης-δεσμευτική και ως εκ τούτου διεγείρει την μεταγραφή των γονιδίων στόχων. Ως εκ τούτου αναλύσαμε την σχετική αφθονία των πρωτεϊνών β-κατενίνης στο κυτοσολικό και πυρηνικά διαμερίσματα σε shNRP-2 και shcntr κύτταρα CNDT2.5 μετά κύτταρο κλασματοποίηση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2F, NRP-2 knockdown οδήγησε σε σημαντική μείωση του επιπέδου σταθερής κατάστασης του πρωτεΐνης β-κατενίνης τόσο στο κυτοσολικά και πυρηνικά κλάσματα των κυττάρων.

Επίδραση του ΕΠΜ-2 knockdown σε λειτουργία της β-κατενίνης

Για να προσδιορίσετε αν ΕΠΜ-2 νοκ ντάουν επηρέασε και τη δραστηριότητα σηματοδότησης της β-κατενίνης, εμείς επιμολυσμένα CNDT 2.5 shcntr και shNRP-2 κύτταρα με το πλασμίδιο TOPflash TCF ανταποκριτή ή το πλασμίδιο ελέγχου FOPflash. TOPflash περιέχει ένα λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο του τρία αντίγραφα του στοιχείου TCF δέσμευσης φυσικού τύπου ανάντη του ελάχιστου υποκινητή της κινάσης της θυμιδίνης και είναι ειδικά ρυθμίζεται από σηματοδότηση β-κατενίνης. Σε FOPflash, το στοιχείο TCF δέσμευσης είναι μεταλλαγμένη. Η δοκιμασία λουσιφεράσης κατέδειξε ότι η δραστηριότητα ανταποκριτή μειώθηκε κατά 2 φορές στα κύτταρα shNRP-2 σε σύγκριση με δραστικότητα στα κύτταρα shcntr (Σχήμα 3Α).

(Α) Εκτίμηση της δραστικότητας ανταποκριτή TCF χρησιμοποιώντας την β-catenin- ανταποκρίνεται TOPflash ή μεταλλαγμένο δημοσιογράφους FOPflash. Οι δραστικότητες της λουσιφεράσης μετρήθηκε μετά από παροδική επιμόλυνση των πλασμιδίων ανταποκριτή σε shcntr και shNRP-2 CNDT 2.5 κυττάρων (Β) Αυξημένη πρωτεασώματος μεσολάβηση αποικοδόμηση του β-κατενίνης σε κύτταρα shNRP-2. shcntr και shNRP-2 CNDT 2.5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 30 μΜ MG132 ή ίσο όγκο DMSO (διαλύτης για MG132) για 2 ώρες. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-β-κατενίνης ( «φ», καμία αγωγή? «Ub», ουβικιτινιωμένες β-κατενίνης). (C) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης που δείχνουν την αποκατάσταση του επιπέδου β-κατενίνης στις κυτταροπλασματικές και πυρηνικών κλασμάτων μετά την αγωγή με 30 μΜ MG132 για 2 ώρες. (D) Μειωμένα επίπεδα φωσφορυλιωμένη ΟδΚ3β στο ΕΠΜ-2 κύτταρα νοκ ντάουν. Ανοσοστύπωμα ανάλυση φωσφορυλιωμένου ΟδΚ3β (στο Ser-9) και της GSΚ3β. (Ε) Αποκατάσταση του επιπέδου β-κατενίνης μετά το κλείδωμα δραστηριότητα της ΟδΚ3β στο ΕΠΜ-2 κύτταρα νοκ ντάουν. shcntr ή shNRP-2 CNDT 2,5 knockdown κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις LiCl για 24 ώρες και συλλέχθηκαν για ανάλυση ανοσοστυπώματος για την ανίχνευση β-κατενίνης.

Η

Επίδραση του ΕΠΜ-2 knockdown στη σταθερότητα του β- οι κατενίνης

τα ενδοκυτταρικά επίπεδα της πρωτεΐνης β-κατενίνης συντηρείται από ένα πολυπρωτεϊνικό «συγκρότημα καταστροφής» που περιέχει APC, Axin και της GSΚ3β. Σε ένα ενεργό σύμπλοκο, ΟδΚ3β φωσφορυλιώνει β-κατενίνης, tagging αυτό για την αναγνώριση από β-trCP, polyubiquitinylation και μετέπειτα αποδόμηση από το σύμπλοκο πρωτεασώματος. Πραγματοποιήσαμε μελέτες αναστολέα για την αξιολόγηση της σταθερότητας της β-κατενίνης στα κύτταρα knockdown ΕΠΜ-2. Η θεραπεία με MG132, έναν αναστολέα πρωτεασώματος, οδήγησε στην αποκατάσταση του συνολικού επιπέδου της πρωτεΐνης β-κατενίνης στα κύτταρα knockdown ΕΠΜ-2 στο επίπεδο στα κύτταρα shcntr (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, η θεραπεία με MG132 αποκατέστησε επίσης το συνολικό επίπεδο πρωτεΐνης β-κατενίνης τόσο στο κυτοσολικό και πυρηνικά διαμερίσματα στα κύτταρα ΕΠΜ-2 knockdown (Σχήμα 3C).

μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που είναι γνωστό ότι παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην ρύθμιση του κύκλου εργασιών β-κατενίνης, και β-κατενίνη διαδοχικά φωσφορυλιώνεται από ΟδΚ3β. Για να διερευνηθεί αν η ενεργοποίηση της ΟδΚ3β συμμετείχε στην κατιούσα ρύθμιση της β-κατενίνης, εξετάσαμε την κατάσταση φωσφορυλίωσης της ΟδΚ3β με χρήση ενός αντισώματος έναντι του Ser-9 φωσφορυλιωμένη μορφή της ΟδΚ3β. Ser-9 φωσφορυλίωση έχει αναφερθεί να καταστήσει ανενεργό ΟδΚ3β. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, Ser-9 φωσφορυλίωση της ΟδΚ3β ήταν σημαντικά μειωμένη στα κύτταρα shNRP-2, που δείχνει ότι σε αυτά τα κύτταρα υπήρχαν αυξημένα επίπεδα δραστικής πρωτεΐνης ΟδΚ3β, το οποίο προωθεί αποικοδόμηση β-κατενίνης. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η εμπλοκή της ενεργοποίησης ΟδΚ3β στη ρύθμιση της β-κατενίνης, η επίδραση από χλωριούχο λίθιο (LiCl)

, ενός γνωστού αναστολέα της δραστικότητας της ΟδΚ3β, αναλύθηκε. LiCl έχει αναφερθεί ότι επάγει την ανασταλτική Ser-9 φωσφορυλίωση της ΟδΚ3β ενώ έχει καμία επίδραση σε άλλες πρωτεϊνικές κινάσες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Ε, η θεραπεία με LiCl σταθεροποιημένη πρωτεΐνη β-κατενίνης στα κύτταρα shNRP-2 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο.

Επίδραση του ΕΠΜ-2 knockdown επί χημειοευαισθησία των γαστρεντερικών καρκινικών κυττάρων in vitro

Δεδομένου του ρόλου των γνωστών β-κατενίνης στην διαμεσολάβηση κυτταρική επιβίωση, υποθέσαμε ότι ένα μειωμένο επίπεδο β-κατενίνης στα κύτταρα knockdown ΕΠΜ-2 θα μεταφραστεί σε αυξημένο χημειοευαισθησία αυτών των κυττάρων. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, πραγματοποιήσαμε πρώτα μία in vitro δοκιμασία χημειοευαισθησίας με 5-φθοριοουρακίλη (5FU), το οποίο χρησιμοποιείται ως πρότυπη θεραπεία για γαστρεντερικούς καρκίνους. Σύμφωνα με την υπόθεσή μας, με τη βοήθεια χρώσης αννεξίνης V, CNDT 2,5 shNRP-2 κύτταρα που κατεργάζονται με κλινικώς δόση 5FU επέδειξε ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων από ό, τι shcntr κύτταρα (25,5% έναντι 12,5%, αντίστοιχα? Ρ & lt? 0,05?. Σχήμα 4Α)

(Α) αννεξίνης V δοκιμασία για shcntr και 2.5 κύτταρα shNRP-2 CNDT μετά τη θεραπεία, χωρίς ή με 5FU για 48 ώρες. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των αποπτωτικών δεικτών σε κυτταρικά εκχυλίσματα από shcntr και shNRP-2 CNDT 2.5 κύτταρα κατεργασμένα χωρίς ή με 5FU. Βινκουλίνης και ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες φόρτωσης.

Η

Για να επιβεβαιώσετε το μηχανισμό της 5FU-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, συγκρίναμε την ενεργοποίηση των αποπτωτικών μεσολαβητών στη CNDT 2,5 shcntr και τα κύτταρα shNRP-2 που έλαβαν θεραπεία με 5FU. Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και -7, οι κασπάσες ενέργειας στον αποπτωτικό καταρράκτη, και διάσπαση του PARP υποστρώματος κασπάσης, η οποία ασκεί προαποπτωτική δραστηριότητα, αξιολογήθηκαν με ανοσοστύπωμα χρησιμοποιώντας αντισώματα που αναγνωρίζουν ειδικά διασπασμένων προϊόντων τους. Σε συμφωνία με την αυξημένη απόπτωση στα 5FU-κατεργασμένων κυττάρων ΕΠΜ-2 knockdown, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση στα επίπεδα των δραστικών κασπάσης-3 και -7 σε αυτά τα κύτταρα, αλλά όχι στα κύτταρα shcntr (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, παρατηρήσαμε διάσπαση PARP σε κύτταρα 5FU επεξεργασμένα shNRP-2, αλλά όχι σε κύτταρα shcntr 5FU-αγωγή (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, παρατηρήσαμε σημαντική έκφραση της πρωτεΐνης αντιαποπτωτικών Bcl2 στα κύτταρα shcntr CNDT 2.5? έκφραση Bcl2 απουσίαζε στα κύτταρα shNRP-2.

Επίδραση του ΕΠΜ-2 knockdown σε in vivo ανάπτυξη του γαστρεντερικού καρκίνου κυττάρων

Για να εξεταστεί το αποτέλεσμα ΕΠΜ-2 knockdown στην ανάπτυξη των γαστρεντερικό καρκινικά κύτταρα in vivo, εμείς εγχέεται CNDT 2,5 shcntr ή shNRP-2 κλώνων στα ήπατα (μια κοινή θέση για μετάσταση καρκίνου του γαστρεντερικού) των ποντικών (10 ζώα ανά ομάδα) και αξιολογούνται εμφάνιση όγκου και ο όγκος του όγκου. Όλοι οι ποντικοί ήταν περίπου το ίδιο βάρος όταν θυσιάστηκαν. Tumor επίπτωση ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους ποντικούς που ενέθηκαν με shNRP-2 κλώνοι σε σχέση με τα ποντίκια που ενέθηκαν με κύτταρα shcntr (30% για shNRP-2 C6 και 10% για shNRP-2 C10 έναντι 80% για shcntr? Ρ & lt? 0,05, Fishers Ακριβής Test, Σχήμα 5Α). Επιπλέον, οι όγκοι που παράγονται από CNDT 2.5 κύτταρα shNRP-2 ήταν σημαντικά μικρότερος (μέσος όγκος όγκου ήπατος 38 ± 24 mm

3 και 14 ± 10 mm

3 για τα δύο κλώνους, αντίστοιχα) από ό, τι ήταν όγκους που παράγονται από τον έλεγχο κυττάρων (μέσος όγκος ήπατος όγκου 1797 ± 880 mm

3? ρ & lt? 0,05? Σχήμα 5Β). Το απεικονίζονται δεδομένα περιλαμβάνει όλα τα 10 ποντίκια σε κάθε ομάδα, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων που δεν ανέπτυξαν καμία όγκου (δηλαδή, 7/10 και 9/10 αντίστοιχα στις δύο ομάδες shNRP2 Vs 2/10 στην ομάδα ελέγχου). Αντιπροσωπευτική εικόνα των ολόκληρο ήπαρ με όγκο από κάθε ομάδα παρουσιάζεται στο κάτω πάνελ. Η knockdown του NRP2 στους όγκους επιβεβαιώθηκε με ανάλυση ανοσοστύπωσης των ΕΠΜ-2 σε ιστούς όγκου ήπατος από ποντικούς που ενέθηκαν με CNDT 2,5 shcntr ή 2 shNRP-C6 κύτταρα (Σχήμα 5C).

(Α) μειωμένη συχνότητα εμφάνισης όγκων και ο μέσος όγκος του όγκου μετά ΕΠΜ-2 νοκ ντάουν. συχνότητα εμφάνισης όγκου (10 ποντικοί) μετά την ένεση του ήπατος με CNDT 2.5 κύτταρα shcntr ή μία από τις δύο κλώνους shNRP-2. (Β) Κορυφή: Τελική όγκων του όγκου του ήπατος σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με shcntr και shNRP-2 κλώνων. Κάτω: Εκπρόσωπος εικόνες των όγκων. (Γ) Η ανάλυση ανοσοαποτύπωσης της ΕΠΜ-2 σε όγκους από τα ποντίκια με ένεση CNDT 2,5 shcntr ή 2-shNRP C6 κύτταρα [ «Τ1»? Όγκου # 1? «T2»? Tumor # 2]. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Επίδραση της in vivo στόχευση του ΕΠΜ-2 επί της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων γαστρεντερικών

Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της ίη νίνο χορήγηση του NRP-2 στοχευμένη siRNA χρησιμοποιώντας 1,2-διολεοϋλ-sn-γλυκερο-3-φωσφατιδυλχολίνη (ΕΠΜ-2-siRNA DOPC) ουδέτερα nanoliposomes [10], [14] για την αύξηση των γαστρεντερικών ξενομοσχευμάτων καρκίνου σε ποντίκια. CNDT 2.5 κύτταρα αναπτύχθηκαν ως υποδόρια ξενομοσχεύματα, και NRP-2 θεραπεία siRNA-DOPC ξεκίνησε την ημέρα 7 σε ποντίκια με ορατούς όγκους (15 ± 1,5 mm

3). Η θεραπεία αποτελείται από δύο φορές την εβδομάδα ενδοπεριτοναϊκή ένεση με 5 μg cntr siRNA-DOPC ή ΕΠΜ-2 siRNA-DOPC. Ο μέσος όγκος των όγκων σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με NRP-2-siRNA DOPC ήταν μικρότερη από ότι για τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με cntr αλληλουχίες siRNA-DOPC (264,4 ± 19,4 mm

3 vs. 751,3 ± 150,6 mm

3, αντίστοιχα? ρ = 0,01? Σχήμα 6Α). Επιπλέον, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με NRP-2 siRNA-DOPC παρουσίασαν μια σημαντική μείωση της μάζας του όγκου σε σύγκριση με μάζα του όγκου σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με cntr αλληλουχίες siRNA-DOPC (160 ± 18 mg έναντι 459 ± 102 mg, αντίστοιχα? Ρ & lt? 0,05? Εικόνα 6Β). Ανοσοϊστοχημική χρώση των καρκινικών ιστών επιβεβαίωσε ότι η έκφραση NRP-2 μειώθηκε στους όγκους από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με NRP-2-siRNA DOPC αλληλουχίες συγκριτικά με όγκους από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με cntr αλληλουχίες siRNA-DOPC (Σχήμα 6C).

όγκοι (Α) του όγκου μετά τη χορήγηση του sicntr και siNRP-2 λιποσώματα. Γυμνοί ποντικοί (7 ανά ομάδα) s.c. ένεση με 1 × 10 2.5 κύτταρα

6 CNDT. Ποντίκια με ορατό όγκους ήταν στρωματοποιημένη και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 μα λιποσώματα συζευγμένα siRNA (ενέσεις i.p.) δύο φορές την εβδομάδα. ΕΠΜ-2-siRNA DOPC-θεραπεία οδήγησε σε σημαντική μείωση στην ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με cntr siRNA DOPC-θεραπεία (264,4 χιλιοστά

3 εναντίον 751,3 χιλιοστά

3, αντίστοιχα? *

p =

0,01). (Β) Κορυφή: Στο τέλος του πειράματος, s.c. όγκοι αποκόπηκαν και ζυγίστηκαν. βάρος του όγκου ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ΕΠΜ-2-siRNA-DOPC ποντίκια με αγωγή (μέση τιμή 160 mg) σε σύγκριση με cntr ποντίκια siRNA DOPC αγωγή (μέση, 459 mg? *

σ

= 0,01). Κάτω: Εκπρόσωπος εικόνες των όγκων (C) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των ΕΠΜ-2 σε όγκους από τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με cntr-siRNA DOPC ή ΕΠΜ-2-siRNA DOPC

Η

Συζήτηση

νευροπιλίνη. -2 (ΕΠΜ-2) είναι παραδοσιακά γνωστό ότι λειτουργεί ως συν-υποδοχέας για nonsignaling κατηγορία 3 σημαφορίνες και τα μέλη της οικογένειας VEGF [1], [2]. Αν και η έκφραση του ΕΠΜ-2 είχε αρχικά πιστεύεται ότι περιορίζονται σε νευρώνες, μελέτες έχουν δείξει ότι NRP-2 εκφράζεται επί VSMCs, ενδοθηλιακά κύτταρα, και καρκινικά κύτταρα. NRP-2 αναφέρεται ότι αλληλεπιδρά με VEGFR2 και VEGFR3 και αυξάνει την επιβίωση και μετανάστευση των αγγειακών και λεμφικών ενδοθηλιακών κυττάρων [15]. Πρόσφατες μελέτες από λειτουργικές Caunt και οι συνεργάτες του έχουν δείξει ότι η αναστολή NRP-2 σε ένα προκλινικό μοντέλο μετάστασης πνεύμονα εμποδίζεται μετάσταση όγκου αναστέλλοντας τον σχηματισμό λεμφαγγεία που σχετίζονται με όγκους [16].

Η έκφραση του ΕΠΜ-2 έχει ανιχνεύθηκε σε κύτταρα όγκου δειγμάτων ασθενών πολλών τύπων όγκων, που περιλαμβάνει το γλοιοβλάστωμα, νευροβλάστωμα, και το μελάνωμα. εργαστήριο μας και άλλοι έχουν δείξει ότι ο όγκος που προέρχεται από κύτταρα NRP-2 παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου [10], [11]. Επιδιώξαμε να διευκρινιστεί περαιτέρω ο λειτουργικός ρόλος του ΕΠΜ-2 και των μηχανισμών σηματοδότησης που μεσολαβούν τη λειτουργία του ΕΠΜ-2 σε καρκίνο GI κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων του στομάχου και του καρκινοειδούς κύτταρα. Έχουμε αποδείξει σε αυτή τη μελέτη ότι NRP-2 εκφράζεται έντονα από κύτταρα όγκου σε ιστούς γαστρικό καρκίνωμα και με γαστρεντερικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, αλλά δεν είναι ανιχνεύσιμο με ανοσοϊστοχημεία σε φυσιολογικούς γαστρικό βλεννογόνο. Οι μηχανισμοί με τους οποίους τα επίπεδα NRP-2 απορυθμίζεται σε γαστρεντερικών καρκίνων παραμένουν ασαφείς. Είναι ενδιαφέρον, Tsukamoto και συνεργάτες [17] έδειξε ότι το 40% των ασθενών με καρκίνο του στομάχου αναλύθηκαν είχε ένα κέρδος στο 2q33 (την περιοχή στην οποία το γονίδιο ΕΠΜ-2 βρίσκεται) με ανάλυση της σειράς συγκριτικών γενωμικού υβριδισμού (CGH), γεγονός που υποδηλώνει αριθμό αντιγράφων εκτροπή ( CNA) της περιοχής αυτής.

Χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση παρεμβολή shRNA μεσολάβηση RNA για να καταστείλει την έκφραση ΕΠΜ-2 σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα για να διερευνήσει τις προκύπτουσες φαινοτυπικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού, μεταναστευτικών και επεμβατική δραστηριότητες. Knockdown του ΕΠΜ-2 δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CNDT 2.5 in vitro? Ωστόσο, η απώλεια του ΕΠΜ-2 μείωσε την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων όγκου

in vivo

. Η διαφορά μεταξύ

in vitro

και

in vivo

ανάπτυξη αναστολή μπορεί να οφείλεται σε NRP-2-αποκρίσεις από κύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου στη θέση του όγκου

in vivo

που δεν είναι αισθητές σε μια

in vitro

σύστημα.

In vitro μελέτες κατέδειξαν

περαιτέρω ότι υπήρξε αξιοσημείωτη αναστολή τόσο της μετανάστευσης και της εισβολής των κυττάρων. Χρησιμοποιώντας γονίδια μετάστασης που σχετίζονται με την ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών, εντοπίσαμε S100A4, ένα βασικό γονίδιο μετάστασης μεσολαβητής, πρέπει να ρυθμίζεται προς τα κάτω σημαντικά μετά την ΕΠΜ-2 αποσιώπηση. S100A4 έχει προηγουμένως συνδεθεί με μετάσταση σε διάφορα πειραματικά συστήματα [18], [19]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι S100A4 μπορεί επίσης να συμβάλει στην πρόοδο του καρκίνου με την ενίσχυση της κυτταρικής επιβίωσης λειτουργίες. Mahon και συνεργάτες [20] έδειξαν ότι S100A4 knockdown ευαισθητοποιεί παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε θεραπεία γεμσιταβίνη, εκτός από την ενεργοποίηση των κασπασών και PARP, με αποτέλεσμα την αυξημένη απόπτωση και διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Παρατηρήσαμε ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των ΕΠΜ-2 σε καρκίνο του στομάχου κύτταρα chemosensitized των κυττάρων στη θεραπεία 5FU. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να καθοριστεί αν ΕΠΜ-2 μεσολαβεί prosurvival λειτουργίες σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα μέσω S100A4.

Η περαιτέρω εξέταση των ΕΠΜ-2-μεσολάβηση ρύθμιση S100A4 απέδειξαν ότι τα επίπεδα σταθερής κατάστασης και τη λειτουργία των β-κατενίνης, άμεσος μεταγραφικός ρυθμιστής του S100A4, είχαν παραβιαστεί στα κύτταρα νοκ ντάουν ΕΠΜ-2. Ένας μεγάλος όγκος δεδομένων υποστηρίζει τη συμβολή της ενεργοποίησης του μονοπατιού σηματοδότησης β-κατενίνης στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των καρκίνων. Η ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης βρίσκεται σε περίπου 30% των γαστρικών καρκίνων [21]. Σε μια πρόσφατη μελέτη, ο Wang και οι συνεργάτες του [22] έχουν προτείνει τη σταθεροποίηση β-κατενίνης ως τρόπου δράσης για ATDC μεσολάβηση ογκογόνο λειτουργία στο καρκίνο του παγκρέατος. Χρησιμοποιώντας ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού, Oshima και οι συνεργάτες του [23] έδειξαν ότι η συνεργασία της Wnt σηματοδότησης και της προσταγλανδίνης Ε

2 (PGE

2) μονοπάτι προκαλεί γαστρικό την ανάπτυξη του καρκίνου. Η παρατεταμένη ενεργοποίηση β-κατενίνης μονοπάτι που παρατηρείται στα κύτταρα NCI-Ν87 πρέπει να είναι ανεξάρτητη από μεταλλάξεις στα γονίδια APC και β-κατενίνης, επειδή αυτή η κυτταρική σειρά δεν φιλοξενούν καμία εγγενή μεταλλάξεις σε οποιοδήποτε από αυτά τα γονίδια. Ο μηχανισμός με τον οποίο ΕΠΜ-2 φίμωση επηρεάζει αυτό το μονοπάτι παραμένει ασαφής.

Ένας πιθανός περιορισμός της μελέτης μας είναι ότι έχουμε αναλύσει την ανάπτυξη των ΕΠΜ-2 νοκ ντάουν γαστρικά καρκινικά κύτταρα, όπως πρωτογενείς όγκους, αλλά δεν αξιολογεί την μετάσταση όγκων. Δεδομένη παρατήρηση μας ότι αυτά τα κύτταρα έχουν μειωθεί μετανάστευση και την εισβολή μετά την ΕΠΜ-2 νοκ ντάουν, το

in vivo

μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων αυτών των αναγκών πρέπει να διερευνηθούν στο μέλλον. Περαιτέρω μελέτες είναι επίσης σαφές ότι απαιτούνται για τη διαλεύκανση της δυναμικό μηχανισμό βασίζεται η εξασθένηση του μονοπατιού β-κατενίνης με την ΕΠΜ-2 αποσιώπηση. Αυτό παραμένει ένα σημαντικό άλυτο πρόβλημα και αποτελεί το αντικείμενο μιας συνεχιζόμενης έρευνας στο εργαστήριο μας.

ΕΠΜ-2 αναδύεται ως ένα νέο θεραπευτικό στόχο. Δεδομένου του ρόλου του ΕΠΜ-2 σε μετανάστευση καρκινικών κυττάρων και εισβολή, τη στόχευση NRP-2 προσφέρει μια πιθανή νέα προσέγγιση στην αναστολή της ανάπτυξης και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων σε ασθενείς με μεταστατική νόσο. Επίσης, επειδή NRP-2 φαίνεται να έχει ρόλους διαφορετική από εκείνη της οικογένειας VEGF υποδοχέων, η στόχευση NRP-2 είναι απίθανο να έχει το ίδιο αποτέλεσμα ως στόχευση VEGF. Έχουμε βρει ότι η θεραπεία των γαστρεντερικών καρκινικών κυττάρων με bevacizumab δεν έχει καμία επίδραση στην έκφραση β-κατενίνης (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στόχευση ΕΠΜ-2 μπορεί, επομένως, να συμπληρώσει και να επεκτείνει τα αποτελέσματα κατά των όγκων των θεραπειών που στοχεύουν VEGF, όπως bevacizumab.

Βρήκαμε ότι η ΕΠΜ-2-μεσολάβηση έκφραση της β-κατενίνης που παρατηρήθηκαν σε αυτή τη μελέτη είναι συνδέτη ανεξάρτητη. Αυτό ανεξάρτητη συνδεσμικού σηματοδότηση NRP2 είναι νέα, ωστόσο? ο μηχανισμός (ες) που μεσολαβούν αυτό το φαινόμενο παραμένει να γίνει κατανοητό. Προς το παρόν, μπορούμε μόνο να υποθέσουμε για το μηχανισμό (ες) που συμμετέχουν, με βάση εκείνα που τεκμηριώνεται για άλλους υποδοχείς της μεμβράνης. (I) Είναι κατανοητό ότι σε κύτταρα όγκου αυξημένη έκφραση NRP2 σχετικά με τα αποτελέσματα κυτταρικής επιφάνειας σε ανεξάρτητη από πρόσδεμα ενεργοποίηση του NRP2 σηματοδότηση μέσω μέσω σύνδεσης προς VEGFR /plexin αυθόρμητη NRP2. (Ii) Εναλλακτικά, ανεξάρτητη συνδεσμικού σηματοδότηση NRP2 θα μπορούσε επίσης να ενεργοποιηθεί μέσω ομο-διμερισμού (ή ετεροδιμερισμό με NRP1) όπως στην περίπτωση πολλών άλλων υποδοχέων μεμβράνης. ΕΠΜ είναι γνωστό ότι σχηματίζουν ομο- ή ετερο-πολυμερών, ακόμη και εν απουσία του συνδέτη μέσω της περιοχής c πλησίον της μεμβράνης. (Iii) Μια τρίτη δυνατότητα επικαλείται ενεργοποίηση μέσω μονοπατιού στιχομυθία με άλλες μεμβράνη υποδοχείς, αλλά αυτό εγείρει το ερώτημα πώς ενεργοποιούνται οι αξιωματική υποδοχείς. Σε κάθε περίπτωση, οι πρωτεΐνες που συνδέουν με NRP2, συμπεριλαμβανομένων νευροπιλίνη αλληλεπιδρώντας πρωτεΐνη (ΕΕΠ) /synectin, είναι πιθανό να είναι το κλειδί για τη σηματοδότηση συνδέτη-ανεξάρτητη.